KR20240046506A - 치료용 nk세포 집단 - Google Patents

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요나 게펀
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줄리아 리프만
쉐리 코헨
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Abstract

임상용으로 자연살해(NK) 세포 분획을 확장하고 냉동 보존하는 방법, 특히 암 및 기타 질병 치료를 위한 세포 이식 및 주입에 응용할 수 있는 확장, 냉동보존된 NK 세포 분획 및 이를 사용하기 위한 프로토콜을 제공하는 방법이 제공된다.

Description

치료용 NK 세포 집단
관련 출원
본 출원은 2021년 7월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 63/223,024에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
자연살해(NK) 세포의 주입은 혈액학적 악성종양을 포함한 암 환자의 면역치료에 있어 매력적인 접근법이다. 그러나 NK 세포의 단기간 지속성과 주입 후 이펙터 기능의 손상으로 인해 효능이 제한되었다. 말초혈액 단핵세포의 부족한 NK 세포 수와 입양 이식된 NK 세포의 생체 내 증식 및 종양 미세 환경으로의 이동과 유지 능력의 한계가 현재까지 제한된 효능의 원인으로 작용한 것으로 보인다.
따라서, 생성된 NK 세포 분획이 사멸 활성을 유지하면서 생체내 주입 시 증가된 귀소, 보유 및 증식 활성을 나타내도록 NK 세포를 배양하고 확장시키는 방법이 당업계에 필요하다.
본 발명은 자연살해(NK) 세포를 배양하는 방법, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하기 위한 확장된 NK 세포 집단의 선택 및 혈액 악성종양 및 기타(예를 들어, 악성) 질환의 치료를 위한 임상 환경에서의 이식을 위한 적합한 생체 외 확장된 NK 세포 분획의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 확장된 NK 세포 분획을 포함하는 조성물 및 키트를 구상한다.
요약
본 개시는 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 제공하며, 상기 집단은 적어도 1.0 x 106개의 유핵 세포를 포함하고, 상기 집단 내 적어도 약 70%의 세포는 생존 가능하며, 여기서: 상기 집단 내 적어도 약 70%의 세포가 CD56+이고; 상기 집단 내 세포의 약 0.5% 이하가 CD3+이며; 상기 집단 내 세포의 약 10% 이하가 CD19+이고; 상기 집단 내 세포의 약 10% 이하가 CD14+이며; 상기 집단 내 세포의 적어도 약 44%가 CD49a+이고; 상기 집단 내 세포의 약 27% 이하가 LAG3+이며; 상기 집단 내 세포의 약 32% 이하가 CD200R+이고; 상기 집단 내 세포의 약 25% 이하가 CD57+이며; 상기 집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD16+이고; 상기 집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD62L+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 90%가 CD56+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 약 90 내지 약 95%가 CD56+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 약 0.2 내지 약 0.3%가 CD3+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 CD56+/CD3-이고, 상기 집단 내 세포의 약 0.5% 이하가 CD56-/CD3+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 99%가 CD56+/CD3-이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 15%가 CD62L+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 약 18% 내지 약 70%가 CD62L+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 20%가 CD16+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 약 20% 내지 약 60%가 CD16+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 중 세포의 약 1% 이하가 LAG3+이고, 집단 중 세포의 약 1.5% 이하가 CD200R+이고, 상기 집단 중 세포의 약 2.5% 이하가 CD57+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 중 약 3% 이하의 세포가 CD56+/LAG3+이고, 상기 집단 중 약 11% 이하의 세포가 CD56+/CD200R+이고, 상기 집단 중 약 4% 이하의 세포가 CD56+/CD57+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 43%가 CD56+/CD16+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 57%가 CD56+/CD16+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 78%가 CD56+/CD62L+이다.
일부 양태에서, 상기 집단 내 세포의 약 77% 이하가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 집단 내 세포의 약 15.77% 이하가 NKp80+이다.
일부 양태에서, 상기 NK 세포 분획은 i) 적어도 약 17.5 x 108개 유핵 세포; ii) 적어도 약 35 x 108개의 유핵 세포; iii) 적어도 약 2.5 x 109개의 유핵 세포; iv) 적어도 약 5 x 109개의 유핵 세포; v) 적어도 약 1.25 x 107개의 유핵 세포; vi) 적어도 약 2.5 x 107개의 유핵 세포; vii) 적어도 약 5 x 107개의 유핵 세포; 또는 viii) 적어도 약 1 x 108개의 유핵 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 NK 세포 분획은 이전에 동결된 후 해동되었다.
본 개시는 본 개시의 NK 세포 분획 및 DMSO를 포함하는 냉동보존된 NK 세포 분획을 제공하며, 여기서 DMSO의 농도는 약 10% v/v이다.
일부 양태에서, 상기 냉동보존된 NK 세포 분획은 i) 적어도 약 6주 동안 약 -80℃에서; 및/또는 ii) 적어도 약 12개월 동안 약 -150℃에서 안정적이다.
본 개시는 NK 세포 분획을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 대상체와 동종인 NK 세포 및 CD3+ 세포를 포함하는 혈액성분채집 생성물을 얻는 단계; (b) 혈액성분채집 생성물을 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획으로 분리하는 단계; (c) 방사선 조사에 의해 상기 CD3+ 세포 분획의 세포를 불활성화시키는 단계; (d) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 CD3-고갈 세포 분획을 불활성화되고 조사된 CD3+ 세포 분획과 함께 생체외 배양하는 단계, 여기서 상기 조건은 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아미드를 1.0 mM 내지 10 mM 양으로 제공하는 것을 포함하고; (e) 단계 (d) 이후 6~10일에 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드로 보충하여 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 생성하는 단계; (f) 단계 (d) 이후 14-16일에 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 수확하는 단계; 및 (g) 상기 (f) 단계의 조합된 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획을 세척 및 농축하여 NK 세포 분획을 제조하는 단계.
일부 양태에서, 상기 혈액성분채집 생성물은 인간 NK 및 CD3+ 세포 분획을 포함하는 인간 혈액성분채집 생성물이다.
일부 양태에서, 상기 CD3 작용제는 OKT3이다.
일부 양태에서, 상기 세포 증식을 허용하는 조건은 i) 약 10%(v/v) 농도의 인간 혈청; ii) 약 20ng/ml 농도의 IL-15; iii) 약 1μg/ml 농도의 OKT3; iv) 약 7.0 mM 농도의 니코틴아미드; 및 v) 최소 필수 세포 배양 배지를 포함하는 영양소를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 CD3-고갈 및 상기 조사된 CD3+ 세포는 단계 (d)에서 1:1 비율로 접종된다.
일부 양태에서, 단계 (d)의 상기 배양은 플라스크에서 i) 0.30-0.40 x 106 CD3-고갈 및 0.30-0.40x106 조사된 CD3+ 세포/ml; ii) 0.35 x 106 CD3-고갈 및 0.35 x 106 조사된 CD3+ 세포/ml; iii) 400-900 x 106 CD3-고갈 및 400-900 x 106 조사된 CD3+ 세포/플라스크; 또는 iv) 700 x 106 CD3 고갈 및 700 x 106 조사된 CD3+ 세포/플라스크의 영향을 받는다.
본 개시는 (a) 본 개시의 NK 세포 분획을 DMSO가 없는 냉동보존 버퍼에 현탁시키는 단계; (b) DMSO를 10% v/v로 첨가하는 단계; (c) 상기 세포의 온도를 -120℃로 낮추는 단계; (d) 냉동보존된 NK 세포를 -120℃ 이하의 온도에서 보관하는 단계를 포함한다.
본 개시는 (a) 본 개시의 냉동보존된 NK 세포 분획을 37℃ 수조에서 해동시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 해동된 냉동보존 NK 세포 분획을 주사 액으로 희석하여 이식용 해동, 냉동보존된 NK 세포 분획을 제조하는 단계를 포함한다.
본 개시는 혈액 질환의 치료가 필요한 인간 대상체에서 혈액 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 대상체에게 적어도 하나의 항암 단일클론 항체를 투여하는 단계; (b) 상기 대상체에게 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 단계; (c) 본 개시의 NK 세포 분획을 투여하는 단계; 및 (d) 상기 대상체에게 IL-2를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 단계 (c)는 상기 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획의 제 1 용량을 투여하고, 2일 후에 상기 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획의 제 2 용량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 양태에서: (i) 상기 제 1 용량 및 상기 제 2 용량은 2.5 x 107개 세포/kg의 총 용량에 대해 각각 적어도 약 1.25 x 107개 세포/kg을 포함하고; (ii) 상기 제 1 용량 및 상기 제 2 용량은 각각 적어도 약 2.5 x 107개 세포/kg을 포함하고, 총 용량은 적어도 약 5 x 107개 세포/kg이고; (iii) 상기 NK 세포 분획의 상기 제 1 용량과 제 2 용량은 각각 5 x 107개 세포/kg을 포함하여 총 용량은 1 x 108개 세포/kg이고; 또는 (iv) 상기 NK 세포 분획의 상기 제 1 용량 및 제2 용량은 각각 1 x 108개 세포/kg을 포함하여 총 용량은 2 x 108개 세포/kg이다.
일부 양태에서, 상기 면역억제제는 화학요법적 면역억제제, 방사선 조사 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 양태에서, 상기 혈액 질환은 혈액 악성종양이다.
일부 양태에서, 상기 혈액 질환은 다발성 골수종이다.
일부 양태에서, 상기 혈액 질환은 비호지킨 림프종(NHL)이다. 일부 양태에서, NHL은 i) CD20 양성 B 세포 NHL; ii) 여포성 림프종(FL); iii) 고등급 B세포 림프종(HGBCL); iv) 달리 명시되지 않은 HGBCL(HGBCL, NOS); v) 원발성 종격동 거대 B세포 림프종(PMBCL); 또는 vi) 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다.
일부 양태에서, 상기 NHL은 a) 기존 치료법에 실패한 재발성/불응성 질환; b) 이전에 적어도 두 가지의 치료를 받은 환자, 바람직하게 적어도 두 가지의 이전 치료법 중 적어도 하나는 화학 요법의 투여를 포함하고, 적어도 두 가지의 이전 치료법 중 적어도 하나는 항-CD20 단일 클론 항체의 투여를 포함하며; c) 루가노 반응 기준에 의해 정의된 측정 가능한 질병; d) 상기 NLH가 HGBCL로 변환된 FL이고, 대상체는 HGBCL로 변환된 후 이전에 적어도 한 가지 치료법을 받은 적이 있다.
일부 양태에서, 상기 혈액 질환은 NHL이고 상기 항암 단일클론 항체는 리툭시맙이며, 바람직하게는 리툭시맙은 약 375mg/m2의 용량으로 적어도 1회 투여되고, 바람직하게는 리툭시맙은 적어도 3회 투여된다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 항암 단일클론 항체는 대상체에게 적어도 3회 투여되고, 바람직하게는 적어도 하나의 항암 단일클론 항체는 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 10일 전; NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 3일 전; 및 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 후 12~16일째에 투여된다.
일부 양태에서, 상기 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드(400 mg/m2) 및 플루다라빈(30 mg/m2)을 모두 포함하며, 여기서 사이클로포스파미드는 400mg/m2의 용량으로 투여되고, 플루다라빈은 30mg/m2의 용량으로 투여되고, 상기 사이클로포스파미드 및 상기 플루다라빈은 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 5일 전; NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 4일 전; 및 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 4일 전에 투여된다:
일부 양태에서, 단계 (d)는 (i) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 처음 투여한 날; (ii) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 처음 투여한 후 2일; 및 (iii) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 처음 투여한 후 4일에, 상기 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포의 수혈 후 각각 하나씩 6 x 106 단위의 IL-2를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예의 측면에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체를 위해 NK 세포 분획을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 대상체와 동종인 NK 세포 및 CD3+ 세포를 포함하는 혈액성분채집 생성물을 얻는 단계;
(b) 혈액성분채집 생성물을 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획으로 분리하는 단계;
(c) 방사선 조사에 의해 CD3+ 세포 분획의 세포를 불활성화하는 단계;
(d) 세포 증식을 가능하게 하는 조건 하에서 CD3-고갈 세포 분획을 불활성화되고 조사된 CD3+ 세포 분획과 함께 생체외 배양하는 단계, 여기서 조건은 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아미드를 1.0 mM 내지 10 mM 양으로 제공하는 것을 포함하고;
(e) 단계 (d) 이후 6-10일, 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획에 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 보충하여 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 생성하는 단계;
(f) 단계 (d) 후 14-16일, 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 수확하는 단계; 및
(g) 단계 (f)의 조합된 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획을 세척하고 농축시켜 대상체에 이식하기 위한 확장된 NK 세포 분획을 생성하는 단계.
본 발명의 일부 구현예의 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 제조된 NK 세포 분획이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 또 다른 양태에 따르면, 다음을 포함하는 NK 세포 분획의 냉동보존 방법이 제공된다:
(a) NK 세포 분획의 NK 세포를 DMSO가 없는 냉동보존 버퍼에 현탁시키는 단계;
(b) DMSO를 10% v/v에 첨가하고,
(c) 상기 세포의 온도를 -120℃로 낮추고,
(d) 냉동보존된 NK 세포를 -120 ℃ 미만에서 보관하는 단계.
본 발명의 일부 구현예의 다른 양태에 따르면,
(a) 냉동보존된 NK 세포 분획을 37℃ 수조에서 해동하는 단계;
(b) 냉동보존된 NK 세포 분획을 주사 액으로 희석시켜 이식을 위해 해동 냉동보존된 NK 세포 분획을 생성하는 단계를 포함하는 투여용 냉동보존된 NK 세포 분획을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 제조된 냉동보존된 NK 세포 분획이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생산된 투여(이식이라고도 함)용 해동, 냉동보존된 NK 세포 분획이 제공되며, 여기서 냉동보존된 NK 세포 분획은 본 발명의 방법에 의해 생성된 냉동보존된 NK 세포 분획이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면 냉동보존된 NK 세포 분획은 20ml의 부피에 2.5 X 108 총 세포/ml를 포함하는 냉동보존 백이다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 냉동보존된 NK 세포 분획은 20ml의 부피에 50x108 세포를 포함하는 냉동보존 백이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 해동 냉동보존된 NK 세포 분획의 확장된 CD3-고갈 세포는 CD3-고갈 세포와 비교하여 방사선 조사된 마우스에 주입한 후 비장 및 골수에서의 생체내 보유가 증가하였다. 5mM 니코틴아미드가 있고 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건에서 확장되었다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 이식용 해동되고 냉동보존된 NK 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 생존율이 적어도 70%일 것;
(c) 주입 시 환자의 1X106 CD3+/CD56- 세포/Kg 미만일 것;
(d) 주입 시 환자의 5 EU 내독소/Kg 이하일 것;
(e) 마이코플라스마 없을 것, 및
(f) 무균.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 이식용 해동 냉동보존된 NK 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 생존율이 적어도 70%일 것;
(c) 0.5% 미만의 세포가 CD3+/CD5-일 것;
(d) 0.5 내독소 단위(EU)/mL 이하일 것;
(e) 마이코플라스마 없을 것, 및
(f) 무균.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 해동 냉동보존된 NK 세포 분획은 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 냉동보존 백에 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 해동 냉동보존된 NK 세포 분획은 2.5X108개 세포/ml를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 해동 냉동보존된 NK 세포 분획은 100 ml의 부피로 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면 성분채집 생성물은 인간 NK 및 CD3+ 세포 분획을 포함하는 인간 혈액성분채집 생성물이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈청은 인간 혈청이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 세포 증식을 허용하는 조건은 10% 인간 혈청을 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, IL-15는 20ng/ml의 IL-15를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면 CD3 작용제는 OKT3이고, OKT3은 1μg/ml OKT3을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면 니코틴아미드는 7.0 mM 니코틴아미드를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 영양소는 최소 필수 세포 배양 배지를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 확장된 NK 세포 분획의 NK 세포는 적어도 40-97%의 CD56+/CD3- 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에 대한 NK 세포 분획을 제조하는 방법의 단계 (e)에 의해 생성된 세척 및 농축된 확장된 NK 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 생존율이 적어도 70%일 것;
(c) 주입 시 환자의 CD3+/CD56- 세포 수가 1X106개/Kg 미만일 것;
(d) 주입 시 환자의 내독소/Kg 질량이 5 이하일 것;
(e) 마이코플라즈마가 없을 것, 및
(f) 무균.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 이를 필요로 하는 대상체에 대한 NK 세포 분획을 제조하는 방법의 단계 (e)에 의해 생성된 세척 및 농축된 팽창된 NK 세포 분획은, 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 생존율이 적어도 70%일 것;
(c) 0.5% 미만의 세포가 CD3+/CD56-일 것;
(d) 0.5 내독소 단위(EU)/mL 이하;
(e) 마이코플라즈마 없을 것, 및
(f) 무균
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 주입 시 CD3+ 세포는 환자 질량의 0.5X X106 CD3+/CD56- 세포/Kg 미만이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, CD3-고갈된 세포와 조사된 CD3+ 세포는 1:1 비율로 접종된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 배양은 플라스크에 0.30-0.40X106 CD3-고갈 및 0.30-0.40X106 조사된 CD3+ 세포/ml로 영향을 받는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 배양은 플라스크에 0.35X106 CD3-고갈 및 0.35X106 조사된 CD3+ 세포/ml에서 영향을 받는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 배양은 플라스크에 400-900X106 CD3 고갈 및 400-900X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크에서 영향을 받는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 배양은 플라스크에 700X106 CD3-고갈 및 700X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크에서 영향을 받는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 확장된 CD3-고갈 세포는 5 mM 니코틴아미드를 갖고 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포에 비해 CD62L의 발현이 증가한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 확장된 CD3-고갈 세포는 5mM 니코틴아마이드를 갖고 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포에 비해 항체 의존적 세포 독성이 증가한다.
본 발명의 일부 구현예의 양상에 따르면, 혈액 질환을 필요로 하는 인간 대상체의 혈액 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
(a) 대상체에 항암 단일클론 항체를 투여하는 단계;
(b) 대상체에 적어도 하나의 면역 억제제를 투여하는 단계;
(c) 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획을 이를 필요로 하는 대상체에 이식하는 단계, 여기서, 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획은 CD3+ 세포, 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아마이드와 1.0 mM 내지 10 mM 사이의 양으로 생체 외 배양에 의해 확장된 것; 및
(d) 대상체에 IL-2를 투여하여 대상체의 혈액 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 면역 억제제는 화학 요법 면역 억제제 및/또는 방사선 조사이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈액 질환은 혈액 악성 종양이다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 혈액학적 질환은 비호지킨 림프종(NHL)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈액 질환은 여포성 림프종(FL) 또는 고등급 B 세포 림프종(HGBCL)이다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈액 질환은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈액 질환은 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈액 질환은 달리 명시되지 않은 HGBCL(HGBCL, NOS)이다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈액 질환은 원발성 종격동 거대 B세포 림프종(PMBCL)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, NHL은 CD20 양성 B 세포 NHL이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예에 따르면, NHL은 다음 중 적어도 하나를 특징으로 한다:
(a) 종래의 치료에 실패한 재발성/불응성 질환;
(b) 적어도 2가지 이상의 선행 치료(적어도 하나는 화학 요법을 포함하고 적어도 하나는 항-CD20 단일클론 항체를 포함)를 받은 환자;
c) 루가노 반응 기준에 정의된 대로 측정 가능한 질병;
d) NLH가 HGBCL로 전환된 FL인 경우, HGBCL로 전환된 후 최소 한 차례의 치료를 받아야 한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 혈액 악성 종양은 NHL이고, 항암 단일 클론 항체는 리툭시맙(375mg/m2)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 대상체에 항암 단일클론 항체를 투여하는 것은 세 번 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 투여는 동종 해동 냉동보존된 확장된 세포 분획의 제 1 용량을 투여한 후, 2일 후에 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획의 제 2 용량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 항암 항체의 투여는 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획의 제 1 용량 10일 전, 제 1 용량 3일 전, 및 제 1 용량 후 12-16일에 3회 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 세포 분획은 대상체 kg당 1X107 내지 5X108 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 세포 분획은 대상체 kg당 2X108개의 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 제 1 및 제 2 용량 조합은 2X107/kg 내지 2X108/kg의 총 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, (a) NK 세포 분획의 제1 용량 및 제2 용량은 대상체 kg당 5X107 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포의 총 용량에 대해 각각 대상체 kg당 2.5X107 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포를 포함하거나, 또는
(b) NK 세포 분획의 제1 용량 및 제2 용량은 대상체 kg당 1X108 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포의 총 용량에 대해 각각 대상체 kg 당 5X107 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포를 포함하거나, 또는
(c) NK 세포 분획의 제1 용량 및 제2 용량은 대상체 kg당 2X108 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포의 총 용량에 대해 각각 1X108개의 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획은 해동 후 4시간 이내에 대상체에게 투여된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획은 필터나 펌프 없이 주입에 의해 10cc/kg 환자 체중/hr 이하의 속도로 상기 대상체에게 투여된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획은 주입 또는 펌프에 의해 10cc/kg 환자 체중/hr 이하의 속도로 상기 대상체에게 투여된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 동종 해동 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획은 필터 또는 펌프를 사용하여 주입에 의해 10cc/kg 환자 체중/hr 이하의 속도로 상기 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 필터는 약 170 내지 약 260 마이크론의 기공 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면,
(i) 상기 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드(400 mg/m2) 및 플루다라빈(30 mg/m2)을 모두 포함하고; 및
(ii) 상기 사이클로포스파미드 및 상기 플루다라빈은 상기 해동 냉동보존 확장된 NK 세포의 수혈(transfusion) 전 5일, 4일 및 3일 중 각각 하나에 투여된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 투여(단계 (d))는 동종 해동 냉동보존 확장된 NK 세포의 수혈 후 6X106 단위 IL-2를 (i) 동종 해동 냉동보존 확장된 NK 세포의 수혈 당일; 및 (ii) 동종 해동 냉동보존 확장된 NK 세포를 수혈 후 2일; 및 (iii) 동종 해동 냉동보존 확장된 NK 세포의 수혈 후 4일에 투여하는 것을 포함한다:
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 방법은 임의의 방법에 따라 제조된 이식 가능한 NK 세포 분획을 이식하는 단계를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시예 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 아래에 설명되어 있다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 특허 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 예시는 예시적인 것일 뿐이며 반드시 제한하려는 의도는 없다. 본 명세서에 설명된 임의의 양상 및/또는 실시예는 본 명세서에 설명된 임의의 다른 양상 및/또는 실시예와 결합될 수 있다.
상기 특징 및 추가적인 특징은 첨부 도면과 함께 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 니코틴아미드 없이 또는 방사선 조사된 피더 세포 없이 배양된 세포와 비교하여, 본원에 개시된 방법에 따라 배양되고, 냉동보존되고, 해동되고 확장된 세포에서 우수한 NK 세포 기능의 유지를 보여주는 히스토그램이다. 세포를 피더가 없는 5mM NAM, 피더가 있는 5mM NAM 또는 피더가 있는 7mM NAM과 함께 배양하고 냉동보존하였다. ADCC 분석은 표지된 BL2 세포를 사용하여 수행되었다. BL2 세포의 사멸은 전체 표지된 세포로부터 프로피듐-요오드(PI)-양성(사망)의 백분율로서 FACS에 의해 결정되었다;
도 2는 니코틴아미드 없이 또는 조사된 피더 세포 없이 배양된 세포와 비교하여, 본원에 개시된 방법에 따라 배양되고, 냉동보존되고 해동되고 확장된 세포에서 향상된 NK 세포 효능을 보여주는 히스토그램이다. 세포를 피더가 없는 5mM NAM, 피더가 있는 5mM NAM 또는 피더가 있는 7mM NAM으로 2주 동안 배양하고 냉동보존하였다. 세포를 해동하고, 해동 후 2시간에 CD62L에 대한 염색을 위해 샘플링하고 FACS로 분석하였다.
