BR112019024113A2 - Métodos para selecionar uma unidade de sangue do cordão umbilical e frações de célula sanguínea do cordão umbilical e para preparar uma unidade de sangue do cordão umbilical. - Google Patents
Métodos para selecionar uma unidade de sangue do cordão umbilical e frações de célula sanguínea do cordão umbilical e para preparar uma unidade de sangue do cordão umbilical. Download PDFInfo
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Abstract
métodos para selecionar unidades de sangue do cordão umbilical para expansão ex-vivo, separação de frações cd133+/cd34+ positivas e cd133+/cd34+ negativas não cultivadas, métodos para expandir a fração cd133+/cd34+ selecionada, seleção de populações expandidas de células sanguíneas do cordão cd133+/cd34+ para transplantação a sujeitos em necessidade da mesma e o uso terapêutico de frações sanguíneas do cordão cd133+/cd34+ expandidas ex-vivo selecionadas adequadas e cd133/cd34 negativas não selecionadas para transplantação no cenário clínico, para tratamento de neoplasias hematológicas são providos. a presente invenção também vislumbra kits que compreendem as frações sanguíneas do cordão expandidas e não selecionadas.
Description
MÉTODOS PARA SELECIONAR UMA UNIDADE DE SANGUE DO CORDÃO UMBILICAL E FRAÇÕES DE CÉLULA SANGUÍNEA DO CORDÃO UMBILICAL E PARA PREPARAR UMA UNIDADE DE SANGUE DO CORDÃO UMBILICAL CAMPO E FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a métodos para selecionar unidades de sangue do cordão umbilical para expansão ex-vivo, separação das frações positivas CD133+/CD34+ e negativas CD133+/CD34+ não cultivadas, métodos para expandir a fração CD133+/CD34+ selecionada, seleção de populações expandidas de células sanguíneas do cordão CD133+/CD34+ para transplantação a sujeitos em necessidade do mesmo e o uso terapêutico de frações de sangue do cordão negativas CD133+/CD34+ expandidas ex-vivo selecionadas e negativas CD133/CD34 não selecionadas adequadas para transplantação no cenário clínico, para tratamento de neoplasias hematológicas. A presente invenção também prevê kits compreendendo as frações de sangue do cordão expandidas e não selecionadas.
[002] Mais de dois terços dos pacientes que aguardam a transplantação de células-tronco hematopoiéticas não têm um doador relacionado compatível adequado, tomando necessário o enxerto de doadores não relacionados. O sangue do cordão umbilical, a medula óssea e outros tecidos ricos em hematopoiéticos são uma fonte valiosa de células-tronco, particularmente onde um doador não relacionado compatível não pode ser encontrado dentro de um prazo razoável. As vantagens do uso do sangue do cordão umbilical incluem o fato de estar prontamente disponível, apresentar menos risco de transmissão de doenças infecciosas transmitidas pelo sangue e ser transplantável através das barreiras HLA com risco reduzido de doença do enxerto contra o hospedeiro em comparação com células-tronco similarmente incompatíveis do sangue periférico ou medula óssea de doadores relacionados
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2/95 ou não relacionados. Outra vantagem importante do sangue do cordão umbilical é a rapidez com que uma unidade de sangue do cordão aceitável, uma vez identificada, pode ser adquirida.
[003] No entanto, uma grande limitação clínica do sangue do cordão umbilical é a baixa dose de células-tronco disponível para transplantação, comparada ao sangue periférico mobilizado (PB) ou medula óssea. Essa baixa dose de células-tronco pode comprometer as chances de enxerto e contribuir para a cinética tardia da recuperação de neutrófilos e plaquetas, além de outros resultados do transplante, resultando em complicações relacionadas ao transplante, morbidade e mortalidade e maior duração da hospitalização. Para resolver essa lacuna, várias abordagens foram desenvolvidas, incluindo o transplante de sangue do cordão umbilical duplo (DCBT) e a expansão ex vivo das células-tronco do cordão umbilical. O DCBT tomou-se uma prática padrão no transplante de sangue do cordão umbilical para receptores nos quais uma única unidade de sangue do cordão com dose adequada de células não está disponível.
[004] Ainda assim, a cinética do enxerto de DCBT não é melhor que os transplantes unitários. A expansão ex vivo ainda é uma abordagem experimental. O objetivo da expansão ex vivo do sangue do cordão umbilical é fornecer um enxerto com número suficiente de células que tenham potencial rápido e robusto de produção de neutrófilos e plaquetas in vivo para permitir a transplantação bem-sucedido. Delaney et al. (2010, Nat Med 16:232-236) e De Lima et al. (2012, N Engl J Med, 367:2305-2315) publicaram os resultados de dois estudos clínicos que utilizaram enxertos de sangue do cordão umbilical ex vivo em uma configuração de cordão duplo, ou seja, uma unidade usada para expansão, e uma segunda unidade administrada sem manipulação, relatando que, embora as células expandidas tenham sido observadas uma semana após a transplantação, elas foram perdidas principalmente antes ou após o enxerto, enquanto a unidade não manipulada
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3/95 predominou em todos os receptores.
[005] Os presentes inventores mostraram que cultivar células sanguíneas do cordão CD 133+ na presença de citocinas (SCF, TPO, IL-6 e ligante FLT-3) e nicotinamida resultou em uma expansão melhor e prolongada dos progenitores tardios e precoces, importantes para enxerto de trilinhagem precoce a longo prazo e redução da fração de células mielomonocíticas diferenciadas (CD14+, CDllb+, CDllc+) e aumentam a fração de células progenitoras precoces menos diferenciadas, as células CD34+CD38-. As células CD34+ obtidas após a cultura com NAM exibiram aumento da migração para SDF-1 e lar da medula óssea (24 horas após a infusão) com maior eficácia do que as células cultivadas apenas com citocinas ou células não cultivadas. Além disso, estudos in vitro mostram que essas condições de cultura não suportam a expansão de células T e, portanto, apenas quantidades desprezíveis de células que exibem fenótipo de célula T podem ser encontradas na fração expandida do sangue do cordão umbilical (ver as patentes US n° 7.955.852 e 8.846.393 e Peled et al, 2012, Exp Hematol 40:342-55).
[006] Horowitz et al (2014, J Clin Invest 124:3121-3128), usando a abordagem de transplantação de sangue de cordão duplo, demonstraram que as células-tronco e progenitoras alogênicas ex vivo se expandiram a partir de uma unidade de sangue do cordão umbilical com citocinas e nicotinamida que são capazes de superar um enxerto de sangue do cordão umbilical não manipulado, e fornecer enxerto rápido e hematopoiese de multilinhagem robusta e de longo prazo.
[007] Wagner et al (Cell Stem Cell 2016 18:144-55) relataram resultados positivos em um ensaio clínico de Fase I/II com células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical expandidas com um antagonista do receptor de aril-hidrocarboneto como enxerto independente. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
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4/95
[008] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção, é provido um método para selecionar uma unidade de sangue do cordão umbilical descongelada para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito, o método compreendendo determinar a viabilidade percentual das células na unidade de sangue do cordão umbilical descongelada e selecionar unidades com cerca de 40% a 85% de viabilidade antes de separar a unidade de sangue do cordão umbilical em frações CD133+/CD34+ e CD/133-/CD34-, selecionando assim uma unidade de cordão umbilical descongelada adequada para expansão ex vivo e transplantação para o sujeito.
[009] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende selecionar unidades com cerca de 40% a cerca de 70% de viabilidade.
[0010] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende adicionalmente:
(a) separação da unidade de sangue do cordão umbilical descongelada adequada para transplantação e expansão ex vivo no sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34;
(b) determinação na primeira fração CD133+/CD34+ selecionada dos seguintes parâmetros pós-separação:
(i) cerca de 20X105 a cerca de 20X105 células totais;
(ii) cerca de 70% a cerca de 85% de viabilidade;
(iii)cerca de 70% a cerca de 85% de células CD133+;
(iv) cerca de 70% a cerca de 85% de células CD34+;
(v) cerca de 0,02 a cerca de 1 % de rendimento após seleção de CD133+/CD34+, (vi) cerca de 15 a cerca de 75 UFC por 1000 células, e
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5/95 (vii) menos de 3 Eu/ml de endotoxina, e (c) seleção ou exclusão da primeira fração CD133+/CD34+ selecionada de acordo com os parâmetros, selecionando assim uma fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ para expansão ex-vivo e transplantação para o sujeito.
[0011] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a separação de (a) compreende a seleção imunomagnética de esferas para CD133+.
[0012] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas para CD133/CD34 compreende menos de 0,5% de células CD133+/CD34+.
[0013] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas para CD133/CD34 compreende menos de 0,01% de células CD133+/CD34+.
[0014] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas para CD133/CD34 compreende células imunes, incluindo linfócitos T, linfócitos B e células exterminadoras naturais (NK).
[0015] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção, é provido um método para preparar uma unidade de sangue do cordão umbilical para transplantação para um sujeito, o método compreendendo:
(a) separação de uma única unidade de sangue do cordão umbilical descongelada adequada para transplantação no sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas
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6/95 não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34;
(b) cultura ex vivo da primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e citocinas, incluindo cada um de fator de células-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM.
[0016] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ selecionadas (a)(i) é uma fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada adequada para expansão ex vivo e transplantação para o sujeito de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 3 ou 4.
[0017] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende adicionalmente a exclusão de unidades com mais de 3,0 Eu/ml de endotoxina e/ou crescimento de bactérias, leveduras ou bolores no dia 7 ou no dia 14 da expansão ex vivo.
[0018] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a única unidade de sangue de cordão umbilical adequada para transplantação é distinguida pelos seguintes parâmetros de pré-criopreservação:
(i) cerca de 8X106 a cerca de 15X106 células CD34+ totais;
(ii) HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o sujeito;
(iii) cerca de 1,8X109 a cerca de 3,0X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas; e (iv)cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0019] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o soro compreende 10% de FBS.
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[0020] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, as citocinas compreendem 50 ng cada de fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6.
[0021] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a nicotinamida é fornecida a 2,5 mM.
[0022] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a cultura ex vivo é afetada por 18 a 25 dias.
[0023] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende adicionalmente a colheita da primeira fração CD133+/CD34+ selecionada cultivada ex vivo após 19 a 23 dias em cultura.
[0024] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende adicionalmente a colheita da primeira fração CD133+/CD34+ selecionada cultivada ex vivo após 21 dias em cultura.
[0025] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende adicionalmente a criopreservação separada da primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo, compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+, e a segunda fração de células sanguíneas não selecionada, compreendendo células negativas CD133/CD34.
[0026] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um método para selecionar frações de células sanguíneas do cordão umbilical cultivadas ex vivo compreendendo células sanguíneas do cordão selecionadas CD133+/CD34+ para transplantação para um sujeito, compreendendo:
(a) determinar na fração de sangue do cordão umbilical cultivada ex vivo após a expansão ex vivo os seguintes parâmetros:
(i) cerca de 8X108 a cerca de 15X108 células viáveis totais;
(ii) cerca de 70% a 85% de viabilidade das células;
(iii) cerca de 7 a 15% de células CD34+;
(iv) cerca de 5,6X107 a cerca de 5X108 células CD34+ totais;
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8/95 (v) cerca de 2,4X107 a cerca de 2X108 células CD133+ totais;
(vi) cerca de 8X105 a cerca de 25X105 células CD133+/CD38-;
(vii) cerca de 8X107 a cerca de 15X108 células CD 14+ totais, (viii) cerca de 2X108 a cerca de 2X109 células CD 15+ totais, (ix) cerca de 8X107 a cerca de 8X109 células CD1 lb+ totais, (x) cerca de 3,2X107 a cerca de 3X108 células CDl(a+c)+ totais, (xi) Nenhum micoplasma cultivado ou crescimento de bactérias, leveduras ou bolores, e (b) selecionar ou excluir a fração de sangue do cordão umbilical cultivada ex vivo de acordo com os parâmetros, selecionando assim uma fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ cultivada ex vivo adequada para transplantação para um sujeito.
[0027] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, em que a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ cultivada ex vivo é selecionada quando (i) é igual a pelo menos 8,0X108 células viáveis.
[0028] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a fração de sangue do cordão umbilical cultivada ex vivo foi cultivada a partir de uma unidade de sangue do cordão umbilical selecionada para expansão ex vivo de acordo com os seguintes parâmetros de pré-criopreservação:
(i) cerca de 8X106 a cerca de 15X106 células CD34+ totais;
(ii) HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o sujeito;
(iii) cerca de 1,8X109 a cerca de 3,0X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas;
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9/95 (iv)cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0029] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende adicionalmente a seleção de frações de sangue do cordão umbilical cultivadas ex vivo com uma cor amarelada, turva a opaca e livre de aglomerados brancos e partículas estranhas.
[0030] De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um método para selecionar frações de células sanguíneas do cordão umbilical não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34 para transplantação para um sujeito, compreendendo:
(a) determinar na fração de sangue do cordão umbilical não cultivada após a seleção para células negativas CD133/CD34 os seguintes parâmetros:
(i) cerca de 4X108 a cerca de 15X108 células viáveis totais;
(ii) cerca de 70 a 85% de viabilidade das células;
(iii) cerca de 2,4X107 a cerca de 8X107 células CD3+;
(iv) nenhum crescimento bacteriano, de levedura ou bolor, e (b) selecionar ou excluir a fração de células do sangue do cordão umbilical não selecionadas de acordo com os parâmetros, selecionando assim uma fração de células sanguíneas do cordão umbilical não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34 adequadas para transplantação no sujeito.
[0031] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método compreende adicionalmente a seleção de frações de sangue do cordão umbilical não selecionadas com uma cor vermelha opaca e livre de aglomerados e partículas estranhas.
[0032] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado na técnica a que pertence esta
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10/95 invenção. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou testes das modalidades da invenção, os métodos e/ou materiais exemplificativos são descritos abaixo. Em caso de conflito, o relatório descritivo da patente, incluindo definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitativos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO [0033] A presente invenção se refere a métodos para selecionar unidades de sangue do cordão umbilical para expansão ex-vivo, separação das frações positivas CD133+/CD34+ e negativas CD133+/CD34+ não cultivadas, métodos para expandir a fração CD133+/CD34+ selecionada, seleção de populações expandidas de células sanguíneas do cordão CD133+/CD34+ para transplantação a sujeitos em necessidade do mesmo e o uso terapêutico de frações de sangue do cordão negativas CD133+/CD34+ expandidas ex-vivo selecionadas e negativas CD133/CD34 não selecionadas adequadas para transplantação no cenário clínico, para tratamento de neoplasias hematológicas. A presente invenção também prevê kits compreendendo as frações de sangue do cordão expandidas e não selecionadas.
[0034] A presente invenção também se refere a um kit que compreende a unidade de sangue do cordão umbilical expandido e instruções para o uso da mesma no tratamento de neoplasias hematológicas.
[0035] Antes de explicar pelo menos uma modalidade da invenção em detalhes, deve-se entender que a invenção não é necessariamente limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir. A invenção é capaz de outras modalidades ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras.
[0036] A transplantação alogênica de células-tronco hematopoiéticas é um procedimento que salva vidas de pacientes com distúrbios
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11/95 hematológicos; no entanto, a ampla aplicação desse procedimento é limitada pela disponibilidade de doadores adequadamente compatíveis com HLA.
[0037] Consequentemente, os enxertos de sangue do cordão umbilical são usados rotineiramente e com mais sucesso no cenário de transplantação pediátrico (apenas 20% das unidades de sangue do cordão nos bancos seriam suficientes para um paciente de 75 kg de acordo com a dose limite recomendada de células). Os adultos que recebem transplantação de sangue do cordão umbilical correm alto risco de mortalidade precoce (até 30 a 60% do dia 100 de mortalidade) e infecção devido ao atraso no enxerto e maiores taxas de falha do enxerto. De fato, as publicações que revisam as diferenças nos resultados entre o sangue do cordão umbilical e outras fontes de enxerto relatam consistentemente maior mortalidade sem recaída após o transplante de sangue do cordão, geralmente atribuível à recuperação hematopoiética inadequada, e o atraso no enxerto foi considerado a maior barreira para o sucesso do transplante de sangue do cordão umbilical e o contribuinte mais importante para a mortalidade precoce sem recidiva.
[0038] Um desafio significativo aos métodos atualmente disponíveis para produção de enxerto é a capacidade de gerar uma população expandida de células progenitoras hematopoiéticas comprometidas sem comprometer o número de células progenitoras menos diferenciadas (células CD34+CD38ou CD34+Lin-). A presente invenção fornece uma tecnologia de expansão utilizando nicotinamida (NAM) para aumentar a eficácia do enxerto e migração para a medula óssea. O enxerto é um processo de várias etapas que envolve a migração direcionada das células inoculadas, a migração para a medula óssea (MO), a retenção no nicho da MO, seguida pela autorrenovação e diferenciação. Sabe-se que a eficácia do enxerto após a expansão é baixa devido à falta de migração para a medula óssea em comparação com as células CD34+ frescas ou à autorrenovação reduzida devido à diferenciação intensificada na cultura.
