CN110100812A - 一种免疫细胞的冻存回输液、冻存方法及回输应用 - Google Patents

一种免疫细胞的冻存回输液、冻存方法及回输应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫细胞的冻存回输液，可用于免疫细胞尤其是嵌合抗体免疫细胞产品的冻存及回输，同时提供了冻存、运送以及回输的方式方法。此冻存回输液由0.9％的氯化钠生理盐水溶液和以下组分组成：5％‑10％的二甲基亚砜(DMSO)，1％‑3％的右旋糖酐，1％‑5％的葡萄糖，5％‑10％的人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，50μg/ml‑250μg/ml的维生素C和50μg/ml‑150μg/ml的维生素E，0.5％的葡萄糖酸钠，0.03％‑0.04％的氯化钾和0.03％‑0.04％的氯化镁。本发明的制剂中各组分相互配合，协同作用，按照对应的冻存及回输方法，保证了细胞水分不结晶且保证了细胞复苏后的存活率，同时有利于免疫细胞制品复苏后细胞悬液的运送和回输，起到了很好的保护作用。

Description

一种免疫细胞的冻存回输液、冻存方法及回输应用
技术领域
本发明涉及免疫细胞保护技术领域，具体是一种免疫细胞冻存回输液。
背景技术
细胞免疫治疗是采集人体的免疫细胞，体外培养扩增，增强其靶向的杀伤能力，在回输到患者体内杀灭血液/组织中的病原体、癌细胞、突变细胞的方法。近年来，恶性肿瘤仍然为医学上一大难题，常规的手术和放化疗易复发，导致更加严重的危害，因此靶向免疫治疗，尤其是嵌合抗原受体细胞免疫疗法愈发的热门，目前已经用于包括血液肿瘤以及晚期实体恶性肿瘤的临床治疗研究，由于免疫细胞治疗临床实验的广泛进行，细胞制备后的储存、运送和回输都需要短暂的载体(冻存液、回输液)进行，以确保细胞的质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存回输液，以解决免疫治疗以及临床试验中的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种免疫细胞冻存回输液，包含0.9％氯化钠生理盐水及以下成分：
进一步的，所述的本发明包含的氯化钾和氯化镁的组分为质量体积比(g/ml)，且权利要求1中所述的细胞冻存回输液用于制备好的免疫细胞。
进一步的，所述的可使用本发明的免疫细胞必须要为体外克隆培养的存活量较高，增殖能力较好的细胞，且需要通过各项质量(包括细胞存活率，细胞阳性率等)的检测。
进一步的，所述的本发明可用于的各类型免疫细胞，尤其是用于治疗恶性肿瘤的免疫细胞，包括但不限于：单核细胞、NK细胞、B细胞和T细胞。
进一步的，所述的本发明作为细胞载体制剂适用于免疫细胞疗法中细胞的超低温冻存、回输前运送和稳定的回输。
进一步的，其特征在于，所述的可使用本发明的细胞要求是体外克隆培养的密度约为5×106～1×107个细胞/份数量级的，经过多次PBS缓冲液洗涤，并采用权利要求1制剂10ml～30ml悬浮的免疫细胞，且上述细胞悬浮液需要置于一种体积在10ml～30ml的输液袋中。
进一步的，所述的免疫细胞的冻存回输液需要提供冻存，运送以及回输的方式方法、条件要求。
与现有的技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供了一种用于免疫细胞超低温储存和室温下可进行回输的制剂，适合于免疫细胞较长时间的冻存以及细胞回输量和活率，确保了更多高质量的有效免疫细胞回输给患者，且有助于细胞较长时间的运送和回输过程中的适当冻存，避免了患者给药不足、给药质量差和给药不安全的隐患。
具体实施方式
下面将结合本发明实施中免疫细胞的冷冻保存、回输方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述部分仅属于本发明的一部分实施例，不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域的实验人员在没有进一步创新的基础上劳动的前体下所获得的所有实施例，都隶属于本发明的保护范围。
在本发明的实施例中，一种免疫细胞冻存回输液，都包含有0.9％的氯化钠生理盐水，此外其他成分：
所述二甲基亚砜的含量优选为5％-10％；所述二甲基亚砜的种类为本领域技术人员熟知的二甲基亚砜即可，并无特殊的限制，本发明中优选为医用级二甲基亚砜。
所述右旋糖苷的含量优选为1％-3％，更优选为2％。
所述葡萄糖的含量优选为1％-5％，更优选为3％。
所述人血白蛋白的含量优选为5％～10％，更优选为7.5％。