도 3은 NK 세포 면역 체크포인트 수용체에 대한 본원에 개시된 방법에 따른 배양, 냉동보존 및 해동의 유익한 효과를 나타내는 히스토그램이다. 세포를 NAM 없이, 2.5mM, 5mM NAM 또는 7mM NAM 존재 시 2주 동안 배양하였다. CD200R에 대한 염색 샘플을 FACS로 분석하였다.
도 4는 방사선 조사된 NSG 마우스에 주입한 후 NK 세포 귀소(homing)에 대한 본원에 개시된 방법에 따른 배양, 냉동보존 및 해동의 유익한 효과를 보여주는 히스토그램이다. CD3-고갈 세포를 NAM 유무에 관계없이 배양하였다. NSG 마우스는 GDA-201 주입 및 IL2 및 IL15 IP 주입 24시간 전에 치사량 이하의 방사선 조사를 받았다. 세포를 해동하고, 해동 후 2시간 후에 마우스에 주입하였다. 7일 후, 마우스를 채취하고 인간 CD45 APC 및 CD56 FITC에 대한 염색을 통해 인간 NK 세포 존재에 대해 분석하였다. 7AAD 염료를 사용하여 죽은 세포를 제외시켰다.
도 5A 및 5B는 본원에 개시된 방법에 따라 배양되고, 냉동보존되고 해동된 확장된 세포의 향상된 생착 가능성을 나타내는 히스토그램이다. 세포를 피더가 없는 5mM NAM, 피더가 있는 5mM NAM 또는 피더가 있는 7mM NAM과 함께 배양하고 냉동보존하였다. NSG 마우스는 NK 주입 및 IL2 및 IL15 IP 주입 24시간 전에 치사량 이하의 방사선 조사를 받았다. 세포를 해동하고, 해동 후 2시간 후에 마우스에 주입하였다. 3일 후, 마우스를 채취하고 인간 CD45 APC 및 CD56 FITC에 대한 염색을 통해 인간 NK 세포 존재에 대해 분석하였다. 7AAD 염료를 사용하여 죽은 세포를 제외시켰다. 5A: 비장에서 NK 사건의 절대 수. 5B: 골수 내 NK의 분율.
도 6A-6C는 본원에 개시된 방법에 따라 배양, 냉동 보존 및 해동된 확장 세포를 투여하여 마우스 폐암종 A549 모델에서 고형 종양 부피의 감소를 나타낸다. 세포를 CD3+ 피더가 있는 7mM NAM으로 배양한 다음, 항-Her2 항체 허셉틴이 있거나 없는 5X106 A549 세포를 치사량 이하로 방사선 조사를 받은 마우스에 정맥 투여하였다(도 6A 및 6B). NK 세포의 투여는 종양 부하를 줄이는데 분명히 효과적이며(6C, C-NK), 항 Her2 항체(6C, D-NK+Her2)와 결합하면 시너지 효과를 발휘한다.
도 7A-7C는 본원에 개시된 방법에 따라 배양되고, 냉동보존되고 해동된 확장된 세포의 반복 투여에 의해 마우스 폐 암종 A549 모델에서 고형 종양 부피의 향상된 감소를 보여준다. 세포를 CD3+ 피더가 있는 7mM NAM으로 배양한 다음, 항-Her2 항체 허셉틴이 있거나 없는 5X106 A549 세포를 수용한 치사량 이하로 조사된 마우스에 IV를 투여하였다(도 7A 및 7B). NK 세포의 다중 투여는 종양 부하(7C, C-NK)를 줄이는데 확실히 더 효과적이며, 항-Her2 항체(6C, D-NK+Her2)와 결합할 때 강력한 시너지 효과를 발휘한다.
도 8은 FAC에 의해 측정된 바와 같이 니코틴아미드(NAM0)의 부재 또는 7mM 니코틴아미드(NAM7)의 존재 하에 본 개시의 방법을 사용하여 생산된 세포에서 다양한 세포 표면 마커의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 9는 FAC에 의해 측정된 바와 같이 니코틴아미드(NAM0)의 부재 또는 7mM 니코틴아미드(NAM7)의 존재 하에 본 개시의 방법을 사용하여 생성된 세포에서 다양한 세포 표면 마커의 발현을 보여주는 일련의 대표적인 FAC 플롯이다.
본 발명은 대상체에의 주입에 의해 투여(본원에서는 이식으로도 지칭됨)를 위해 CD3-고갈 세포 분획으로부터 자연살해(NK) 세포를 확장시키는 방법에 관한 것이며, 이는 효율적으로 냉동보존 및 해동될 수 있으며, 동시에 생체 외 및/또는 생체 내에서 세포의 기능을 유지하거나 강화한다. 일 구현예에서, 니코틴아미드 및/또는 기타 니코틴아미드 부분을 갖는 NK 세포, NK 세포 성장 인자 및 해당 CD3+ 분획의 불활성화 세포를 포함하는 혈액성분채집 생성물의 CD3-고갈 분획의 생체 외 배양은 치료용 생체외 확장 NK 세포 제제로 사용하기 위한 NK 세포 집단의 생산을 촉진하며, 이는 대상체에 주입하기에 적합한 파라미터(예, 감소된 CD3+ T 세포 분획과 함께 NK 세포의 강력한 확장)를 갖는 확장된 기능성 NK 세포 집단을 포함하며, 냉동보존을 통해 우수한 생존력과 기능을 유지한다. 특히 이와 관련하여, 본 발명은 암 및 기타 질병의 치료를 위한 세포 이식 및 주입에 적용할 수 있는 NK 세포 분획 및 냉동보존 및 사용을 위한 프로토콜을 제공하는데 사용될 수 있다. 비제한적인 적용에는 동종 입양 면역요법 및 감작제 및 기타 항암 양식과 함께 병용 면역요법이 포함될 수 있다.
본 발명의 원리 및 작동은 첨부된 설명을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 다음 설명에 설명된 세부 사항에 대한 적용이 반드시 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시예가 가능하거나 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다.
자연살해(이하 "NK") 세포는 면역 반응에 참여하는 림프 세포로, 종양 세포에 대해 자발적인 비-MHC 제한 세포 독성 활성을 나타낸다. 따라서 생존 가능한 NK 세포의 생체 외 수를 효과적으로 늘리고 기능과 냉동 보존 적합성, 림프절로의 이동 가능성 및 주입 후 생체 내 항상성 증식 가능성을 효과적으로 향상시키는 임상 수준의 프로토콜을 개발하면 고형 종양, 조혈 악성 종양 등과 같은 암 질환 치료를 위한 NK 세포를 이용한 입양 면역 치료의 성공률을 높일 수 있다.
본 발명은, 본 명세서에 더 상세히 기재된 바와 같이, 니코틴아미드와 함께 NK 세포를 포함하는 CD3-고갈 세포 분획을, 해당 CD3+ 분획의 불활성화 세포와 함께, 특정 농도의 니코틴아미드 이상으로 배양하고, 추가로 확장된 세포 분획을 냉동 보존하는 것을 기반으로, 임상 환경에서 주입을 통한 이식에 적합한 확장된 NK 세포 분획을 제조 및 특성화하기 위한 임상적으로 적절한 조건들을 제공한다. 이와 같이, 본 발명의 구현예에서, 본 발명은 기능적으로 성숙한 NK 세포의 확장된 NK 세포 분획의 생산을 위한 임상적으로 적절한 배양 조건, 비 NK 세포(예, CD3+/CD56-) 증식을 최소화하는 치료용 NK 분획 및 그 선택, 냉동 보존 및 해동에 대한 기준, 암성 질환, 특히 혈액 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 임상 프로토콜을 제공한다.
본 개시의 NK 세포 분획
본 개시는 유핵 세포의 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 유핵 세포의 집단은 적어도 약 1.0 x 106, 또는 적어도 약 5.0 x 106, 또는 적어도 약 1.0 x 107, 또는 적어도 약 5.0 x 107, 또는 적어도 약 1.0 x 108, 또는 적어도 약 5. 0 x 108, 또는 적어도 약 1.0 x 109, 또는 적어도 약 5.0 x 109, 또는 적어도 약 1.0 x 1010, 또는 적어도 약 5.0 x 1010, 또는 적어도 약 1.0 x 1011, 또는 적어도 약 5.0 x 1011, 또는 적어도 약 1.0 x 1012 또는 적어도 약 5.0 x 1012 유핵 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포의 집단은 적어도 약 1.0 x 106 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포의 집단은 적어도 약 17.5 x 108 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포의 집단은 적어도 약 35 x 108을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포의 집단은 적어도 약 2.5 x 109 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포의 집단은 적어도 약 5 x 109 세포를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 유핵 세포의 집단에 있는 세포들의 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 생존 가능하다. 일부 양태에서는, 유핵 세포의 집단에서 적어도 약 70%의 세포가 생존 가능하다.
일부 양태에서, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 유핵 세포의 집단 내 세포가 CD56+이다. 일부 양태에서는, 유핵 세포의 집단에 있는 세포의 적어도 약 70%가 CD56+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 80% 내지 약 99%, 또는 약 85% 내지 약 95%, 또는 약 90 내지 약 95%가 CD56+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 90 내지 약 95%는 CD56+이다.
일부 양태에서, 약 0.1% 이하, 약 0.2% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.5% 이하, 또는 약 0.5% 이하 유핵 세포 집단 중 약 0.6%, 또는 약 0.7% 이하, 또는 약 0.8% 이하, 또는 약 0.9% 이하, 또는 약 1.0% 이하의 세포가 CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 0.5% 이하의 세포가 CD3+이다.
일부 양태에서, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.2%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.3%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.4%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5% 또는 약 0.01% 내지 약 0.6%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.7%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.9%, 또는 약 0.01% 내지 약 1.0%의 세포 유핵 세포 CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 0.5%의 세포가 CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.2% 내지 약 0.3%의 세포가 CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.2% 내지 약 0.3%의 세포가 CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단의 세포의 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 CD56+/CD3-이다. 일부 양태에서는, 유핵 세포 집단의 세포의 적어도 약 70%가 CD56+/CD3-이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단의 세포의 적어도 약 99%는 CD56+/CD3-이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단의 세포의 약 80% 내지 약 99%, 또는 약 85% 내지 약 95%, 또는 약 90 내지 약 95%가 CD56+/CD3-이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 90 내지 약 95%가 CD56+/CD3-이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 이하, 약 0.2% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.9% 이하 또는 약 1.0% 이하가 CD56-/CD3+이다. 일부 양태에서 유핵 세포 집단 내 세포의 0.5% 이하가 CD56-/CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.01% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.2%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.3%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.4%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0. 6%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.7%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.9%, 또는 약 0.01% 내지 약 1.0%가 CD56-/CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.01% 내지 0.5%가 CD56-/CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 약 0.1% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.2% 내지 약 0.3%의 세포가 CD56-/CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.2% 내지 약 0.3%가 CD56-/CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%가 CD62L+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 10%의 세포는 CD62L+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 15%의 세포는 CD62L+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 13%의 세포가 CD62L+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 8% 내지 약 80%, 또는 약 13% 내지 약 75%, 또는 약 18% 내지 약 70%가 CD62L+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 13% 내지 약 88%의 세포가 CD62L+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단의 세포 중 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%가 CD16+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 10%의 세포는 CD16+이다. 일부 측면에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 20%의 세포는 CD16+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 적어도 30%가 CD16+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 10% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 65%, 또는 약 20% 내지 약 60%가 CD16+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 20% 내지 약 60%의 세포가 CD16+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 30% 내지 약 88%의 세포가 CD16+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하는 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 10% 이하의 세포가 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.7% 이하의 세포가 CD19+이다.
일부 양태에서는, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%, 또는 약 0.01% 내지 약 25%가 CD19+이다. 일부 양태에서는, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.01% 내지 약 10%가 CD19+이다. 일부 양태에서는, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.01% 내지 약 0.7%가 CD19+이다.
일부 양태에서는, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 25%가 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.1% 내지 약 10%가 CD19+이다. 일부 양태에서는 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.1% 내지 약 0.7%가 CD19+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하가 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 10% 이하의 세포가 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.05% 이하의 세포가 CD14+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포가 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%, 또는 약 0.01% 내지 약 25% CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 10%의 세포가 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 0.05%의 세포가 CD14+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 25%의 세포는 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 10%의 세포가 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 0.05%의 세포가 CD14+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 44.99%가 CD49a+이다. 일부 측면에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 45%의 세포가 CD49a+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 96%의 세포는 CD49a+이다. 일부 양태에서, 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%가 CD49a+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 44% 내지 약 96%는 CD49a+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 26.39% 이하의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 27% 이하의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 76.68% 이하의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 76% 이하의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 약 25% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 45% 이하, 또는 약 50% 이하 또는 약 55% 이하, 또는 약 60% 이하, 또는 약 65% 이하, 또는 약 70% 이하, 또는 약 75% 이하, 또는 약 77% 이하, 또는 유핵 세포 집단 중 약 80% 이하의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 26% 내지 약 77%는 NKp80+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 26.39%는 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 27%는 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 76.68%의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 76%의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 25%, 또는 약 0.01% 내지 약 30%, 또는 약 0.01% 내지 약 35%, 또는 약 0.01% 내지 약 40%, 또는 약 0.01% 내지 약 45%, 또는 약 0.01% 내지 약 50%, 또는 약 0.01% 내지 약 55%, 또는 약 0.01% 내지 약 60%, 또는 약 0.01% 내지 약 65%, 또는 약 0.01% 내지 약 70%, 또는 약 0.01% 내지 약 75%, 약 0.01% 내지 약 77%, 또는 약 0.01% 내지 약 80%가 NKp80+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 26.39%는 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 27%는 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 76.68%의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 76%의 세포가 NKp80+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 25%, 또는 약 0.01% 내지 약 30%, 또는 약 0.01% 내지 약 35%, 또는 약 0.1% 내지 약 40%, 또는 약 0.1% 내지 약 45%, 또는 약 0.1% 내지 약 50%, 또는 약 0.1% 내지 약 55%, 또는 약 0.1% 내지 약 60%, 또는 약 0.1% 내지 약 65%, 또는 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 0.1% 내지 약 75% 약 0.1% 내지 약 77%, 또는 약 0.1% 내지 약 80%가 NKp80+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.57% 이하의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 1% 이하의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 2% 이하의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 26.89% 이하의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 27% 이하의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 약 2.5% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 20% 이하, 또는 약 30% 이하 또는 유핵 세포 집단 중 세포의 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 10% 이하의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.5% 내지 약 27%의 세포가 LAG3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 0.57%는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 1%의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 2%가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 26.89%가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 27%가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%, 또는 약 0.01% 내지 약 30%, 또는 약 0.01% 내지 약 35%, 또는 약 0.01% 내지 약 40%의 세포가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 10%의 세포가 LAG3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 0.57%는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 1%가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 2%가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 26.89%가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 27%가 LAG3+이다. 일부 측면에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 30%, 또는 약 0.1% 내지 약 35%, 또는 약 0.1% 내지 약 40%가 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 10%의 세포가 LAG3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 1.03% 이하의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 2% 이하의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 3.68% 이하의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 31.8% 이하의 세포가 CD200R+이다. 일부 측면에서, 유핵 세포 집단 중 약 32% 이하의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 2.5% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 20% 이하, 또는 약 30% 이하 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 10% 이하의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 세포의 약 1% 내지 약 32%가 CD200R+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 1.03%의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 2%는 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 3.68%의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 31.8%는 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 32%는 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%, 또는 약 0.01% 내지 약 30%, 또는 약 0.01% 내지 약 35%, 또는 약 0.01% 내지 약 40%의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 10%의 세포가 CD200R+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 1.03%의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 2%는 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 3.68%는 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 31.8%의 세포가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 32%는 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.1% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 30%, 또는 약 0.1% 내지 약 35%, 또는 약 0.1% 내지 약 40%가 CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 10%의 세포가 CD200R+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 2.05% 이하의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 2.5% 이하의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 3.6% 이하의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 4% 이하의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 24.59% 이하의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 25% 이하의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 2.5% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 20% 이하, 또는 약 30% 이하 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하가 CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 10% 이하의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 2% 내지 약 25%의 세포가 CD57+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 2.05%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 2.5%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 3.6%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 4%가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 24.59%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 25%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%, 또는 약 0.01% 내지 약 30%, 또는 약 0.01% 내지 약 35%, 또는 약 0.01% 내지 약 40%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 10%의 세포가 CD57+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 2.05%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 2.5%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 3.6%의 세포가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 4%가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 24.59%가 CD57+이다. 일부 양태에서, 세포 집단 중 세포의 약 0.1% 내지 약 25%가 CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 세포의 약 0.1% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 30%, 또는 약 0.1% 내지 약 35%, 또는 약 0.1% 내지 약 40%가 CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.1% 내지 약 10%의 세포가 CD57+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 1% 이하, 또는 약 2% 이하, 또는 약 3% 이하, 또는 약 4% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 이하 약 6% 이하, 또는 약 7% 이하, 또는 약 8% 이하, 또는 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 11% 이하, 또는 약 12% 이하 %, 또는 약 13% 이하, 또는 약 14% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 16% 이하, 또는 약 17% 이하, 또는 약 18% 이하, 또는 약 19% 이하, 또는 약 20% 이하의 세포가 CD56+/LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 3% 이하의 세포가 CD56+/LAG3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 1% 이하, 또는 약 2% 이하, 또는 약 3% 이하, 또는 약 4% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 이하 약 6% 이하, 또는 약 7% 이하, 또는 약 8% 이하, 또는 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 11% 이하, 또는 약 12% 이하 %, 또는 약 13% 이하, 또는 약 14% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 16% 이하, 또는 약 17% 이하, 또는 약 18% 이하, 또는 약 19% 이하, 또는 약 20% 이하의 세포가 CD56+/CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 11% 이하의 세포가 CD56+/CD200R+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 또는 약 5% 이하 약 6% 이하, 또는 약 7% 이하, 또는 약 8% 이하, 또는 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 11% 이하, 또는 약 12% 이하, 또는 약 13% 이하, 또는 약 14% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 16% 이하, 또는 약 17% 이하, 또는 약 18% 이하, 또는 약 19% 이하, 또는 약 20% 이하의 세포가 CD56+/CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 4% 이하의 세포가 CD56+/CD57+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 1%, 또는 약 0.01% 내지 약 2%, 또는 약 0.01% 내지 약 3%, 또는 약 0.01% 내지 약 4%, 또는 약 0.01% 내지 약 5% , 또는 약 0.01% 내지 약 6%, 또는 약 0.01% 내지 약 7%, 또는 약 0.01% 내지 약 8%, 또는 약 0.01% 내지 약 9%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 약 11%, 또는 약 0.01% 내지 약 12%, 또는 약 0.01% 내지 약 13%, 또는 약 0.01% 내지 약 14%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 16%, 또는 약 0.01% 내지 약 17%, 약 0.01% 내지 약 18%, 약 0.01% 내지 약 19%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%가 CD56+/LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 3%는 CD56+/LAG3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 1%, 또는 약 0.01% 내지 약 2%, 또는 약 0.01% 내지 약 3%, 또는 약 0.01% 내지 약 4%, 또는 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 6%, 또는 약 0.01% 내지 약 7%, 또는 약 0.01% 내지 약 8%, 또는 약 0.01% 내지 약 9%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 약 11%, 또는 약 0.01% 내지 약 12%, 또는 약 0.01% 내지 약 13%, 또는 약 0.01% 내지 약 14%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 16%, 또는 약 0.01% 내지 약 17%, 약 0.01% 내지 약 18%, 약 0.01% 내지 약 19%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%가 CD56+/CD200R+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 약 0.01% 내지 약 11%의 세포가 CD56+/CD200R+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 1%, 또는 약 0.01% 내지 약 2%, 또는 약 0.01% 내지 약 3%, 또는 약 0.01% 내지 약 4%, 또는 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 6%, 또는 약 0.01% 내지 약 7%, 또는 약 0.01% 내지 약 8%, 또는 약 0.01% 내지 약 9%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 약 11%, 또는 약 0.01% 내지 약 12%, 또는 약 0.01% 내지 약 13%, 또는 약 0.01% 내지 약 14%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 16%, 또는 약 0.01% 내지 약 17%, 약 0.01% 내지 약 18%, 약 0.01% 내지 약 19%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%가 CD56+/CD57+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 약 0.01% 내지 약 4%는 CD56+/CD57+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단에서 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 중 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%의 세포가 CD56+/CD16+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 43%가 CD56+/CD16+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 57%가 CD56+/CD16+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 세포의 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%가 CD56+/CD62L+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 중 적어도 약 78%의 세포는 CD56+/CD62L+이다.
임의의 전술한 표현형 파라미터는 임의의 전술한 다른 표현형 파라미터와 조합될 수 있다.
따라서, 비-제한적인 예에서, 본 개시는 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 제공하며, 상기 집단은 적어도 1.0 x 106개 유핵 세포를 포함하고, 집단 내 세포의 적어도 약 70% 생존 가능하며,
상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 CD56+이고;
집단 내 세포의 약 0.5% 이하가 CD3+이며,
집단 내 세포의 약 10% 이하가 CD19+이고;
집단 내 세포의 약 10% 이하가 CD14+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 44%가 CD49a+이고;
집단 내 세포의 약 10% 이하가 LAG3+이고;
집단 내 세포의 약 20% 이하가 CD200R+이고;
집단 내 세포의 약 10% 이하가 CD57+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD16+이고; 및
집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD62L+이다.
따라서, 비-제한적인 예에서, 본 개시는 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 제공하며, 상기 집단은 적어도 1.0 x 106 유핵 세포를 포함하고, 집단 내 세포의 적어도 약 70% 생존 가능하며,
상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 CD56+이고;
집단 내 세포의 약 0.5% 이하가 CD3+이고;
집단 내 세포의 약 1% 이하가 CD19+이고;
집단 내 세포의 약 0.05% 이하가 CD14+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 44%가 CD49a+이고;
집단 내 세포의 약 27% 이하가 LAG3+이고;
집단 내 세포의 약 32% 이하가 CD200R+이고;
집단 내 세포의 약 25% 이하가 CD57+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 30%가 CD16+이고; 및
집단 내 세포의 적어도 약 13%가 CD62L+이다.
따라서, 비-제한적인 예에서, 본 개시는 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 제공하며, 여기서 집단은 적어도 1.0 x 106 유핵 세포를 포함하고, 집단 내 세포의 적어도 약 70% 생존 가능하며,
상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 CD56+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 0.5%가 CD3+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 10%가 CD19+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 10%가 CD14+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 44%가 CD49a+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 10%가 LAG3+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 20%가 CD200R+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 10%가 CD57+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD16+이고; 및
집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD62L+이다.
따라서, 비-제한적인 예에서, 본 개시는 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 제공하며, 상기 집단은 적어도 1.0 x 106 유핵 세포를 포함하고, 집단 내 세포의 적어도 약 70% 생존 가능하며,
상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 CD56+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 0.5%가 CD3+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 1%가 CD19+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 0.05%가 CD14+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 44%가 CD49a+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 27%가 LAG3+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 32%가 CD200R+이고;
집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 25%가 CD57+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 30%가 CD16+이고; 및
집단 내 세포의 적어도 약 13%가 CD62L+이다.