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[0039] Os métodos para a seleção de unidades de sangue do cordão umbilical e expansão ex vivo das células progenitoras hematopoiéticas (HPC) fornecidos aqui permitem aumentar seus números, mantendo sua capacidade de autorrenovação e sua capacidade de migrar para a medula óssea (MO) e reconstituir eficientemente a hematopoiese. A adição de nicotinamida atrasa a diferenciação e aumenta a eficácia de migração e enxerto de células CD 133+ purificadas derivadas de sangue do cordão, cultivadas com uma combinação de 4-citocinas (FLT3, SCF, TPO e IL6) por 21 (+/- 2) dias (19 a 23 dias). Como essas condições de cultura para não apoiar a expansão de células T (apenas quantidades desprezíveis de células que exibem fenótipo de células T podem ser encontradas nas células cultivadas e expandidas), a presente invenção fornece uma fração não cultivada e não manipulada derivada da mesma unidade de sangue do cordão umbilical para fornecer células T.
[0040] A presente invenção fornece critérios para a seleção de unidades de sangue do cordão umbilical para a preparação de frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex vivo cultivadas e CD133/CD34 negativas não cultivadas, métodos para a cultura e expansão ex vivo da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ , critérios para seleção de frações do sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas e CD133/CD34 negativas não cultivadas adequadas para transplantação com alta probabilidade de enxerto eficaz e métodos de criopreservação e preparação das frações de sangue de cordão cultivadas e não cultivadas. A presente invenção também fornece métodos para o uso de frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas e CD133/CD34 negativas não cultivadas que atendem aos critérios de seleção para transplantação no cenário clínico, para tratamento de distúrbios sanguíneos malignos.
Seleção de unidades do sangue do cordão umbilical para expansão ex vivo [0041] De acordo com algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para selecionar uma unidade de sangue do cordão
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13/95 umbilical criopreservada para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito, compreendendo: determinar na dita unidade de sangue do cordão umbilical antes da expansão ex vivo os seguintes parâmetros de précriopreservação:
(i) cerca de 8X106 a cerca de 15X106 células CD34+ totais;
(ii) HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito;
(iii) cerca de 1,8X109 a cerca de 3,0X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas;
(v) cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito, e selecionar ou excluir a dita unidade de sangue do cordão umbilical de acordo com os ditos parâmetros, selecionando assim uma unidade de sangue do cordão umbilical adequada para expansão ex-vivo e transplantação para o sujeito.
[0042] Todas as unidades de sangue do cordão umbilical são adquiridas em bancos públicos que atendem aos regulamentos nacionais aplicáveis. Os doadores são rastreados e testados de acordo com os requisitos regulatórios relevantes. Os bancos de sangue do cordão umbilical tipicamente utilizam métodos para armazenamento eficiente do sangue do cordão umbilical recém-colhido, incluindo a depleção de glóbulos vermelhos e a de plasma, resultando em redução de volume e criopreservação da unidade de sangue do cordão com volume reduzido. Antes da criopreservação da unidade de sangue do cordão umbilical, uma amostra da unidade é analisada para produzir um perfil da unidade, incluindo, mas não se limitando à viabilidade celular, quantidades de populações celulares específicas, tipagem de antígeno leucocitário humano (HLA) e critérios de segurança como contaminação bacteriana/viral e volume unitário, fornecendo, entre outros, valores totais
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14/95 para toda a unidade, valores relativos (por exemplo, porcentagem de qualquer tipo específico de célula do número total de células) e valores ajustados por volume (por exemplo, concentração de qualquer tipo específico de célula em um volume unitário). Como usado aqui, o termo “criopreservação” refere-se a um processo em que entidades biológicas sujeitas a danos por cinética química não regulamentada (por exemplo, células, tecidos, organelas) são preservadas por resfriamento a temperaturas extremamente baixas, tipicamente -80°C com dióxido de carbono sólido ou -196°C usando nitrogênio líquido. Em uma modalidade, as células sanguíneas do cordão são criopreservadas com nitrogênio líquido. Métodos de preservação de populações de células hematopoiéticas são bem conhecidos na técnica (ver, Watts et al, Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, in Methods in Molecular Biology, 2007; 368:237-259).
[0043] Como usado aqui, o termo “pré-criopreservação” refere-se a parâmetros, valores ou características registrados antes da criopreservação, por exemplo, antes da criopreservação de uma unidade de sangue do cordão umbilical criopreservada armazenada. Em algumas modalidades, esses dados de “pré-criopreservação” podem ser referidos para a seleção de unidades de sangue do cordão umbilical candidatas para uso nos métodos da presente invenção.
[0044] Assim, de acordo com uma modalidade da presente invenção, parâmetros pré-criopreservados de células CD34+ totais, células nucleadas totais, e depleção e redução de volume de glóbulos vermelhos são determinados para uma unidade de sangue do cordão umbilical para selecionar ou excluir a unidade de sangue do cordão umbilical para expansão ex vivo e transplantação. Quando a identidade do candidato aa transplantação (por exemplo, o “sujeito”) é conhecida, parâmetros como HLA compatível (compatibilidade) e células nucleadas totais pré-criopreservação por quilograma de peso do sujeito também podem ser determinados e servem
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15/95 como critério de seleção.
[0045] Em modalidades particulares, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm valores de CD34+ total précriopreservação de cerca de 8X106 a cerca de 15X106 células CD34+ totais, cerca de 9X106 a cerca de 13X106 células CD34+ totais, cerca de 10X106 a cerca de 12X106 células CD34+ totais. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 12X106 células CD34+ pré-criopreservadas totais. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 8X106 células CD34+ pré-criopreservadas totais. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 10X106 células CD34+ pré-criopreservadas totais.
[0046] Em modalidades particulares, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm valores de células nucleadas totais pré-criopreservação de cerca de l,8X109 a cerca de 3,0X109 células nucleadas totais, cerca de 2X109 a cerca de 2,7X109 células nucleadas totais ou cerca de 2,2X109 a cerca de 2,5X109 células nucleadas totais. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 2,5X109 células nucleadas totais précriopreservadas. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 2,0X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos l,8X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas. Tipicamente, as células nucleadas podem ser contadas manualmente em hemocitômetros (por exemplo, Neubauer) ou com um contador automatizado. [0047] Em modalidades particulares, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm células nucleadas totais
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16/95 pré-criopreservação por quilograma de peso do sujeito de cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 células nucleadas totais por quilograma de peso do sujeito, cerca de l,7X107 a cerca de 2,8X107 células nucleadas totais por quilograma de peso do sujeito, cerca de l,9X107 a cerca de 2,5X107 células nucleadas totais por quilograma de peso do sujeito ou cerca de 2X107 a cerca de 2,2X107 células nucleadas totais por quilograma de peso do sujeito. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 3,0X107 células nucleadas totais précriopreservadas por quilograma de peso do sujeito. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 2,3X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito. Em uma modalidade, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos l,5X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0048] Em modalidades particulares, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex vivo são HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito pré-criopreservação, em pelo menos 5 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito, ou em pelo menos 6 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito. Em algumas modalidades, as unidades de cordão são HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito pré-criopreservação, com pelo menos uma compatibilidade HLA-DRB1. Em algumas modalidades, as unidades de cordão são HLA compatível em pelo menos 5 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e
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HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito précriopreservação. Em algumas modalidades, as unidades de cordão são HLA compatível em pelo menos 5 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito pré-criopreservação, com pelo menos uma compatibilidade HLADRB1. Tipicamente, os antígenos HLA de Classe I (ou Complexo Principal de Histocompatibilidade, MHC) são determinados nas células sanguíneas do cordão por um ensaio de microcitotoxicidade usando aloantissoros para HLAs específicos, complemento para citotoxicidade e um corante para identificar células mortas. O HLA de Classe II é tipicamente determinado pela reação de linfócitos mistos (MLR), medindo a proliferação de linfócitos após a cultura de populações de linfócitos mistos. Os antígenos HLA DR podem ser identificados por antissoros de células B em um ensaio de microcitotoxicidade com células B enriquecidas. Os antissoros podem ser substituídos por anticorpos monoclonais específicos.
[0049] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 8X106 células CD34+ pré-criopreservadas totais e pelo menos l,5X107 células nucleadas totais précriopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0050] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 10X106 células CD34+ pré-criopreservadas totais e pelo menos 2,5X107 células nucleadas totais précriopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0051] Exemplos de critérios de pré-criopreservação exemplificativos para seleção de unidades de sangue do cordão umbilical para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito são apresentados nas Tabelas I-IV abaixo.
TABELA I- Critérios de seleção de pré-criopreservação de CBU
| Parâmetro | Valor |
| Células CD34+ totais | Pelo menos 12X106 |
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| Compatibilidade com HLA | HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito |
| Células nucleadas totais (TNC) | Pelo menos 1,8X109 |
| Células nucleadas totais pot quilograma de peso do sujeito | Pelo menos 2,5X107 |
T ABEL A II- Critérios de seleção de pré-criopreservação de CBU
| Parâmetro | Valor |
| Células CD34+ totais | Pelo menos 10X106 |
| Compatibilidade com HLA | HLA compatível em pelo menos 5 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito |
| Células nucleadas totais (TNC) | Pelo menos 2,7X109 |
| Células nucleadas totais pot quilograma de peso do sujeito | Pelo menos 2,0Χ107 |
TABELA III- Critérios de seleção de pré-criopreservação de CBU
| Parâmetro | Valor |
| Células CD34+ totais | Pelo menos 8X106 |
| Compatibilidade com HLA | HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito |
| Células nucleadas totais (TNC) | Pelo menos 1,8X109 |
| Células nucleadas totais pot quilograma de peso do sujeito | Pelo menos l,5X107 |
T ABEL A IV- Critérios de seleção de pré-criopreservação de CBU
| Parâmetro | Valor |
| Células CD34+ totais | Pelo menos 13X106 |
| Compatibilidade com HLA | HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito |
| Células nucleadas totais (TNC) | Pelo menos 2,2X109 |
| Células nucleadas totais pot quilograma de peso do sujeito | Pelo menos 2,7X107 |
[0052] Como aqui usado, o termo “ex-vivo” refere-se a um processo no qual as células são removidas de um organismo vivo e propagadas para fora do organismo (por exemplo, em um tubo de ensaio, em uma bolsa de cultura celular, etc.).
[0053] Como aqui usado, o termo “m vitro” refere-se a um processo no qual células originárias de uma linhagem ou linhagens celular(es) (como linhagens celulares embrionárias, etc.) mantidas em laboratório são manipuladas fora de um organismo. Tais linhagens celulares são
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19/95 frequentemente células imortalizadas.
[0054] Como aqui usada, a expressão “células-tronco” refere-se tanto à população de células renováveis mais comprometida com a linhagem responsável por gerar massa celular rápida em um tecido ou corpo quanto às células progenitoras muito precoces, que são um pouco menos diferenciadas, ainda não comprometidas com uma determinada linhagem e podem facilmente reverter para se tomar parte da população de células renováveis a longo prazo. As células-tronco hematopoiéticas são células-tronco que podem regenerar os componentes celulares do sangue, como eritrócitos, leucócitos, plaquetas, etc.
[0055] Como usadas aqui, as expressões “não tronco”, “não progenitor” e “células comprometidas” referem-se a células em vários estágios de diferenciação, que geralmente não mantêm mais a capacidade de reverter para se tomar parte de uma população de células renováveis. Os métodos de cultura ex-vivo de células-tronco, progenitoras e comprometidas não progenitoras e não tronco são bem conhecidos na técnica de cultura de células. Para esse efeito, ver, por exemplo, o livro-texto “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), terceira edição, cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência.
[0056] Uma vez identificadas as unidades de sangue do cordão criopreservadas adequadas, elas podem ser transportadas para processamento adicional (por exemplo, descongelamento e expansão ex vivo), ou podem ser marcadas e mantidas congeladas até surgir a necessidade de processamento adicional na preparação para a transplantação. Assim, um “banco” de unidades de sangue do cordão umbilical criopreservadas adequadas para expansão ex vivo e transplantação e um banco de dados correspondente das unidades podem ser estabelecidos, permitindo um acesso mais rápido a unidades de sangue do cordão umbilical adequadas.
[0057] Em algumas modalidades, as unidades do sangue do cordão
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20/95 umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 1,8Χ109 células nucleadas totais pré-criopreservadas e pelo menos 1,5X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0058] Em algumas modalidades, as unidades do sangue do cordão umbilical selecionadas para expansão ex-vivo têm pelo menos 2,5X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas e pelo menos 2,0X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0059] O processamento adicional de unidades de sangue do cordão umbilical adequadas selecionadas para expansão ex vivo e transplantação inclui o descongelamento da unidade criopreservada selecionada e a determinação da adequação das células sanguíneas do cordão descongeladas para prosseguir para uma seleção adicional, separação de uma fração de células sanguíneas do cordão CD133+/CD34+ da fração de células sanguíneas do cordão CD133-/CD34-.
[0060] Assim, de acordo com algumas modalidades, é fornecido um método para selecionar uma unidade de sangue do cordão umbilical descongelado para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito, o método compreendendo determinar a viabilidade percentual das células na dita unidade de sangue do cordão umbilical descongelada e selecionar unidades com cerca de 40% a cerca de 85% de viabilidade antes da separação da dita unidade de sangue do cordão umbilical em frações CD133+/CD34+ e CD/133-/CD34-, selecionando assim uma unidade de cordão umbilical descongelada adequada para expansão ex vivo e transplantação para o sujeito.
[0061] Em algumas modalidades, unidades com cerca de 40% a cerca de 70% de viabilidade são selecionadas. Em algumas modalidades, unidades com cerca de 42%, cerca de 46%, cerca de 48%, cerca de 50%, cerca de 52%, cerca de 54%, cerca de 56%, cerca de 58%, cerca de 60%, cerca de 60%, cerca de 62%, cerca de 64%, cerca de 66%, cerca de 68% a cerca de 70% de viabilidade são selecionadas.
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[0062] Deverá ser reconhecido que as unidades de sangue do cordão umbilical descongeladas são tipicamente unidades de sangue do cordão umbilical criopreservadas que foram selecionadas como adequadas para processamento adicional usando os critérios e métodos aqui descritos.
[0063] De acordo com algumas modalidades, a unidade de sangue do cordão congelada selecionada é transferida para o local de fabricação de acordo com os procedimentos do banco de sangue do cordão umbilical. Após confirmação da identidade da unidade de sangue do cordão umbilical, a unidade é armazenada no armazenamento central de nitrogênio líquido até o início do procedimento de seleção e expansão das células.
[0064] No local de fabricação, a bolsa de sangue do cordão umbilical é cuidadosamente limpa com lenços esterilizados com álcool, descongelado em banho-maria a 37°±1C e transferida para um local de produção (por exemplo, sala limpa) para posterior manuseio.
[0065] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão descongeladas são preparadas para seleção de células da seguinte maneira: O sangue descongelado é transferido para um tubo de centrífuga de 175 ml. A bolsa de criopreservação é lavada com 10% p/v de dextrano-40 em solução salina e 5% p/v de HSA e depois adicionado ao tubo de centrifugação. Duas amostras são removidas para determinar a viabilidade celular e a concentração viável de células da suspensão celular, bem como o conteúdo de CD34+, CD133+ da CBU descongelada. Após centrifugação, o sobrenadante é removido e o volume é levado a 100 ml pela adição de um tampão PBS contendo 0,4% p/v de citrato de sódio e 1 % v/v de HSA. Adiciona-se Ig IV e após incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, a suspensão celular é centrifugada e as células sedimentadas são ressuspensas.
[0066] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo são de HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de
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22/95 classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito pré-criopreservação e pelo menos 8X106 células CD34+ pré-criopreservadas totais.
[0067] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo são de HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito pré-criopreservação e pelo menos 2,0X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[0068] Como aqui usado, o termo “viabilidade” refere-se à distinção entre células vivas e não vivas. A viabilidade celular pode ser julgada por alterações morfológicas ou por alterações na permeabilidade da membrana e/ou estado fisiológico inferidas pela exclusão de certos corantes ou pela captação e retenção de outros. Os ensaios de viabilidade celular são bem conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, exclusão de azul de tripano ou iodeto de propídio e coloração metabólica de rodamina (Coder, D., Current Protocols in Cytometry, 1997, John Wiley and Sons, Inc., Unit 9.2, 9.2.19.2.14).
[0069] As unidades de sangue do cordão descongeladas excluídas de acordo com os critérios de viabilidade são descartadas e não podem prosseguir com as etapas adicionais de processamento das unidades de sangue do cordão transplantáveis. As unidades de sangue do cordão descongeladas que atendem aos critérios de viabilidade podem ser analisadas para a porcentagem de células CD 133+ e porcentagem de CD34+ na unidade descongelada, e os dados registrados para referência posterior.
[0070] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo são de HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito pré-criopreservação, pelo menos l,5X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por
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23/95 quilograma de peso do sujeito e pelo menos 8X106 células CD34+ précriopreservadas totais.
[0071] As unidades de sangue do cordão descongeladas consideradas adequadas, por viabilidade, para processamento adicional para expansão ex vivo e transplantação são então separadas em duas frações do sangue do cordão umbilical por seleção de acordo com o marcador de células-tronco CD133+. A fração de células CD133+/CD34+ da unidade de sangue do cordão umbilical representa uma população de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras com potencial para proliferar, diferenciar e reconstituir todas as linhagens de células sanguíneas, enquanto a fração de células “negativas” CD133-/CD34- não selecionadas representa uma fração rica em células imunes maduras, como células B, células T e células exterminadoras naturais (NK).
[0072] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo são de HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito pré-criopreservação e pelo menos 1,8X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas.