所述维生素C的含量优选为50μg/ml-250μg/ml，更优选为150μg/ml。
所述维生素E的含量优选为50μg/ml-150μg/ml，更优选为100μg/ml。
所述葡糖酸钠的含量优选为0.5％。
所述氯化钾的含量优选为0.03％-0.04％，更优选为0.03％。
所述氯化镁的含量优选为0.03％-0.04％，更优选为0.03％。
在本发明提供的一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：0.9％氯化钠生理盐水；二甲基亚砜5％；右旋糖苷1％；葡萄糖1％；人血白蛋白5％；维生素C 50μg/ml；维生素E 50μg/ml；葡糖酸钠0.5％；氯化钾0.03％；氯化镁0.03％。
在本发明提供的一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：0.9％氯化钠生理盐水；二甲基亚砜10％；右旋糖苷3％；葡萄糖5％；人血白蛋白10％；维生素C 250μg/ml；维生素E 150μg/ml；葡糖酸钠0.5％；氯化钾0.04％；氯化镁0.04％。
本发明冻存液中0.9％氯化钠生理盐水可保持渗透压、酸碱平衡和提供营养，人血白蛋白在一定程度上可以替代胎牛血清在冻存中发挥的作用、维生素C和维生素E以保证复苏后细胞增殖活力不受影响，二甲基亚砜的起到细胞保护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶，上述成分相互作用，从而使本发明在不含胎牛血清的情况下仍可实现免疫细胞的冻存。
本发明细胞冻存液既采用了医用级DMSO和药品人血白蛋白，从而保证了安全性，可直接进行临床回输。
本发明还提供了一种上述细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用，所述细胞冻存液同上所述，在此不再赘述。
本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，用上述细胞冻存液冻存免疫细胞，所述细胞冻存液同上所述，在此不再赘述。
按照本发明所述冻存方法优选包括以下步骤：A)免疫细胞培养；B)将所述免疫细胞用磷酸缓冲液清洗，除去缓冲液后，与细胞冻存液混合，分装，冻存。
其中，所述免疫细胞培养具体按照以下方法进行：A1)将生理盐水、Ficoll与外周血或脐血混合，离心，吸取中间白膜层；A2)将所述白膜层接种至含有5％人AB血清的KBM581培养基中，添加300UI/ml的IL-2，24h后添加300UI/ml的白介素2与CD3/CD28免疫磁珠，培养7～10天，得到免疫细胞。
将生理盐水、Ficoll分离液与外周血或脐血混合，所述生理盐水与外周血或脐血的体积比优选为1:2；所述所述生理盐水与外周血或脐血的体积和与Ficoll分离液的体积比优选为3:1。混合后，离心，吸取中间白膜层。
将所述白膜层接种至含有5％人AB血清的KBM581培养基中，所述接种密度优选为0.5×106-1×106cell/ml，添加300UI/ml的IL-2，24h后添加300UI/ml的白介素2与CD3/CD28免疫磁珠，培养7～10天，优选每2天补液至密度为0.5×106～1×106cell/ml，并根据补液体积添加300UI/ml的白介素2，得到免疫细胞。
将免疫细胞从培养瓶中倒出，优选离心后，用缓冲液清洗，然后除去缓冲液，再与细胞冻存液混合，分装，冻存。其中所述缓冲液优选为磷酸缓冲液(PBS)；所述免疫细胞与细胞冻存液的比例优选为1×106～5×107cell/ml。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
取20ml外周血或脐血，添加等体积的生理盐水稀释，添加稀释液三分之一体积的Ficoll分离液，2000rpm离心20～30min，升降速降为零，吸取中间白膜层。
将白膜层用生理盐水清洗两遍，根据计数结果，接种密度1×106cell/ml 5％人AB血清的KBM581培养基中，添加300UI/ml的IL-2，24h后添加300UI/ml的白介素2和CD3/CD28免疫磁珠；第4天补液，补液密度0.5～1×106cell/ml，并根据补液体积添加300UI/ml的白介素2；后续每2天补液一次，补液后密度维持在0.5～1×106cell/ml，并根据补液体积添加对300UI/ml的白介素2；培养7～10天得到免疫细胞。