따라서, 비-제한적인 예에서, 본 개시는 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 제공하며, 상기 집단은 적어도 1.0 x 106 유핵 세포를 포함하고, 집단 중 세포의 적어도 약 70% 생존 가능하며,
상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 CD56+이고;
집단 내 세포의 약 0.5% 이하가 CD3+이고;
집단 내 세포의 약 0% 내지 약 1%가 CD19+이고;
집단 내 세포의 약 0% 내지 약 0.05%가 CD14+이고;
집단 내 세포의 약 44% 내지 약 96%가 CD49a+이고;
집단 내 세포의 약 0.5% 내지 약 27%가 LAG3+이고;
집단 내 세포의 약 1% 내지 약 32%가 CD200R+이고;
집단 내 세포의 약 2% 내지 약 25%가 CD57+이고;
집단 내 세포의 약 30% 내지 약 88%가 CD16+이고; 및
집단 내 세포의 약 13% 내지 약 88%가 CD62L+이다.
본 개시의 NK 세포 분획의 표현형 파라미터들의 조합의 다른 비-제한적인 예들이 표 A - 표 D에 제시되어 있다.
표 A
표 B
표 C
표 D
본 개시는 또한 본원에 기술된 임의의 NK 세포 분획 및 DMSO를 포함하는 동결보존된 NK 세포 분획을 제공한다. 일부 양태에서, DMSO의 농도는 약 1% v/v, 약 2% v/v, 약 3% v/v, 약 4% v/v, 또는 약 5% v/v, 약 6% v/v, 또는 약 7% v/v, 또는 약 8% v/v, 또는 약 9% v/v, 또는 약 10% v/v, 또는 약 11% v/v, 또는 약 12 % v/v, 또는 약 13% v/v, 또는 약 14% v/v, 또는 약 15% v/v일 수 있다. 일부 양태에서, DMSO의 농도는 약 10% v/v일 수 있다.
일부 양태에서, 냉동보존된 NK 세포 분획은 약 6주 이상, 약 1개월 이상, 약 2개월 이상, 약 3개월 이상, 또는 약 4개월 이상, 또는 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월, 또는 적어도 약 7개월, 또는 적어도 약 9개월, 또는 적어도 약 10개월, 또는 적어도 약 11개월, 또는 적어도 약 12개월 동안 안정할 수 있다. 일부 양태에서, 냉동보존된 NK 세포 분획은 약 -80℃에서 적어도 약 6주, 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월, 또는 적어도 약 3개월, 또는 적어도 약 4개월, 또는 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월, 또는 적어도 약 7개월, 또는 적어도 약 9개월, 또는 적어도 약 10개월, 또는 적어도 약 11개월, 또는 적어도 약 12개월 동안 안정할 수 있다. 일부 양태에서, 냉동보존된 NK 세포 분획은 약 -80℃에서 적어도 약 6주 동안 안정할 수 있다. 일부 양태에서, 동결보존된 NK 세포 분획은 약 -150℃에서 적어도 약 6주, 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월, 또는 적어도 약 3개월, 또는 적어도 약 4개월, 또는 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월, 또는 적어도 약 7개월, 또는 적어도 약 9개월, 또는 적어도 약 10개월, 또는 적어도 약 11개월, 또는 적어도 약 12개월 동안 안정할 수 있다. 일부 양태에서, 냉동보존된 NK 세포 분획은 약 -150℃에서 적어도 약 12개월 동안 안정할 수 있다.
본 개시의 효능 분석
본 개시는 다음 단계를 포함하는 1차 효능 분석을 제공한다:
a) 본 개시의 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 배양하는 단계(여기서, 복수의 표적 세포는 적어도 하나의 증식 염료로 염색됨);
b) 복수의 표적 세포에서 세포 사멸 백분율을 측정한다.
1차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (a)의 인큐베이션 조건은 적어도 하나의 항암 치료 단일클론 항체를 추가로 포함할 수 있다.
1차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 K562 세포일 수 있다.
1차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 라지(Raji)(CCL-86) 세포일 수 있다.
1차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 라지(CCL-86) 세포일 수 있고, 단계 (a)의 인큐베이션 조건은 리툭시맙을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 리툭시맙은 약 1μg/ml의 농도로 존재할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 1차 효능 분석의 단계 (b)에서 복수의 표적 세포에서 세포 사멸 백분율을 결정하는 것은 세포 사멸 백분율을 측정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 복수의 표적 세포에서 세포 사멸 백분율을 측정하는 것은 i) 단계 (a)에서 배양된 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 하나 이상의 생존성 염료로 염색하는 단계; ii) 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 NK 세포 분획으로부터 다수의 표적 세포를 분리하는 단계; 및 iii) 생존성 염색을 사용하여 단계 (ii)에서 분리된 다수의 표적 세포에서 세포 사멸 백분율을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 단계 (ii)에서 분리된 다수의 표적 세포에서 세포 사멸 백분율을 측정하기 위해 생존성 염료를 사용하는 것은 세포 사멸 백분율을 측정하기 위해 생존성 염료와 조합하여 증식 염료를 사용하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 증식 염료는 카르복시플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르(CFSE)일 수 있다. 당업가가 이해하는 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 증식 염료가 본원에 기술된 1차 효능 분석에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 생존성 염료는 Helix NP™ Blue(Sytox™ Blue로도 알려짐)일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 증식 염료가 1차 효능 검정에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 당업자가 이해하는 바와 같이, 살아있는 세포 분석 시스템은 IncuCyte® 시스템일 수 있다.
일부 양태에서, 1차 효능 분석의 단계 (a)에서의 인큐베이션은 약 37℃에서 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 1차 효능 분석의 단계 (a)에서의 인큐베이션은 적어도 약 3시간 동안 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 1차 효능 분석의 단계 (a)에서 NK 세포 분획의 세포 수 대 복수의 표적 세포의 세포 수의 비율은 약 2.5:1 또는 약 5 :1 또는 약 10:1일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 NK 세포 분획을 시험할 때 상기 표적 세포가 K562 세포이며, 표적 세포의 세포 사멸 %는 적어도 약 10%이다. 일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 상기 기술된 1차 효능 분석을 사용하여 NK 세포 분획을 시험할 때, 표적 세포가 K562 세포인 경우, 표적 세포의 세포 사멸 %는 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%이다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기술된 1차 효능 분석을 사용하여 시험할 때 표적 세포가 K562 세포이고, 여기서 세포 수의 비율이 K562 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 1차 효능 분석의 단계 (a)에서 NK 세포 분율 대 다수의 표적 세포 내 세포 수는 약 5:1이고, 표적 세포의 세포 사멸 백분율은 적어도 약 10%이다. 일부 양태에서, 세포 사멸 백분율은 NK 세포 분획을 표적 세포와 인큐베이션한지 약 12시간 후에 측정된다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기술된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때 표적 세포가 K562 세포이고, 여기서 세포 수의 비율이 K562 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 1차 효능 분석의 단계 (a)에서 NK 세포 분율 대 다수의 표적 세포 내 세포 수는 약 10:1이고, 표적 세포의 세포 사멸 백분율은 적어도 약 10%이다. 일부 양태에서, 세포 사멸 백분율은 NK 세포 분획을 표적 세포와 함께 인큐베이션한 지 약 3시간 후에 측정된다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 상기 기술된 1차 효능 분석을 사용하여 NK 세포 분획을 시험할 때, 표적 세포가 Raji 세포이며, 표적 세포에서의 세포 사멸 백분율은 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%이다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기술한 1차 효능 분석을 사용하여 시험할 때, 표적 세포가 Raji 세포이며, 단계 (a)의 인큐베이션 조건은 리툭시맙을 추가로 포함하고, 표적 세포에서의 세포 사멸 백분율은 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%이다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기술된 1차 효능 분석을 사용하여 시험할 때 표적 세포가 Raji 세포이며, 상기 기술된 1차 효능 분석을 사용하여 시험할 때 표적 세포가 Raji 세포이며, 그리고 단계 (a)의 인큐베이션 조건은 리툭시맙을 추가로 포함하고, 리툭시맙이 없는 표적 세포의 세포 사멸 백분율은 리툭시맙이 존재하는 경우 표적 세포의 세포 사멸 백분율 보다 낮다.
본 개시는 다음 단계를 포함하는 2차 효능 분석을 제공한다:
a) 본 개시의 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 배양하는 단계(여기서, NK 세포 분획은 검출 가능한 표지를 포함하는 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색됨);
b) 단계 (a)에서 배양된 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 하나 이상의 단백질 수송 억제제(protein trafficking inhibitors)로 처리하고, NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계;
c) NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 적어도 하나의 생존성 염료; 검출 가능한 라벨을 포함하는 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색하는 단계;
d) NK 세포 분획과 복수의 표적 세포를 고정하는 단계;
e) NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 투과시키는 단계;
f) i) 검출 가능한 라벨을 포함하는 적어도 하나의 항-IFNγ 항체;ii) 검출 가능한 라벨을 포함하는 적어도 하나의 항-TNFα 항체로 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 염색하는 단계;
g) 다음 중 적어도 하나를 측정하는 단계:
g1) 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색된 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색된 생존 세포의 백분율(즉, CD107a+/CD56+ 세포 수 ÷ CD56+ 세포 수 x 100%);
g2) 적어도 하나의 항-IFNγ 항체로 염색된 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색된 생존 세포의 백분율(즉, IFNγ+/CD56+ 세포 수 ÷ CD56+ 세포 수 x 100%); 및
g3) 적어도 하나의 항-TNFα 항체로 염색된 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색된 생존 세포의 백분율(즉, TNFα+/CD56+ 세포 수 ÷ CD56+ 세포 수 x 100%).
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 K562 세포일 수 있다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 라지(CCL-86) 세포일 수 있다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 Raji(CCL-86) 세포일 수 있고, 단계 (a) 및 단계 (b)의 인큐베이션 조건은 리툭시맙을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 리툭시맙은 약 0.5μg/ml의 농도로 존재할 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 생존성 염료는 Zombie Violet™ 생존성 염료일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 증식 염료는 1차 효능 분석에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 하나 이상의 단백질 수송 억제제는 브레펠딘, GolgiStop™ 단백질 수송 억제제(BD), 브레펠딘과 GolgiStop™ 단백질 수송 억제제의 조합, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 단백질 추적 억제제를 포함할 수 있다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (b)의 추가 인큐베이션은 약 37 ℃에서 수행된다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (b)의 추가 인큐베이션은 약 37℃ 이상에서 수행된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 단계 (g)의 적어도 하나의 (g1) - (g3) 측정은 검출 가능한 라벨을 포함하는 항체로 라벨링된 세포의 백분율을 측정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있으며, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (g)는 (g1) - (g3) 각각을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 2차 효능 분석의 단계 (a)에서 복수의 표적 세포의 세포 수에 대한 NK 세포 분획의 세포 수의 비율은 약 1:3일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 상기 기술된 2차 효능 분석을 사용하여 NK 세포 분획을 시험할 때, 상기 표적 세포가 K562 세포이며, 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색되는 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색된 생존 세포의 백분율은 적어도 10%이다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 상기 표적 세포는 Raji 세포이고, 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색되는 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색된 생존 세포의 백분율은 적어도 4%이다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 상기 표적 세포는 K562 세포이고, 적어도 하나의 항-IFNγ 항체로 염색되는 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색된 생존 세포의 백분율은 적어도 10%이다.
일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 상기 표적 세포는 K562 세포이고, 적어도 하나의 항-TNFα 항체로 염색되는 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색된 생존 세포의 백분율은 적어도 10%이다.
따라서, 본 발명의 구현예의 일 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체를 위해 확장된 NK 세포 분획을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다:
(a) 대상체와 동종인 NK 세포 및 CD3+ 세포를 포함하는 혈액성분채집 생성물을 얻는 단계;
(b) 혈액성분채집 생성물을 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획으로 분리하는 단계;
(c) 방사선 조사에 의해 상기 CD3+ 세포 분획의 세포를 불활성화시키는 단계;
(d) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 CD3-고갈 세포 분획을 불활성화되고 조사된 CD3+ 세포 분획과 함께 생체외 배양하는 단계; 여기서 상기 조건은 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아미드를 1.0 mM 내지 10 mM 양으로 제공하는 것을 포함하고;
(e) 단계 (d) 이후 6~10일, 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드로 보충하여 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 생성하는 단계;
(f) 단계 (d) 이후 14-16일, 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 수확하는 단계; 및
(g) 단계 (f)의 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 세척 및 농축하여 상기 대상체에게 투여하기 위한 확장된 NK 세포 분획을 생성하는 단계.
본원에 사용된 용어 자연살해(NK) 세포는 선천성 면역 반응에 관여하는 큰 과립형 림프구를 의미한다. 기능적으로 NK 세포는 퍼포린, 그랜자임 프로테아제 등 다양한 단백질을 함유한 세포질 과립의 세포외유출을 통해 다양한 표적에 대해 세포용해 활성을 나타낸다. 사멸(Killing)은 항원에 대한 사전 감작을 필요로 하지 않는 접촉 의존적, 비식세포 과정에서 유발된다. 인간 NK 세포는 세포 표면 표지인 CD16과 CD56이 존재하고 T 세포 수용체(CD3)가 없다는 특징이 있다. 인간 골수 유래 NK 세포는 CD2+CD16+CD56+CD3- 표현형을 특징으로 하며 T 세포 수용체 제타 사슬[zeta(ζ)-TCR]을 추가로 포함하고 종종 NKp46, NKp30 또는 NKp44를 특징으로 한다. NKT 세포 또는 CD8NKT와 같은 비-NK 세포는 T 세포와 NK 세포 모두의 특성과 세포 표면 마커를 보유한다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 세포 집단으로부터 성숙한 NK 세포의 생체외 증식을 위해 사용된다. 본원에 사용된 용어 "성숙한 NK 세포"는 특징적인 표면 마커 및 NK 세포 기능을 갖고 추가 분화 가능성이 결여된 수임 NK 세포로 정의된다. 본원에서 사용되는 성숙한 NK 세포에는 증식하여 풍부한 사이토카인을 생산할 수 있는 CD56bright 세포, 강력한 세포독성을 나타내는 CD56dim세포, CD56brightCD94high 및 CD56dimCD94high 세포가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 구현예에서, NK 전구 세포, 또는 NK 전구 세포와 성숙한 NK 세포의 혼합 집단이 증식된다. CD56, CD3, CD94 및 기타 마커의 세포 표면 발현은 예를 들어 FACS 분석 또는 면역조직학적 염색 기술을 통해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전구체"는 하나 이상의 성숙한 이펙터 세포로 분열 및/또는 분화를 겪을 수 있는 미성숙 세포를 의미한다. 림프구 전구세포에는 예를 들어 B 세포, T 세포 및 NK 계통의 성숙한 세포를 생성할 수 있는 다능성 조혈 줄기 세포가 포함된다. B 세포 계통(즉, 성숙한 B 세포를 생성하는 발달 경로)에서 전구 세포에는 면역글로불린 유전자 재배열 및 발현을 특징으로 하는 pro-B 세포 및 pre-B 세포도 포함된다. T 및 NK 세포 계통에서 전구 세포에는 골수 유래 양성 T/NK 세포 전구 세포도 포함된다[예, CD34(+)CD45RA(hi)CD7(+) 및 CD34(+)CD45RA(hi)Lin(-)CD10(+) 세포] 뿐만 아니라 이중 음성(CD4 및 CD8에 대해) 및 이중 양성 흉선 세포(T 세포 계통) 및 수임 NK 세포 전구 세포를 포함하는 흉선내 전구 세포도 포함된다.
본 발명의 NK 세포는 이러한 세포를 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. NK 세포는 많은 조직에서 발견되며, 예를 들어 림프절, 비장, 간, 폐, 장, 십이지장에서 얻을 수 있으며 iPS 세포 또는 배아줄기세포(ESC)에서도 얻을 수 있다. 일반적으로 이종 림프구 세포 집단을 포함하는 제대혈, 말초 혈액, 동원된 말초 혈액 및 골수는 연구 및 임상용으로 많은 수의 NK 세포를 제공하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 NK 세포는 혈액성분채집 생성물 또는 백혈구 성분채집 생성물의 NK 세포 분획이다.
혈액성분채집술에서, 기증자 혈액 전체는 일반적으로 원심분리에 의해 혈액 성분(예, 혈장, 백혈구 및 적혈구)으로 분리되고, 선택된 성분은 조작(예, 백혈구 분획 배양)을 위해 채취되고 나머지는 기증자에게 반환된다. 혈액성분채집술은 체액(예, 혈장) 및 기타 혈액 성분을 고갈시키지 않고 특정 혈액 분획(예, 백혈구 분획)을 대량으로 제공할 수 있다는 장점이 있다. 혈액성분채집술은 적은 체외 부피를 필요로 하는 연속 흐름 원심분리 또는 주기에 따라 성분을 분리하는 혈액의 간헐 흐름 원심분리를 기반으로 할 수 있지만 일반적으로 시간이 더 많이 걸리고 기증자 혈액의 체외 부피가 더 크다는 특징이 있다. 많은 적합한 혈액성분채집 장치가 시판 중이다. 일반적으로 혈액성분채집술은 기증자의 말초 혈액에서 혈액 성분을 분리하는데 적용된다.
본원에 사용된 용어 "혈액성분채집 생성물"은 혈액성분채집술을 통해 기증자의 순환 혈액에서 수집한 세포를 의미한다. NK 세포 주입에 대한 임상 경험에 따르면 동종 NK 세포는 숙주에 성공적으로 이식될 수 있으며 이식편대숙주병(GVHD) 발생률이 낮다. 본원에 사용된 "대상체와 동종이계 혈액성분채집 생성물"은 대상 자신이 아닌 기증자로부터 수집된 세포를 의미한다. 특정 구현예에서, 혈액성분채집 생성물 또는 생성물들은 대상과 동종이계 혈액성분채집 생성물이다. 일부 구현예에서, 알려진 대상체에 대한 혈액성분채집 생성물을 제공하기 위해 특정 기증자 또는 기증자들이 식별될 수 있다. 다른 구현예에서, 동종 혈액성분채집 생성물은 기증자의 신원을 고려하지 않고 적합한 혈액성분채집 생성물의 "뱅크"로부터 선택된다.
혈액성분채집 생성물은 일부 양태에서 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하고, 일부 측면에서는 적혈구 이외의 세포를 포함한다. 세포와 혈소판. 다양한 혈액성분채집 방법이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 20160184361, 20180043082, 20170021083, 20060116271, 20050155932, 20050143684 및 20030195455에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 버퍼 또는 배지에 넣기 위해 기증자로부터 수집된 세포를 세척한다. 일부 구현예에서, 세포는 PBS로 세척되고 PBS에 재현탁된다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 원치 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 풍부하게 하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위해 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 민감도 및/또는 특정 성분에 대한 저항성과 같은 하나 이상의 특성을 기준으로 분리된다. 일부 구현예에서, 방법에는 RBC 용해 버퍼(예, 염화암모늄-칼륨(ACK) 버퍼)를 사용하여 적혈구를 용해시키는 단계, 투명하거나 밝은 분홍색이 될 때까지 세척 및 원심분리를 반복하는 단계가 포함된다.
따라서, 본 발명의 일 구현예의 일 양태에 따르면, 방법은 NK 세포를 포함하는 CD3-고갈 세포 분획을 배양하는 것을 포함하며, 여기서 CD3-고갈 세포 분획은 혈액성분채집술로부터 유래된다. 특정 구현예에서, CD3-고갈 세포 분획은 PCS2 또는 MCS8150 Haemonetics 성분채집 기계(Haemonetics, Boston, MA)를 사용하여 공여자로부터 얻은 혈액성분채집 단위로부터 유래된다. 특정 구현예에서, CD3-고갈 세포 분획은 기증자의 말초 혈액으로부터 얻은 혈액성분채집 단위로부터 유래된다. 혈액성분채집술 전에, 기증자는 골수 및 비장과 같은 조혈 세포 공급원으로부터 원하는 세포 집단(예, 림프구)을 동원하는 것으로 알려진 조성물(예: Plerixafor)로 치료될 수 있다.
확장된 NK 세포 집단은 임상 환경(예, 환자에게 주입)에 사용하기 위한 것이라는 사실로 인해, 본원에 기술된 방법에 따라 세포 선택 및 확장을 위해 선택된 혈액성분채집 생성물은 임상 등급 혈액성분채집 단위라는 것이 이해될 것이다.
일부 구현예에서 혈액성분채집 생성물은 신선한 세포 집단일 수 있는 반면, 다른 구현예에서 세포는 저장된 혈액성분채집 세포 집단(예컨대, 냉동보존 및 해동된 세포)으로부터 배양된다. 다른 구현예에서, 세포는 이전에 배양된 세포 집단으로부터 배양된다.
일부 구현예에서, 혈액성분채집 생성물은 CD3- 및 CD3+ 세포를 분리하기 전에 생존력 및 세포 표현형에 대해 평가된다. 특정 구현예에서, 성분채집 생성물의 세포는 적어도 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 생존 가능하다. 일부 구현예에서, 세포 생존력은 FACS 및/또는 Cedex(자동 트립판 블루 배제 검정)에 의해 평가된다. 특정 구현예에서, 혈액성분채집 생성물의 세포는 90% 이상 생존 가능하다.
전체 세포 수, 생존력, 표현형, 효능 및/또는 기능에 대한 평가는 과정의 임의의 시점(예, CD3 고갈 전 또는 후, 확장 전, 시딩, 배양 중, 수확 중, 냉동 보존 전, 냉동 보존 후, 보관 중, 해동 전, 해동 중 및/또는 해동 후, 주입 전 또는 중 언제든지)에서 임의의 세포 집단에 대해 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 결과 프로파일(세포 수, 생존력, 표현형 및/또는 기능)은 세포 집단을 모니터링하는데 사용될 수 있거나. 예, 청구된 방법의 임의의 시점에서든 세포 집단 또는 제제의 선택 또는 제외를 위한, 또는 프로토콜 변경(예, 단위 내 세포 수는 프로토콜의 다음 단계를 진행하기 위해 단위 조합의 필요성을 결정할 수 있음)을 위한 선택 또는 방출 기준을 식별하는데 사용될 수 있다.
청구된 방법에 대해 평가될 수 있는 관련 파라미터에는 세포 수, 세포 생존율(예, Cedex, 상기 참조), 오염(예, 마이코플라스마, 박테리아, 내독소 수준), 무균성, NK 관련 세포 기능(예: 세포 사멸 분석, 항체 의존성 세포 독성-ADCC, 생착 가능성), 표현형(예, CD56, CD3, CD16, CD107a와 같은 세포 마커, CD62L), 효능(CD107a 및 CD62L, 사이토카인 분비 - 예: INF-γ, TNF-α, GM-CSF), 외관 및 온도을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법의 임의의 단계에서 처리 전, 도중 및/또는 처리 후의 세포 집단은 유세포 분석(FACS) 분석 또는 특정 항체를 사용한 ELISA 통해 생존력(예, Zombie Violet Violet Viability Dye(Biolegend) 사용), 표면 마커 CD107a, CD56 및 CD16과 INF-γ, TNF-α, 및 NK 기능(ADCC 및 세포 사멸)을 포함한 효능에 대해 평가될 수 있다.