[0073] As células-tronco podem ser identificadas e enriquecidas usando marcadores de células-tronco, tais como CD34+, CD34+/CD38-, CD133+, CD34+/Lin- e outros marcadores de células-tronco conhecidos na técnica. A identificação e separação da fração CD133+/CD34+ das células sanguíneas do cordão descongeladas podem ser realizadas por seleção usando FACS, métodos de separação imunomagnética ou ácido nucleico, como PCR, como os métodos de isolamento ou enriquecimento para sangue do cordão e células-tronco adultas descritos em Stem Cell Biology Daniel R. Marshak (Editor) Richard L. Gardner (Editor), Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001) e Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Anthony D. Ho (Editor) Richard Champlin (Editor), Publisher: Marcel
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Dekker (2000).
[0074] Em uma modalidade específica, a unidade de sangue do cordão descongelada selecionada adequada para expansão ex vivo e transplantação é separada em uma fração CD133+/CD34+ (positiva) e uma fração CD133-/CD34- (negativa) usando esferas imunomagnéticas conjugadas com anti-CD133 (CliniMacs, Milentyi Biotec, Alemanha).
[0075] Em modalidades específicas, a separação da fração CD 133+ é afetada da seguinte forma: 1,2 ml do reagente Miltenyi CliniMACS CD 133 é adicionado à suspensão de células sanguíneas do cordão umbilical e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente. E adicionado tampão e a suspensão centrifugada durante 10 minutos a 450Xg à temperatura ambiente. O sobrenadante é removido e o glóbulo celular é ressuspenso em tampão PBS contendo 0,4% p/v de citrato de sódio e 1 % v/v de HSA, e a suspensão celular é transferida para uma bolsa de transferência. O sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec, Alemanha) é montado de acordo com as instruções do fabricante, e as células CD 133+ selecionadas são coletadas em uma bolsa de transferência “de coleta”, enquanto as células não ligadas não selecionadas CD 133- são coletadas na bolsa de fração negativa. As células são transferidas assepticamente da bolsa de “coleta” para um tubo de centrífuga de 175 ml. A suspensão celular selecionada é centrifugada a 450Xg por 10 minutos em temperatura ambiente, o sobrenadante removido e as células transferidas para um tubo estéril para testes de segurança. O glóbulo celular é ressuspenso e o volume exato medido e registrado.
[0076] Uma amostra da suspensão celular é removida e a viabilidade celular e a concentração viável de células são medidas. O número total de células viáveis e o rendimento celular obtido a partir da coluna são calculados. A porcentagem de células CD 133+ e CD34+ purificadas é medida. A pureza é definida como a porcentagem de células CD 133+ dentro da população de células selecionada.
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[0077] Uma vez separada, a fração positiva CD133+/CD34+ pode ser expandida ex vivo, mas deve primeiro ser rastreada quanto à adequação para processamento adicional. Assim, em algumas modalidades, o método para selecionar uma unidade de sangue do cordão umbilical descongelada para expansão ex vivo e transplantação em um assunto compreende adicionalmente:
(a) separação da dita unidade de sangue do cordão umbilical descongelada adequada para transplantação e expansão ex vivo no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34, e (b) determinação na dita primeira fração CD133+/CD34+ selecionada dos seguintes parâmetros pós-separação:
(i) cerca de 20X105 a cerca de 20X105 células totais;
(ii) cerca de 70% a cerca de 85% de viabilidade;
(iii)cerca de 70% a cerca de 85% de células CD133+;
(iv) cerca de 70% a cerca de 85% de células CD34+;
(v) cerca de 0,02 a cerca de 1 % de rendimento após seleção de CD133+/CD34+ (vi) cerca de 15 a cerca de 50 UFC/1000 células, e (vii) menos de 3 Eu/ml de endotoxina, e (c) seleção ou exclusão da dita primeira fração CD133+/CD34+ selecionada de acordo com os ditos parâmetros, selecionando assim uma fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ para expansão ex-vivo e transplantação para o dito sujeito. [0078] Em modalidades particulares, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex-vivo tem contagem
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26/95 de células pós-separação totais de cerca de 20X105 a cerca de 75X105 células, cerca de 25X105 a cerca de 65X105 células, cerca de 30X105 a cerca de60X105 células, cerca de 36X105 a cerca de 55X105 células e cerca de 40X105 a cerca de 50X105 células. Em uma modalidade, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex-vivo tem uma contagem de células pós-separação totais de pelo menos 20X106, pelo menos 30X106, pelo menos 35X106, pelo menos 40X106, pelo menos 45X106, pelo menos 50X106, pelo menos 55X106, pelo menos 60X106 e pelo menos 70X106 células totais. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex-vivo tem uma contagem de células pós-separação totais de pelo menos 25X106 células totais. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex-vivo tem uma contagem de células pós-separação totais de pelo menos 20X106 células totais. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex-vivo tem uma contagem de células pós-separação totais de pelo menos 45X106 células totais.
[0079] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo são de HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito de précriopreservação e têm pelo menos l,8X109 células nucleadas totais précriopreservadas.
[0080] Em algumas modalidades, as unidades de sangue do cordão selecionadas para expansão ex-vivo são de HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito de précriopreservação e têm pelo menos 2,5X109 células nucleadas totais précriopreservadas.
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[0081] Em algumas modalidades, frações de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ com cerca de 70% a cerca de 85% de viabilidade são selecionadas. Em algumas modalidades, frações de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ com cerca de 71%, cerca de 73%, cerca de 75%, cerca de 78%, cerca de 80%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84% a cerca de 85% de viabilidade são selecionadas. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 70% de células viáveis. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 77% de células viáveis. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 85% de células viáveis.
[0082] O teor de células CD133+, CD34+ e CD133+/CD34+ da fração de sangue do cordão umbilical separada é crítico para o enxerto bemsucedido das células sanguíneas do cordão expandidas transplantadas e é, portanto, um critério central para avançar para a expansão ex vivo. Assim, em modalidades particulares, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem contagem total de células pósseparação de cerca de 70% a cerca de 85% de células CD133+, cerca de 73% a cerca de 82% de células CD133+, cerca de 75% a 80% de células CD133+ e cerca de 76 a 79% de células CD133+. Em uma modalidade, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD 133+ pós-separação de pelo menos 70%, pelo menos 74%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 83% ou pelo menos 85% de células CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD 133+ pós-separação de pelo menos 80% de células CD 133+ pós-separação para CD133+. Em uma modalidade adicional,
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28/95 a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD 133+ pós-separação de pelo menos 70% de células CD133+ pós-separação para CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD133+ pós-separação de pelo menos 75% de células CD133+ pós-separação para CD133+.
[0083] Assim, em modalidades particulares, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem contagem total de células pós-separação de cerca de 70% a cerca de 85% de células CD133+, cerca de 73% a cerca de 82% de células CD133+, cerca de 75% a 80% de células CD133+ e cerca de 76 a 79% de células CD134+. Em uma modalidade, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD34+ pós-separação de pelo menos 70%, pelo menos 74%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 83% ou pelo menos 85% de células CD34+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD34+ pós-separação de pelo menos 82% de células CD34+ pós-separação para CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD34+ pós-separação de pelo menos 70% de células CD 133+ pós-separação para CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células CD34+ pós-separação de pelo menos 78% de células CD 133+ pósseparação para CD 13 3+.
[0084] Em modalidades particulares, o rendimento pós-seleção da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo é de cerca de 0,02% a cerca de 1,0%, cerca de 0,05% a cerca de 0,8%,
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29/95 cerca de 0,08% a cerca de 0,7%, cerca de 0,1% a cerca de 0,55%, cerca de 0,25% a cerca de 0,45% e cerca de 0,3 a 0,4% após a separação para CD 133+. Em uma modalidade, o rendimento pós-seleção da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo é de pelo menos 0,01%, pelo menos 0,05%, pelo menos 0,1%, pelo menos 0,3%, pelo menos 0,5%, pelo menos 0,65%, pelo menos 0,75%, pelo menos 0,9% ou pelo menos 1,0% após a seleção para CD133+. Em uma outra modalidade, o rendimento pósseleção da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo é de pelo menos 0,02% após a separação. Em uma outra modalidade, o rendimento pós-seleção da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo é de pelo menos 0,3% após a separação. Em uma outra modalidade, o rendimento pós-seleção da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo é de pelo menos 0,5% após a separação. Em uma outra modalidade, o rendimento pós-seleção da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo é de pelo menos 0,8% após a separação.
[0085] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem cerca de 15 a cerca de 75 UFC por 1000 células, cerca de 20 a cerca de 60 UFC por 1000 células, cerca de 25 a cerca de 50 UFC por 1000 células, cerca de 30 a cerca de 40 UFC por 1000 células após a separação. Em uma modalidade, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células, pelo menos 22 UFC por 1000 células, pelo menos 25 UFC por 1000 células, pelo menos 30 UFC por 1000 células, pelo menos 36 UFC por 1000 células, pelo menos 40 UFC por 1000 células, pelo menos 45 UFC por 1000 células, pelo menos 52 UFC por 1000 células, pelo menos 60 UFC por 1000 células, pelo menos 68 UFC por 1000 células ou pelo menos 75 UFC por 1000 células pós-seleção para CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+
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30/95 selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células após a seleção para CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 25 UFC por 1000 células após a seleção para CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 40 UFC por 1000 células após a seleção para CD133+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 45 UFC por 1000 células após a seleção para CD133+.
[0086] Exemplos de critérios exemplificativos para seleção de unidades de sangue do cordão descongeladas adequadas para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito são apresentados nas Tabelas V-VIII abaixo.
TABELA V- Critérios de seleção do sangue do cordão umbilical para expansão ____________________________________________
| Parâmetro | Valor |
| Células totais | Pelo menos 35Χ105 |
| Viabilidade | Pelo menos 85% |
| Fração de células CD 133+ | Pelo menos 77% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 83% |
| UFC por 1000 células | Pelo menos 23 |
| Rendimento pós-seleção | Pelo menos 0,5% |
| Endotoxina | Não mais que 3 Eu/ml |
TABELA VI- Critérios de seleção do sangue do cordão umbilical para expansão ____________________________________________
| Parâmetro | Valor |
| Células totais | Pelo menos 20X105 |
| Viabilidade | Pelo menos 70% |
| Fração de células CD 133+ | Pelo menos 70% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 70% |
| UFC por 1000 células | Pelo menos 15 |
| Rendimento pós-seleção | Pelo menos 0,02% |
| Endotoxina | Não mais que 3 Eu/ml |
TABELA VII- Critérios de seleção do sangue do cordão umbilical para expansão
| Parâmetro | Valor |
| Células totais | Pelo menos 45X105 |
| Viabilidade | Pelo menos 85% |
| Fração de células CD 133+ | Pelo menos 72% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 83% |
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| UFC por 1000 células | Pelo menos 18 |
| Rendimento pós-seleção | Pelo menos 0,5% |
| Endotoxina | Não mais que 3 Eu/ml |
TABELA VIII- Critérios de seleção do sangue do cordão umbilical para expansão ____________________________________________
| Parâmetro | Valor |
| Células totais | Pelo menos 55Χ105 |
| Viabilidade | Pelo menos 76% |
| Fração de células CD 133+ | Pelo menos 85% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 76% |
| UFC por 1000 células | Pelo menos 35 |
| Rendimento pós-seleção | Pelo menos 0,09% |
| Endotoxina | Não mais que 3 Eu/ml |
[0087] A esterilidade e a segurança da unidade de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ descongelada para expansão ex vivo e transplantação são garantidas pelo monitoramento, inter alia, do teor de endotoxinas e da presença de contaminação bacteriana, fúngica, viral e micoplasma. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem um teor de endotoxina de não mais de 3 Eu/ml a qualquer momento durante o processo de expansão (cultura de células). Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo está livre de bactérias, leveduras, mofo e micoplasma após a seleção para CD 133+ e em qualquer dia testado. Em algumas modalidades, o teor de endotoxina é monitorado nos dias 0 e 7 da expansão ex vivo. Em algumas modalidades, bactérias, leveduras, fungos e micoplasmas são monitorados nos dias 0, 7 e 14 da expansão ex vivo.
[0088] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células e um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,02%. Em outras modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células, um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,02% e uma contagem total de células CD133+ pós-separação de pelo menos 75% células CD133+ pósseparação para CD133+. Em outras modalidades, a fração de sangue do
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32/95 cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 35 UFC por 1000 células e um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,1%.
[0089] Em outras modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células e uma contagem total de células CD 133+ pós-separação de pelo menos 70% de células CD133+ pós-separação para CD133+.
[0090] A fração CD 133- negativa não selecionada compreende o repertório de células imunes, incluindo, mas não limitado a linfócitos T, linfócitos B e células exterminadoras naturais (NK). Após a seleção das células sanguíneas do cordão descongeladas para células CD133+, a fração CD133- negativa não selecionada é preparada para criopreservação por lavagem e suspensão em solução de criopreservação. Muitas soluções de criopreservação estão disponíveis comercialmente. Em algumas modalidades, a solução de criopreservação é CryoStor®CS10 (BioLife Solutions, Inc). Antes da criopreservação, a fração de células sanguíneas do cordão negativa CD133/CD34 não selecionadas também é monitorada quanto a parâmetros, incluindo viabilidade, teor de células CD3+ (células T), teor de CD133+/CD34+ e esterilidade. Assim, em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para selecionar frações de células sanguíneas do cordão umbilical não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34 para transplantação para um sujeito, compreendendo:
(a) determinar na dita fração de sangue do cordão umbilical não cultivada após a seleção para células negativas CD133/CD34 os seguintes parâmetros:
(i) cerca de 4X108 a cerca de 15X108 células viáveis totais;
(ii) cerca de 70 a 85% de viabilidade das células;
(iii) cerca de 2,4X107 a cerca de 8X107 células CD3+;
(iv) nenhum crescimento bacteriano, de levedura ou bolor, e (b) selecionar ou excluir a dita fração de células do sangue do
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33/95 cordão umbilical não selecionadas de acordo com os ditos parâmetros, selecionando assim uma fração de células sanguíneas do cordão umbilical não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34 adequadas para transplantação no sujeito.
[0091] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células pós-separação de pelo menos 20X106 células totais e pelo menos 70% de células pós-separação viáveis.
[0092] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células pós-separação de pelo menos 20X106 células totais e pelo menos 80% de células CD133+.
[0093] Em outras modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células, um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,02% e uma contagem total de células CD34+ pós-separação de pelo menos 70% células CD34+ pós-separação para CD133+.
[0094] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com cerca de 70% a cerca de 85% de viabilidade são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 com cerca de 71%, cerca de 73%, cerca de 75%, cerca de 78%, cerca de 80%, cerca de 82%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84% a cerca de 85% de viabilidade são selecionadas. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 selecionada para transplantação tem pelo menos 70% de células viáveis.
[0095] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células pós-separação de pelo menos 20X106 células totais e pelo menos
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70% de células CD 133+.
[0096] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem uma contagem total de células pós-separação de pelo menos 20X106 células totais e pelo menos 70% de células CD34+.
[0097] Em outras modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células, um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,02% e uma contagem total de células CD34+ pós-separação de pelo menos 85% células CD133+ pós-separação para CD133+.
[0098] Em outras modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 15 UFC por 1000 células, um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,02% e uma contagem total de células CD 133+ pós-separação de pelo menos 70% células CD 133+ pós-separação para CD133+.
[0099] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 70% de viabilidade e pelo menos 70% de células CD34+.
[00100] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com cerca de 4X108 a cerca de 15X108 de células viáveis totais são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, o número de células viáveis totais na fração negativa de CD133/CD34 selecionada para transplantação é de cerca de 6X108 a cerca de 13X108 células, cerca de 7,5X108 a cerca de 11X108 células viáveis ou cerca de 9X108 a cerca de 10X108 células viáveis. Em algumas modalidades, o número de células viáveis totais na fração negativa CD133/CD34 selecionada para transplantação é de pelo menos 4X108, pelo menos 6X108, pelo menos 7,5X108, pelo menos 9X108, pelo menos 10X108, pelo menos 12X108, pelo menos 14X108 ou pelo menos 15X108 células viáveis totais. Em
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35/95 uma modalidade particular, o número de células viáveis totais na fração negativa CD133/CD34 selecionada para transplantação é de pelo menos 4X108 células viáveis totais.
[00101] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 70% de células viáveis e um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,02% células CD133+/CD34+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 80% células CD34+, 85% de células viáveis e um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,1% células CD133+/CD34+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para expansão ex vivo tem pelo menos 70% células CD34+, 80% de células viáveis e um rendimento pós-seleção de pelo menos 0,02 % células CD133+/CD34+.
[00102] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com cerca de 2,4X107 a cerca de 8X107 células CD3+ são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com cerca de 2,4X107 a cerca de 8X107 células CD3+, cerca de 3,5X107 a cerca de 7X107 células CD3+, cerca de 4,3X107 a cerca de 6,2X107 células CD3+ ou cerca de 4,8X107 a cerca de 5X107 células CD3+ são selecionadas para transplantação. Em outras modalidades, frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 2,4X107 células CD3+, pelo menos 3,0X107 células CD3+, pelo menos 3,5X107 células CD3+, pelo menos 4,0X107 células CD3+, pelo menos 4,5X107 células CD3+, pelo menos 5X107 células CD3+, pelo menos 6X107 células CD3+, pelo menos 7X107 células CD3+ ou pelo menos 8X107 células CD3+ são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas selecionadas para transplantação têm pelo menos 3,0X107 células CD3+. Em algumas
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36/95 modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas selecionadas para transplantação têm pelo menos 2,4X107 células CD3+. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas selecionadas para transplantação têm pelo menos 5X107 células CD3+.
[00103] Em outras modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 5X107 células CD3+ e 6X108 células viáveis totais são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 2,4X107 células CD3+ e 4X108 células viáveis totais são selecionadas para transplantação. Em ainda outras modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 6X107 células CD3+ e 4X108 células viáveis totais são selecionadas para transplantação.