将得到的免疫细胞从培养瓶中倒出，1500rpm离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方见表1)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫细胞的表面标记物CD3；将余下的细胞悬液加入冻存袋中，每袋10ml～30ml分为1个月、3个月、6个月三组，每组3袋细胞，总共9袋细胞；将冻存袋放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。
免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存1个月、3个月、6个月的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在3min内；将解冻后的免疫细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫的表面标记物CD3；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表4与表5。
表1实施例1中细胞冻存液的配方
实施例2
将实施例1中得到的免疫细胞从培养瓶中倒出，1500rpm离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方见表2)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫细胞的表面标记物CD3；将余下的细胞悬液加入冻存袋中，每袋10ml～30ml分为1个月、3个月、6个月三组，每组3袋细胞，总共9袋细胞；将冻存袋放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。
免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存1个月、3个月、6个月的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在3min内；将解冻后的免疫细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫细胞的表面标记物CD3；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表4与表5。
表2实施例2中细胞冻存液的配方
实施例3
将实施例1中得到的免疫细胞细胞从培养瓶中倒出，1500rpm离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方见表3)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫细胞的表面标记物CD3；将余下的细胞悬液加入冻存袋中，每袋10ml～30ml分为1个月、3个月、6个月三组，每组3袋细胞，总共9袋细胞；将冻存袋放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。
免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存1个月、3个月、6个月的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在3min内；将解冻后的免疫细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫细胞的表面标记物CD3；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表表4与表5。
表3实施例3中细胞冻存液的配方
冻存液组分 浓度
二甲基亚砜(DMSO) 10％
右旋糖酐 3％
葡萄糖 5％
HSA 10％
维生素C(Vc) 250μg/ml
维生素E(V<sub>E)</sub> 150μg/ml
葡萄糖酸钠 0.5％
氯化钾 0.04％
氯化镁 0.04％
比较例1
将实施例1中得到的免疫细胞从培养瓶中倒出，1500rpm离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方为体积分数10％DMSO+90％的胎牛血清)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫细胞的表面标记物CD3；将余下的细胞悬液加入冻存袋中，每袋10ml～30ml分为1个月、3个月、6个月三组，每组3袋细胞，总共9袋细胞；将冻存袋放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。