"버피 코트" 또는 혈액성분채집 단위와 같은 림프구 분획은 특정하게 정의된 세포 집단을 농축, 정제 또는 분리하기 위해 처리될 수 있다. "정제"와 "분리"라는 용어는 절대적인 순도를 요구하지 아니라 상대적인 용어로 사용된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 림프구 집단은 특정 세포가 그 원천 조직에 있는 세포 보다 더 농축된 세포 집단이다. 실질적으로 순수한 림프구 제제는 원하는 세포가 제제에 존재하는 전체 세포의 50% 이상을 나타내도록 농축될 수 있다. 특정 구현예에서, 실질적으로 순수한 세포 집단은 제제 중 전체 세포의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 나타낸다. 일부 구현예에서, 혈액성분채집 생성물은 CD3-(예, CD3-CD56+ NK 세포) 및 CD3+ 세포(예, T 세포 및 NKT 세포)를 모두 포함한다.
림프구를 농축하고 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 원하는 집단에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 접근법에서는 적혈구를 제거하여 원료 물질에서 림프구를 강화한다. 밀도에 따라 적혈구는 림프구 및 다른 세포와 분리된다. 그런 다음 림프구가 풍부한 분획을 선택적으로 회수할 수 있다. 림프구와 그 전구 세포는 또한 다양한 상업적 소스에서 구할 수 있는 표준 림프구 분리 배지(LSM)와 같은 분리 배지를 사용하여 원심분리하여 농축할 수 있다. 대안적으로, 림프구/전구체는 다양한 친화력 기반 절차를 사용하여 농축될 수 있다. 항체 접합 자기 비드와 같은 수많은 항체 매개 친화성 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. 림프구 농축은 또한 FICOLL-HYPAQUE™ 및 전체 림프구, T 세포 또는 NK 세포의 농축을 위해 제조된 기타 밀도 구배 배지와 같이 원치 않는 세포를 음성으로 선택하기 위해 시판되는 제제를 사용하여 수행될 수도 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 혈액성분채집 생성물은 CD3-고갈 세포 분획과 CD3-함유(CD3+) 세포 분획으로 분리된다. 혈액, 골수, 림프구 제제(예, 혈액성분채집 단위) 또는 조직 샘플로부터 CD3-세포를 선택하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜은 단핵 세포 분별 및 CD3+와 같은 비-NK 세포의 고갈을 기반으로 하는 프로토콜이다. CD34+ 및 CD133+와 같은 다른 세포 유형의 고갈도 수행될 수 있다. 2개 이상의 프로토콜을 조합하여 비-NK 오염물질로부터 더 높은 순도를 갖는 CD3-고갈 세포 집단을 제공할 수 있다. CD3-음성 세포 분리를 위해 시판되는 키트에는 CD3+의 고갈, 또는 부분 고갈 또는 T 세포를 인식하고 제거하는 비-NK 세포 항체의 고갈을 포함하는 1단계 절차와 다단계 절차가 포함된다. 특정 구현예에서, NK 세포 분획은 예를 들어 CliniMACS T 세포 고갈 세트((LS Depletion set (261-01) Miltenyi Biotec, CliniMACS CD3 시약(Miltenyi REF 273-01, Miltenyi Biotech) 사용)을 사용하여 면역자기(immunomagnetic) 선택에 의해 CD3 세포를 고갈시킨다. 특정 구현예에서, CD3-고갈 세포 분획 및 CD3+ 세포 분획은 별도로 세척되고 원심분리된다.
일부 구현예에서, CD3-고갈 분획은 CD56+CD16+CD3- 세포 및/또는 CD56+CD16-CD3- 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, CD3-고갈 분획은 적어도 10% CD56+/CD3- 세포, 적어도 20% CD56+/CD3- 세포, 적어도 30% CD56+/CD3- 세포, 적어도 40% CD56+/CD3- 세포, 적어도 50% CD56+/CD3- 세포, 적어도 60% CD56+/CD3- 세포, 적어도 70% CD56+/CD3- 세포, 적어도 80% CD56+/CD3- 세포 또는 적어도 90% CD56+/CD3- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3-고갈 분획은 40%-97% CD56+/CD3- 세포, 30%-90% CD56+/CD3- 세포, 40%-80% CD56+/CD3- 세포, 55-75% CD56+/CD3- 세포, 60%-70% CD56+/CD3- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3-고갈 분획은 15% 내지 90% CD56+/CD3- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3-고갈 분획은 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.25% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만, 0.025% 미만의 CD3+ 세포를 포함한다.
표현형에 따라 세포를 선택하는 방법에는 면역검출(예, ELISA) 및 FACS 분석이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, CD3-고갈 세포 분획은 비분할 피더 세포와 같은 피더 세포를 배양에 첨가함으로써 확장된다. 적합한 피더 세포는, NK 세포 배양 조건에 대한 기여도를 유지하면서 배양에서의 증식을 방지하기 위해 방사선 조사 또는 다른 방식으로 불활성화되는 T 세포, 기질 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 섬유아세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 분리 후 혈액성분채집 생성물의 CD3+ 세포 분획은 불활성화되어 CD3-고갈 세포의 배양을 위한 피더 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 비-분열 피더 세포는 감마- 또는 X-선 조사된 CD3+ 피더 세포를 포함할 수 있다. 조사는 CELLRAD 조사기(Precision X-Ray, N Branford CT)와 같은 상업적으로 이용 가능한 세포 조사 장치 중 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, CD3+ 세포 분획 세포는 세포 분열을 방지하기 위해 약 30 내지 50Gy, 130kV 범위의 X-선으로 조사된다. 특정 구현예에서, CD3+ 분획은 CELLRAD 조사기를 사용하여 40Gy, 130 kV, 5mA의 표적 용량으로 조사된다. 조사 후, CD3+ 세포 분획을 세척하고, 원심분리에 의해 농축하고, 예를 들어 접종 전에 배양 배지에 재현탁시킬 수 있다. CD3+ 세포의 불활성화는 세포에 배양 조건(배지, 온도 및 습기)을 제공하고 성장 또는 부재를 모니터링하여 평가할 수 있다.
본 발명자들은 비-증식 피더 세포와 함께 NK 세포를 포함하는 CD3 세포 분획의 배양이 확장된 NK 세포 집단의 더 큰 확장 및 강화된 기능을 제공한다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 일부 양태에서, NK 세포를 포함하는 CD3-세포 분획은 불활성화된(예, 방사선 조사된) 피더 세포와 함께 배양을 위해 접종된다. 특정 구현예에서, NK 세포를 포함하는 CD3- 세포 분획은 조사된 CD3+ 세포와 함께 배양하기 위해 접종된다. 특정 구현예에서, NK 세포를 포함하는 CD3-세포 분획은 동일한 혈액성분채집 생성물로부터의 상응하는 CD3+ 세포 분획과 함께 배양을 위해 접종된다.
일부 구현예에서, CD3- 세포 및 CD3+ 세포는 0.1:1 내지 5:1 CD3- 세포 대 CD3+ 세포 범위의 (수치적) 비율로 배양을 위해 접종된다. 일부 구현예에서, 접종을 위한 CD3- 대 CD3+ 세포 비율은 0.2:1, 0.5:1, 0.75:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.4:1, 1.8:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1 또는 5:1이다. 특정 구현예에서, CD3+ 세포는 CD3- 분획의 세포와 1:1의 비율로 접종된다.
본 발명의 일부 양태에서, 세포는 0.20-0.60 X106 세포/ml 범위로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 0.25 X106 세포/ml, 0.30 X106 세포/ml, 0.35 X106 세포/ml, 0.40 X106 세포/ml, 0.45 X106 세포/ml, 0.50 X106 세포/ml, 0.55 X106 세포/ml, 또는 0.60 X106 세포/ml의 농도로 접종된다. 특정 구현예에서, 세포는 0.30-0.40 X106 세포/ml, 특히 0.35 X106 세포/ml의 농도로 접종된다. 특정 구현예에서, 배양용 세포의 접종은 0.35X106 CD3-고갈 및 0.35X106 조사된 CD3+ 세포/ml에서 영향을 받는다.
배양용 세포는 세포 배양 플라스크 또는 기타 적합한 용기에 접종될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 기체 투과성 세포 배양 플라스크, 예컨대 G-Rex 플라스크(WilsonWolf, St Paul MN), 특히 G-Rex 플라스크에 접종된다. 플라스크 부피는 필요에 따라 선택될 수 있다. 특정 구현예에서 세포는 G-Rex500MCS 플라스크, GMP 등급에 접종된다.
일부 구현예에서, CD3-고갈 세포 분획 및 CD3+ 세포 분획(혈액성분채집 단위의 분리로부터 얻음)의 전체 부피는 배양을 위해 접종된다. 따라서 일부 구현예에서는 하나 이상의 플라스크에 접종이 필요하다. 예를 들어, 2리터 용량의 배지가 들어 있는 플라스크를 사용하여 배양용 세포 접종에 0.35X106 CD3-고갈 및 0.35X106 조사된 CD3+ 세포/ml에서 영향을 받을 때, CD3-고갈 및/또는 CD3+ 세포의 세포 수가 분획이 분획당 700X106개 세포를 초과한다면, CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획의 전체 부피를 시드하려면 추가 플라스크가 필요하다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포의 배양은 플라스크 내 400-900X106 CD3이 고갈되고 400-900X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크, 특히 700X106 CD3이 고갈되고 700X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크의 영향을 받는다.
NK 세포는 단기 또는 장기 배양에 의해 생체외에서 배양될 수 있다. 본 발명자들은 NK 세포가 성장 인자 및 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 부분과 함께 배양될 수 있으며, 적게는 7일, 많게는 3주 동안 배양된 NK의 강화되고 우선적인 증식 및/또는 기능성을 가져온다는 것을 입증하였다. 사이토카인과 함께 배양되었지만 0.1 mM 미만의 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 모이어티를 가지고 배양된 세포와 비교한 결과이다(PCT 공개 WO2011/080740 참조). 임상 시험에서, 양성-선별된 CD56+/CD3- 세포 분획에서 니코틴아미드로 새로 준비된 일란성 NK 세포를 14~16일 동안 NHL 및 MM 환자에게 주입하면 효율적인 생착과 상당한 비율의 무진행 생존이 가능해졌다(참조: Bachanova 등 2019, Blood, Volume 134, Supplement 1, Page 777). 그러나 새로 확장된 세포의 사용은 심각하게 제한되어 있으므로, 냉동보존 및 보관에 적합한 확장된 NK 세포 분획의 치료적으로 유리한 기능을 유지하면서 더 큰 생체외 NK 세포 확장을 제공하는 것이 바람직하다.
따라서, 특정 구현예에서, CD3-고갈 세포 및 CD3+ 세포 분획은 14-16일의 기간에 걸쳐 배양된다.
본 발명의 이러한 양태에 따르면, NK 세포를 포함하는 CD3-고갈 분획의 생체외 배양은 CD3-고갈 세포에 세포 증식을 위한 조건을 생체 외 제공하고 CD3-고갈 세포를 니코틴아미드 모이어티와 함께 생체 외 배양함으로써 NK 세포 집단을 생체 외에서 확장하는 효과를 얻을 수 있다.
조사된 CD3+ 분획과 결합하면, CD3-고갈 분획의 배양은 NK 세포 분획의 증식 및 기능 향상에 관련되며, 불활성화된 CD3+ 분획은 비증식성이고 본원에 기술된 방법의 배양 조건 하에서 유의한 확장을 거치지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다.
본원에 사용된 "배양"에는 NK 세포 유지 및 성장 인자에 필요한 화학적 및 물리적 조건(예, 온도, 가스)을 제공하는 것이 포함된다. 일 구현예에서, 조합된 CD3-고갈 세포 및 CD3+ 세포 분획을 배양하는 것은 세포에 NK 세포 증식을 위한 조건을 제공하는 것을 포함한다. NK 세포 증식을 지원할 수 있는 화학적 조건의 예에는 버퍼, 영양소, 혈청, 비타민 및 항생제뿐만 아니라 성장(즉, 배양) 배지에 일반적으로 제공되는 사이토카인 및 기타 성장 인자가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 세포 증식을 위한 조건은 영양소, 혈청 및 사이토카인(들)을 포함한다. 일 구현예에서, NK 배양 배지는 MEMα(BI, 이스라엘 Bet HaEmek, 이스라엘) 및 혈청과 같은 최소 필수 배지(MEM)를 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청은 배양 배지의 2-20%, 5-15% 또는 5-10%로 제공된다. 특정 구현예에서, 혈청은 배양 배지의 10%로 제공되는 인간 혈청이다. 특정 구현예에서, 배양 배지는 10% 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 MEMα이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 배지는 Glascow 배지(Gibco Carlsbad CA), RPMI 배지(Sigma-Aldrich, St Louis MO) 또는 DMEM(Sigma-Aldrich, St Louis MO)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 많은 배양 배지에는 비타민 보충제, 예를 들어 MEMα(8.19μM 니코틴아미드), RPMI(8.19μM 니코틴아미드), DMEM(32.78μM 니코틴아미드) 및 Glascow 배지(16.39μM 니코틴아미드)로 니코틴아미드를 포함되어 있음을 유의할 것이나, 본 발명의 방법은 배지의 포뮬러에 포함된 임의의 니코틴아미드 및/또는 니코틴아미드 모이어티를 보충하는 외인성 첨가 니코틴아미드, 또는 배지 성분 농도의 전반적인 조정으로 인한 결과와 관련된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, NK 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 CD3-고갈 세포 및 CD3+ 세포 분획을 배양하는 것은 세포에 영양소, 혈청 및 사이토카인을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 성장 인자는 사이토카인 및/또는 케모카인을 포함한다. 사이토카인 및 기타 성장 인자는 일반적으로 0.5-100ng/ml 또는 1.0-80ng/ml, 보다 일반적으로 5-750ng/ml, 더욱 일반적으로 5.0-50ng/ml 범위의 농도로 제공된다(이러한 농도의 최대 10X가 고려될 수 있음). 예를 들어 미국 뉴저지주 록키힐 소재의 Perpo Tech, Inc.로부터 상업적으로 입수 가능하다. 일 구현예에서, 세포 증식을 가능하게 하는 조건은 사이토카인 인터루킨 15(IL-15)를 제공하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, CD3-고갈 세포는 20ng/ml IL-15와 함께 배양된다.
배양에서 NK 세포 증식을 위한 추가 조건에는 에너지 및 질소의 보조 공급원으로서 글루타민의 제공이 포함된다. 일부 구현예에서 배양 배지는 0.5-5 mM 글루타민을 포함한다. 특정 구현예에서, 배양 배지는 2mM 글루타민을 포함한다. 글루타민은 배양 안정성을 높이기 위해 글루타민 또는 디펩티드 L-알라닌-L-글루타민으로 제공될 수 있다.
배양 배지는 일반적으로 항생제(예, 겐타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신)를 포함하며; 일부 구현예에서, 배양 배지는 0.01-1.0 mg/ml 범위의 겐타마이신을 포함한다. 특정 구현예에서, 겐타마이신은 배양 배지에 0.05 mg/ml로 제공된다.
비-증식(예, 방사선 조사) CD3+ 세포와 배양된 세포에서, CD3-고갈 세포 분획에 유익한 성장 인자를 분비하도록 T 세포를 자극하는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 구현예에서, CD3-고갈 세포 및 CD3+ 세포 분획은 CD3 작용제가 보충된 배양 배지에 접종된다. 본 발명의 방법과 사용하기에 적합한 CD3 작용제는 특히 OKT-3(Muromonab-CD3으로도 알려짐), mAb 145-2C11, MGA031 및 ChAglyCD3과 같은 항-CD3 단일클론-CD3 작용제 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, CD3 작용제 OKT-3은 접종 시 0.1 내지 5 μg/ml의 농도 범위로 제공된다. 특정 구현예에서, OKT-3(MACS® GMP CD3 pure, Milentyi 170-076-116로 이용 가능)는 1μg/ml의 농도로 접종 시 배양 배지에 제공된다.
또한, 이와 관련하여 신규한 사이토카인이 지속적으로 발견되고 있으며, 그 중 일부가 본 발명의 NK 세포 증식 방법에 사용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
일 구현예에 따르면, CD3-고갈 세포 및 CD3+ 세포 분획은 영양소, 혈청, 사이토카인(예, IL-15), CD3 작용제 및 니코틴아미드 및/또는 니코틴아미드 모이어티와 배양된다. 본원에서 사용된 용어 "니코틴아미드 모이어티"는 니코틴아미드뿐만 아니라 니코틴아미드, 이의 유도체, 유사체 및 대사산물, 예를 들어 NAD, NADH 및 NADPH로부터 유도된 생성물을 의미하며, 이는 NK 세포 증식 및/또는 활성화를 효과적이고 우선적으로 향상시킬 수 있다. 니코틴아미드 유도체, 유사체 및 대사체는 아래에 설명된 바와 같이 유지된 NK 배양에 추가하여, 사멸 및 운동성 분석과 같은 기능 분석 또는 당업자에게 잘 알려진 고처리량 분석을 위해 설계된 자동화된 스크리닝 프로토콜을 통해 생체 외 NK 증식에 미치는 영향을 스크리닝하고 평가할 수 있다.
본원에 사용된 "니코틴아미드 유사체"라는 문구는 상기 언급된 또는 유사한 분석에서 니코틴아미드와 유사하게 작용하는 것으로 알려진 모든 분자를 의미한다. 니코틴아미드 유사체의 대표적인 예로는 벤즈아미드, 니코틴티오아미드(니코틴아미드의 티올 유사체), 니코틴산 및 α-아미노-3-인돌프로피온산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"니코틴아미드 유도체"라는 문구는 니코틴아미드 자체 또는 니코틴아미드 유사체의 임의의 구조적 유도체를 추가로 의미한다. 이러한 유도체의 예로는 치환된 벤즈아미드, 치환된 니코틴아미드 및 니코틴티오아미드 및 N-치환된 니코틴아미드 및 니코틴티오아미드, 3-아세틸피리딘 및 소듐 니코티네이트가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서 니코틴아미드 모이어티는 니코틴아미드이다.
본 발명의 일부 구현예에 사용하기에 적합한 니코틴아미드 또는 니코틴아미드 모이어티 농도는 일반적으로 약 0.5mM 내지 약 50mM, 약 1.0mM 내지 약 25mM, 약 1.0mM 내지 약 25mM, 약 2.5mM, 약 2.5mM 내지 약 10mM, 약 5.0mM 내지 약 10mM의 범위에 있다. 니코틴아미드의 예시적인 유효 농도는 니코틴 아미드가 증식 및 NK 세포 기능에 미치는 영향에 기초하여 약 0.5 내지 약 15mM, 1.0-10.0mM, 전형적으로 2.5 또는 5.0mM일 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 니코틴아미드는 약 0.5, 약 0.75, 약 1.0, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2.0, 약 2.25, 약 2.5, 약 2.75, 약 3.0, 약 3.25, 약 3.5, 약 3.75, 약 4.0, 약 4.25, 약 4.5, 약 4.75, 약 5.0, 약 5.25, 약 5.5, 약 5.75, 약 6.0, 약 6.25, 약 6.5, 약 6.75, 약 7.0, 약 7.25, 약 7.5, 약 7.75, 약 8.0, 약 8.25, 약 8.5, 약 8.75, 약 9.0, 약 9.25, 약 9.5, 약 9.75, 약 10.0, 약 11.0, 약 12.0, 약 13.0, 약 14.0, 약 15.0, 약 16.0, 약 17.0, 약 18.0 및 약 20.0 mM의 범위 농도로 제공된다. 모든 효과적인 중간 농도가 고려된다. 특정 구현예에서, 증식을 허용하는 조건은 1.0 내지 10.0 mM 니코틴아미드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 증식을 허용하는 조건은 7.0 mM 니코틴아미드를 포함한다.
니코틴아미드 및/또는 니코틴아미드 모이어티의 적합한 농도는 NK 증식, 세포 표현형 및/또는 활성, 예를 들어 세포 배양 또는 기능(예, 효능)의 임의의 분석에 따라 결정될 수 있다. 니코틴아미드의 적합한 농도는 동일한 분석 및 유사한 배양 조건(니코틴아미드에 노출되는 기간, 니코틴아미드에 노출되는 시간)에서 동일한 NK 세포 공급원(예, 제대혈, 골수 또는 말초 혈액 제제)에서 테스트되고 0.1mM 미만의 니코틴아미드인 "대조군" 배양과 비교하여, 배양에서 이를 사용하면 배양에서 NK 세포의 증식, 특정 표현형 및/또는 기능을 "강화"하거나 결과적으로 증가시키는 농도이다.
일부 연구에서, 영양소, 혈청, 사이토카인 및 니코틴아미드를 사용한 배양에 의한 NK 세포의 생체 외 확장은 배양 기간 동안 배지를 보충하거나 조작할 필요가 없으며, 다른 연구에서는 NK 세포 배양 중 서로 다른 간격으로 배양 배지 보충("재공급")을 옹호하였다. 본 발명의 특정 구현예에서, CD3-고갈 세포 분획은 배양 기간 동안 "재공급"된다. 따라서, 특정 구현예에서, CD3-고갈 세포를 배양하는 것은 생체외 배양 개시 후 6-10일에 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획에 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 보충하는 것을 포함한다(단계 "e " 참조). 일부 구현예에서, 생체외 배양 개시 후 6~7일 사이, 생체 외 배양 개시 후 7~8일 사이, 생체 외 배양 개시 후 8~9일 사이, 생체외 배양(접종) 개시 후 9~10일 사이 또는 CD3-고갈 세포의 배양 개시 후 6-10일 사이에 보충된다.
일부 구현예에서, 보충(또는 "재공급")은 세포 배양 배지의 약 30-80%, 약 40-70% 또는 약 45-55%를 제거하고 제거된 배지를 동일한 조성 및 수준의 영양소, 혈청, 사이토카인(예, IL-15) 및 니코틴아미드를 갖는 유사한(예, 동등한) 부피의 새로운 배지로 교체하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 보충(또는 "재공급")은 NK 세포 분획 배양 배지의 약 50%를 제거하고, 제거된 배지를 동일한 조성 및 영양소, 혈청, 사이토카인(예, IL-15) 및 니코틴아미드를 갖는 유사한(예, 동등한) 부피의 새로운 배지로 교체하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 재공급을 위해 배양 배지를 제거하지 않으며, 동일한 조성과 수준의 영양소, 혈청, 사이토카인(예, IL-15), 항생제, 글루타민 및 니코틴아미드를 포함하는 새로운 배양 배지를 CD3-고갈 세포 배양 시작 시("접종") 배양 부피가 원래 배양 부피의 약 2배에 도달할 때까지 첨가한다 . 특정 구현예에서, "재공급"을 위한 배양 배지는 CD3-수용체 작용제를 포함하지 않는다. (예, OKT-3 미포함)
NK 세포 집단은 다양한 방법과 장치를 사용하여 배양될 수 있다. 배양 장비의 선택은 일반적으로 배양 규모와 목적에 따라 결정된다. 세포 배양의 스케일 업은 전용 장치를 사용하는 것이 바람직하다. 대규모 임상 등급 NK 세포 생산을 위한 장치는 예를 들어 Spanholtz et al. (PLoS ONE 2010;5:e9221) 및 Sutlu et al. (Cytotherapy 2010, Cytotherapy 12(8):1044-55)에 상세히 설명되어 있다. 일부 구현예에서, (예, 본 방법의 단계 (b) 및/또는 (c)) NK 세포 분획의 배양은 100-4000 X 106 세포/플라스크의 세포 밀도로 플라스크에서 수행된다. 특정 구현예에서, NK 세포 분획의 배양(예, 생체외 배양의 개시 및/또는 "재공급")은 200-300 X 106 세포/플라스크의 세포 밀도로 플라스크에서 수행된다. 특정 구현예에서, 플라스크는 G-Rex 배양 장치(G-Rex 100M 또는 폐쇄 시스템 G-Rex MCS, WolfWilson, St Paul MN)와 같은 기체 투과성 막을 포함하는 플라스크이다.