[00104] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com cerca de 0,01% a cerca de 0,5% de células CD133+/CD34+ são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 com não mais de cerca de 0,03%, cerca de 0,05%, cerca de 0,08%, cerca de 0,1%, cerca de 0,25%, cerca de 82%, cerca de 3%, cerca de 4% ou cerca de 5% de células CD133+/CD34+ são selecionadas. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 selecionada para transplantação tem não mais de 0,01% de células CD133+/CD34+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 selecionada para transplantação tem não mais de 0,05% de células CD133+/CD34+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 selecionada para transplantação tem não mais de 0,1% de células CD133+/CD34+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 selecionada para
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37/95 transplantação tem não mais de 0,25% de células CD133+/CD34+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 selecionada para transplantação tem não mais de 0,5% de células CD133+/CD34+.
[00105] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 4X108 células viáveis totais e 85% de viabilidade são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 70% de viabilidade e 2,4X107 células CD3+ são selecionadas para transplantação.
[00106] As frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 criopreservadas selecionadas adequadas para a transplantação podem ser armazenadas e mantidas congeladas até serem necessárias para a transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 selecionadas adequadas para transplantação são armazenadas em nitrogênio líquido.
[00107] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 4X108 células viáveis totais e 70% de viabilidade são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 70% de viabilidade e 2,4X107 células CD3+ são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 4X108 células viáveis totais, pelo menos 2,4X107 células CD3+ e 70% de viabilidade são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 6X108 células viáveis totais, pelo menos 2,7X107 células CD3+ e pelo menos 75% de viabilidade são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão
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38/95 negativas CD133/CD34 não selecionadas com pelo menos 4X108 células viáveis totais e pelo menos 80% de viabilidade são selecionadas para transplantação.
[00108] A separação e o manuseio das frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas podem compreender o monitoramento das unidades cultivadas quanto à segurança e contaminação. Assim, de acordo com modalidades específicas, as frações ou unidades de sangue do cordão com mais de 3,0 Eu/ml de endotoxina e/ou crescimento de bactérias, leveduras ou fungos são excluídas da criopreservação ou, se detectadas em qualquer ponto durante o processo de preparação, o processamento adicional é encerrado e as unidades contaminadas descartadas.
Cultura (expansão ex vivo) de frações selecionadas CD133+/CD34+
[00109] Qualquer um dos métodos para seleção de unidades de sangue do cordão umbilical para expansão ex vivo descritos acima e cada uma de suas modalidades tomadas sozinhas ou em várias combinações pode ser usada para afetar os métodos de cultura (expansão ex vivo) das frações selecionadas CD133+/CD34+ como é descrito nesta seção e nas seções a seguir.
[00110] A nicotinamida (NAM) é um derivado solúvel em água da vitamina B, cujas formas ativas fisiológicas são o dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD+/NADH) e o fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NADP+/NADPH). As formas fisiológicas ativas da NAM servem como coenzima em uma variedade de reações metabólicas importantes. A nicotinamida é adicionalmente conhecida por inibir a atividade enzimática de CD38, afetando assim a via de transdução de sinal de cADPR.
[00111] Os métodos para expansão ex vivo da fração CD133+CD34+ selecionada adequada para expansão e transplantação da presente invenção podem ser realizados fornecendo as células com a própria nicotinamida ou com um análogo de nicotinamida, uma nicotinamida ou um derivado análogo de nicotinamida ou uma nicotinamida ou um metabólito análogo de
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39/95 nicotinamida.
[00112] Como aqui usado, a expressão “análogo de nicotinamida” refere-se a qualquer molécula conhecida por agir de maneira similar à nicotinamida. Exemplos representativos de análogos de nicotinamida incluem, sem limitação, benzamida, nicotinotioamida (o análogo tiol da nicotinamida), ácido nicotínico e ácido oc-amino-3-indolpropiônico. A expressão “um nicotinamida ou um derivado análogo de nicotinamida” referese a qualquer derivado estrutural da própria nicotinamida ou de um análogo de nicotinamida. Exemplos de tais derivados incluem, sem limitação, benzamidas substituídas, nicotinamidas e nicotinotioamidas substituídas e nicotinamidas e nicotintioamidas N-substituídas. A expressão “uma nicotinamida ou um metabólito análogo da nicotinamida” refere-se a produtos derivados da nicotinamida ou de análogos da mesma, tais como, por exemplo, NAD, NADH e NADPH. Em modalidades particulares, a fração CD133+CD34+ selecionada adequada para expansão e transplantação é cultivada com nicotinamida para expansão ex vivo.
[00113] As concentrações finais da nicotinamida ou dos análogos, derivados ou metabólitos da mesma são preferivelmente, dependendo da aplicação específica, nas faixas milimolares. Por exemplo, entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM, entre cerca de 2,5 mM e cerca de 8 mM ou entre cerca de 2,5 mM e cerca de 5 mM.
[00114] De acordo com outras características nas modalidades preferidas da invenção aqui descrita, as condições para a proliferação celular ex vivo compreendem fornecer às células soro, nutrientes e citocinas.
[00115] As citocinas podem ser citocinas de ação precoce. Em algumas modalidades, as citocinas de ação precoce são selecionadas do grupo que compreende o fator de célula-tronco, ligante FLT3, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-6, interleucina-10, interleucina-12, fator de necrose tumoral-oc e trombopoietina. Em modalidades específicas, as
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40/95 citocinas são uma combinação de citocinas, incluindo cada um dos fatores de células-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6.
[00116] De acordo com os métodos da presente invenção, a fração de sangue do cordão CD133+CD34+ selecionada adequada para expansão ex vivo e transplantação é expandida cultivando a primeira fração de células sanguíneas selecionadas compreendendo células selecionadas CD133+CD34+ ex vivo sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições que compreendem o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada um de fator de células-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e, no mesmo meio de cultura, nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 e 10,0 mM.
[00117] Assim, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para preparar uma unidade de sangue do cordão umbilical para transplantação para um sujeito, o método compreendendo:
(a) separação de uma única unidade de sangue do cordão umbilical descongelada adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34; e (b) cultura ex vivo da dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e citocinas, incluindo cada um de fator de células-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM.
[00118] Em algumas modalidades, a única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação para um sujeito é uma unidade de sangue do cordão descongelada selecionada adequada para expansão ex
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41/95 vivo e transplantação para um sujeito de acordo com os métodos aqui descritos para selecionar sangue do cordão umbilical criopreservado para expansão e transplantação para um sujeito. Por exemplo, unidades de sangue de cordão umbilical únicas descongeladas adequadas para transplantação para um sujeito podem ser distinguidas por (i) cerca de 8X106 a cerca de 15X106 células CD34+ totais, (ii) HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLADRBI, alta resolução) com o dito sujeito, (iii) cerca de l,8X109 a cerca de 3,0X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas e (iv) cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[00119] Em algumas modalidades, a primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ selecionadas (a)(i) é uma fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada adequada para expansão ex vivo e transplantação no dito sujeito de acordo com os métodos aqui descritos para selecionar uma fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ adequada para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito. Por exemplo, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ adequada para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito podem ser distinguidas por (i) cerca de 8X106 a cerca de 15X106 células CD34+ totais; (ii) compatibilidade de HLA em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito; (iii) cerca de l,8X109 a cerca de 3,0X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas; e (iv) cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 células nucleadas totais précriopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[00120] Em modalidades adicionais do método da presente invenção, frações ou unidades de sangue do cordão com mais de 3,0 Eu/ml de endotoxina e/ou crescimento de bactérias, leveduras ou bolores no dia 0, dia 7 ou 14 da dita expansão ex vivo são excluídas da cultura (expansão ex vivo).
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[00121] Em outras modalidades, o soro no meio de cultura para expansão da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ adequada para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito compreende 10% de FBS e 50 ng cada de fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6. Em modalidades específicas, o meio de cultura para expansão da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ compreende nicotinamida a 2,5 mM. Em modalidades adicionais, a cultura das células em condições que permitem a proliferação celular compreende o fornecimento de nutrientes, 10% de soro fetal bovino (FBS) e citocinas, incluindo 50 ng de fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida a 2,5 mM. Em algumas modalidades, a nicotinamida é fornecida a 5,0 mM.
[00122] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ adequada para expansão ex vivo e transplantação para um sujeito é cultivada para expansão ex vivo por cultura nas condições aqui descritas por 18 a 25 dias. Em modalidades específicas, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ é cultivada por 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24 ou 25 dias. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ é cultivada para expansão ex vivo por 21 dias.
[00123] Como mencionado aqui, a cultura da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ para expansão ex vivo pode compreender o monitoramento das unidades cultivadas quanto à segurança e contaminação. Assim, de acordo com modalidades específicas, as frações ou unidades de sangue do cordão com mais de 3,0 Eu/ml de endotoxina e/ou crescimento de bactérias, leveduras ou bolores no dia 7 ou no dia 14 da dita expansão ex vivo são excluídas da cultura (expansão ex vivo) ou, se detectada durante o processo de cultura, a cultura (expansão) é encerrada e as unidades contaminadas são descartadas.
Seleção de unidades de sangue do cordão umbilical expandidas ex vivo para transplantação
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[00124] No final da cultura (expansão ex vivo) da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada adequada para expansão ex vivo, a primeira CD133+/CD34+ selecionada cultivada ex vivo pode ser colhida para armazenamento.
[00125] Qualquer um dos métodos para seleção de unidades de sangue do cordão umbilical para expansão ex vivo descritas acima, e para expansão (cultura ex vivo) das unidades de sangue do cordão descritas acima, e cada uma de suas modalidades realizadas isoladamente ou em várias combinações pode ser usada para afetar os métodos para selecionar as frações selecionadas CD133+/CD34+ cultivadas (expandidas ex vivo), conforme descrito nesta seção e nas seções a seguir.
[00126] Antes do armazenamento, a fração de sangue do cordão CD133+CD34+ expandida ex vivo é distinguida por adequação à criopreservação como uma fração de sangue do cordão CD133+CD34+ expandida para transplantação para um sujeito. Assim, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para selecionar frações de células sanguíneas do cordão umbilical cultivadas ex vivo compreendendo células sanguíneas do cordão selecionadas CD133+CD34+ para transplantação para um sujeito, o método compreendendo:
(a) determinar na dita fração de sangue do cordão umbilical cultivada ex vivo após a expansão ex vivo os seguintes parâmetros:
(i) cerca de 8X108 a cerca de 15X108 células viáveis totais;
(ii) cerca de 70% a 85% de viabilidade das células;
(iii)cerca de 7 a 15% de células CD34+;
(v) cerca de 5,6X107 a cerca de 5X108 células CD34+ totais;
(vi) cerca de 2,4X107 a cerca de 2X108 células CD133+ totais;
(vii) cerca de 8X105 a cerca de 25X105 células CD133+/CD38-;
(viii) cerca de 8X107 a cerca de 15X109 células CD 14+
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44/95 totais, (ix) cerca de 2X108 a cerca de 2X109 células CD15+ totais, (x) cerca de 8X107 a cerca de 8X109 células CD1 lb+ totais, (xi) cerca de 3,2X107 a cerca de 3X108 células CDl(a+c)+ totais, (xii) Nenhum micoplasma cultivado ou crescimento de bactérias, leveduras ou bolores, e (b) selecionar ou excluir a dita fração de sangue do cordão umbilical cultivada ex vivo de acordo com os ditos parâmetros,
[00127] selecionando assim uma fração de sangue do cordão umbilical CD133+/CD34+ cultivada ex vivo adequada para transplantação para um sujeito.
[00128] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex vivo com total de cerca de 8X108 a cerca de 15X108 células viáveis totais são selecionadas. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex vivo com total de cerca de 9X108 a cerca de 13X108 células viáveis totais, cerca de 10X108 a cerca de 12X108 ou cerca de 10,5X108 a cerca de 11X108 células viáveis totais são selecionadas para transplantação. Em uma modalidade, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem pelo menos 8X108, pelo menos 10X108, pelo menos 11X108, pelo menos 12X108, pelo menos 13X108, pelo menos 14X108 e pelo menos 15X108 células viáveis totais. Em uma modalidade particular, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem pelo menos 8X108 células viáveis totais. Em uma modalidade particular, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem pelo menos 11,5X108 células viáveis totais. Em uma modalidade particular, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação
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45/95 tem pelo menos 15X108 células viáveis totais.
[00129] Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex vivo com cerca de 70% a cerca de 85% de viabilidade são selecionadas. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex-vivo têm cerca de 71%, cerca de 73%, cerca de 75%, cerca de 78%, cerca de 80%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84% a cerca de 85% viabilidade são selecionadas para transplantação. Em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex vivo têm pelo menos 71%, pelo menos 73%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84% ou pelo menos 85% de viabilidade são selecionadas. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem pelo menos 70% de células viáveis. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem pelo menos 78% de células viáveis. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem pelo menos 83% de células viáveis.
[00130] O teor de células CD133+, CD34+ e CD133+/CD34+, CD133+/CD38-, CD14+, CD15+, CD1 lb+ e CDl(a e c)+ da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo é fundamental para o enxerto bem-sucedido das células sanguíneas do cordão umbilical expandidas transplantadas e, portanto, é um critério central para a seleção do processo de expansão ex vivo.
[00131] Assim, em uma modalidade específica, uma fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma porção total pós-expansão (pós-cultura) de células CD34+ de pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14% ou pelo menos
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15% de células CD34+. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para transplantação tem uma porção total pós-expansão (pós-cultura) de células CD34+ de pelo menos 7%. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para transplantação tem uma porção total pós-expansão (póscultura) de células CD34+ de pelo menos 7,8%. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para transplantação tem uma porção total pós-expansão (pós-cultura) de células CD34+ de pelo menos 9%. Em uma modalidade adicional, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionada para transplantação tem uma porção total pós-expansão (pós-cultura) de células CD34+ de pelo menos 13%.
[00132] Assim, em modalidades particulares, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD34+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 5,6X107 a cerca de 5X108 células CD34+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD34+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 6X107 a cerca de 4X108, cerca de 9X107 a cerca de 3X108, cerca de 1X108 a cerca de 2,5X108, cerca de l,5X108 a cerca de 2X108 de células CD34+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD34+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 5,6X107, pelo menos 6X107, pelo menos 8X107, pelo menos 9X107, pelo menos pelo menos IX108, pelo menos 2X108, pelo menos 3X108, pelo menos 4X108 ou pelo menos 5X108 de células CD34+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD34+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2X108 células CD34+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão
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CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD34+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 8X107 células CD34+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD34+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 5,6X107 células CD34+ totais.
[00133] Em modalidades particulares, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 133+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 2,4X107 a cerca de 2X108 células CD133+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 133+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 3X107 a cerca de IX108, cerca de 5X107 a cerca de 8X107, cerca de 6X107 a cerca de 7X107 de células CD 133+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD133+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2,4X107, pelo menos 3,5X107, pelo menos 5X107, pelo menos 7X107, pelo menos 8X107, pelo menos IX108, pelo menos 1,5X108 ou pelo menos 2X108 de células CD133+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 133+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2,4X107 células CD133+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 133+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 4X107 células CD 133+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 133+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 7,5X107 células CD133+ totais. Em algumas
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48/95 modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida exvivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 133+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos l,2X108 células CD 133+ totais.
[00134] Em modalidades adicionais, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD133+/CD38- pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 8X105 a cerca de 25X105 células CD133+/CD38-. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD133+/CD38- pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 10X105 a cerca de 22X105, cerca de 13X105 a cerca de 20X105 ou cerca de 15X105 a cerca de 17X105 de células CD133+/CD38- totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD133+/CD38- pósexpansão (pós-cultura) de pelo menos 8X105, pelo menos 10X105, pelo menos ll,5X105, pelo menos 13X105, pelo menos 15X105, pelo menos 18X105, pelo menos 20,0X105, pelo menos 22X105 ou pelo menos 25X105 de células CD 133+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD133+/CD38- pós-expansão (póscultura) de pelo menos 13X105. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD133+/CD38- pós-expansão (póscultura) de pelo menos 8X105. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD133+/CD38- pós-expansão (póscultura) de pelo menos 10X105.
[00135] Ainda em modalidades adicionais, a fração de sangue do
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49/95 cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 14+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 8X107 a cerca de 15X108 células CD14+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CD 14+ pós-expansão (póscultura) de cerca de 10X107 a cerca de 10X108, cerca de 12X107 a cerca de 8X108, cerca de 15X107 a cerca de 6X108, cerca de 2X108 a cerca de 5X108, ou cerca de 3X108 a cerca de 4X108 células CD14+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CD 14+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 8X107, pelo menos 10X107, pelo menos 2X108, pelo menos 4X108, pelo menos 6X108, pelo menos 8X108, pelo menos 10,0X108, pelo menos 12X108 ou pelo menos 15X108 células Cl4+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 14+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 8X107. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 14+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2X108. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 14+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 7,5X108.
[00136] Ainda em modalidades adicionais, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 15+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 2X108 a cerca de 2X109 células CD15+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CD 15+ pós-expansão (pós
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50/95 cultura) de cerca de 2,5X108 a cerca de l,5X109, cerca de 4X108 a cerca de 0,5X109, cerca de 6X108 a cerca de 9X108 ou cerca de 7X108 a cerca de 8X108 células CD15+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CD 15+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2X108, pelo menos 4X108, pelo menos 6X108, pelo menos 8X108, pelo menos IX109 ou pelo menos 2X109 células CD 15+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 15+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2X108. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 15+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 6X108. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 15+ pós-expansão (póscultura) de pelo menos 8,5X108. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD 15+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos Ι,ΙΧΙΟ9.