免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存1个月、3个月、6个月的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在3min内；将解冻后的免疫细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测免疫细胞的表面标记物CD3；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表表4与表5。
表4细胞活性计算结果
表5细胞表面标记物表达率检测结果

Claims (10)

1.一种免疫细胞的冻存回输液，其特征在于，所述的成分中包含有0.9％的氯化钠生理盐水溶液和以下组分(百分比计)：
2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞的冻存回输液，其特征在于，所述的本发明包含的氯化钾和氯化镁的组分为质量体积比(g/ml)，且权利要求1中所述的细胞冻存回输液用于制备好的免疫细胞。
3.根据权利要求2所述的一种免疫细胞的冻存回输液，其特征在于，所述的可使用本发明的免疫细胞必须要为体外克隆培养的存活量较高，增殖能力较好的细胞，且需要通过各项质量(包括细胞存活率，细胞阳性率、附属物检查等)和安全性指标(病毒、支原体、细菌、真菌等污染物)的检测。
4.根据权利要求3所述的一种免疫细胞的冻存回输液，其特征在于，所述的本发明可用于的各类型免疫细胞，尤其是用于治疗恶性肿瘤的免疫细胞，包括但不限于：单核细胞、NK细胞、B细胞和T细胞。
5.根据权利要求2、3、4所述的一种免疫细胞的冻存回输液，其特征在于，所述的本发明作为细胞载体制剂适用于免疫细胞疗法中细胞的超低温冻存、回输前运送和稳定的回输。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞的冻存回输液的应用，其特征在于，所述的可使用本发明的细胞要求是体外克隆培养的密度约为5×106～1×107个细胞/份数量级的，经过多次PBS缓冲液洗涤，并采用权利要求1制剂10ml～30ml悬浮的免疫细胞，且上述细胞悬浮液需要置于一种体积在10ml～30ml的输液袋中。
7.根据权利要求6所述的免疫细胞的冻存回输液的应用，其特征在于，所述的每个输液袋包装好免疫细胞悬浮液后，需要提供一种冻存的方法，包括：
①利用权利要求1所述的一种冻存回输液将制备并洗涤好的免疫细胞重悬均匀；
②免疫细胞悬浮液要置于患者回输使用的输液袋中；
③输液袋包装好免疫细胞后，进行阶段性的降温处理(放置于4℃10min，放置于-20℃30min，放置于-80℃，16-18小时)后可置于-80℃或液氮环境中较为长期的储存。
④在输液袋降温处理从4℃转移到-20℃的过程中，需要轻轻颠倒混匀细胞，放置长时间放置导致细胞的大量沉降堆积而影响冻存效果。
8.根据权利要求6和7所述的一种利用本冻存回输液的免疫细胞的冻存方法，其特征在于，冻存后的免疫细胞在患者使用前要运送到治疗地点并进行解冻处理，运送和解冻的方法包括：
①冻存的免疫细胞输液袋包装在运送到患者治疗地点的过程中需要储存在4℃～15℃的保温盒中，且在12小时内运送到指定地点；
②将冻存好的输液袋取出后快速置于25℃～37℃的水浴中1min～3min；
③水浴过程中需要轻微振荡摇晃输液袋，直至冰冻的细胞悬浮液完全融化(没有可见冰)；
④输液袋解冻后不要继续放置于37℃的环境中，一旦解冻则必须要置于20℃～25℃的室温中，并在30min内回输给患者。
9.根据权利要求8所述的一种免疫细胞冻存回输液的运送及回输前解冻方法，其特征在于，解冻后的输液袋封装的免疫细胞，需要提供回输的方法，包括：
①解冻后的输液袋细胞制剂需要仔细检查是否完整，若有袋子破损的现象请勿回输；
②解冻后的输液袋细胞制剂需要放在第二个无菌袋中封装，放置意外泄露并保护端口免受污染；
③已经处于解冻状态的输液袋细胞制剂准备好后，立即在30min内给对应的患者进行回输，输注前请勿使用新的溶液稀释或洗涤免疫细胞制剂，若输液袋内存在可见的细胞团块，需要轻轻混合内容物。
10.根据权利要求7、8、9中所述的一种利用本发明的免疫细胞的冻存、运送以及回输方法，若每个输液袋给对应患者回输时需要分2～3次进行，每次回输结束后剩余的细胞制剂在下次回输前需进行再次冻存，且冻存前可按照剩余细胞制剂体积/本冻存回输液体积为99:1、98:2、97:3的比例进行混合。再次解冻和回输时无需添加包括本发明制剂在内的任何物质，且方法同权利要求8和9。
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