배양 플라스크 내 세포의 밀도는 배양 기간에 걸쳐 세포의 증식에 따라 증가한다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 400-900X106 CD3-고갈 및 400-900X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크, 특히 배양 내 확장 과정 동안, 700X106 CD3-고갈 및 700X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크에서 접종함으로써 세포의 배양이 플라스크에서 영향을 받지만, CD3-고갈 분획의 세포는 100-4000 X 106 세포/플라스크, 150-3500 X 106 세포/플라스크, 200-4000 X 106 세포/플라스크, 300-4000 X 106 세포/플라스크, 200-3000 X 106 세포/플라스크, 300-2000 X 106 세포/플라스크, 400-1000 X 106 세포/플라스크, 250-800 X 106 세포/플라스크, 100-600 X 106 세포/플라스크 또는 150-500 X 106 세포/플라스크의 세포 밀도에서 배양된다. 특정 구현예에서, 플라스크에서 배양 기간 동안, NK 세포 분획의 NK 세포는 플라스크당 100-3000 X 107개 세포의 세포 밀도로 배양된다. 일부 구현예에서, 확장되고 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더 세포 분획 내 NK 분획의 확장 배수는 원래 세포 수의 2-15X 범위에 있다. 특정 구현예에서, NK 세포 확장은 확장 주기 완료 시 세포의 약 90%이고, 배수 증가는 2-10배이다. 특정 구현예에서, 확장 동안 NK 세포의 배수 증가는 배양 전 혈액성분채집 유닛 내 NK 세포 수의 2-6배, 3-5, 4-6 또는 4-5배이다.
NK 세포의 배양은 피더 세포 또는 피더 세포층의 유무에 따라 효과적일 수 있다. 본 발명자들은 CD3-고갈 분획을 이의 불활성화된 상응하는 CD3+ 분획과 함께 배양하는 것이 확장된 NK 세포 집단의 증식 및 기능성을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 따라서, 일 구현예에 따르면, 피더층 또는 피더 세포로 NK 세포 집단을 배양하는 것이 효과적이다.
특정 구현예에서, CD3-고갈 및 CD3+ 분획 세포 배양 개시 후 14-16일에 CD3-고갈 NK 세포가 배양물로부터 수확된다 (단계 (b)). 세포 수확은 부착된 세포를 방출(예, 배양 용기 표면을 "스크래핑")하거나 배양 용기에서 세포를 효율적으로 세척하고 자동으로 세포를 수집하도록 설계된 세포 수확 장치를 사용하여 수동으로 수행할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 수확 장치(예, Fresenius Kabi(독일 함부르크)의 LOVO 세포 처리 장치)에 의해 배양 용기에서 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획을 수확한다.
일부 구현예에서, 배양물로부터 확장된 CD3-고갈, NK-세포 농축(확장을 통해) 분획을 수확하면 배양 용기에서 대부분 또는 거의 모든 세포(조사된 CD3+ 피더 세포 포함)가 제거된다. 다른 구현예에서, 수확은 2단계 이상으로 수행될 수 있으며, 수확되지 않은 세포는 나중에 수확될 때까지 배양 상태로 유지될 수 있다. 특정 구현예에서, 확장된 CD3-고갈 NK 세포-함유 분획은 두 단계로 수확되는데, 이는 확장된 CD3-고갈 NK-함유 세포 분획의 첫 번째 부분을 수확하고 이어서 확장된 CD3-고갈 세포의 두 번째 부분을 수확하는 것을 포함한다. 두 부분의 수확은 첫 번째 부분과 두 번째 부분의 수확 사이에 수 시간, 수 일 또는 그 이상의 간격을 두고 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 수확은 단계 (b)(배양 개시) 후 약 14일에 확장된 CD3-고갈 NK 세포의 첫 번째 부분을 수확하고, 약 2일 후에 확장된 CD3-고갈 세포 분획의 두 번째 부분을 수확하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 첫 번째 부분은 생체외 배양 개시 후 14일에 수확되고, 두 번째 부분은 생체외 배양 개시 후 16일에 수확된다.
특정 구현예에서, 첫 번째 부분과 두 번째 부분은 거의 동일하다. 즉, 첫번째 (수확된) 부분은 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획의 약 50%를 포함하고, 두 번째(수확된) 부분은 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획의 나머지 부분을 포함한다.
특정 구현예에서, 배양 용기(예, 플라스크)의 전체 세포 내용물이 동시에 수확된다. 일부 구현예에서, 세포는 접종 후 14일, 15일 또는 16일에 수확된다.
추가 사용(예, 이식(주입) 또는 냉동보존)을 위해 확장되고 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더 세포 집단을 준비하기 위해 수확된 세포를 배양 배지로 세척하고 중요한 파라미터를 평가하고 추가 처리에 적합한 농도로 부피를 조정할 필요가 있다.
수확 후, 확장된 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더 세포 집단은 수동으로 또는 바람직하게 임상 적용을 위해 폐쇄 시스템을 사용하는 자동화 장치를 사용하여 배양 배지 없이 세척될 수 있다. 세척된 세포는 즉각적인 사용을 위해 주입 용액으로 재구성될 수 있다(본원에 기술된 방법과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 주입 용액에는 CSB 버퍼(Biolife Solutions, Bothell, WA), 2-8 Cellsius 버퍼(Protide Pharmaceuticals, Lake Zurich, IL) 및 8% w/v HSA 및 6.8% w/v Dextran-40), 식염수 또는 기타 재구성/주입 버퍼, 예컨대 PlasmaLyte(Baxter Healthcare Ltd)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다). 본 개시의 방법의 일부 양태에서, 주입 용액은 PlasmaLyte일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, PlasmaLyte는 pH 약 7.4 (6.5 ~ 8.0 범위)로, 5.26 g/l 농도의 염화나트륨, 0.37 g/l 농도의 염화칼륨, 0.30 g/l 농도의 염화마그네슘 6수화물, 3.68 g/l 농도의 아세트산나트륨 삼수화물, 및 5.02 g/l 농도의 글루콘산나트륨을 포함한다.
따라서 일부 구현예에서는 대상체에 주입하기에 적합한 확장된 NK 세포를 포함하는 CD3-고갈 세포 분획이 제공되며, 이는 본원에 기술된 방법에 따라 제조된다.
냉동보존을 위해, 세척된 세포를 냉동보존 버퍼로 재구성할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 먼저 세척되고 DMSO가 없는 냉동보존 버퍼(예, CSB 버퍼, Biolife)에서 재구성(예, 현탁)된다. 세척된 세포는 본원에 자세히 설명된 절차에 따라 온도를 낮추기 전에 생존력, 기능, 효능, 불임 세포 수 등을 평가하기 위해 샘플링할 수 있다.
본 발명자들은 본원에 기술된 방법에 따라 니코틴아마이드 및 CD3+ 피더 세포로 확장된 NK 세포가 표현형, 기능성 및 생존력을 유지하면서 효율적으로 냉동 보존될 수 있으며, 극저온 저장 후 해동 및 치료용으로 적합하다는 것을 보여주었다.
따라서, 본 발명의 일부 양태에 따르면, 다음을 포함하는 NK 세포 분획의 냉동 보존 방법이 제공된다:
(a) NK 세포 분획의 NK 세포를 DMSO가 없는 냉동보존 버퍼에 현탁시키는 단계;
(b) 세포를 4℃에서 10-30분 동안 냉각시키는 단계;
(c) DMSO를 10% w/v에 첨가하는 단계;
(d) 세포의 온도를 -120℃로 낮추고,
(e) 냉동보존된 NK 세포를 <120 ℃에서 보관하는 단계.
특정 구현예에서, 냉동보존을 위한 NK 세포 분획은 확장된 NK 세포 분획이다. 특정 구현예에서, 냉동보존을 위한 NK 세포 분획은 본원에 기술된 방법에 따라 배양, 수확 및 세척된 CD3이 고갈되고 불활성화된 CD3+ 피더 세포의 확장된 NK 세포 분획이다.
따라서, 본 발명의 일부 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체를 위해 냉동보존된 NK 세포 분획을 제조하는 방법이 제공되며, 이는 다음 단계를 포함한다:
(a) 대상체와 동종인 NK 세포 및 CD3+ 세포를 포함하는 혈액성분채집 생성물을 얻는 단계;
(b) 혈액성분채집 생성물을 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획으로 분리하는 단계;
(c) 방사선 조사에 의해 상기 CD3+ 세포 분획의 세포를 불활성화시키는 단계;
(d) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 CD3-고갈 세포 분획을 불활성화되고 조사된 CD3+ 세포 분획과 함께 생체외 배양하는 단계, 여기서 상기 조건은 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아미드를 1.0 mM 내지 10 mM 양으로 제공하는 것을 포함하고;
(e) 단계 (d) 이후 6~10일, 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드로 보충하여 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 생성하는 단계;
(f) 단계 (d) 이후 14-16일, 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 수확하는 단계; 및
(g) 단계 (f)의 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 세척하고 농축하는 단계, 및
(h) 단계 (g)의 조합된 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획을 동결 및 냉동보존하여 이를 필요로 하는 대상체를 위해 냉동보존된 NK 세포 분획을 생성하는 단계. 기재된 방법에 따라 제조된 냉동보존된 NK 세포 분획은 임상 환경에서의 투여에 적합하다.
동결을 위해 온도를 낮추기 전에, 적합한 동결 방지제(예, 인간 혈청 알부민 및/또는 DMSO)를 세포에 첨가하여 냉동보존 버퍼를 완성한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 용액은 예를 들어 적어도 또는 약 1 내지 30% DMSO이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포는 1.0% 내지 30% DMSO 용액, 예컨대 5% 내지 20% DMSO 용액 또는 5% 내지 10% DMSO 용액을 함유하는 냉동보존 용액으로 제제화된다. 일부 구현예에서, 동결보존제를 포함하는 냉동보존 용액은 예를 들어 10% DMSO를 함유하는 CSB 버퍼(Biolife Solutions, Bothell, WA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 처리 단계는 세포를 원하는 농도 또는 수로 희석하거나 농축하는 것을 포함할 수 있는데, 예를 들어 주어진 용량 또는 그 분획에서 투여할 세포의 수를 포함하는 단위 용량 형태 조성물이 이에 해당한다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 원하는 대로 세포의 농도를 증가시키기 위한 부피 감소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 원하는 대로 세포의 농도를 감소시키기 위한 부피 추가를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 냉동보존을 위한 처리에는 확장된 세포에 냉동보존 버퍼의 부피를 추가하거나 냉동보존 백의 원하는 최종 부피까지 부피를 보충하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 제형 버퍼의 부피는 약 10 mL 내지 1000 mL, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 또는 약 또는 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400mL, 500mL, 600mL, 700mL, 800mL, 900mL 또는 1000mL이다. 특정 구현예에서, 버퍼를 포함하여 냉동보존을 위한 현탁 세포의 부피는 20 ml이다.
일부 구현예에서, 확장된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더층 세포는 폐쇄 세포 처리 시스템의 일부로서 작동 가능하게 연결된 백과 같은 용기로 옮겨진다. 일부 구현예에서 백과 같은 용기는 배출 라인 또는 배출 위치에서 시스템에 연결된다. 일부 구현예에서, 백은 냉동보존 백, 구체적으로 플루오르화 에틸렌 프로필렌 냉동보존 백이다. 다양한 적합한 냉동보존 백이 시판되고 있으며, 예를 들어 CryoMACS® 냉동보존 백(Miltenyi Biotech) 또는 OriGen 냉동보존 백(Abacus)이 있다. 특정 구현예에서, 냉동보존 백은 CryoMACS 냉동보존 백이다. 일부 양태에서, 냉동보존 백은 250ml 냉동보존 백일 수 있다. 일부 양태에서, 냉동보존 백은 50ml 냉동보존 백일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 처리 시스템과 관련된 폐쇄 시스템은 단일 포트 배출구, 또는 확장된 세포 조성물의 이송을 위해 하나 또는 복수의 용기가 연결될 수 있는 포트와 튜빙 라인의 각 단부에 연결된 다방향 튜빙 매니폴드를 포함하는 다중 포트 출력 키트를 포함한다. 일부 양태에서, 원하는 개수 또는 복수의 출력 용기(예, 냉동보존 백)는 하나 이상, 일반적으로 2개 이상(예, 다중 포트 출력의 포트 중 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상)에 무균 상태로 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기, 예를 들어, 백이 포트에 부착될 수 있거나, 모든 포트 보다 적은 수의 포트에 부착될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 시스템은 배양 및 확장된 CD3-고갈 세포를 복수의 출력 백으로, 그리고 원하는 경우, 대상체로의 이송을 효과적으로 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 용기, 예를 들어 백은 단위 용량의 세포를 개별적으로 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 각각의 용기는 동일하거나 대략 또는 실질적으로 동일한 수의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 총 세포/ml의 약 5X108, 2.5X108, 1X108, 5X107, 2X106 미만과 같거나 또는 약 5X105 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 각 백 내 세포와 냉동보존 버퍼의 부피는 10mL 내지 100mL, 예를 들어 적어도 또는 약 적어도 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL 또는 100mL이다. 일부 구현예에서, 각각의 단위 용량은 20ml 부피의 동결 방지제 버퍼(예, CSB 버퍼)에 약 2.5X108개의 총 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 극저온 냉동은 시료, 예를 들어 세포가 포함된 시료의 온도를 -80 ℃ ~ -210 ℃의 온도로 낮추는 것을 의미한다.
확장된 CD3가 고갈 및 조사된 CD3+ 피더 세포 집단의 냉동은 단계적으로 영향을 받는다: 첫째, 세포의 온도(밀봉된 냉동보존 백 내)를 -120℃(영하 120℃)로 낮춘다. 온도 감소는 세포의 충격과 손상을 방지하기 위해 점진적으로 수행된다. 일부 구현예에서, -120℃로의 감소는 2단계로 수행된다: 예를 들어 -1 ℃/분으로 -60 ℃까지 점진적으로 동결한 다음, 예를 들어 목표 온도(-120 ℃)까지 -5 ℃/분으로 더 빠르게 동결한다. 냉동보존된 세포를 포함하는 냉동 보존 백은 액체질소 플라스크(예, 액체질소 플라스크의 증기상) 또는 초저온 냉동고와 같은 냉동보존 장치로 옮겨 -120 ℃ 미만. 일부 구현예에서 -140 ℃ 미만 또는 -150 ℃ 이하에서 보관한다.
일부 구현예에서, 점진적인 온도 감소 동안(예, -60℃에 도달하기 전) "급속 동결"의 중간 단계가 도입되는데, 이는 급격한 온도 감소를 포함하고, 이어서 점진적인 동결로 복귀한다.
본원에 사용된 용어 "극저온으로 저장" 또는 "극저온 저장"은 일반적으로 샘플, 예를 들어 세포가 포함된 샘플을 -80 ℃ ~ -210 ℃의 온도에서 다음과 같은 조건으로 저장하는 것을 의미한다. 세포는 일정 기간 보관 후에 해동될 수 있어, 해동 시 또는 해동 후 샘플 내 세포의 적어도 일부 또는 상당 부분이 생존 가능한 상태로 유지되고/되거나 생물학적 기능의 적어도 일부가 유지된다. 일 양태에서, 세포 샘플은 적어도 특정 백분율, 예를 들어 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상이 생존 가능한 상태로 유지되도록 해동될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 제조되고, 투여(예, 주입에 의한)에 적합한, 확장된 NK 세포를 포함하는 냉동보존된 CD3-고갈 세포 분획이 제공된다. 일부 구현예에서, 확장된 NK 세포를 포함하는 냉동보존된 CD3-고갈 세포 분획은 0.5 X108 총 세포/ml, 1.0 X108 총 세포/ml, 1.5 X108 총 세포/ml, 총 2.0 X108 총 세포/ml, 2.5 X108 총 세포/ml, 3.0 X108 총 세포/ml, 3.5 X108 총 세포/ml 또는 4.0 X108 총 세포/ml를 포함하는 불소화 에틸렌 프로필렌 냉동보존 백에 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 90, 100ml 이상의 부피로 제공된다. 일부 구현예에서, 냉동 보존 백의 부피는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 또는 50-1000, 50-500, 100-500, 50-250 ml 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 확장된 NK 세포를 포함하는 냉동보존된 CD-고갈 세포 분획은 250 또는 50ml의 동결보존 백에 제공된다. 특정 구현예에서, 확장된 NK 세포를 포함하는 냉동보존된 CD3-고갈 세포 분획은 2.5 X108 총 세포/ml를 포함하는 불소화 에틸렌 프로필렌 냉동보존 백에 20ml의 부피로 제공된다.
보관 기간 동안 생존율, 특성, 기능, 효능 및 세포 밀도(수/부피)를 모니터링하기 위해, 냉동보존된 분획 중 일부를 냉동보존 후 다양한 시점에 해동하고 샘플링할 수 있다. 샘플링은 정기적인 간격(월 1회, 2개월, 6개월 이상)으로 수행할 수 있다.
일부 양태에서, 단일 냉동보존 백은 단 한 번만 해동된다.
저장된 냉동보존 세포 집단의 정확한 특성 분석을 제공하기 위해 개별 냉동보존 분획의 파라미터(역가, 오염, 무균, 생존 가능성, 외관, 표현형, 기증자 통계 등)가 나중에 해동하기 위한 냉동 보존 단위의 선택에 참조하기 위해 기록될 수 있다.
세포는 액체 질소 저장 탱크의 증기상에서와 같이 상술한 구현예에 따른 방식으로 1일 내지 12년의 저장 기간 동안 극저온으로 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 이상의 기간 동안 저장되거나 뱅킹된다. 일부 구현예에서, 세포는 1주, 2주, 3주 또는 4주 이상의 기간 동안 저장되거나 뱅킹된다. 일부 구현예에서, 세포는 장기 보관 또는 장기 "뱅킹" 상태로 배치된다. 일부 양태에서, 세포는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년 이상의 기간 동안 저장된다.
일부 구현예에서, 저장 기간 후에 세포는 해동된다. 일부 구현예에서, 세포의 생물학적 기능 중 적어도 일부를 회복시키기 위해 세포의 온도를 0℃ 이상으로 상승시켜 세포를 해동시킨다. 일부 구현예에서, 세포의 생물학적 기능 중 적어도 일부를 회복시키기 위해 세포의 온도를 37℃로 상승시켜 세포를 해동시킨다.
일부 구현예에서, 세포는 신속하게, 예, 세포를 과열시키지 않거나 세포를 37℃ 이상의 고온에 노출시키지 않고 가능한 한 빠르게 해동된다. 일부 구현예에서, 급속 해동은 고농도의 동결 방지제 및/또는 DMSO에 대한 세포의 노출을 감소 및/또는 방지한다. 특정 구현예에서, 해동이 일어나는 속도는 세포가 동결되고 해동되는 용기, 예, 바이알 및/또는 백의 특성에 의해 영향을 받을 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 열 블록, 건식 해동기 또는 수조에서 해동된다. 특정 구현예에서, 세포는 열 블록, 건식 해동기 또는 수조에서 해동되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 실온에서 해동된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 37℃, 35℃, 32℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 15℃의 온도 또는 그 미만 또는 15℃ 내지 30℃, 23℃ 내지 28℃, 또는 24℃ 내지 26℃(각각 포함)의 온도에서 해동된다.
일부 구현예에서, 냉동동결 세포는 신속하게 해동된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 120분, 90분, 60분, 45분, 30분, 25분, 20분, 15분 또는 10분 내에 해동된다. 일부 실시양태에서, 세포는 각각 10분 내지 60분, 15분 내지 45분, 또는 15분 내지 25분 동안 해동된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 20분 내에, 또는 20분 이내에 해동된다.
일부 구현예에서, 세포는 열 블록(heat block), 건식 해동기 또는 수조에서 해동된다. 특정 구현예에서, 세포는 열 블록, 건식 해동기 또는 수조에서 해동되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 실온에서 해동된다. 특정 구현예에서, 세포는 실온에서 2-15분 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포가 담긴 냉동보존 백은 실온(예, 15-25℃)에서 5분 동안 인큐베이션된 다음, 37℃ 수조에서 해동될 때까지 - 예, 모든 고체가 용액에 완전히 용해될 때까지 해동된다.
특정 구현예에서, 해동된 세포는 투여 전 또는 임의의 후속 조작 및/또는 처리 단계 전에 휴지(rest)된다, 예를 들어 인큐베이션 또는 배양된다. 일부 구현예에서, 세포는 낮은 양 및/또는 검출불가능한 양의 동결 방지제 중에, 또는 동결 방지제, 예를 들어 DMSO의 부재 하에 휴지된다. 특정 구현예에서, 해동된 세포는 예를 들어 동결 방지제 및/또는 DMSO를 제거하기 위해 세척 단계 후 또는 직후에 휴지된다. 일부 구현예에서, 세포는 약 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 동안 휴지된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 2시간 동안, 또는 적어도 2시간 동안 휴지된다.
해동된 세포는 임의의 적합한 주입액, 버퍼, 식염수, PlasmaLyte 등의 용액으로 재구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 철저한 해동 후, 세포는 주입 용액(예, PlasmaLyte®(Baxter) 또는 젖산 링거 용액)으로 희석되어 치료에 직접 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 덱스트란 및 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함하는 용액으로 희석된다.
특정 구현예에서, 세포는 해동 후 PlasmaLyte(Baxter), 젖산 링거액 등과 같은 상업적으로 이용 가능한 전해질 주입 용액으로 희석된다. 일부 구현예에서, 해동된 세포는 세포 대 희석제의 비율이 1:4인 PlasmaLyte(Baxter)로 희석된다. 일부 구현예에서, 해동된 세포 20ml를 PlasmaLyte 80ml로 최종 부피 100ml가 될 때까지 희석된다.
일부 구현예에서 재구성은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 주입 용액은 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 사용하기에 적합한지 선별된다. 적합한 주입 용액 선택을 위한 예시적인 기준에는 박테리아, 효모 또는 곰팡이 성장이 없고, 내독소 함량이 0.5 Eu/ml 미만이며, 투명하고 이물질이 없는 외관을 나타내는 안전성 테스트가 포함된다. 일부 양태에서, 본 개시의 NK 세포 분획 및 NK 분획을 포함하는 조성물은 약 0.5 내독소 단위(EU)/ml 이하를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "전파(propagation)" 또는 "증식(proliferation)"은 성장, 예를 들어 세포 성장 및 세포 수의 증식을 의미한다. 본원에 사용된 전파 및 증식은 인큐베이션 기간 동안 발생하는 NK 세포의 수 증가와 관련이 있다. NK 세포의 표현형을 나타내는 세포의 시험관 내 또는 생체 내 증식은 IL-2, Epstein-Barr 바이러스로 형질전환된 림프구 세포주, RAJI 및 K562 세포 등 자극 후 나타나는 현상으로 알려져 있다.