[00137] Ainda em modalidades adicionais, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDllb+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 8X107 a cerca de 8X109 células CDllb+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CDllb+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 1X108 a cerca de 5X109, cerca de 4X108 a cerca de 2X109, cerca de 6X108 a cerca de 1X109 ou cerca de 8X108 a cerca de 9X108 células CDllb+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem
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51/95 contagem total de células CDllb+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 8X107, pelo menos IX108, pelo menos 4X108, pelo menos 6X108, pelo menos 8X108, pelo menos IX109, pelo menos 2X109, pelo menos 4X109, pelo menos 6X109 ou pelo menos 8X109 células Cllb-i- totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CD1 lb-ι- pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 8X107. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDllb-i- pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 10X107. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDllb-i- pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2X108. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDllb-i- pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 5X108. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34 expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDllb-i- pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 3X109.
[00138] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CDl(a e c)+ pós-expansão (pós-cultura) de cerca de 3,2X107 a cerca de 3X108 células CD15+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CDl(a e c)+ pós-expansão (póscultura) de cerca de 4X107 a cerca de IX108, cerca de 6X107 a cerca de 9X107 ou cerca de 7X107 a cerca de 8X107 células CDl(a e c)+. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo selecionada para transplantação tem contagem total de células CDl(a e
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c)+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 3,2X107, pelo menos 4X107, pelo menos 6X107, pelo menos 8X107, pelo menos 1X108 ou pelo menos 3X108 células CDl(a e c)+ totais. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDl(a e c)+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 3,2X107. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDl(a e c)+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 5X107. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDl(a e c)+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 7,3X107. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex-vivo selecionada para transplantação tem uma contagem total de células CDl(a e c)+ pós-expansão (pós-cultura) de pelo menos 2,2X108.
[00139] Exemplos de critérios pós-expansão exemplificativos para seleção de unidades de sangue do cordão umbilical para transplantação ex vivo em um sujeito são apresentados nas Tabelas IX-XII abaixo.
TABELA IX- Critérios para o transplante de sangue do cordão selecionado e expandido ____________________________________________
| Parâmetro | Valor |
| Células viáveis totais | Pelo menos 12Χ108 |
| Viabilidade | Pelo menos 76% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 10% |
| Células CD34+ totais | Pelo menos 7X107 |
| Células CD 133+ totais | Pelo menos 2,9X107 |
| Células CD133+/CD38- totais | Pelo menos 11X105 |
| Células CD 14+ totais | Pelo menos 8X107 |
| Células CD 15+ totais | Pelo menos 4Χ108 |
| Células CD1 lb+ totais | Pelo menos 1Χ108 |
| Células CDl(a e c)+ totais | Pelo menos 8X107 |
TABELA X- Critérios para o transplante de sangue do cordão selecionado e expandido ____________________________________________
| Parâmetro | Valor |
| Células viáveis totais | Pelo menos 8Χ108 |
| Viabilidade | Pelo menos 70% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 7% |
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| Células CD34+ totais | Pelo menos 5,6X107 |
| Células CD 133+ totais | Pelo menos 2,4X107 |
| Células CD133+/CD38- totais | Pelo menos 8X105 |
| Células CD 14+ totais | Pelo menos 8X107 |
| Células CD 15+ totais | Pelo menos 2Χ108 |
| Células CD1 lb+ totais | Pelo menos 8X107 |
| Células CDl(a e c)+ totais | Pelo menos 3,2X107 |
TABELA XI- Critérios para o transplante de sangue do cordão selecionado e expandido
| Parâmetro | Valor |
| Células viáveis totais | Pelo menos 8Χ108 |
| Viabilidade | Pelo menos 80% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 11% |
| Células CD34+ totais | Pelo menos 1Χ108 |
| Células CD 133+ totais | Pelo menos 4X107 |
| Células CD133+/CD38- totais | Pelo menos l,6X106 |
| Células CD 14+ totais | Pelo menos 2Χ108 |
| Células CD 15+ totais | Pelo menos 7Χ108 |
| Células CD1 lb+ totais | Pelo menos l,3X108 |
| Células CDl(a e c)+ totais | Pelo menos 6X107 |
TABELA XII- Critérios para o transplante de sangue do cordão selecionado e expandido
| Parâmetro | Valor |
| Células viáveis totais | Pelo menos 11Χ108 |
| Viabilidade | Pelo menos 72% |
| Fração de células CD34+ | Pelo menos 11% |
| Células CD34+ totais | Pelo menos 6,7X107 |
| Células CD 133+ totais | Pelo menos 5,8X107 |
| Células CD133+/CD38- totais | Pelo menos 9,3X105 |
| Células CD 14+ totais | Pelo menos 11X107 |
| Células CD 15+ totais | Pelo menos 6,9X108 |
| Células CD1 lb+ totais | Pelo menos 21X107 |
| Células CDl(a e c)+ totais | Pelo menos 9,2X107 |
[00140]
Como descrito acima, os parâmetros de segurança e contaminação são monitorados para garantir que nenhuma fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo com micoplasma ou crescimento de bactérias, leveduras ou fungos seja selecionada para transplantação. Assim, em algumas modalidades, as frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas para transplantação estão livres de bactérias, leveduras, mofo e micoplasma após o início da expansão, no dia 7, no dia 14 e na conclusão da expansão.
[00141] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 5,6 X107 células CD34+
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54/95 totais, pelo menos 2,4 X107 células CD133+ totais, pelo menos 8X107 células CD 14+ totais e em pelo menos 3,2X107 células CDl(a e c)+ totais. Em outras modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 10X108 células viáveis totais, pelo menos 9% de células CD34+, pelo menos 5,6 X107 células CD34+ totais, pelo menos 4 X107 células CD133+ totais, pelo menos 2X108 células CD15+ totais, pelo menos 10X107 células CDllb+ totais e pelo menos 5X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00142] Em outras modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 70% de viabilidade das células, pelo menos 7% de células CD34+, pelo menos 8X105 células CD133+/CD38-, pelo menos 2X108 células CD15+ totais e pelo menos 8X107 células CDllb+ totais.
[00143] Em outras modalidades, o aparecimento da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida ex vivo é monitorado. A observação da fração de células CD133+/CD34+ expandida é direcionada para a cor e textura da fração. Em algumas modalidades, as frações de células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo que aparecem amareladas, turvas a opacas sem aglomerados brancos ou partículas estranhas são selecionadas.
[00144] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação são lavadas e suspensas em uma solução de criopreservação, como CryoStor®CS10 (BioLife Solutions, Inc.). A suspensão de células da fração CD133+/CD34+ expandida é transferida para a bolsa de criopreservação (bolsa de congelamento CryoMACS, Miltenyi Biotech), rotulada e congelada usando um congelador de taxa de controle. O armazenamento é feito em nitrogênio líquido (NL).
[00145] Em algumas modalidades, a primeira fração de sangue do
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55/95 cordão CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a segunda fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 não selecionada são criopreservadas separadamente, em nitrogênio líquido.
Transplantação de frações de sangue do cordão selecionadas CD133+/CD34+ cultivadas ex-vivo expandidas e de frações de sangue do cordão negativas CD133/CD34 não selecionadas em um sujeito
[00146] As frações de sangue do cordão CD133+/CD34+ selecionadas expandidas e as frações negativas de CD133/CD34 não selecionadas que foram selecionadas apropriadamente para transplantação podem ser usadas para transplantação em sujeitos que necessitam das mesmas. Qualquer um dos métodos para seleção de unidades de sangue do cordão para expansão ex vivo descritas acima, para expansão (cultura ex vivo) das unidades de sangue do cordão descritas acima e/ou para transplantação após expansão ex vivo e/ou para criopreservação das frações do sangue do cordão, e cada uma de suas modalidades tomadas sozinhas ou em várias combinações podem ser usadas para afetar os métodos de seleção de frações CD133+/CD34+ cultivadas (expandidas ex vivo) selecionadas e frações negativas CD133/CD34 não selecionadas, conforme descrito nesta seção e nas seções a seguir. Será reconhecido que as frações de células sanguíneas do cordão CD133+/CD34+ expandidas ex vivo e negativas CD133/CD34 não cultivadas podem ser selecionadas ou excluídas de acordo com pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais, ou de acordo com todos os parâmetros de seleção aqui descritos.
[00147] Em algumas modalidades, o sujeito que precisa de transplantação está sofrendo de uma doença hematológica. Em algumas modalidades, o sujeito está sofrendo de uma neoplasia hematológica.
[00148] Será reconhecido que os métodos, composições, kits e artigos de fabricação da presente invenção podem ser usados para tratar ou melhorar
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56/95 sintomas de outras indicações, incluindo mas não se limitando a leucemia mieloide crônica, outros distúrbios mieloproliferativos, mieloma múltiplo, anemia aplástica, aplasia pura de glóbulos vermelhos, hemoglobinúria paroxística noturna, anemia de Fanconi, talassemia major, anemia falciforme, imunodeficiência combinada grave (SCID), síndrome de Wiskott-Aldrich, linfo-histiocitose hemofagocítica, erros inatos do metabolismo, epidermólise bolhosa, neutropenia congênita grave, síndrome de Shwachman-Diamond, anemia de Diamond-Blackfan, deficiência de adesão de leucócitos, doenças autoimunes e doença metabólica.
[00149] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 2,4 X107 células CD133+ totais, pelo menos 2X108 células CD15+ totais e pelo menos 3,2X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00150] Em modalidades adicionais, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 83% de viabilidade das células, pelo menos 2X108 células CD 14+ totais, pelo menos 1X108 células CD1 lb+ totais e pelo menos 6X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00151] Em modalidades adicionais, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 83% de viabilidade das células, pelo menos 2X108 células CD 14+ totais, pelo menos 1X108 células CD1 lb+ totais e pelo menos 6X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00152] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 70% de viabilidade, pelo menos 8X105 células CD133+/CD38- totais e pelo menos 8X107 células CDllb+ totais.
[00153] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+
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57/95 expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 70% de viabilidade, pelo menos 8X105 células CD133+/CD38- totais e pelo menos 8X107 células CDllb+ totais.
[00154] Em modalidades adicionais, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm uma fração CD34+ total de pelo menos 7%, pelo menos 8X107 células CD14+ totais e pelo menos 8X107 células CD1 lb+ totais.
Sujeitos
[00155] Como usado aqui, um “sujeito” ou “paciente” pode ser qualquer mamífero, por exemplo, um humano, um primata, camundongo, rato, cachorro, gato, vaca, cavalo, porco, ovelha, cabra, camelo. Em uma modalidade específica, o sujeito é um humano.
[00156] Como usado aqui, um “sujeito em necessidade do mesmo” é um sujeito com a necessidade de transfusão, infusão ou implantação das frações do sangue do cordão da presente invenção para tratar ou melhorar uma doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade, o sujeito tem (foi diagnosticado) ou sofre de uma doença hematológica. Em algumas modalidades, a doença hematológica é um distúrbio proliferativo celular. Em outras modalidades, a doença hematológica é uma neoplasia hematológica.
[00157] Como usado aqui, o termo “risco de” ou “probabilidade de” refere-se à probabilidade de uma ocorrência. Em algumas modalidades, o risco ou probabilidade de uma ocorrência (por exemplo, enxerto ou não enxerto de um enxerto de sangue do cordão, mortalidade sem recidiva e similares) em um sujeito refere-se a um risco calculado a partir de dados comparativos entre grupos que recebem tratamento comparado a grupos que não recebem o mesmo tratamento. Em algumas modalidades, um risco ou probabilidade aumentada ou diminuída reflete a diferença entre os grupos de tratamento e controle em relação ao resultado em consideração. Em algumas
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58/95 modalidades, um aumento ou diminuição no risco ou probabilidade de uma ocorrência ou condição específica é apenas relativo e não expresso em valores numéricos.
[00158] Como usado aqui, o termo “distúrbio proliferativo celular” refere-se a condições nas quais o crescimento não regulado ou anormal, ou ambos, de células pode levar ao desenvolvimento de uma condição ou doença indesejada, que pode ou não ser cancerígena. Distúrbios proliferativos celulares exemplificativos da invenção abrangem uma variedade de condições em que a divisão celular é desregulada. Distúrbios proliferativos celulares exemplificativos incluem, mas não estão limitado a neoplasias, tumores benignos, tumores malignos, condições pré-cancerosas, tumores in situ, tumores encapsulados, tumores metastáticos, tumores líquidos, tumores sólidos, tumores sólidos, tumores imunológicos, tumores hematológicos, cânceres, carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas e células de divisão rápida. O termo “célula de divisão rápida”, como usado aqui, é definido como qualquer célula que se divide a uma taxa que excede ou é maior do que a esperada ou observada entre células vizinhas ou justapostas no mesmo tecido. Um distúrbio proliferativo celular inclui um pré-câncer ou uma condição précancerosa. Um distúrbio proliferativo celular inclui câncer. Em modalidades específicas, os métodos aqui fornecidos são usados para tratar ou aliviar um sintoma de câncer. O termo “câncer” inclui tumores sólidos, bem como tumores e/ou neoplasias hematológicas. Em modalidades preferidas, o sujeito tem (foi diagnosticado) ou sofre de uma neoplasia hematológica. A neoplasia hematológica pode ser selecionada do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC), síndrome mielodisplásica (SMD), linfoma não Hodgkin ou doença de Hodgkin.
[00159] Em modalidades adicionais, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo
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59/95 menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 75% de viabilidade das células, pelo menos 7% de células CD34+, pelo menos 8,1 X107 células CD34+ totais, pelo menos 6X107 células CD133+ totais, pelo menos 3X108 células CD15+ totais, pelo menos 8,7X107 células CDllb+ totais e pelo menos 5X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00160] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 7% de células CD34+, pelo menos 8X105 células CD133+/CD38-, pelo menos 2X108 células CD15+ totais e pelo menos 8X107 células CD1 lb+ totais.
[00161] Em algumas modalidades, os métodos e composições e kits da presente invenção podem ser usados para o tratamento de sujeitos de todas as faixas etárias. Em modalidades específicas, o sujeito ou paciente tem entre 16 e 60 anos de idade.
[00162] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 2,4X107 células CD133+ totais e pelo menos 5,6X107 células CD34+ totais.
[00163] Em modalidades adicionais, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 10X108 células viáveis totais, pelo menos 83% de viabilidade das células e pelo menos 7X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00164] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm uma fração de células CD34+ de pelo menos 7%, pelo menos 8X105 células CD133+/CD38- totais e pelo menos 8X107 células CD14+ totais.
[00165] Em algumas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo pode ter leucemia linfoblástica aguda (LLA) em um dos seguintes estágios: (a) remissão morfológica completa (CRI) de alto risco, definida como um ou
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60/95 mais dos seguintes: presença de t(4;l 1), t(9;22), t(l;19) ou rearranjos MLL t(llq23); leucocitose extrema (leucócitos > 30.000/μί para B-ALL ou > 100.000/μί para T-ALL); falha em alcançar remissão morfológica completa após a primeira terapia de indução; Doença Residual Mínima (DRM) na triagem por citometria de fluxo, ou (b) segunda remissão ou subsequente.
[00166] O sujeito em necessidade pode ter leucemia mieloide aguda (LMA) em um dos seguintes estágios: (a) Primeira remissão morfológica completa (CRI) que não é considerada um risco favorável, sendo o risco favorável definido como um ou mais dos seguintes e ausência de DRM na triagem: t(8,21) sem mutação cKIT; inv(16) ou t(16;6) sem mutação cKIT, cariótipo normal com NPM1 mutado e sem duplicação em tandem interna de FLT-3; cariótipo normal com CEBPA com duas mutações; APL na primeira ou segunda remissão molecular no final da consolidação ou (b) segunda remissão ou subsequente.
[00167] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 70% de viabilidade das células, pelo menos 8X107 células CD 14+ totais e pelo menos 3,2X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00168] Em modalidades adicionais, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm uma fração CD34+ total de pelo menos 7%, pelo menos 8X107 células CD14+ totais e pelo menos 8X107 células CD1 lb+ totais.
[00169] Em modalidades adicionais, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 83% de viabilidade das células, pelo menos 2X108 células CD 14+ totais, pelo menos 1X108 células CD1 lb+ totais e pelo menos 6X107 células CDl(a e c)+ totais.
[00170] O sujeito em necessidade pode ter leucemia mieloide crônica
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61/95 (LMC) em um dos seguintes estágios: (a) Fase crônica com uma ou mais das seguintes características: Falha em obter uma resposta hematológica ou citogênica primária ao nilotinibe ou ao dasatinibe (seguindo os cronogramas europeus da LeukemiaNet). Intolerância a/falha de dois inibidores de tirosina quinase (TKI) e qualquer mutação T315I; (b) Fase acelerada com uma ou mais das seguintes características: Paciente recém-diagnosticado que não obtém resposta ideal aos TKIs, conforme descrito nos cronogramas europeus da LeukemiaNet; Pacientes com TKI progredindo da fase crônica ou (c) uma crise blástica prévia (mieloide e linfoide) atualmente em remissão morfológica completa.
[00171] O sujeito em necessidade pode ter Síndrome Mielodisplásica (SMD) com categoria de risco do Sistema Internacional de Classificação de Prognóstico (IPSS) de INT-1 ou maior. Na triagem da análise morfológica, os pacientes não apresentam mieloblastos circulantes e <10% de mieloblastos na medula óssea. Os pacientes com SMD categorizados como INT-1 na apresentação primária apresentam neutropenia com risco de vida (ANC < 0,5xl09/L) ou trombocitopenia (plaquetas < 30xl09/L).
[00172] O sujeito em necessidade pode ter linfoma não Hodgkin ou doença de Hodgkin com pelo menos uma das seguintes características: (a) progrediu ou não respondeu à quimioterapia inicial e alcançou uma remissão parcial (remissão parcial definida como >50% de redução de doença desde o curso anterior da quimioterapia) até terapia subsequente ou (b) segunda ou remissão completa ou parcial subsequente (remissão parcial definida como >50% de redução da doença no curso anterior da quimioterapia) e candidatos não adequados para transplantação autólogo de células-tronco.
[00173] Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 70% de viabilidade das células, pelo menos 7% de células CD34+, pelo menos 2,4 X107 células CD133+ totais, pelo menos 8X107 células
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CD 14+ totais e em pelo menos 3,2X107 células CDl(a e c)+ totais. Em algumas modalidades, as células CD133+/CD34+ expandidas ex vivo selecionadas adequadas para transplantação têm pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 2X108 células CD14+ totais e pelo menos 8X107 células CDllb+ totais.
[00174] Em algumas modalidades, um sujeito em necessidade do mesmo pode ser definido de acordo com os seguintes critérios: uma pontuação de desempenho de pelo menos 70% por Karnofsky e reservas fisiológicas suficientes, incluindo: a. Cardíaca: Fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) >40% por ecocardiograma, exame de radionuclídeo ou ressonância magnética cardíaca; b. Testes de função pulmonar demonstrando CVF e VEF1 de > 50% do previsto para a idade e cDLCO > 50% do previsto; c. Renal: teste de depuração da creatinina (pela equação de Cockcroft-Gault) >60 mL/min, e d. Hepática: Bilirrubina sérica <2,0 mg/dl; Transaminases hepáticas (ALT e AST) < 3 x limite superior da faixa normal.
[00175] Em algumas modalidades, os sujeitos podem ser excluídos da consideração do tratamento para qualquer um dos seguintes:
1. SMD ou LMC com fibrose “marcada” ou “3+”;
2. LMMC ou SDM/LMMC se sobrepõem;
3. menos de 21 dias se passaram desde o início do último ciclo quimioterápico do paciente e o início do regime preparatório para transplante de células-tronco (agentes intratecais, hidroxiureia, inibidores de tirosina quinase, agentes hipometilantes, rituximabe e lenalidomida não considerados quimioterápicos);
4. toxicidades clinicamente significativas persistentes que tomam o paciente inadequado para transplante;
5. evidência de anticorpos anti-HLA para um perfil candidato a unidade de sangue do cordão umbilical (MFI>3000 para HLA A, B, C ou DRB1);
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6. evidência de infecção por HIV ou sorologia positiva para HIV;
7. evidência de hepatite B ativa, hepatite C ou EBV, conforme determinado por sorologia ou PCR;
8. gravidez, conforme indicado por um teste positivo para gonadotrofina coriônica humana sérica (HCG), ou lactação;
9. neoplasia ativa diferente daquela para a qual o transplante de UCB está sendo realizado dentro de 12 meses após a inscrição no programa de tratamento. E permitida a presença de carcinoma cutâneo de células escamosas ou células basais ou carcinoma cervical in situ completamente ressecado dentro de 12 meses após a inscrição;
10. evidência de infecções bacterianas, fúngicas ou virais não controladas ou doenças concomitantes graves, indicando que o paciente poderia não tolerar a transplantação;
11. pacientes com sinais e sintomas de blastos leucêmicos no sistema nervoso central (SNC);
12. pacientes com um doador relacionado ou não relacionado com HLA compatível de nível 8/8 de alelo e com disponibilidade imediata (cujas células-tronco podem ser coletadas em tempo hábil sem comprometer o resultado do receptor);
13. transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas prévias;
14. alergia a produtos bovinos, gentamicina ou qualquer outro produto que possa interferir no tratamento;
15. psicologicamente incapaz de se submeter a transplante de medula óssea (TMO) com isolamento estrito associado ou histórico documentado de não conformidade médica e/ou doença psiquiátrica e/ou situações sociais que limitariam a conformidade com os requisitos de tratamento, e
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16. inscrito em um ensaio clínico intervencionista ou que recebeu um tratamento de investigação dentro de 30 dias antes da data de tratamento aprovada.
[00176] Em algumas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo foi submetido a terapia mieloablativa ou regime de condicionamento. Em modalidades específicas, o sujeito foi submetido a terapia mieloablativa ou regime de condicionamento antes da transplantação ou administração das composições da presente invenção. O sujeito pode ser submetido a terapia mieloablativa ou regime de condicionamento entre 11 dias (-11) a 2 dias (-2) antes da transplantação ou administração das composições da presente invenção ou, em outro regime, entre 8 dias (-8) a 1 dia (-1) antes da transplantação ou administração das composições da presente invenção, ou entre 7 dias (-7) a 3 dias (-3) antes da transplantação ou administração das composições da presente invenção. A terapia mieloablativa ou o regime de condicionamento pode incluir irradiação corporal total (TBI) e fludarabina e também pode incluir bussulfano, ciclofosfamida ou tiotepa. Em um regime, a dose total de radiação será de 1350 cGy em 8 ou 9 frações ao longo de 5 dias. Duas frações no mesmo dia serão dadas com no mínimo 6 horas de intervalo entre feixes, por exemplo, nos dias -9 a -5 do regime de 11 dias. No regime de 11 dias, a fludarabina (40 mg/m2/dia) será administrada IV, por exemplo, nos dias -5 a -2. A fludarabina será dosada de acordo com o peso corporal ideal ajustado. No regime de 11 dias, Tiotepa (5 mg/kg) é administrada IV nos dias -11 e-10.
[00177] Em um regime de 8 dias, a dose total de radiação será de 1350 cGy em 8 frações ao longo de 4 dias, duas frações no mesmo dia serão dadas com no mínimo 6 horas de intervalo entre feixes, nos dias -4 a -1. A fludarabina 25 mg/m2/dia é administrada durante 60 minutos de infusão intravenosa nos dias -8 a -6. A fludarabina será dosada de acordo com o peso corporal ideal ajustado. Em algumas modalidades, o regime também pode
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65/95 incluir ciclofosfamida. A ciclofosfamida pode ser administrada a 60 mg/kg/dia, conforme o peso corporal ideal ajustado, por exemplo, nos dias -8 e -7 do regime de 8 dias.
[00178] Alguns regimes de condicionamento não incluem TBI. Em um regime exemplificativo de 7 dias, Tiotepa (5mg/kg) é administrada por via intravenosa nos dias -7 e -6, e Bussulfano (3,2 mg/kg ou ajustado para a exposição cumulativa de Bussulfano de 75mg*h/L após 3 dias) é administrado por via intravenosa nos dias -5 a -4. Nesse regime, a fludarabina 50 mg/m2/dia é administrada por 60 minutos em infusões intravenosas nos dias -5 a -3.
[00179] Em algumas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo foi submetido ao regime de profilaxia da doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Em uma modalidade, o sujeito foi submetido ao regime de profilaxia de DECH antes da transplantação ou administração das composições da presente invenção. O sujeito pode ser submetido ao regime de profilaxia da DECH entre 9 dias (-9) a 1 dia (-1) antes da transplantação ou administração das composições da presente invenção. Em outras modalidades, o sujeito tem o regime de profilaxia de DECH pelo menos 3 dias antes (-3) da transplantação ou administração das composições da presente invenção, até pelo menos dia +150. O sujeito pode ser submetido a terapia mieloablativa ou regime de condicionamento ou regime de profilaxia da DECH individualmente ou em combinação. O regime de profilaxia da DECH pode incluir micofenolato de mofetila (MMF) e tacrolimus. Em algumas modalidades, o tacrolimus é administrado via IV a partir do dia -3 até que os medicamentos orais sejam tolerados, depois PO até o dia +150 para atingir o nível sanguíneo de 5-15 ng/ml e o MMF é administrado 1 g TID via IV ou PO (15 mg/kg TID IV se o paciente pesar <50 kg) a partir do dia -3 até pelo menos dia +60.
[00180] Em algumas modalidades, os sujeitos em necessidade do
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66/95 mesmo terão um acesso venoso central a longo prazo apropriado colocado antes do regime de condicionamento. Em algumas modalidades, os sujeitos terão um cateter em túnel com triplo lúmen.
[00181] Em algumas modalidades, os sujeitos podem receber qualquer um ou todos os seguintes: suporte à infusão (por exemplo, difenil-hidramina ou dexclorfeniramina, hidrocortisona e acetaminofeno), citocinas de suporte (por exemplo, G-CSF), produtos sanguíneos conforme necessário, profilaxia antiviral, antibacteriana, PCP e/ou fúngica, vigilância de CMV, EBV e HHV6 e imunoglobulina IV, conforme necessário.
[00182] Em algumas modalidades, os sujeitos recebem todo ou qualquer tratamento adicional para a doença hematológica. O dito tratamento pode ser um tratamento selecionado do grupo que consiste em um tratamento imunossupressor, quimioterapia e radioterapia.
[00183] Assim, em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de uma doença hematológica em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo:
(a) separação de uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34;
(b) cultura ex vivo da dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada um de fator de células-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM;
(c) criopreservação da dita primeira fração de células
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67/95 sanguíneas CD133+/CD34+ selecionadas cultivadas ex-vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionadas não cultivadas da etapa (b), (d) descongelamento da dita primeira fração de células sanguíneas selecionadas cultivadas ex-vivo e da dita fração de células sanguíneas não selecionadas não cultivadas, e (e) transplantar as primeiras frações de células sanguíneas selecionadas ex vivo cultivadas e segundas frações não cultivadas não selecionadas descongeladas da etapa (d) para um sujeito em necessidade das mesmas, tratando assim a dita doença hematológica no dito sujeito.
[00184] Em algumas modalidades, o método de tratamento de uma doença hematológica em um sujeito em necessidade do mesmo consiste em:
(a) separação de uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionadas compreendendo células negativas CD133/CD34;
(b) cultura ex vivo da dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada um de fator de células-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM;
(c) criopreservação da dita primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ selecionadas cultivadas ex-vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionadas não cultivadas da etapa (b), (d) descongelamento da dita primeira fração de células sanguíneas selecionadas cultivadas ex-vivo e da dita fração de células sanguíneas não selecionadas não cultivadas, e
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68/95 (e) transplantar as primeiras frações de células sanguíneas selecionadas ex vivo cultivadas e segundas frações não cultivadas não selecionadas descongeladas da etapa (d) para um sujeito em necessidade das mesmas, tratando assim a dita doença hematológica no dito sujeito.
[00185] Em algumas modalidades, a única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação é distinguida pelos seguintes parâmetros de pré-criopreservação:
(i) pelo menos 8X106 células CD34+ totais;
(ii) HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito;
(iii) cerca de 1,8X109 a cerca de 3,0X109 células nucleadas totais pré-criopreservadas, e (iv)cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
[00186] Em uma modalidade particular, a primeira fração de células sanguíneas cultivada ex vivo criopreservada selecionada e a dita segunda fração não selecionada não cultivada são descongeladas no mesmo dia da transplantação. Em algumas modalidades, a primeira fração CD133+/CD34+ cultivada (expandida) ex vivo criopreservada é mantida congelada até o dia da transplantação. No dia da transplantação, no local clínico, a primeira fração CD133+/CD34+ cultivada (expandida) ex vivo criopreservada é descongelada e reconstituída com a solução de infusão (8% p/v Albumina sérica humana (HSA) e 6,8% p/v Dextrano-40) em um sistema fechado.
[00187] Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 não selecionada da mesma unidade de sangue do cordão é a fração de células que é eluída durante a separação (por exemplo, separação positiva CliniMACS) das células CD133+. Essa fração contém todo o repertório de células imunes, como as células B, T e NK. As células são
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69/95 lavadas e suspensas em solução de criopreservação, CryoStor®CS10 (BioLife Solutions, Inc.) após a eluição da coluna de seleção (por exemplo, coluna CliniMACS), rotuladas e congeladas usando um congelador de taxa de controle. O armazenamento é feito em nitrogênio líquido. A fração negativa CD133/CD34 não selecionada é mantida congelada até o dia da transplantação para o sujeito. No dia da transplantação, a fração negativa CD133/CD34 não selecionada é descongelada e reconstituída com a solução de infusão (8% p/v HSA e 6,8% p/v Dextrano-40) em um sistema fechado. Em algumas modalidades, a solução de infusão é rastreada quanto à adequação para uso com os métodos e composições da presente invenção. Critérios exemplificativos para a seleção da solução de infusão adequada incluem testes de segurança que não indicam crescimento de bactérias, levedura ou bolor, teor de endotoxina menor que 0,5 Eu/ml e aparência clara e livre de partículas estranhas.
[00188] Em algumas modalidades, a solução de infusão é armazenada em bolsas até o uso (por exemplo, transplantação) a 2-8°C.
[00189] Em algumas modalidades específicas, a transplantação de frações do sangue do cordão é precedido por uma avaliação de segurança do sujeito em necessidade no dia da transplantação, geralmente incluindo um exame físico, hemograma completo, química do sangue (por exemplo, pelo menos creatinina sérica, bilirrubina total, fosfatase alcalina, AST, ALT e magnésio), sinais vitais: peso, temperatura, pressão arterial, pulso e frequência respiratória e administração de medicamentos concomitantes, incluindo transfusões de hemácias e plaquetas.
[00190] A infusão das frações de sangue CD133+CD34+ expandidas selecionadas e negativas CD133CD34 não selecionadas no sujeito em necessidade das mesas é tipicamente feita por transfusão através do cateter venoso central do paciente, sujeito às limitações da prática local individual. Em algumas modalidades, a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+
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70/95 selecionada e expandida é infundida primeiro, seguida imediatamente pela infusão da fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 não selecionada (não manipulada). Em outras modalidades, a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 não selecionada (não manipulada) é infundida primeiro, seguida imediatamente pela infusão da fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida selecionada.
[00191] Assim, em algumas modalidades da presente invenção, a transplantação é afetado por infusão em uma solução de infusão no dito paciente, em que a dita primeira fração de células sanguíneas cultivada ex vivo é infundida antes da dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada, enquanto em outras modalidades a segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada é infundida antes da dita primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo.
[00192] Como detalhado acima, tanto a fração de sangue do cordão CD133+/CD34+ expandida selecionada quanto a fração de sangue do cordão negativa CD133/CD34 não selecionada (não manipulada) selecionada adequada para transplantação são examinadas, inter alia, quanto ao conteúdo de células viáveis totais. Em algumas modalidades, a primeira fração de células sanguíneas CD133+CD34+ cultivada ex vivo para infusão no sujeito compreende pelo menos 8X108 células viáveis totais. Em algumas modalidades, a segunda fração de células sanguíneas negativa CD133/CD34 não cultivada para infusão no sujeito compreende pelo menos 4X108 células viáveis totais.
[00193] O método de tratamento da doença hematológica da presente invenção pode ser usado para tratar neoplasias hematológicas, incluindo, entre outras, leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA) e síndrome mielodisplásica (SMD). Também está contemplado o tratamento da Doença de Hodgkin e do Linfoma não Hodgkin. Como usado aqui, o termo “tratar uma doença hematológica”
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71/95 ou “tratar uma neoplasia hematológica” refere-se a reduzir os sintomas ou sinais da doença hematológica. Em algumas modalidades, o tratamento de doenças hematológicas ou uma neoplasia hematológica é avaliado de acordo com, mas não exclusivamente, redução nos sintomas ao longo do tempo, melhoria nos parâmetros clínicos como contagem de neutrófilos e plaquetas, hospitalização reduzida e risco reduzido de recidiva ou mortalidade.
[00194] Assim, de acordo com algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada, compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui o tempo da transplantação ao enxerto de neutrófilos no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão umbilical não manipulado.
[00195] Como usado aqui, o termo “sangue do cordão não manipulado” refere-se ao sangue do cordão que não foi submetido à seleção
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72/95 e/ou expansão conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, o sangue do cordão não manipulado é uma unidade nova ou uma unidade de sangue do cordão criopreservada do banco de sangue do cordão.
[00196] Em algumas modalidades, a transplantação da dita primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e do dito segundo sangue CD133-/CD34- não cultivado diminui o tempo de enxerto de neutrófilos em 5 a 14 dias quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00197] Como usado aqui, o termo “enxerto de neutrófilos” refere-se a alcançar uma contagem absoluta de neutrófilos (CAN) > 0,5 x 109/L em 3 medições consecutivas em dias diferentes com quimerismo subsequente de doador (< 10% de células hospedeiras por quimerismo de sangue periférico), em ou antes de 42 dias após o transplante (e antes da infusão de qualquer produto adicional de células-tronco). Em algumas modalidades, diminuir o tempo para enxerto de neutrófilos refere-se a alcançar uma contagem absoluta de neutrófilos (CAN) > 0,5 x 109/L em 3 medições consecutivas em dias diferentes com quimerismo subsequente de doador (< 10% de células hospedeiras por quimerismo de sangue periférico), em ou antes de 16 dias após o transplante.
[00198] De acordo com algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada, compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco,
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73/95 trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui o tempo da transplantação ao enxerto de plaquetas no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão umbilical não manipulado.