세포 증식용 분석은 당업계에 잘 알려져 있으며, 세포를 저밀도로 접종 및 배양하고 콜로니를 계수하는 클론 생성 분석, 세포 수를 기계적으로 측정하는 기계적 분석[유세포 분석(예, FACS™), 프로피디움], 생존 세포 수를 측정하는 대사 분석(예, 테트라졸륨 염의 통합, 예: XTT, MTT 등), 증가하는 집단의 DNA 합성을 측정하는 직접 증식 분석(예, 브로모데옥시유리딘, 티미딘 통합 등)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 유효 농도의 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 모이어티로 배양된 NK 세포 집단의 세포 증식은 CD3-고갈 세포를 배양에 접종한 후 소정의 시간(예, 약 10시간, 12시간, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 약 1, 2, 3, 4, 5주, 2개월 이상)에 측정되며, 항-CD56 및 항-CD3 마커를 사용하여 집단 내 CD56+CD3-NK 세포 분획을 확인하고 정량화하기 위해 FACS 분석으로 결정된다. NK 세포의 증식은 배양 전의 원래 NK 세포 분획과 비교하여 NK 세포의 배수 증가(예, 확장 또는 배수 확장)로 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 유효 농도의 니코틴아미드에 노출된 NK 세포 집단은 약 5일, 약 7일, 약 12일, 약 14일, 약 16일, 약 18일, 약 21일, 약 25일, 약 30일 이상의 배양 후에 NK 세포 집단이 적어도 2X, 적어도 10X, 적어도 20X, 적어도 40X, 적어도 50X, 적어도 75X, 적어도 100X, 적어도 150X, 적어도 250X 및 적어도 500X 이상 증가한다. 다른 구현예에서, 유효 농도의 니코틴아미드에 노출된 FACSTM에 의해 결정된 NK 세포 집단의 배수 확장은 적어도 약 1.2X, 약 1.3X, 약 1.5X, 약 1.75X, 약 2X, 약 2.25X, 약 2.5X, 약 2.75X, 약 3.0, 약 3.5X, 약 4X, 약 4.5X, 약 5X, 약 6X , 약 7X, 약 8X, 약 9X, 약 10X이며, 이는 0.1mM 미만의 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 부분을 사용하여 동일한 조건에서 배양된 NK 세포의 배수 확장보다 높다.
본원에 사용된 용어 "기능" 또는 "NK 세포 기능"은 NK 세포에 기인하는 임의의 생물학적 기능을 지칭한다. NK 세포 기능의 비-제한적 목록에는 예를 들어, 세포독성, 세포사멸 유도, 세포 운동성, 직접적인 이동, 사이토카인 및 기타 세포 신호 반응, 사이토카인/케모카인 생산 및 분비, 시험관 내 활성화 및 억제 세포 표면 분자의 발현, 세포 호밍 및 생착(생체 내 보유)) 이식된 숙주에서, 및 생체내에서 질병 또는 질병 과정의 변경을 포함한다. 일부 구현예에서, 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 모이어티에 대한 노출에 의해 강화된 NK 세포 기능은 증가된 주입된 NK 세포의 귀소 및 생체내 유지도뿐만 아니라 CD62L 표면 마커 CD107a의 증가된 발현, 증가된 이동 반응, 및 NK 세포의 더 큰 세포독성 활성중 적어도 하나를 포함한다.
이식 시 세포의 귀소(homing)/생착 및 유지에 중요한 CD62L, CXCR-4, CD49e 등과 같은 부착 및 이동 분자에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포에서의 CD62L 발현은 예를 들어 유세포분석, 면역검출, 정량적 cDNA 증폭, 혼성화 등에 의해 분석할 수 있다. 일 구현예에서, CD62L 발현은 세포를 형광 태그된 특정 항-인간 CD62L 단일클론 항체[예, CD62L PE, Cat. BioLegend (San Diego, CA, USA) 제품번호 304806]에 노출시키고 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 세포를 분류함으로써 다양한 NK 세포 집단에서 검출할 수 있다.
세포 이동에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포 이동은 예를 들어 이동 분석 또는 갭 폐쇄 분석에 의해 분석될 수 있다. 2-챔버 기술과 같은 이동 분석에서 세포는 장벽(예, 필터)에 의해 자극으로부터 분리되고, 세포의 이동은 특정 간격으로 원점으로부터의 세포 손실, 장벽을 가로지르는 세포의 축적 또는 두 가지 모두를 계산하여 감지된다. 간격 폐쇄 분석에서 세포는 눈에 보이는 간격(점을 매긴 한천 플레이트, 원 주위 등)의 주변에 배치되고 자극과 함께 배양된다. 자극에 대한 반응으로 세포 운동성에 의해 적용된 세포 사이 공간의 폐쇄는 세포 계측법, 면역 검출, 현미경/형태 측정 등을 사용하여 시각화된다. 일 구현예에서, 다양한 NK 세포 집단의 이동 가능성은 SDF(250ng/ml)에 반응하는 "Transwell"™ 이동 분석에 의해 결정된다.
수혈되거나 이식된 세포의 귀소 및 생체내 보유에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 사용된 용어 "귀소(homing)"은 수혈되거나 이식된 세포가 숙주 표적 기관에 도달하여 생존하는 능력을 의미한다. 예를 들어, NK 세포 표적 기관은 림프 조직일 수 있고, 간세포 표적 기관은 간 실질일 수 있고, 폐포 세포 표적 기관은 폐 실질일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "생체내 보유"("생착"으로도 알려짐)는 수혈되거나 이식된 세포가 표적 기관에서 증식하고 생존 가능한 상태를 유지하는 능력을 의미한다. 이식된 NK 세포의 귀소 및 생체내 보유를 분석하기 위한 동물 모델에는 면역결핍 소형 포유동물(예, SCID 및 IL2Rγnull 마우스 등)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. SCID-Hu 마우스 모델은 인간 태아 흉선 및 간 조직 또는 태아 BM 조직이 이식된 C.B-17 scid/scid(SCID) 마우스를 사용하고 이식된 인간 NK 세포 보유 및 치료 가능성을 평가하기 위한 적절한 모델을 제공한다. 이식된 세포의 귀소 및 생체 내 유지는 인간 숙주 대상에서도 평가할 수 있다. 일 구현예에서, 귀소 및 생체내 보유는 본 발명에 따른 유효 농도의 니코틴아미드로 배양된, 약 15X104, 약 15X105, 약 15X106, 약 15X107 이상의 인간 NK 세포를 예를 들어 수혈한 방사선 조사된 NOD/SCID 마우스에서 분석하고, 수혈 후 미리 정해진 시간(예, 수혈 후 약 5시간, 10시간, 12시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 1, 2, 3, 4, 5주, 2, 3, 4개월 이상)에 희생시켰다. 마우스를 희생시킨 후, 인간 특이적 Ab를 사용하여 인간 NK 세포(CD56+CD45+)의 존재에 대해 비장, 골수, 말초 혈액 및 기타 기관 샘플을 FACS로 평가한다. 생체내 보유율(%)은 기증자 표현형을 나타내는 장기 세포(예, 인간 세포의 경우 CD45)의 백분율로 표시된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 확장되고, 냉동보존되고 해동된 NK 세포의 생체내 보유는 니코틴아미드 및 CD3+ 피더층 없이 배양된 NK 세포와 비교하여 비장에서의 보유가 증가되었다.
세포독성("세포 사멸")에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 재지정 사멸 분석에 사용하기에 적합한 표적 세포의 예는 암 세포주, 원발성 암세포 고형 종양 세포, 백혈병 세포 또는 바이러스 감염된 세포이다. 특히, K562, BL-2, colo250, RAJI(림프아세포형 버킷 림프종 세포) 및 원발성 백혈병 세포가 사용될 수 있지만, 임의의 다수의 다른 세포 유형도 사용될 수 있으며 이는 당업계에 잘 알려져 있다(예, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135 참조). 세포 사멸은 세포 생존력 분석(예, 염료 배제, 크롬 방출, CFSE), 대사 분석(예: 테트라졸륨 염) 및 직접 관찰을 통해 평가된다.
확장된 CD3-고갈 세포 분획이 해동되고 희석되면, 확장된 분획은 이식에 사용하기에 적합한지 평가할 수 있다. 적합한 이식 가능한 NK 세포 제제를 선택하기 위한 일반적인 기준에는 CD56+/CD3- 세포의 비율, 세포 생존율, CD3+ 세포 분획의 양, 내독소의 존재, 미생물 오염 등이 포함된다. 확장된 NK 세포 분획의 CD56+, CD3+ 및 CD56+/CD3- 세포 함량은 주입된 NK 세포의 성공적인 귀소 및 유지에 중요하며, 따라서 주입을 진행하기 위한 중심 기준이 된다. 따라서, 특정 구현예에서, 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 약 60% 내지 약 90% CD56+/CD3- 세포, 약 68% 내지 약 85% CD56+/CD3- 세포, 약 72% 내지 약 82% CD56+/CD3- 세포 및 76-79% CD56+/CD3- 세포를 특징으로 한다. 일 구현예에서, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 적어도 60%, 적어도 64%, 적어도 70%, 적어도 74%, 적어도 80% 또는 적어도 85% CD56+/ CD3-세포를 특징으로 한다. 추가 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 적어도 70% CD56+/CD3- 세포를 특징으로 한다. CD56 및 CD3 세포 마커에 따른 NK 세포 표현형의 확인은 위에 자세히 설명되어 있다.
이식용 세포 분획에 동종 T(CD3+) 세포가 존재하는 것은 GVHD의 위험을 크게 증가시키기 때문에 문제가 된다. 따라서 임상용 확장된 NK 세포 분획의 적합성에 대한 중요한 파라미터는 CD3+, 특히 CD3+/CD56- 세포의 양 또는 분획이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 환자의 질량 Kg당 1.0X105 내지 1.0X106 CD3+/CD56-세포를 특징으로 한다. 추가 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 환자의 질량 Kg당 7.0X105개 CD3+/CD56- 세포 미만, 환자 질량 Kg당 6.5X105 CD3+/CD56- 세포 미만, 환자 질량 Kg당 6.0X105 CD3+/CD56- 세포 미만, 환자 질량 Kg당 5.5X105 CD3+/CD56- 세포 미만, 환자 질량 Kg당 5.5X105 CD3+/CD56- 세포 미만 환자 질량 Kg당 5.0X105 CD3+ 세포, 환자 질량 Kg당 4.5X105 CD3+/CD56- 세포 미만, 환자 질량 Kg당 4.0X105 CD3+/CD56- 세포 미만, 환자 질량 Kg당 3.5X105 CD3+ 세포 미만 환자의 질량 Kg 또는 환자의 질량 Kg당 3.0X105 CD3+CD56-세포 미만을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 환자의 질량 Kg당 1X106 CD3+CD56-세포 미만을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 환자의 질량 Kg당 0.5X106 CD3+CD56-세포 미만을 특징으로 한다. 환자의 질량 Kg당 표현되는, CD3+ CD56-분획, 해동되고 희석된 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획의 일부 또는 함량의 계산은 환자(즉, 대상체)에게 이식(예, 주입)된 CD3+CD56-세포의 총량에 관한 것임을 유의할 것이다. 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획 중 CD3+ CD56- 세포의 분획, 부분 또는 양은 또한 CD56+/CD3- 대 CD3+CD56- 세포의 비율 또는 해동되고 희석된 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획의 부피 분율(예, CD3+/CD56- 세포/mL) 또는 중량 분율(CD3+/CD56- 세포/100g)로 표현될 수 있다. CD3+ 세포 마커의 확인은 위에 자세히 설명되어 있다.
이식용 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획의 무균성 및 안전성은 특히 내독소 함량 및 박테리아, 진균, 바이러스 및 마이코플라스마 오염의 존재를 모니터링함으로써 보장된다. 일부 구현예에서, 이식을 위해 선택된 확장된 NK 세포 분획은 해동 및 희석 후 5 Eu/ml 이하의 내독소 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 해동, 희석된 이식용 CD3-고갈 세포 분획은 해동 및 희석 후에 미생물(예, 그람 양성 미생물)이 없는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 해동되고 희석된 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획은 멸균되고, 해동 및 희석 후에 마이코플라스마가 없다.
일부 구현예에서, 확장된 NK 세포 분획은 약 50% 내지 약 85% 생존력을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 약 55%, 약 60%, 약 63%, 약 65%, 약 68%, 약 70%, 약 75%, 약 78%, 약 80%, 약 82%, 약 82%, 83%, 약 84% 내지 약 85% 생존력 이상의 생존력을 갖는 확장된 NK 세포 분획이 선택된다. 추가 구현예에서, 생체외 확장을 위해 선택된 NK 세포 분획(예, CD3-고갈 분획)은 적어도 70%의 생존 가능한 세포를 갖는다. 추가 구현예에서, 임상 적용에 적합한 확장된 NK 세포 분획(예, 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포)은 세척 및 농축 후 적어도 70%의 생존 가능한 세포를 특징으로 한다. 추가 구현예에서, 이식에 적합한 확장된 NK 세포 분획은 적어도 85%의 생존 가능한 세포를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "생존력"은 살아있는 세포와 살아있는 세포가 아닌 세포 사이의 구별을 의미한다. 세포 생존 가능성은 형태학적 변화나 막 투과성 및/또는 특정 염료의 배제나 다른 염료의 흡수 및 유지로부터 유추되는 생리학적 상태의 변화로 판단할 수 있다. 세포 생존력 평가는 분석(예, 염료 배제, 크롬 방출), 대사 분석(예, 테트라졸륨 염) 및 직접 관찰을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 잘 알려져 있다 (Coder, D., Current Protocols in Cytometry, 1997, John Wiley and Sons, Inc., Unit 9.2, 9.2.1-9.2.14).
일부 구현예에서, CD56+/CD3- 세포 분획, CD3+ 세포 분획, 생존력, 내독소 및 미생물 함량 뿐만 아니라 표현형, NK 세포 기능, 효능 및 외관의 파라미터는 세포 배양을 위한 접종 전, 세포 배양 중, 수확 후, 확장된 CD3-고갈 세포 분획의 세척 및 농축 후, 냉동 보존 후, 보관 후, 채취한 샘플에서, 그리고 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획에서 모니터링된다. 일부 구현예에서, 샘플은 임의의 혈액성분채집 단위에서 처리 전(예: 100 x 106 세포), 컬럼 후(CD3 고갈) 배양 전 샘플(예, 10 x 106 세포), 팽창 후-전 세척(예: 10ml 샘플), 최종 확장, 세척 및 농축된 CD3-고갈 세포 생성물(10 x 106개 세포), 냉동 보존 후, 보관 중, 해동 및 희석 후 및/또는 첫 주입일(0일) 및, 필요한 경우 추가 주입 당일 또는 이들의 조합 시에 채취된다.
본 발명자들은 CD3-고갈 세포를 니코틴아미드 및 조사된 CD3+ 피더 세포와 배양하면 NK 세포 분획의 강력한 확장뿐만 아니라 NK 세포 기능성 및 귀소/생착 가능성이 향상된다는 것을 보여주었다(실시예 1-4 참조). 따라서, 일부 구현예에서, 확장된 CD3-고갈 세포는 5mM 니코틴아미드를 갖고 상기 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포와 비교하여 CD62L의 발현이 증가한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 5mM 니코틴아미드가 있고 상기 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포와 비교하여 CD62L의 발현이 증가한다.
다른 구현예에서, 확장된 CD3-고갈 세포는 5mM 니코틴아미드가 있고 상기 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포와 비교하여 조사된 마우스에 주입한 후 비장 및 골수에서 생체내 보유가 증가하였다. 추가 구현예에서, 제25항의 해동된 냉동보존된 NK 세포 분획물, 여기서 상기 확장된 CD3-고갈 세포는 5mM 니코틴아미드가 있고 상기 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포와 비교하여 방사선 조사된 마우스에 주입한 후 비장 및 골수에서 생체내 보유가 증가하였다.
따라서, 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70% 생존 가능하며;
(c) 주입 시 1X106 CD3+CD56-세포/환자 질량 Kg 미만;
(d) 주입 시 5 EU 내독소/환자 질량 Kg 이하;
(e) 마이코플라스마가 없고,
(f) 무균.
따라서, 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70% 생존 가능하며;
(c) 0.5% 미만의 세포가 CD3+/CD56-이며,
(d) 0.5 내독소 단위(EU)/mL 이하;
(e) 마이코플라스마가 없고,
(f) 무균.
위에서 언급한 기준을 충족하는 확장된 CD3-고갈 세포 분획은 이를 필요로 하는 대상체(예, 환자)에 주입하기 위해 사용될 수 있다. 상술한 투여용 CD3 고갈 세포 분획의 생체외 확장(배양), 선택 및 제조를 위한 임의의 방법과 이들의 각 구현예를 단독으로 또는 다양한 조합은 이 섹션과 다음 섹션에 설명된 대로 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 투여(예, 이식, 주입)하는 방법에 영향을 미치는 데에 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획을 제조하는 방법 중 임의의 방법에 따라 제조된 해동되고 냉동보존된 NK 세포 분획이 제공된다. 특정 구현예에서, 해동되고 냉동보존된 CD3-고갈 NK 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70% 생존 가능하며;
(c) 주입 시 1X106 CD3+/CD56- 세포/환자 질량 Kg 미만;
(d) 주입 시 5 EU 내독소/환자 질량 Kg 이하;
(e) 마이코플라스마가 없고,
(f) 무균.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획을 제조하는 방법 중 임의의 방법에 따라 제조된 해동되고 냉동보존된 NK 세포 분획이 제공된다. 특정 구현예에서, 해동되고 냉동보존된 CD3-고갈 NK 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 한다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70% 생존 가능하며;
(c) 0.5% 미만의 세포가 CD3+/CD56-이고,
(d) 0.5 내독소 단위(EU)/mL 이하;
(e) 마이코플라스마가 없고,
(f) 무균.
일부 구현예에서, 해동 및 희석 후, NK 세포 분획은 (예, 이식(주입) 부위로의 전달용) 용기에 제공된다. 일부 구현예에서, 용기는 배양 백이다. 높은 가스 투과성과 낮은 수분 손실, 유연성 및 높은 광 투과성을 갖는 불활성 물질로 구성된 배양 백이 바람직하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 이식 가능한 확장 NK 세포 분획의 해동된 냉동보존 및 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 배양 백에 제공된다.
다른 구현예에서, 다음 파라미터를 특징으로 하는 이식 가능한 인간 NK 세포 분획이 제공된다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70% 생존 가능하며;
(c) 주입 시 5.0X105 CD3+/CD56- 세포/환자 질량 Kg 미만;
(d) 주입 시 5 EU 내독소/환자 질량 Kg 이하; 및
(e) 마이코플라스마가 없고,
(f) 무균.
일부 구현예에서, 해동 및 희석 후, NK 세포 분획은 (예, 이식(주입) 부위로의 전달용) 용기에 제공된다. 일부 구현예에서, 용기는 배양 백이다. 높은 가스 투과성과 낮은 수분 손실, 유연성 및 높은 광 투과성을 갖는 불활성 물질로 구성된 배양 백이 바람직하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 이식 가능한 확장 NK 세포 분획의 해동된 동결보존 및 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 배양 백에 제공된다.
다른 구현예에서, 다음 파라미터를 특징으로 하는 이식 가능한 인간 NK 세포 분획이 제공된다:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70% 생존 가능하며;
(c) 0.5% 미만의 세포가 CD3+/CD56-이고;
(d) 0.5 내독소 단위(EU)/mL 이하;
(e) 마이코플라스마가 없고,
(f) 무균.
본 발명의 확장된 CD3-고갈 세포 분획은 이를 필요로 하는 대상체에 주입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 확장된 CD3-고갈 세포 분획은 해동되어 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획으로 희석된다.
본원에 사용된 용어 "이식"은 세포 치료, 입양 전달, 세포 면역치료 등의 맥락에서 대상체, 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 질병이나 상태에 대한 환자에게 예상되는 치료 효과를 갖는 세포를 투여하는 것을 의미한다. 이러한 세포 치료는 혈관 연결을 통해 대상체의 신체에 치료 세포 분획을 도입하는 것을 포함하므로, 본원에서 사용된 바와 같이 NK 세포의 "이식" 및 "투여"는 "주입"과 동일하다. 일반적으로, 치료 세포 분획은 예를 들어 중심 정맥 카테터(예, Hickman 카테터)를 통해 정맥 내로 대상체에 주입된다. 대상체에 대한 치료 세포 분획의 주입 속도는 펌프에 의해 제어되거나, 중력에 의해 공급되고 세포 분파와 입구 카테터 사이의 높이 차이에 의해 조정되는 비보조 펌프에 의해 제어될 수 있다. 일부 구현예에서, 확장된 NK 세포 분획은 펌프 또는 펌프 없이 및/또는 필터 없이 중력 공급에 의해 정맥내로 이식(주입, 투여)된다. 일부 양태에서, 확장된 NK 세포 분획은 필터를 사용하여 이식(주입/투여)된다. 일부 양태에서, 필터는 약 170 내지 약 260 마이크론의 기공 크기를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 이식이 필요한 대상은 혈액 질환을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 혈액 악성종양을 앓고 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 CD3-고갈 확장된 NK 세포 분획, 해동되고 희석된 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획 또는 본원에 기술된 방법을 사용한 치료를 위해 표시된 혈액 악성종양은 비호지킨 림프종(NHL)이다. 특히, 본 발명의 세포 분획 또는 방법을 사용한 치료에 필요한 혈액 악성종양은 CD20+ 발현 NHL, 여포성 백혈병(FL) 및 고등급 B 세포 림프종(HGBCL)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, NHL은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)일 수 있다. 일부 양태에서, NHL은 맨틀 세포 림프종(MCL)일 수 있다. 일부 양태에서, HGBCL은 달리 지정되지 않은 HGBCL(HGBCL, NOS)일 수 있다. 일부 양태에서, NHL은 원발성 종격동 거대 B세포 림프종(PMBCL)일 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서는 혈액 질환의 치료가 필요한 대상체에서 혈액 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다:
(a) 상기 대상체에게 항암 단일클론 항체를 투여하는 단계;
(b) 상기 대상체에게 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 단계;
(c) 동종 해동되고 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획을 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 이식하는 단계로서, 여기서 상기 동종 해동된 냉동보존된 확장 NK 세포 분획은 CD3+ 세포, 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 1.0 mM 내지 10 mM 양의 니코틴아미드 생체외 배양에 의해 확장된 것; 그리고
(d) 상기 대상체에게 IL-2를 투여함으로써 대상체의 혈액 질환을 치료하는 단계.
본원에 사용된 "대상체" 또는 "환자"는 임의의 포유동물, 예를 들어 인간, 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 낙타일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 추가 구현예에서, 대상체는 인간이고 CD3-고갈 세포 분획은 인간 CD3-고갈 세포 분획이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료가 필요한 대상체"는 질병, 장애 또는 상태를 치료 또는 개선하기 위해 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 이식, 수혈, 주입 또는 이식이 필요한 대상체이다. 일 구현예에서, 대상체는 혈액 질환을 앓고 있거나(진단받았거나) 고통받고 있다. 일부 구현예에서, 혈액 질환은 세포 증식성 질환이다. 다른 구현예에서, 혈액 질환은 혈액 악성종양이다.