[00199] Em outras modalidades, a transplantação da dita primeira fração de células-tronco/progenitoras sanguíneas hematopoiéticas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada aumenta a probabilidade de enxerto de plaquetas no dito sujeito aos 42 dias após a transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00200] Em modalidades específicas, o termo “enxerto de plaquetas” se refere ao primeiro dia de um mínimo de 3 medições consecutivas em dias diferentes, de modo que o paciente tenha atingido uma contagem de plaquetas >20x109/L sem transfusões de plaquetas nos 7 dias anteriores (contando dia do enxerto como um dos 7 dias anteriores). O primeiro dia das três medições será designado como o dia do enxerto de plaquetas e ocorre antes de qualquer infusão de um segundo produto de célula-tronco.
[00201] De acordo com algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+
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74/95 e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34 não cultivada, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui a probabilidade de não enxerto no dia 42 após a transplantação no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Em modalidades específicas, o termo “falha primária do enxerto”, ou “não enxerto” refere-se à falha em atingir o enxerto de neutrófilos até o dia 42, conforme descrito acima. O requisito para a infusão de um segundo produto de célula-tronco no sujeito no dia 42 ou antes do dia 42 após a transplantação também é considerado falha primária do enxerto. No entanto, a necessidade de infusão de um produto adicional de células-tronco após enxerto de neutrófilos documentado pode ser considerada falha secundária do enxerto, mesmo que ocorra no dia 42 ou antes do dia 42 após a transplantação. A data da falha primária do enxerto será designada como dia 43 após o transplante.
[00202] Em outras modalidades, a transplantação da dita primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita
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75/95 segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada para um sujeito em necessidade das mesmas, de acordo com os métodos da presente invenção, diminui a probabilidade de falha secundária do enxerto ou não enxerto secundário quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Em modalidades específicas, o termo “falha secundária do enxerto” ou “não enxerto” refere-se ao enxerto de neutrófilos documentado, seguido por neutropenia grave (<0,5 x 109/L para três ou mais valores laboratoriais consecutivos em dias separados) com celularidade da medula <5%, sem melhora subsequente ocorrendo espontaneamente ou após tratamento com fator de crescimento. A infusão de um produto adicional de células-tronco após enxerto de neutrófilos documentado é considerada falha secundária do enxerto. O início do primeiro dia de neutropenia grave, conforme definido acima, ou a data de infusão adicional de células-tronco será designada a data da falha secundária do enxerto.
[00203] De acordo com algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira
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76/95 fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34 não cultivada, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui a probabilidade de mortalidade sem recidiva após a transplantação no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Como usado aqui, o termo “mortalidade sem recidiva” refere-se a qualquer morte não precedida por recidiva da doença ou das doenças hematológicas do sujeito.
[00204] Em algumas modalidades, a transplantação da dita primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada diminui a probabilidade de mortalidade sem recidiva aos 180 a 210 dias após a transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00205] Em algumas modalidades, a transplantação da dita primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada diminui o risco de mortalidade sem recidiva em 1 ano, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Em algumas modalidades, a transplantação da dita primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada de acordo com os métodos da presente invenção diminui o risco de mortalidade sem recidiva em 15 meses após o ano da transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00206] De acordo com algumas modalidades do método da presente
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77/95 invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34 não cultivada, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui a duração da hospitalização no dito sujeito nos primeiros 100 dias após a transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Como usado aqui, o termo “duração da hospitalização” refere-se ao número total de dias desde o transplante até a primeira alta do hospital.
[00207] Em algumas modalidades, a transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada diminui a duração da hospitalização após a transplantação em 5 a 30 dias, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Em algumas modalidades, a transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração
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78/95 de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada aumenta o número de dias de vida e fora do hospital após a transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Dias de vida e fora do hospital, como usados aqui, são definidos como dias completos (dias corridos) em que o paciente estava vivo e não foi hospitalizado.
[00208] De acordo com algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34 não cultivada, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui o risco de infecções fúngicas invasivas ou bacterianas grau 2/3 após a transplantação no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. A classificação de infecções fúngicas invasivas e/ou bacterianas é bem conhecida na técnica. Os sinais de infecções
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79/95 bacterianas de grau 3 incluem, mas não se limitam a bacteremia com envolvimento profundo de órgãos (por exemplo, com infiltrados pulmonares novos ou agravados; endocardite), sepse grave com bacteremia, fascite com desbridamento, pneumonia com intubação, abscesso cerebral ou meningite sem bacteremia e fezes positivas para toxina de Difficile com dilatação tóxica ou insuficiência renal com/sem diarréia. Os sinais de infecções fúngicas de grau 3 incluem, mas não se limitam a fungemia, incluindo candidemia, infecções fúngicas invasivas comprovadas ou prováveis (por exemplo, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Scedosporium), infecções disseminadas (definidas como pneumonia multifocal, presença de antígeno urinário ou sanguíneo, e/ou envolvimento do SNC) com histoplasmose, blastomicose, coccidiomicose ou pneumonia por Cryptococcus e Pneumocystis jiroveci (independentemente do nível de PaO2).
[00209] Em algumas modalidades, a transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada de acordo com os métodos da presente invenção diminui o risco de infecções fúngicas invasivas ou bacterianas de grau 2/3 até 100 dias após a transplantação no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00210] De acordo com algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma
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80/95 combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34 não cultivada, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui o risco de doença do enxerto contra o hospedeiro aguda grau ΠΙ-IV no dito sujeito aos 100 dias após a transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado. Em algumas modalidades, a transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD 133/CD34- não cultivada de acordo com os métodos da presente invenção diminui o risco de doença do enxerto contra o hospedeiro aguda grau III-IV no dito sujeito aos 180 dias após a transplantação no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00211] Em algumas modalidades, a transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e da dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada de acordo com os métodos da presente invenção diminui o risco de doença do enxerto contra o hospedeiro crônica (leve/moderada/grave) no dito sujeito aos 180 dias ou 1 ano após a transplantação no dito sujeito, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00212] Como usado aqui, o termo “DECH aguda” refere-se à doença do enxerto contra o hospedeiro aguda, ocorrendo mais cedo após a
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81/95 transplantação, e DECHc ou crônica refere-se à doença do enxerto contra o hospedeiro crônica, presente posteriormente, após o ponto de corte de DECH aguda pós-transplantação. Em algumas modalidades, a DECH aguda é classificada de acordo com a Conferência de Consenso sobre classificação de DECH aguda (ver Przepiorka et al., Bone Marrow Transplant 1995, 15:825828), e a DECHc é classificada de acordo com os critérios de consenso do NIH para a classificação de DECHc (ver Jagasia et al, Biol. Blood Marrow Transplant, 2015 21:389-401).
[00213] Em algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34 não cultivada, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas aumenta a probabilidade de sobrevida livre de doença em 15 meses após a transplantação, aumenta a probabilidade de sobrevida geral em 210 dias e/ou 15 meses após a transplantação, melhora
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82/95 a reconstituição imunológica (números e proporções de diferentes subpopulações de linfócitos) no dito sujeito, por exemplo, aos 28, 70, 100, 180 e 365 dias após a transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00214] Em algumas modalidades do método da presente invenção, separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de células sanguíneas selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34; cultivar ex vivo a dita primeira fração de células sanguíneas compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas, incluindo cada fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM e 10 mM; criopreservar a dita fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada; descongelar a dita primeira fração de células sanguíneas selecionada CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração não selecionada negativa CD133/CD34 não cultivada, e transplantar a primeira fração de células sanguíneas selecionada cultivada ex vivo e a segunda fração não selecionada não cultivada descongeladas para um sujeito em necessidade das mesmas diminui a probabilidade de recidiva da doença e mortalidade por recidiva no dito sujeito após a transplantação, quando comparado à transplantação de uma unidade única ou dupla de sangue do cordão não manipulado.
[00215] Em algumas modalidades, a recidiva da doença é definida de acordo com os seguintes critérios:
Recidiva de neoplasia - A recidiva é definida por evidências
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83/95 morfológicas ou citogenéticas de LMA, LLA, LMC ou SMD consistentes com as características pré-transplante.
[00216] Doença residual mínima - a doença residual mínima (DRM) é definida pela única evidência de células malignas por citometria de fluxo, ou hibridização fluorescente in situ (FISH), ou Southern blot ou Western blot, ou reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outras técnicas, na ausência de evidência morfológica ou citogenética de doença no sangue ou na medula. A evidência de doença residual mínima por si só não é suficiente para atender à definição de recidiva; no entanto, a doença residual mínima que progride pode ser considerada como recidiva.
[00217] Leucemia aguda - Recidiva pode ser definida como qualquer um dos seguintes:
> 5% de blastos na medula, não atribuídos a outras causas (por exemplo, regeneração da medula óssea)
[00218] O aparecimento de novas alterações displásicas na medula óssea, não atribuídas a outras causas.
[00219] Reaparecimento de blastos leucêmicos no sangue periférico.
[00220] Reaparecimento de marcador citogenético ou molecular anterior da doença presente antes da transplantação.
[00221] O desenvolvimento de leucemia extramedular ou células leucêmicas no líquido cefalorraquidiano.
[00222] A instituição de qualquer terapia em resposta à detecção de DRM, incluindo a retirada da terapia imunossupressora ou a adição de inibidores de tirosina quinase ou agentes hipometilantes, será considerada evidência de recidiva, independentemente de os critérios descritos acima serem atendidos.
Leucemia Mieloide Crônica (LMC)
[00223] A recidiva hematológica pode ser diagnosticada quando:
1. células hematopoiéticas imaturas são persistentemente
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84/95 documentadas no sangue periférico; ou,
2. há hiperplasia mieloide na medula óssea na presença de recidiva citogenética.
[00224] A recidiva citogenética pode ser diagnosticada quando:
1. 50% das metáfases apresentam a translocação característica (9; 22) com pelo menos dez metáfases analisadas; ou,
2. pelo menos uma metáfase apresenta a translocação (9; 22) em cada um dos dois exames consecutivos separados com pelo menos um mês de intervalo, independentemente do número de metáfases analisadas. A data do primeiro teste será considerada a data da recidiva.
SDM
[00225] A recidiva pode ser definida como qualquer um dos seguintes: cumprimento dos critérios acima para evolução para leucemia aguda; ou, reaparecimento de anormalidades morfológicas prétransplante, detectadas em duas amostras consecutivas de medula óssea colhidas com um intervalo de pelo menos um mês (a data do primeiro teste será considerada a data da recidiva); ou, reaparecimento de anormalidade citogenética pré-transplante em pelo menos uma metáfase em cada um dos dois exames consecutivos separados com pelo menos um mês de intervalo, independentemente do número de metáfases analisadas.
[00226] A instituição de qualquer terapia em resposta à detecção de DRM, incluindo a retirada da terapia imunos supres sora ou tratamento com agentes hipometilantes, é considerada evidência de recidiva, independentemente de os critérios descritos acima serem atendidos.
[00227] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um artigo de fabricação, uma composição ou kit compreendendo um material de acondicionamento e frações de células sanguíneas do cordão umbilical,
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85/95 compreendendo:
(i) uma primeira fração de células sanguíneas adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células sanguíneas do cordão selecionadas CD133+/CD34+ cultivadas ex vivo sob condições que permitem a proliferação celular, as ditas condições compreendendo o fornecimento de nutrientes, soro e uma combinação de citocinas incluindo cada um de fator de célula-tronco, trombopoietina, ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM a 10 mM; e (ii) uma segunda fração de células sanguíneas não cultivada e não selecionada adequada para transplantação para um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células negativas CD133/CD34, em que o dito material de acondicionamento compreende um rótulo ou bula indicando que as ditas primeira e segunda populações de células sanguíneas do cordão umbilical são para o tratamento de uma doença hematológica em um sujeito em necessidade das mesmas.
[00228] Em algumas modalidades, o artigo de fabricação, composição ou kit da presente invenção compreende adicionalmente instruções para administrar a (i) primeira fração de células sanguíneas adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células sanguíneas do cordão selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) a segunda fração de células sanguíneas não cultivada e não selecionada adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células negativas CD133/CD34 a um sujeito em necessidade da mesma.
[00229] Em algumas modalidades do artigo de fabricação, composição ou kit da presente invenção, a (i) primeira fração de células sanguíneas adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células sanguíneas do cordão selecionadas CD133+/CD34+ compreende pelo menos 8X108 células viáveis totais. Em algumas modalidades, a primeira fração de sangue do cordão selecionada
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CD133+/CD34+ compreende pelo menos 10X108 células viáveis totais, pelo menos 15X108 células viáveis totais, pelo menos 20X108 células viáveis totais ou pelo menos 25XIO8 células viáveis totais. Em algumas modalidades do artigo de fabricação, composição ou kit da presente invenção, a (ii) segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células negativas CD133/CD34 compreende 4X108 células viáveis totais. Em algumas modalidades, a segunda fração de células sanguíneas não selecionada não cultivada adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células negativas CD133/CD34 compreende pelo menos 6X108 células viáveis totais, pelo menos 8X108 células viáveis totais, pelo menos 10X108 células viáveis totais ou pelo menos 15X108 células viáveis totais.
[00230] Em algumas modalidades do artigo de fabricação, composição ou kit da presente invenção, a (i) primeira fração de células sanguíneas adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células sanguíneas do cordão selecionadas CD133+/CD34+ e a (ii) segunda fração de células sanguíneas não cultivada e não selecionada adequada para transplantação em um sujeito em necessidade da mesma compreendendo células negativas CD133/CD34 são providas como frações de células sanguíneas do cordão criopreservadas.
[00231] Populações celulares selecionadas da presente invenção podem ser fornecidas per se, juntamente com o meio de cultura que contém as mesmas, isoladas do meio de cultura e combinadas com um carreador farmaceuticamente aceitável, bem como com agentes adicionais que podem promover o enxerto celular e/ou a função do órgão (por exemplo, agentes imunossupressores, antibióticos, fator de crescimento). Portanto, as populações de células da invenção podem ser administradas em um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável, como solução salina estéril e
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87/95 soluções tampão aquosas. O uso de tais carreadores e diluentes é bem conhecida na técnica.
[00232] As composições da presente invenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo dispensador, como um kit ou artigo de fabricação aprovado pela FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o ingrediente ativo (por exemplo, células). A embalagem pode, por exemplo, compreender folhas de metal ou plástico, como uma embalagem em blister. A embalagem ou o dispositivo dispensador pode ser acompanhado de instruções para administração. A embalagem ou o dispositivo dispensador também pode ser acompanhado por um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, aviso que reflete a aprovação pela agência da forma das composições para administração humana ou veterinária. Esse aviso, por exemplo, pode incluir rotulagem aprovada pela Food and Drug Administration dos EUA para fármacos prescritos ou de uma bula de produto aprovado. As composições compreendendo uma preparação da invenção formulada em um carreador farmaceuticamente aceitável também podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para o tratamento de uma condição indicada, como mais detalhado acima.
[00233] As células preparadas de acordo com os métodos da presente invenção podem ser administradas ao sujeito per se, ou em uma composição farmacêutica onde é misturada com carreadores ou excipientes adequados.
[00234] Como usado aqui, uma “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação de um ou mais dos ingredientes ativos aqui descritos com outros componentes químicos, tais como carreadores e excipientes fisiologicamente adequados. O objetivo de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.
[00235] A seguir, as expressões “carreador fisiologicamente aceitável” e “carreador farmaceuticamente aceitável”, que podem ser usadas de forma
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88/95 intercambiável, referem-se a um carreador ou um diluente que não causa irritação significativa a um organismo e não revoga a atividade biológica e as propriedades do composto administrado. Um adjuvante está incluído nessas expressões.
[00236] Aqui, o termo “excipiente” refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração de um ingrediente ativo. As técnicas para formulação e administração de fármacos podem ser encontradas na edição mais recente da “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, que é aqui totalmente incorporada por referência.
[00237] Assim, as composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais carreadores fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos ingredientes ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.
[00238] Para injeção, os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão fisiológico de sal.
[00239] As composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto da presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Mais especificamente, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade de ingredientes ativos (por exemplo, células CD133+/CD34+ expandidas) eficazes para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas de um distúrbio (por exemplo, leucemia) ou prolongar a sobrevida do sujeito a ser tratado.
[00240] A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz
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89/95 está dentro da capacidade dos versados na técnica, especialmente à luz da descrição detalhada fornecida neste documento.
[00241] A toxicidade e eficácia terapêutica dos ingredientes ativos aqui descritos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, em culturas celulares ou animais experimentais. Os dados obtidos a partir desses ensaios in vitro e de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. A formulação exata, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico em vista da condição do paciente. (Ver, por exemplo, Fingí, E. et al. (1975), “The Pharmacological Basis of Therapeutics,” Ch. 1, p.l.)
[00242] Dependendo da gravidade e capacidade de resposta da condição a ser tratada, a dosagem pode ser de uma única ou de várias administrações. A quantidade de uma composição a ser administrada dependerá, é claro, do sujeito a ser tratado, da gravidade da dor, do modo de administração, do julgamento do médico prescritor, etc.
Experiência clínica com transplantação
[00243] Avaliação do enxerto de plaquetas em pacientes humanos recebendo transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada de acordo com os métodos da presente invenção indicam enxerto de plaquetas bem-sucedido, e em menos dias do que foi observado com a transplantação de unidades únicas ou duplas de sangue do cordão não manipulado.
[00244] Em um ensaio clínico envolvendo 36 pacientes com neoplasias hematológicas recebendo transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada de acordo com os métodos
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90/95 da presente invenção, o tempo para o enxerto de plaquetas foi determinado quanto ao intervalo entre a transplantação e o primeiro dia de no mínimo três medições consecutivas em dias diferentes nos quais o paciente alcançou uma contagem de plaquetas >20x109/L sem transfusões de plaquetas nos 7 dias anteriores (contando o dia do enxerto como um dos 7 dias anteriores). O primeiro dia das três medições foi então designado como o dia do enxerto de plaquetas, ocorrendo antes de qualquer infusão de um segundo produto de células-tronco. Nos pacientes com enxerto de plaquetas bem-sucedido (no momento do monitoramento), o tempo médio para enxerto de plaquetas foi de 34 dias (IC 95% :32-42 dias) (p<0,001) para pacientes que receberam transplantação de acordo com os métodos da presente invenção. O tempo para enxerto de plaquetas nas coortes comparadoras (na literatura) é de 46 dias (IC 95%:42-50 dias).
[00245] Quando as contagens individuais de plaquetas de pacientes foram analisadas de acordo com os parâmetros pré-enxerto, foi observada uma correlação altamente significativa estatisticamente entre o número de células viáveis totais infundidas e o tempo de enxerto. A Tabela XIII representa a razão da probabilidade de obter enxerto a qualquer momento entre pacientes com diferentes valores do número total de células viáveis (“modelo proporcional de riscos de subdistribuição”). O baixo “valor-p” (pr>ChiSq) para cálculos totais e winsorized suporta a hipótese de que o número total aumentado de células viáveis leva a um enxerto de plaquetas mais rápido usando o método de transplantação reivindicado.
Tabela XIII: Modelo proporcional de riscos de subdistribuição para enxerto de plaquetas com número total de células viáveis totais
| Covariáv eis | Cias se | Estimati va de parâmet ros | Erro padrã 0 | Quiquadr ado | Pr > Chi Sq______ | Razão de risco de subdistribuiç ão | Limite de confiança mais baixo da razão de risco de 95% | Limites de confiança mais altos da razão de risco de 95% |
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| Covariáv eis | Cias se | Estimati va de parâmet ros | Erro padrã 0 | Quiquadr ado | Pr > Chi Sq | Razão de risco de subdistribuiç ão | Limite de confiança mais baixo da razão de risco de 95% | Limites de confiança mais altos da razão de risco de 95% |
| Número total de células viáveis | 0,28221 | 0,0859 8 | 10,774 6 | 0,001 | 1,326 | 1,120 | 1,569 | |
| I-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-: | ||||||||
| I-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-: | ||||||||
| Número total de células viáveis (winsorize d*) | 0,38293 | 0,1545 3 | 6,1405 | 0,013 | 1,467 | 1,083 | 1,985 |
*Dados winsorized são aqueles em que os valores extremos foram limitados para eliminar valores de distorção espúrios.
[00246] Quando os dados de enxerto de plaquetas foram analisados usando um modelo de risco específico de causa, o valor p para o conjunto de dados winsorized caiu um pouco abaixo da probabilidade de 95% (Tabela XIV):
Tabela XIV: Modelo de riscos específicos de causa para enxerto de plaquetas com número total de células viáveis totais________________
| Covariá veis | Classe | Estimat iva de parâme tros | Erro padrão | Quiquadra do | Pr>Ch iSq | Razão de risco específi co de causa | Limite de confian ça mais baixo da razão de risco de 95% | Limites de confian ça mais altos da razão de risco de 95% |
| Número total de células viáveis | 0,28811 | 0,14414 | 3,9954 | 0,046 | 1,334 | 1,006 | 1,769 | |
| Número total de células viáveis (winsori zed*) | 0,38608 | 0,20432 | 3,5706 | 0,059 | 1,471 | 0,986 | 2,196 |
[00247] Quando os dados de tempo para enxerto de plaquetas de pacientes recebendo transplantação da primeira fração de células sanguíneas CD133+/CD34+ cultivada ex vivo e a dita segunda fração de células
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92/95 sanguíneas CD133-/CD34- não cultivada de acordo com os métodos da presente invenção foram analisados com o parâmetro adicional células viáveis totais (CVT) infundidas por quilograma de peso do paciente, a correlação entre o número de células viáveis totais/kg infundidas e o tempo para enxerto foi altamente significativo estatisticamente quando o enxerto de plaquetas foi tratado como uma variável contínua (CVT/Kg e CVT/Kg winsorized) (Tabela XV). A correlação permaneceu altamente significativa quando os dados foram divididos em três grupos e o quartil mais alto de valores foi comparado com os do quartil mais baixo (ver “>Q3”, Tabela XV).
Tabela XV: Modelo proporcional de risco de subdistribuição para
| enxerto de plaquetas com número total de células viáveis | totais/kg | |||||||
| Covariáve is | Class e | Estimativ a de parâmetr os | Erro padrã 0 | Quiquadrad 0 | Pr > ChiS q | Razão de risco de subdistribuiç ão | Limite de confianç a mais baixo da razão de risco de 95% | Limites de confianç a mais altos da razão de risco de 95% |
| Número total de células viáveis/kg | 0,19959 | 0,0558 6 | 12,7686 | <0,001 | 1,221 | 1,094 | 1,362 | |
| Número total de células viáveis/kg (winsorize d) | 0,31055 | 0,0712 2 | 19,0150 | <0,001 | 1,364 | 1,186 | 1,569 | |
| I-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-: | ||||||||
| Número total de células viáveis/kg (3 classes*) | >Q3 | 1,52637 | 0,3860 0 | 15,6369 | <0,001 | 4,601 | 2,159 | 9,805 |
*”3 classes” (>Q3”): Os dados foram divididos em três categorias (“classes”) - quartil superior, dois quartis médios e quartil inferior, e o quartil superior foi comparado com o inferior.
[00248] Quando os dados de CVT/Kg v. tempo de enxerto de plaquetas foram analisados usando um modelo de risco específico de causa, as correlações permaneceram altamente significativas para todos os três valores de CVT/Kg, CVT/Kg-winsorized e CVT/Kg de >Q3 (quartis maiores v
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93/95 menores) (Tabela XVI):
Tabela XVI: Modelos de riscos específicos de causa para enxerto de plaquetas com número total de células viáveis totais/kg
| Covariávei s | Class e | Estimativa de parâmetro s | Erro padrão | Quiquadrad 0 | Pr > ChiS q | Razão de risco específic o de causa | Limite de confianç a mais baixo da razão de risco de 95% | Limites de confianç a mais altos da razão de risco de 95% |
| Número total de células viáveis/kg | 0,18866 | 0,0758 4 | 6,1879 | 0,013 | 1,208 | 1,041 | 1,401 | |
| I-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:- | ||||||||
| Número total de células viáveis/kg (winsorized ) | 0,29125 | 0,1140 9 | 6,5173 | 0,011 | 1,338 | 1,070 | 1,673 | |
| I-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:- | ||||||||
| Número total de células viáveis/kg (3 classes) | >Q3 | 1,41491 | 0,5451 3 | 6,7368 | 0,009 | 4,116 | 1,414 | 11,981 |
[00249] O tempo para o enxerto de plaquetas após a transplantação é de importância crítica, pois a trombocitopenia prolongada representa um fator de risco para a sobrevida dos receptores de transplante. Tomados em conjunto, os resultados encorajadores analisados aqui refletem enxerto eficiente de plaquetas nos pacientes com neoplasias hematológicas recebendo transplantação de acordo com os métodos da presente invenção, com tempo significativamente reduzido para atingir o enxerto (mediana de 34 dias (IC95%:32-42 dias), comparado aos tempos típicos da recuperação plaquetária relatada para pacientes transplantados com unidades únicas ou duplas de sangue não manipulado (ver, por exemplo, Barker et al. 2015, Brit J Hemat 168:405: mediana de 49 dias (IC 95%:31-320 dias para enxerto de plaquetas com transplantação de sangue do cordão de unidade dupla).
[00250] Como usado aqui, o termo “cerca de” refere-se a ± 10 %.
[00251] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”,
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94/95 “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significam “incluindo, mas não limitado a”.
[00252] O termo “consistindo em” significa “incluindo e limitado a”.
[00253] O termo “consistindo essencialmente em” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, do método ou da estrutura reivindicada.
[00254] Como usada aqui, a forma singular “um”, “uma”, “o” e “a” inclui referências plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.
[00255] Ao longo deste pedido, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo descrito especificamente todos os possíveis subintervalos, bem como valores numéricos individuais dentro desse intervalo. Por exemplo, a descrição de um intervalo de 1 a 6 deve ser considerada como tendo subintervalos especificamente descritos, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, a de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro desse intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude do intervalo.
[00256] Sempre que um intervalo numérico é aqui indicado, pretendese incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro do intervalo indicado. As expressões “variando/varia entre” um primeiro número de indicação e um segundo número de indicação e “variando/varia de” um primeiro número de indicação “a” um segundo número de indicação são
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95/95 usadas aqui de forma intercambiável e devem incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e integrais entre os mesmos.
[00257] Como usado aqui, o termo “método” refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa incluindo, mas não limitado a maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou prontamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.
[00258] E reconhecido que certas características da invenção, que são, por clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, podem também ser providas em combinação em uma única modalidade. Inversamente, várias características da invenção, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, podem também ser providas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Determinados recursos descritos no contexto de várias modalidades não devem ser considerados recursos essenciais dessas modalidades, a menos que a modalidade seja inoperante sem esses elementos.
Claims (24)
1. Método para selecionar uma unidade de sangue do cordão umbilical descongelada para transplantação e expansão ex-vivo em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende determinar viabilidade percentual das células na dita unidade de sangue do cordão umbilical descongelada e selecionar unidades tendo cerca de 40% a cerca de 85% de viabilidade antes da separação da dita unidade de sangue do cordão em frações CD133+/CD34+ e CD/133-/CD34-, selecionando assim uma unidade do cordão umbilical descongelada adequada para transplantação e expansão ex-vivo no dito sujeito.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende selecionar unidades tendo cerca de 40% a cerca de 70% de viabilidade.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) separar a dita unidade de sangue do cordão umbilical descongelada selecionada adequada para transplantação de expansão ex-vivo no dito sujeito em (i) uma primeira fração de célula sanguínea selecionada compreendendo células selecionadas CD133+/CD34+ e (ii) uma segunda fração de célula sanguínea não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34, (b) determinar na dita primeira fração CD133+/CD34+ selecionada os seguintes parâmetros pós-separação:
(i) cerca de 20X105 a cerca de 75X105 de células totais;
(ii) cerca de 70% a cerca de 85% de viabilidade;
(iii) cerca de 70% a cerca de 85% de células CD133+;
(iv) cerca de 70% a cerca de 85% de células CD34+;
(v) cerca de 0,02 a cerca de 1 % de rendimento após seleção de CD133+/CD34+;
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2/7 (vi) cerca de 15 a cerca de 75 CFU por 1000 células, e (vii) menos do que 3 Eu/ml de endotoxina, e (c) selecionar ou excluir a dita primeira fração CD133+/CD34+ selecionada;
conforme os ditos parâmetros, selecionando assim uma fração sanguínea do cordão CD133+/CD34+ adequada para transplantação e expansão ex-vivo no dito sujeito.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita separação de (a) compreende seleção de esfera imunomagnética para CD133+.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a segunda fração de célula sanguínea não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34 compreende menos do que 0,5% de células CD133+/CD34+.
6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a segunda fração de célula sanguínea não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34 compreende menos do que 0,01% de células CD133+/CD34+.
7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a segunda fração de célula sanguínea não selecionada compreendendo células negativas CD133/CD34 compreende células imunes incluindo linfócitos T, linfócitos B e células exterminadoras naturais (NK).
8. Método para preparar uma unidade de sangue do cordão umbilical para transplantação em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) separar uma única unidade de sangue do cordão umbilical descongelada selecionada adequada para transplantação no dito sujeito em (i) uma primeira fração de célula sanguínea selecionada compreendendo células
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CD133+/CD34+ selecionadas e (ii) uma segunda fração de célula sanguínea não selecionada compreendendo células CD133/CD34 negativas; e (b) cultivar ex vivo a dita primeira fração de célula sanguínea compreendendo células CD133+/CD34+ selecionadas sob condições que permitem proliferação celular, as ditas condições compreendem fornecer nutrientes, soro e citocinas incluindo cada dentre fator de células-tronco, trombopoietina e ligante FLt3 e IL-6 e nicotinamida em uma quantidade entre 1,0 mM a 10 mM.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita primeira fração de célula sanguínea CD133+/CD34+ selecionada (a)(i) é uma fração de célula sanguínea do cordão CD133+/CD34+ selecionada adequada para transplantação e expansão exvivo no dito sujeito conforme o método como definido na reivindicação 3 ou 4.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente excluir unidades tendo mais do que 3,0 Eu/ml de endotoxina e/ou crescimento bacteriano, de levedura ou de mofo no dia 7 ou no dia 14 da dita expansão ex-vivo.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a dita única unidade de sangue do cordão umbilical adequada para transplantação é distinguida pelos seguintes parâmetros de pré-criopreservação:
(i) cerca de 8X106 a cerca de 15X106 de células CD34+ totais;
(ii) HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito;
(iii) cerca de l,8X109 a cerca de 3,0X109 de células nucleadas totais pré-criopreservadas; e (iv) cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 de células nucleadas
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4/7 totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 all, caracterizado pelo fato de que o dito soro compreende 10% de FBS.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que as ditas citocinas compreendem 50 ng cada dentre fator de células-tronco, trombopoietina, ligante de FLt3 e IL-6.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que a dita nicotinamida é provida a 2,5 mM.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que a dita cultivação ex-vivo é afetada por 18 a 25 dias.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente colheita da dita primeira fração CD133+/CD34+ selecionada cultivada ex-vivo após 19 a 23 dias em cultura.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente colheita da dita primeira fração CD133+/CD34+ selecionada cultivada ex-vivo após 21 dias em cultura.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente criopreservar separadamente a dita primeira fração de célula sanguínea selecionada cultivada ex-vivo compreendendo células CD133+/CD34+ selecionadas e a dita segunda fração de célula sanguínea não selecionada compreendendo células CD133/CD34 negativas.
19. Método para selecionar frações de célula sanguínea do cordão umbilical cultivadas ex-vivo que compreendem células sanguíneas do cordão CD133+/CD34+ selecionadas para transplantação em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende:
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5/7 (a) determinar, na dita fração sanguínea do cordão umbilical cultivada ex-vivo, após expansão ex-vivo, os seguintes parâmetros:
(i) cerca de 8X108 a cerca de 15X108 de células totais viáveis;
(ii) cerca de 70% a 85% de viabilidade das células;
(iii) cerca de 7 a 15% de células CD34+;
(iv) cerca de 5,6X107 a cerca de 5X108 de células CD34+ totais;
(v) cerca de 2,4X105 a cerca de 2X108 de células CD 133+ totais;
totais;
(ix) cerca de 8X107 a cerca de 8X109 de células CDllb+ totais;
(x) cerca de 3,2X107 a cerca de 3X108 de células CDl(a+c)+ totais;
(xi) nenhum micoplasma cultivado ou crescimento bacteriano, de levedura ou de mofo, e (b) selecionar ou excluir a dita fração sanguínea do cordão umbilical cultivada ex-vivo conforme os ditos parâmetros, selecionando assim uma fração sanguínea do cordão umbilical CD133+/CD34+ cultivada ex-vivo adequada para transplantação no sujeito.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a dita fração sanguínea do cordão umbilical CD133+/CD34+ cultivada ex-vivo é selecionada quando (i) é igual a pelo menos 8,0X108 de células viáveis.
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21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a dita fração sanguínea do cordão umbilical cultivada ex-vivo foi cultivada a partir de uma unidade de sangue do cordão umbilical selecionada para expansão ex-vivo conforme os seguintes parâmetros de précriopreservação:
(i) cerca de 8X106 a cerca de 15X106 de células CD34+ totais;
(ii) HLA compatível em pelo menos 4 dos 6 loci HLA de classe I (HLA-A e HLA-B, baixa resolução) e HLA de classe II (HLA-DRB1, alta resolução) com o dito sujeito;
(iii) cerca de l,8X109 a cerca de 3,0X109 de células nucleadas totais pré-criopreservadas;
(iv) cerca de l,5X107 a cerca de 3,0X107 de células nucleadas totais pré-criopreservadas por quilograma de peso do sujeito.
22. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente selecionar frações sanguíneas do cordão umbilical cultivadas ex-vivo tendo uma cor amarelada e turva a opaca e livre de aglomerados brancos e partículas estranhas.
23. Método para selecionar frações de célula sanguínea do cordão umbilical não selecionadas que compreendem células CD133/CD34 negativas para transplantação em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) determinar, na dita fração sanguínea do cordão umbilical não cultivada, após a seleção para células CD133/CD34 negativas, os seguintes parâmetros:
(i) cerca de 4X108 a cerca de 15X108 de células totais viáveis;
(ii) cerca de 70 a 85% de viabilidade das células;
(iii) cerca de 2,4X107 a cerca de 8X107 de células CD3+;
(iv) nenhum crescimento bacteriano, de levedura ou de mofo, e (b) selecionar ou excluir a dita fração de célula sanguínea do
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7/7 cordão umbilical não selecionada conforme os ditos parâmetros, selecionando assim uma fração de célula sanguínea do cordão umbilical não selecionada que compreende células CD133/CD34 negativas adequadas para transplantação no sujeito.
24. Método de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente selecionar frações de célula sanguínea do cordão umbilical não selecionadas tendo uma cor vermelha e opaca e livre de aglomerados e partículas estranhas.
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