본 문서에 사용된 용어 "리스크" 또는 "확률"은 발생 가능성을 의미한다. 일부 구현예에서, 개체에서 발생 위험 또는 확률(예, 종양 수축, 반응, 무진행 생존 등)은 동일한 치료를 받지 않은 그룹과 치료를 받은 그룹 간의 비교 데이터로부터 계산된 위험을 의미한다. 일부 구현예에서, 증가 또는 감소된 위험 또는 확률은 고려 중인 결과에 대한 치료군과 대조군 사이의 차이를 반영한다. 일부 구현예에서, 특정 발생 또는 상태의 위험 또는 확률의 증가 또는 감소는 상대적일 뿐이며 수치로 표현되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "세포 증식성 장애"는 세포의 조절되지 않거나 비정상적인 성장, 또는 둘 다가 암성일 수도 있고 아닐 수도 있는 원치 않는 상태 또는 질병의 발달로 이어질 수 있는 상태를 의미한다. 본 발명의 예시적인 세포 증식성 장애는 세포 분열이 탈조절된 다양한 상태를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "빠르게 분열하는 세포"는 동일한 조직 내의 이웃 또는 병치된 세포들 사이에서 예상되거나 관찰되는 것보다 더 크거나 초과하는 속도로 분열하는 임의의 세포로 정의된다. 세포 증식성 장애에는 전암성 질환 또는 전암성 질환이 포함된다. 세포 증식 장애에는 암이 포함된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법 및 세포 조성물은 암 증상을 치료하거나 완화하는데 사용된다. "암"이라는 용어에는 고형 종양뿐만 아니라 혈액 종양 및/또는 악성 종양도 포함된다. 특정 구현예에서, 혈액 악성종양은 비호지킨 림프종(NHL) 또는 다발성 골수종(MM)이다.
본 발명의 일 구현예의 또 다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 치료 유효량의 본 발명의 NK 세포 집단을 상기 대상체에게 투여함으로써 달성된다.
"치료하다" 또는 "치료"는 질병의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 발병을 예방 또는 지연시키고, 증상을 완화시키거나 질병의 추가 발생을 정지 또는 억제하기 위해 본 발명의 농축, 활성화 또는 배양된 NK 세포 조성물 또는 집단의 투여, 상태 또는 장애 (예, 암, 전이성 암 또는 전이성 고형 종양)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치료는 예방적일 수 있으며, 즉, (질병의 발병을 예방 또는 지연시키거나 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하기 위해) 보조적 또는 질병 발현 후 증상을 치료적으로 억제하거나 완화하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, NK 세포 집단은 고형 종양 또는 악성종양과 같은 암을 감소 또는 제거하거나 그의 발생 또는 재발을 예방하는데 효과적인 양으로 투여된다. "고형 종양을 감소 또는 제거하거나 이의 발생 또는 재발을 예방하는데 효과적인 양" 또는 "과증식성 장애를 감소 또는 제거하거나 이의 발생 또는 재발을 예방하는 데 효과적인 양"은 환자 테스트 데이터, 생존 데이터, 종양 마커 수준의 상승 또는 억제, 유전적 프로필에 따른 감수성 감소 또는 환경 요인에 대한 노출로 측정된 종양 질병 상태 또는 과다증식성 장애에 대한 치료 후 환자 결과 또는 생존을 향상시키는 치료 조성물의 양을 의미한다. "종양 성장을 억제하는 것"은 종양 세포의 크기, 생존력 또는 수를 감소시키는 것을 의미한다. "암", "악성 종양", "고형 종양" 또는 "과증식성 장애"는 동의어로 사용되며 통제되지 않고 비정상적인 세포 증식, 영향을 받은 세포가 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 확산(즉, 전이)되는 능력, 그리고 여러 가지 특징적인 구조적 및/또는 분자적 특징으로 하는 여러 질병을 의미한다. "암성" 또는 "악성 세포" 또는 "고형 종양 세포"는 특정 구조적 특성을 갖고, 분화가 결여되어 있으며 침습 및 전이가 가능한 세포로 이해된다. "암"은 암종 및 육종을 포함하여 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 의미한다. 예로는 유방암, 폐암, 비소세포폐암, 위암, 뇌암, 두경부암, 수모세포종, 뼈암, 간암, 결장암, 비뇨생식기암, 방광암, 요로암, 신장암, 고환암, 자궁암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 흑색종, 중피종, 육종 등이 있다 (DeVita, et al., (eds.), 2001, Cancer Principles and Practice of Oncology, 6th. Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. 참조; 이 참고문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함됨.).
"암 관련"은 대상 세포에서 악성 종양의 발병에 대한 핵산 및 이의 발현 또는 이의 결여, 단백질 및 이의 수준 또는 활성 또는 이의 결여의 관계를 지칭한다. 예를 들어, 암은 정상적인 건강한 세포에서는 발현되지 않거나 더 낮은 수준으로 발현되는 특정 유전자의 발현과 연관될 수 있다. 반대로, 암 관련 유전자는 악성 세포(또는 형질전환 중인 세포)에서 발현되지 않거나 정상적인 건강한 세포에서 발현되는 것보다 악성 세포에서 더 낮은 수준으로 발현되는 것일 수 있다.
"과다증식성 질환"은 세포가 정상 조직 성장 보다 더 빠르게 증식하는 임의의 질환 또는 장애를 의미한다. 따라서 과다증식 세포는 정상 세포 보다 더 빠르게 증식하는 세포이다.
"진행된 암"은 원발 종양 부위에 더 이상 국한되지 않는 암, 또는 미국 암 합동위원회(AJCC)에 따르면 III기 또는 IV기인 암을 의미한다.
"내성이 좋다"는 것은 치료의 결과로 발생하고 치료 결정에 영향을 미칠 수 있는 건강 상태의 불리한 변화가 없음을 의미한다.
"전이성"은 종양 세포, 예를 들어 인간 고형 종양 또는 비뇨생식기 악성종양을 지칭하며, 이는 면역 결핍 마우스의 유방 지방 패드 및/또는 순환계에 주사 시 면역 결핍 마우스의 폐, 간, 뼈 또는 뇌에 이차 종양 병변을 형성할 수 있다.
"고형 종양"에는 육종, 흑색종, 암종 또는 기타 고형 종양 암이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. "육종"은 배아 결합 조직과 같은 물질로 구성되고 일반적으로 원섬유형 또는 균질한 물질에 박혀 있는 밀집된 세포로 구성된 종양을 의미한다. 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메시 육종, 지방 육종, 지방육종, 폐포 연부 육종, 아멜로모세포 육종, 보트리오이드 육종, 녹색종 육종, 융모막 암종, 배아 육종, 윌름스 종양 육종, 자궁내막 육종, 간질육종 , 유잉 육종, 근막 육종, 섬유 아세포 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 색소 출혈성 육종, B 세포의 면역 아세포 육종, 림프종, T 세포의 면역 아세포 육종, 젠슨 육종, 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종, 혈관육종, 백혈구 육종, 악성 간엽종 육종, 골막 육종, 망상 육종, 로우스 육종, 혈청 낭성 육종, 활액 육종, 및 모세혈관 확장 육종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"흑색종"은 피부 및 기타 기관의 멜라닌 세포 시스템에서 발생하는 종양을 지칭한다. 흑색종에는 예를 들어, 연부 흑색종, 아멜라노틱 흑색종, 양성 청소년 흑색종, 클라우드만 흑색종, S91 흑색종, 하딩-패시 흑색종, 청소년 흑색종, 렌티고 악성 흑색종, 악성 흑색종, 결절 흑색종, 진피하 흑색종 및 표피 확산 흑색종 등이 있다.
"암종"은 주변 조직에 침투하여 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포로 구성된 악성 새로운 성장을 의미한다. 예시적인 암종에는 예를 들어 선암종, 선포 암종, 선낭성 암종, 선종 낭성 암종, 암종 선종, 부신 피질 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저세포암, 기저편평세포암종, 기관지 폐포 암종, 기관지 암종, 세기관지 암종, 기관지 형성 암종, 대뇌 형성 암종, 담관 세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 코메도 암종, 코퍼스 암종, 크리브리 폼 암종, 쿠라세 암종, 피부암종, 원통암종, 원통형 세포 암종, 덕트 암종, 암종 두럼, 배아 암종, 뇌종양 암종, 상피암종, 상피 아데노이드 암종, 외피성 암종, 궤양성 암종, 섬유성 암종, 젤라틴형 암종, 젤라틴성 암종, 거대 세포 암종, 거대 세포 암종, 선암종, 육아종 세포 암종, 모발 기질 암종, 혈종 암종, 간세포 암종, 허슬 세포 암종, 히알린 암종, 부갑상선 암종, 영아 배아 암종, 상피 내암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 크롬페처 암종, 쿨치츠키 세포 암종, 대세포 암종, 렌티큘러 암종, 렌티큘라 암종, 지방종 암종, 림프 상피 암종, 암종 수질, 수질 암종, 흑색종 암종, 암종 몰레, 점액성 암종, 암종 점액종, 뮤코피부암종, 점막 피막 암종, 점막 암종, 점액 암종, 점액종 암종, 비인두 암종, 귀리 세포 암종, 골육종, 골육종, 유두 암종, 말초 암종, 전침습성 암종, 가시 세포 암종, 농포성 암종, 신장의 신세포 암종, 예비 세포 암종, 암종 육종, 슈나이더 암종, 편평 암종, 음낭암종, 시그넷 고리 세포 암종, 단순 암종, 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 구상 세포 암종, 방추세포 암종, 해면상 암종, 편평상피 암종, 편평 세포 암종, 현 암종, 모세 혈관 확장 암종, 모세 혈관 확장성 암종, 전이 세포 암종, 암종 결절, 결절 암종, 유암종 및 비플로섬 암종을 포함한다.
"백혈병"은 조혈 기관의 진행성 악성 질환을 말하며, 일반적으로 혈액과 골수에서 백혈구와 그 전구체의 왜곡된 증식과 발달을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 (1) 질병의 기간과 성격(급성 또는 만성)에 따라 임상적으로 분류된다. (2) 관련된 세포의 유형; 골수성(골수성), 림프성(림프성) 또는 단핵구; 및 (3) 혈액 내 비정상 세포 수의 증가 또는 비증가(백혈병 또는 백혈병(준백혈병)). 백혈병에는 예를 들어 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구 백혈병, 만성 과립구 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T 세포 백혈병, 백혈병, 백혈구 백혈병, 호염기성 백혈병, 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 백혈병, 절단성 백혈병, 배아 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병, 털-세포 백혈병, 혈모구 백혈병, 조혈모구 백혈병, 조직구 백혈병, 줄기세포 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구 백혈병, 림프성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 미세골수구성 백혈병, 단핵구 백혈병, 골수모세포 백혈병, 골수성 백혈병, 골수성 과립구 백혈병, 골수단헥구 백혈병, 네겔리 백혈병, 형질세포 백혈병, 형질세포 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리더 세포 백혈병, 실링 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아 백혈병 및 미분화 세포 백혈병을 포함한다. 특정 구현예에서, 혈액 악성종양은 비호지킨 림프종(NHL)이다.
추가 암에는 예를 들어 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 소세포폐종양, 원발성 뇌종양, 위암, 대장암, 악성 췌장섬섬종, 악성 유암종, 방광암, 전악성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식기암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 부신피질암, 및 전립선암을 포함한다.
본 발명의 이러한 양태의 또 다른 특정 구현예에서, 방법은 상기 대상체에 대한 조혈, 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포 이식과 동시에, 이후 또는 이전에 영향을 받는다. 추가 구현예에서, 대상체는 수혈된 NK 세포의 생체내 기능을 추가로 향상시키는 감작제 또는 강화제(예, 프로테아좀 억제제, IL-2, IL-15 등)로 동시에 치료되고 있다(자세한 내용은 예를 들어 Childs 등의 미국 특허 출원 20090104170 참조.)
자가면역 환자에서 NK 세포의 수 및 기능 감소가 관찰되었으며, 이는 다양한 자가면역 질환 및 상태에서 NK 세포 치료의 가능성을 나타낸다(Schleinitz, et al., Immunology 2010; 131:451-58, and French and Yokohama, Arthrit Res Ther 2004;6:8-14 참조). 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 치료량의 본 발명의 NK 세포 집단을 상기 대상체에게 투여함으로써 달성된다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환에는 심혈관 질환, 류마티스 질환, 선 질환, 위장 질환, 피부 질환, 간 질환, 신경계 질환, 근육 질환, 신장 질환, 생식 관련 질환, 결합 조직 질환 및 전신 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 심혈관 질환의 예에는 죽상경화증, 심근경색, 혈전증, 베게너 육아종증, 다카야수 동맥염, 가와사키 증후군, 항-제VIII 자가면역 질환, 괴사성 소혈관 혈관염, 미세 다발혈관염, 처그 및 스트라우스 증후군, 파우시- 면역 국소 괴사 및 초승달 사구체신염, 항인지질 증후군, 항체-유도 심부전, 혈소판 감소성 자반증, 자가면역 용혈성 빈혈, 샤가스병의 심장 자가면역 및 항-헬퍼 T 림프구 자가면역을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 류마티스 질환의 예에는 류마티스 관절염 및 강직성 척추염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 선 질환(autoimmune glandular disease)의 예에는 췌장 질환, 제I형 당뇨병, 갑상선 질환, 그레이브스병, 갑상선염, 자발성 자가면역 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 특발성 점액수종, 난소 자가면역, 자가면역 항정자 불임, 자가면역 전립선염 및 제I형 자가면역 다선 증후군을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 질병에는 췌장 자가면역 질환, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브스병, 자발 자가면역 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 특발성 점액수종, 난소 자가면역, 자가면역 항정자 불임, 자가면역 전립선염 및 제1형 자가면역 다선증후군을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 위장 질환의 예에는 만성 염증성 장 질환, 복강병, 대장염, 회장염 및 크론병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 피부 질환의 예에는 심상성 천포창, 수포성 천포창 및 잎사귀성 천포창과 같은 자가면역 수포성 피부 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 간 질환의 예에는 간염, 자가면역 만성 활동성 간염, 원발성 담즙성 간경변증 및 자가면역 간염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 신경 질환의 예에는 다발성 경화증, 알츠하이머병, 중증근육무력증, 신경병증, 운동 신경병증; 길랭-바레 증후군 및 자가면역 신경병증, 근무력증, 램버트-이튼 근무력증 증후군; 부신생물성 신경 질환, 소뇌 위축, 부신생물성 소뇌 위축 및 강직자 증후군; 비신생물성 강직인 증후군, 진행성 소뇌 위축, 뇌염, 라스무센 뇌염, 근위축성 측삭 경화증, 시데남 무도병(Sydeham chorea), 질레스 드 라 투렛(Gilles de la Tourette) 증후군 및 자가면역 다발내분비병증; 면역이상 신경병증; 후천성 신경근긴장증, 선천성 다발 관절만곡증, 신경염, 시신경염 및 신경퇴행성 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 근육 질환의 예에는 근염, 자가면역 근염, 원발성 쇼그렌 증후군, 평활근 자가면역 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 신장 질환의 예에는 신장염 및 자가면역 간질성 신장염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
생식과 관련된 자가면역 질환의 예에는 반복적인 태아 손실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 결합 조직 질환의 예에는 귀 질환, 자가면역 귀 질환 및 내이의 자가면역 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자가면역 전신 질환의 예에는 전신 홍반성 루푸스 및 전신 경화증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 (a) 본원에 기술된 바와 같이 NK 세포 성장 인자, CD3+ 피더 세포 및 유효 농도의 니코틴아미드와 NK 세포 집단을 생체외 배양하는 단계, 여기서 상기 유효 농도의 니코틴아미드는 상기 농도의 니코틴아미드 없이 성장 인자와 배양된 세포 집단과 비교하여, 상기 NK 세포의 증식을 향상시키고; 및 (b) 치료량의 상기 배양된 NK 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 NK 세포 또는 NK 세포 조성물을 사용한 치료에 적합한 바이러스 감염에는 HIV, 림프맥락수막염바이러스(LCMV), 거대세포바이러스(CMV), 백시니아 바이러스, 인플루엔자 및 파라인플루엔자 바이러스, 간염(A형 간염, B형 간염, C형 간염, 비A-비B 등 포함), 단순 포진 바이러스, 대상 포진 바이러스, 타일러 바이러스 및 HSV-1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 NK 세포 또는 NK 세포 제제를 사용한 치료에 적합한 다른 감염성 질환에는 플라모디움, 레슈마니아 및 톡소플라스마 감염과 같은 기생충 감염 및 마이코박테리아 및 리스테리아와 같은 박테리아 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는니다 (바이러스, 박테리아 및 원생동물 질병의 치료에서 NK 세포의 검토에 대해서는 Zucchini et al., Exp Rev Anti-Infect Ther 2008;6:867-85를 참조. 이 내용은 참고로 여기에 포함되어 있음).
일부 구현예에서, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 모든 연령대의 대상체 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체 또는 환자는 18세 초과 70세 미만이다.
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 다발성 골수종을 앓을 수 있다. 추가 구현예에서, 다발성 골수종은 다음 기준 중 적어도 하나를 특징으로 하는 (MM)이다: (a) 첫 번째 자가 줄기 세포 이식 후 2-18개월 사이에 재발된 경우, (b) 활성 이식편대숙주병(GVHD)의 증거 없이 동종 줄기 세포 이식 후 최소 4개월 동안 질병이 재발한 경우, (c) 프로테아좀 억제제와 면역조절제(IMiD)를 포함한 최소 2차 요법 이후 재발/불응성 질환, (d) 혈청 IgG, IgA, IgM 또는 IgD 골수종 단백질(M-단백질) 0.5g/dL 이상 및 (e) 200 mg/24 수집 이상의 소변 M-단백질. 일부 구현예에서, 다발성 골수종은 또한 0.5g/dL 이상의 혈청 IgE 골수종 단백질(M-단백질)을 특징으로 하며, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획으로의 세포 치료 치료를 시작하기 최소 4주 전에 혈장분리교환술을 겪었다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 본원에 기술된 기준 중 하나 이상을 특징으로 하는 다발성 골수종을 앓고 있다.
치료가 필요한 대상은 비호지킨 림프종(NHL)을 앓을 수 있다. 일부 구현예에서, 비호지킨 림프종은 CD20 양성 B 세포 NHL이며, CD20 발현은 유동 세포측정법 또는 면역조직화학에 의해 확인된다. 추가 구현예에서, NHL은 다음 특징 중 적어도 하나를 특징으로 한다: (a) 기존 치료법에 실패한 재발성/불응성 질환, (b) 자가 줄기 세포 이식 후 최소 60일 이내에 질병이 재발한 경우, (c) 활성 이식편대숙주병의 증거 없이 동종 줄기 세포 이식 후 최소 4개월 동안 질병이 재발한 경우, (d) 이전에 최소한 2가지 유형의 치료를 받았고, 최소한 하나는 화학요법이고 최소한 하나는 항-CD20 단클론 항체를 포함하고, (e) 루가노 반응 기준에 따라 정의된 측정 가능한 질병(비장종대의 경우 비장의 수직 길이가 13cm 초과, 측정 가능한 샘병증의 경우 결절 장축 직경이 1.5cm 초과(1차원 측정)).
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상은 본 문서에 기술된 기준 중 하나 이상을 특징으로 하는 NHL을 앓고 있다. 특정 구현예에서, 대상체 또는 환자는 다음을 특징으로 하는 NHL을 앓고 있다: (a) 기존 치료법에 실패한 재발성/불응성 질환; (b) 이전에 최소한 2가지 종류의 치료를 받았음(이 중 최소한 하나는 화학요법을 포함하고 최소한 하나는 항-CD20 단클론 항체를 포함함); (c) Lugano 반응 기준에 의해 정의된 측정 가능한 질병(Cheson et al. 2014, J. Clin Oncol 32(27):3059-3067);(d) HGBCL로 형질전환된 FL의 경우, HGBCL로 형질전환된 후 최소한 한 가지 치료를 받아야 한다.
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상은 다음 기준에 따라 추가로 정의될 수 있다: Karnofsky에 의한 수행 점수가 60% 이상, 적절한 기관(organ) 기능은 다음과 같이 정의된다: a. 심장 기능: 심장초음파검사, 방사성 핵종 스캔 또는 심장 MRI에 의한 좌심실 박출률(LVEF)이 ≥40%이다. b. 폐 기능: 실내 공기 중 산소 포화도 90% 이상, 폐 기능 테스트에서 FVC 및 FEV1이 연령에 따른 예측치의 >50%, cDLCO가 예측치의 >50%임을 입증한다. c. 신장 기능: 크레아티닌 청소율 테스트(Cockcroft-Gault 방정식에 의함) ≥40 mL/min 또는 크레아티닌 < 1.5 mg/dL, d. 간 기능: 총 혈청 빌리루빈은 기관 정상범위 상한의 1.5X 보다 작다, 간 트랜스아미나제(ALT 및 AST)는 기관 정상범위 상한의 3 x 보다 작다; e. 혈액학: 총 백혈구(WBC) 수 ≥ 3000/μL, 절대 호중구 수(ANC) ≥ 1000/μL, 혈소판 수 ≥ 75,000/μL 및 헤모글로빈 ≥ 8.0g/dL(이상이 질병과 관련된 경우 면제될 수 있음) 골수 침범), 및 f. 칼슘(다발성 골수종 환자에게만 해당): 치료 등록 전 2주 이내에 칼슘 < 11.5mg/dL로 교정되었다.
일부 구현예에서, 적격 대상체는 세포 주입 전 적어도 3일 동안 프레드니손 또는 다른 면역억제 약물을 중단할 수 있어야 한다(조제 요법 사전 약물 제외). 성적으로 활동적인 가임기 여성과 가임기 파트너가 있는 남성은 치료 중 및 치료 완료 후 4개월 동안 효과적인 피임법을 사용하는 데 동의하도록 요청받을 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 다음 중 임의의 것에 대한 치료 고려사항에서 제외될 수 있다:
1. 공여자 특이적 항-HLA 항체의 높은 역가(MFI >1000);
2. 치료되지 않은 활성 CNS 침범;
3. 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), 또는 고등급 림프종(버킷 림프종/림프구성 림프종);
4. 임신 또는 모유 수유 중;
5. QT/QTc 간격의 뚜렷한 기준선 연장(예, 500밀리초 이상의 QTc 간격 입증)
6. 클래스 II 이상 뉴욕 심장 협회 기능 분류 기준(부록 III) 또는 사이토카인 치료의 심장 합병증 위험을 증가시킬 가능성이 있는 심각한 심장 부정맥(예, 심실성 빈맥, 잦은 심실 외소증 또는 만성 치료가 필요한 심실상 빈맥)
7. 면역억제요법이 필요한 활동성 자가면역질환
8. 현재 만성 약물 치료를 받고 있는 중증 천식 병력(흡입 스테로이드만을 필요로 하는 경증 천식 병력은 자격이 있음)
9. 흉부 엑스레이 또는 흉부 CT 스캔에서 신규 또는 진행성 폐 침윤이 있는 경우 [폐 전문의가 연구를 위해 승인하지 않은 경우. 감염으로 인한 침윤은 적절한 치료 1주 후(진균 감염으로 추정되거나 기록된 경우 4주)에 안정적/개선되어야 함(관련 임상적 개선 포함). ].
10. 조절되지 않는 활성 박테리아, 진균 또는 바이러스 감염 - 모든 이전 감염은 최적의 치료 후에 해결되어야 한다.
11. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 치료제에 대해 알려진 과민증;
12. NK세포분획 치료 시작 전 14일 이내에 임상시험용 의약품을 투여받은 자
일부 구현예에서, 세포 기증자(예, 성분채집술의 후보)는 다음 기준에 따라 선택된다:
1. 12세 ~ 70세 - 연령(35세 미만)에 우선순위를 두어야 하며, 이어서 HLA 일치(동일성이고 가능하지 않은 경우 완전히 불일치 기증자)가 뒤따라야 한다.
2. 체중이 40kg 이상이어야 한다.
3. 평가 의료 제공자가 판단한 전반적인 건강 상태;
4. 다음과 같이 정의된 적절한 기관 기능: 혈액: 헤모글로빈, WBC, 혈소판이 검사 정상 범위의 상한 및 하한의 10% 이내(헤모글로빈에 따라 성별 기준), 간: ALT < 2 x 정상 상한 및 신장: 혈청 크레아티닌 < 1.8mg/dL;
5. 다음을 포함한 기증자 감염성 질환 스크린 패널 완성
CMV 항체, B형 간염 표면 항원, B형 간염 핵심 항체, C형 간염 항체, HIV PCR, HIV ½ 항체, HTLVA ½ 항체, 급속 혈장(RPR) 트레포네마, Trypanosoma Cruzi(T. Cruzi), HCV by NAT, HIV by NAT NAT 또는 현재 패널에 따른 WNV(웨스트 나일 바이러스) - HIV 및 활동성 B형 간염에 대해 음성이어야 한다.
6. 임신하지 않음 - 가임기 여성은 혈액성분채집술 후 7일 이내에 임신 테스트 음성이 나와야 한다.
7. 혈액성분채집술을 받을 수 있고 의향이 있다.
8. 자발적인 서면 동의(기증자가 18세 미만인 경우 동의 양식 사용).
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상페는 림프구 고갈 준비 요법을 받는다. 특정 구현예에서, 대상체는 본 발명의 조성물을 이식 또는 투여하기 전에 림프구고갈 준비 요법을 받게 된다. 요법에는 사이클로포스파미드, 플루다라빈 또는 기타 화학요법 및/또는 면역억제 요법이 포함될 수 있다.
병용 요법
일부 구현예에서, 필요한 대상체는 추가적인 암 치료법과 함께 본원에 기술된 확장된 CD3-고갈 세포 분획으로 치료된다. 일부 구현예에서, 추가적인 암 치료법은 세포독성제 및/또는 비세포독성제를 포함한다. "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소(예, 131I, 125I, 90Y 및 186Re), 화학요법제 및 독소(예, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 합성 독소 또는 이들의 단편)를 포함하도록 의도된다. 비세포독성물질이란 세포의 기능을 억제 또는 방해하지 않고/또는 세포의 파괴를 일으키지 않는 물질을 말한다. "비-세포독성제"에는 활성화되어 세포독성이 될 수 있는 제제가 포함될 수 있다. 비-세포독성 제제에는 비드, 리포솜, 매트릭스 또는 입자가 포함될 수 있다 (예, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 2003/0028071 및 2003/0032995 참조). 이러한 제제는 본원에 기술된 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획 조성물과 접합, 결합, 연결 또는 회합될 수 있다.
일부 구현예에서, 통상적인 암 약제는 본원에 기술된 조성물과 함께 투여된다. 일부 경우에, 필요한 대상체는 표적 암 세포에 대한 하나 이상의 추가 제제와 함께 본원에 기술된 해동되고 냉동보존된 확장된 CD3-고갈 세포 분획으로 치료된다. 매우 적합한 제제에는 암세포에서 DNA 손상, 예를 들어 세포 DNA의 이중 가닥 절단을 촉진하는 제제가 포함된다. 당업자에게 알려진 임의의 형태의 DNA 손상제가 사용될 수 있다. DNA 손상은 일반적으로 방사선 요법 및/또는 화학 요법으로 인해 발생할 수 있다. DNA 손상 물질은 유전독성 물질이라고도 한다. 본원에 사용된 "~와 함께(in conjunction with)"는 하나 이상의 추가 요법 투여 전 또는 투여 후, 하나 이상의 추가 요법과 동시에(동시에 또는 개별적으로, 그러나 근접하게) 대상체에게 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획을 투여하는 것을 의미한다.
방사선 요법의 예에는 외부 방사선 요법 및 내부 방사선 요법(근접 요법이라고도 함)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 외부 방사선 치료를 위한 에너지원으로는 엑스레이, 감마선, 입자선 등이 있고, 내부 방사선에 사용되는 에너지원으로는 방사성 요오드(요오드125, 요오드131), 스트론튬89, 인, 팔라듐, 세슘, 인듐, 인산염, 코발트의 방사성 동위원소 등이 있다. 방사선 요법을 실시하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
특히, 유용할 수 있는 DNA 손상 화학요법제의 예에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지 않는다: 부설판(마일란), 카보플라틴(파라플라틴), 카머스트메(BCNU), 클로람부실(류케란), 시스플라틴(플래몰), 사이클로포스파미드(사이톡산, 네오사르), 다카바즈메(DTIC-Dome), 이포스파미드(Ifex), 로머스트메(CCNU), 메클로레탐(질소 머스타드, 머스타르겐), 멜팔란(알케란), 프로카바진(마툴란).
다수의 다른 화학요법제도 단독으로 또는 조합하여 본원에 기술된 방법을 위해 사용될 수 있다. 여기에는 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 시스플라틴, 비당류 함유 클로로에틸니트로소우레아, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카바진, 탁솔, 프라글리린, 메글라민 GLA, 발루비신, 카무스테인 및 폴리페포산, MMI270, BAY 12-9566, RAS 파르네실 전이효소 억제제, 파르네실 전이효소 억제제, MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔, 글라몰렉, CI-994, TNP-470, 하이캄틴/토포테칸, PKC412, 발스포다르/PSC833, 노반트론/미트록산트론, 메타렛/수라민, 바티마스타트, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, 인셀/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698 TA 2516/마미스타트, BB2516/마미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레몬알 DP 2202, FK 317, 피치바닐/OK-432, AD 32/발루비신, 메타스트론/스트론튬 유도체, 테모달/테모졸로마이드, 에바셋/리포솜 독소루비신, 유탁산/파클리탁셀, 탁솔/파클리탁셀, 셀로드/카페시타빈, 푸르투론/독시플루리딘, 사이클로팍스/경구용 파클리탁셀, 경구용 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS 종양 유전자 억제제, BMS-182751/경구용 백금, UFT(테가퍼/우라실), 에르가미솔/레바미솔, 에닐루라실/776C85/5FU 증강제, 캄토/레바미솔, 캄토사/이리노테칸, 투모덱스/랄리트렉세드, 류스타틴/클라드리빈, 팍섹스/파클리탁셀, 독실/리포솜 독소루비신, 카엘릭스/리포솜 독소루비신, 플루다라/플루다라빈, 파마루비신/에피루비신, 디포씨트, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈이미드, LU 103793/돌라스테인, 카에틱스/리포솜 독소루비신, 젬자/젬시타빈, ZD 0473/아노미드, YM 116, 요오드 씨즈, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사마이드, 이페스/메스넥스/이포사마이드, 부몬/테니포사이드, 파라플라틴/카보플라틴, 플랜티놀/시스플라틴, 베페사이드/에토포사이드, ZD 9331, 탁소테레/도세탁셀, 구아닌 아라비노사이드의 전구 약물, 탁산 아날로그, 니트로소우레아, 멜펠란 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제, 아미노글루테티미드, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 클로롬부실, 시스플라틴, 사이타라빈 HCl, 닥티노마이신, 다우노루비신 HCl, 에스트라무스틴 인산염 나트륨, 에토포사이드(VP16-213), 플록수리딘, 플루오로우라실(5-FU), 플루타마이드, 하이드록시우레아(하이드록시카바마이드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 류프로라이드 아세테이트(LHRH 방출 인자 유사체), 로무스틴(CCNU), 메클로레타민 HCl(질소 머스타드), 메르캅토퓨린, 메스나, 미토탄(o. p'-DDD), 미톡산트론 HCl, 옥트레오타이드, 플리카마이신, 프로카바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 구연산염, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 황산염, 암사크린(m-AMSA), 아자시티딘, 에스트로포이에틴, 헥사메틸멜라민(HMM), 인터루킨 2, 미토과아존(methyl-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐히드라존; MGBG), 펜토스타틴(2'데옥시코포마이신), 세무스틴(메틸-CCNU), 테니포사이드(VM-26), 빈데신 설페이트(Vindesine sulfate)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 다음 제제도 본 발명에 유용할 수 있다: 알킬화제, 예컨대 카르보플라틴 및 시스플라틴, 질소 머스타드 알킬화제, 니트로소우레아 알킬화제, 예컨대 카르무스틴(BCNU), 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트, 폴린산, 퓨린 유사체 항대사제, 메르캅토퓨린, 피리미딘 유사체 대사산물, 예컨대 플루오로우라실(5-FU) 및 젬시타빈(Gemzar®), 호르몬 항종양제, 예컨대 고세렐린, 류프롤리드, 타목시펜, 천연 항종양제, 예컨대 알데스류킨, 인터루킨-2, 도세탁셀, 에토포사이드(VP-16), 인터페론 알파, 파클리탁셀(Taxol®), 및 트레티노인(ATRA), 항생제 천연 항종양제, 예컨대 블레오마이신, 닥트모마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 다우노마이신 및 미토마이신 C, 및 빈카 알칼로이드 천연 항종양제, 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 하이드록시우레아, 아세톤, 아드리아마이신, 이포스파미드, 에노시타빈, 에피티오스타놀, 아클라루비신, 안시타빈, 니무스틴, 프로카르바진 하이드로클로라이드, 카르보쿠온, 카르보플라틴, 카르모푸르, 크로모마이신 A3, 항종양 다당류, 항종양 혈소판 인자, 사이클로포스파미드(Cytoxan®), 스키조필란, 시타라빈(시토신 아라비노사이드), 다카르바진, 티오모신, 티오테파, 테가푸르, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 예컨대 아우리스타틴, CPT-11(이리노테칸), 미토잔트론, 비노렐빈, 테니포시드, 아미노프테린, 카르보마이신, 에스페라미신(예, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,675,187호 참조), 네오카르지노스타틴, OK 432, 블레오마이신, 푸르툴론, 브록순딘, 부술판, 혼반, 페플로마이신, 베스타틴(Ubenimex®), 인터페론-0, 메피티오스탄, 미토브롬톨, 멜팔란, 라미닌 펩타이드, 렌티난, 코리올루스 베르시컬러 추출물, 테가푸르/우라실, 에스트라무스틴(에스트로겐/메클로레타민), 탈리도마이드 및 레날리도마이드(Revlmid®).
다른 적합한 화학요법제는 프로테아좀 억제제를 포함한다. 프로테아좀 억제제는 단백질, 특히 세포 유지, 성장, 분열 및 세포 사멸에 관여하는 수명이 짧은 단백질을 분해하는 세포 복합체인 프로테아좀의 작용을 차단한다. 프로테아좀 억제제의 예에는 보르테조밉(Velcade®), 락타시스틴(AG Scientific, Inc, San Diego, CA), MG132(Biomol International, Plymouth Meeting, PA.) PS-519, 에포네마이신, 에폭소마이신, 아클라시노마이신 A, 디펩티드 벤즈아미드, CVT-63417, 및 비닐 설폰 트리펩타이드 프로테아좀 억제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및 세포 분획은 암 면역요법을 포함하는 하나 이상의 다른 암 치료와 함께 사용된다. 암 면역요법은 암을 거부하기 위해 면역 체계를 사용하는 것이다. 주요 전제는 질병의 원인이 되는 종양 세포를 공격하도록 대상체의 면역 체계를 자극하는 것이다. 이는 대상체의 면역체계를 통해 대상체 자신의 면역 체계가 종양 세포를 파괴할 표적으로 인식하도록 하거나, 항체와 같은 치료제를 약물로 투여하여 대상체의 면역 체계가 치료제에 의해 종양 세포를 파괴하기 위해 동원된다. 암 면역치료에는 항체 기반 치료법과 사이토카인 기반 치료법이 있다.
사이토카인 기반 암 치료법은 대상의 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 사이토카인을 활용한다. 암 치료에 유용한 사이토카인의 비-제한적인 예에는 인터페론-알파(IFN-알파), 인터루킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨-12(IL-12)가 포함된다.
종양 표적화 및 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 촉진하기 위해, 일부 구현예에서, 질환 특이적 단일클론 항체는 본원에 기술된 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획과 함께(예, 이전, 동시에 또는 이후) 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 및 확장된 CD3-고갈 NK 세포 분획 및 조성물과 함께 사용하기에 적합한 단일클론 항체, 이들의 암세포 표적 및 이들의 사용을 위해 현재 표시된 특정 질병의 비제한적인 목록이 아래 표 5에 제공되어 있다.
종양 표적화 및 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 촉진하기 위해, 일부 구현예에서, 질병 특이적 단일클론 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 혈액 악성종양이 NHL인 경우, 하나 이상의 NHL 특이적 단일클론 항체(예, 리툭시맙)가 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 본 발명의 방법에 유용한 리툭시맙의 예시적인 투여량은 대상체(환자)의 375 mg/m2이다. 특정 구현예에서, 질병 특이적 단일클론 항체 치료는 3가지 용량으로 단일클론 항체(들)를 투여하는 단계를 포함한다: 제 1 용량 NK세포분획 투여(주입, 이식) 10일 전, 제 2 용량 NK세포분획 투여(주입, 이식) 3일 전, 및 제 3 그리고 마지막 용량 - NK 세포분획 투여(주입, 이식) 후 11일, 그리고 일부 구현예에서, 최종(두 번째) NK 세포 분획의 투여(주입, 이식) 후 대략 1주. 특정 구현예에서, 질병 특이적 단일클론 항체는 제 1 용량 전 9-11일, 제 1 용량 전 3일 및 동종의 해동, 냉동보존 확장된 CD3-고갈 세포 분획의 제 1 용량 후 12-16일에 투여된다.
주입, 모니터링 반응 및 단클론 항체 투여에 대한 독성에 대한 표준 지침을 따른다. 엘로투주맙은 일반적으로 주입 시작 전에 덱사메타손, H1 차단제(예, 디펜히드라민), H2 차단제(예, 라니티딘, 아세트아미노펜)를 포함한 전처치 요법과 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 해동되고 희석된 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획을 투여(주입, 이식)하기 전에 면역억제 요법의 예비 요법을 받는다. 적합한 면역억제제는 알킬화제, 퓨린 유사체, 항대사물질 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 면역억제제는 또한 화학요법 면역억제제로 간주된다. 특정 구현예에서, 면역억제 요법은 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 사이클로포스파미드의 예시적인 투여량은 대상(환자)의 400mg/m2이고, 본 발명의 방법에 유용한 플루다라빈의 예시적인 투여량은 대상(환자)의 25mg/m2이다. 특정 구현예에서, 사이클로포스파미드는 해동되고 희석된 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획을 투여(이식, 주입)하기 5일 전에 (IV로) 투여되고, 플루다라빈은 해동되고 희석된 본 발명의 CD3-고갈 세포 분획을 투여(이식, 주입)하기 전 5일, 4일 및 3일 중 각각 하루에 투여(IV)된다. 대안적으로, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드 투여는 면역억제제의 마지막 용량이 세포 분획 투여 개시 2~3일 전에 완료되도록 조정될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 일부 구현예에서, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 이를 필요로 하는 대상체에게 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3 고갈 세포 분획을 투여하는 것은 해동되고 희석된 본 발명의 CD3 고갈 세포 분획의 단일 용량을 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 "단일 용량"은 단일 치료 방문 동안의 투여를 의미하며, "단일 용량"은 각 백의 세포(즉, CD56+/CD3-) 수와 각 개별 환자/대상체의 개별 파라미터(질량, 표면적)에 따라 여러 번 해동하고 희석된 냉동보존된 확장된 CD3-고갈 세포 냉동 보존 백의 내용물을 주입하는 것으로 포함할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 대상체(환자)에게 투여하기 위한 본 발명의 해동되고 희석된 CD3 고갈 세포 분획의 총 용량은 대상체 kg당 1X107/세포 내지 대상체 kg당 5X108/세포, 대상체 kg당 2X107/세포 내지 대상체 kg당 2X108/세포, 대상체 kg당 5X107 내지 2X108/세포, 또는 대상체 kg당 2X107 내지 5X107/세포 확장된 동종 해동 NK 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체(환자)에게 투여하기 위한 본 발명의 해동되고 희석된 CD3 고갈 세포 분획의 총 용량은 대상체의 kg당 1X107, 5X107, 1X108 또는 2X108 확장된 동종 해동 NK 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체(환자)에게 투여하기 위한 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 총 용량은 대상체 kg당 2X108 확장된 동종 해동 냉동보존 NK 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 동종 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 제 1 및 제 2 용량으로 제공된다 (예, 투여 간격이 최소 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 1주, 2주 이상인 2회의 별도 치료 방문).
일부 구현예에서, 상기 조합된 제 1 및 제 2 용량은 대상체 kg당 1X107/세포 내지 대상체 kg당 5X108/세포, 대상체 kg당 2X107/세포 내지 대상체 kg당 2X108/세포, 대상체 kg당 5X107 내지 2X108/세포, 또는 대상체 kg당 2X107 내지 5X107/세포 확장된 동종 해동 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체(환자)에게 투여하기 위한 본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 조합된 제 1 및 제 2 용량은 대상체의 kg당 1X107, 5X107, 1X108 또는 2X108 확장된 동종 해동 NK 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체(환자)에게 투여하기 위한 본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 조합된 제 1 및 제 2 용량은 대상체 kg당 2X108 확장된 동종 해동 냉동보존 NK 세포를 포함한다.
본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 투여는 입원환자 또는 외래환자 절차로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 CD3-고갈 NK 세포 분획의 투여는 주입에 의해 이루어지며, 특정 구현예에서, 본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 냉동보존된 CD3-고갈 세포 분획의 해동 및 희석 후 1시간 이내에 그리고 해동 및 희석된 확장된 CD3-고갈 세포 분획의 최종 생성물 방출 후 4시간 이내에 대상체(환자)에게 주입된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 투여될 때까지 실온에서 유지되며, 사용 전에 냉장 보관되지 않는다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 해동되고 희석된 동종 확장된 CD3-고갈 세포 분획은 이식을 위해 제공한 후 1시간 이내에 그리고 해동되고 희석된 세포 분획의 최종 생성물 방출 후 4시간 이내에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 해동, 희석된 확장된 CD3-고갈 동종 세포 분획은 1회 주입당 15분 이상 60분 이하의 기간 동안 필터나 펌프 없이 정맥내 주입으로 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 세포 분획은 환자 체중 1kg당 시간당 10cc 이하의 속도로 투여된다.
일부 구현예에서, 해동, 희석된 확장된 CD3-고갈 동종 세포 분획은 1회 주입당 15분 이상 60분 이하의 기간 동안 펌프 없이 필터를 사용하여 정맥내 주입으로 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 세포 분획은 환자 체중 1kg당 시간당 10cc 이하의 속도로 투여된다.
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 해동, 희석된 세포 분획 투여 후 인터루킨 2(IL-2)의 지지 요법을 받는다.
일부 구현예에서, IL-2는 본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획을 투여하는 날, 2일 후 및 투여일로부터 4일 후에 6 MU의 용량 (체중이 45 킬로그램 미만인 환자의 경우, IL-2 투여량은 3 MU/m2)으로 피하(SC) 투여된다. 일부 구현예에서, IL-2는 세포 주입일에 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획 후 4시간 이내에 투여된다. 특정 구현예에서, 제1 2번의 IL-2 용량은 세포 주입을 위한 입원의 일부로 투여된다. 제 3 IL-2 용량은 외래환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, Il-2 투여는 확장된 CD3-고갈 NK 세포의 수혈 후 6X106 단위 IL-2를 투여하는 것을 포함한다:
(i) 상기 해동, 희석된 본 발명의 확장된 동종 CD3-고갈 세포 분획의 수혈 당일, 및
(ii) 상기 해동, 희석된 확장된 동종 CD3-고갈 세포의 수혈 후 2일, 및
(iii) 상기 해동, 희석된 확장된 동종 CD3-고갈 세포의 수혈 후 4일.
발열과 오한의 강도를 줄이려면 IL-2를 투여하기 전과 투여 후 4시간 동안 아세트아미노펜/파라세타몰 500~1000mg PO 및 디펜히드라민 25~50mg PO/IV로 사전 투여하는 것을 권장한다.
또한, 환자가 3등급 독성을 경험하고 독성이 48시간 이내에 2등급 이상으로 회복된 경우, 감소된 용량(예, 제곱미터당 200-400만 단위)으로 IL-2 투여를 재개할 수 있다. 증상이 악화되면 IL-2 투여를 중단해야 한다. 환자가 제 1 또는 제 2 용량에서 2등급 이상의 IL-2 주입 관련 독성을 경험한 경우, 최대 48시간 동안 IL-2 투여를 유지할 수 있다. 48시간 이내에 독성이 1등급 이상으로 회복되면 계획된 모든 용량을 투여할 수 있지만, 남은 용량은 최소 24시간 간격으로 투여해야 한다.
일부 구현예에서, 대상체는 다음 중 임의의 일부 또는 전부를 받을 수 있다: 필요에 따라 주입 지원(예, 디펜히드라민 또는 덱스클로르페니라민, 하이드로코르티손 및 아세트아미노펜), 보조 사이토카인(예, G-CSF), 필요에 따라 혈액 제품, 항바이러스, 항균, PCP 및/또는 진균 예방, CMV, EBV 및 HHV6 감시 및 IV 면역글로불린.
일부 구현예에서, 대상체는 혈액 질환에 대한 추가 치료 중 일부 또는 전부를 받는다. 상기 치료법은 면역억제 치료법, 화학요법 및 방사선 치료법으로 이루어진 군에서 선택된 치료법일 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서는 혈액 질환의 치료가 필요한 대상체에서 혈액 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 그 방법은 다음을 포함한다:
(i) 대상체와 동종인 NK 세포 및 CD3+ 세포를 포함하는 혈액성분채집 생성물을 얻는 단계;
(ii) 혈액성분채집 생성물을 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획으로 분리하는 단계;
(iii) 방사선 조사에 의해 상기 CD3+ 세포 분획의 세포를 불활성화하는 단계;
(iv) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 CD3-고갈 세포 분획을 불활성화되고 조사된 CD3+ 세포 분획과 생체외 배양하는 단계, 상기 조건은 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아미드를 1.0 mM 내지 10 mM 양으로 제공하는 것을 포함하고;
(v) 단계 (d)로부터 6~10일, 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획에 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드로 보충하여 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 생성하는 단계;
(vi) 단계 (d)로부터 14-16일, 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 수확하는 단계; 및
(vii) 단계 (vi)의 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 세척하고 농축하는 단계,
(viii) (vii)의 세척 및 농축된 세포를 DMSO가 없는 냉동보존 버퍼에 현탁시키는 단계;
(ix) DMSO를 10% v/v에 추가하는 단계;
(x) 세포의 온도를 -120℃로 낮추는 단계,
(xi) 냉동보존된 세포를 -120℃ 미만에서 보관하여 냉동보존된 확장된 CD3- 고갈 세포 분획을 생성하는 단계;
(xii) (xi)의 냉동보존된 세포 분획을 37℃ 수조에서 해동하는 단계,
(xiii) (xii)의 해동된 세포 분획을 주입 용액으로 희석하여 이식용 해동되고 희석된 냉동보존된 NK 세포 분획을 생성하는 단계;
(xiv) 대상체에게 항암 단일클론 항체를 투여하는 단계;
(xv) 대상체에게 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 단계;
(xvi) 해동되고 희석된 동결보존 NK 세포 분획 (xiii)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및
(xix) IL-2를 대상체에게 투여하여 대상체의 혈액 질환을 치료하는 단계.
일부 특정 구현예에서, 본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 이식(투여, 주입)은 세포 이식 당일에 이를 필요로 하는 대상체에 대한 안전성 평가가 선행되며, 일반적으로 신체 검사, CBC, 혈액 화학(예. 적어도 혈청 크레아티닌, 총 빌리루빈, 알칼리성 포스파타제, AST, ALT 및 마그네슘), 활력 징후: 체중, 체온, 혈압, 맥박 및 호흡수, 적혈구 및 혈소판 수혈을 포함한 병용 약물의 투여를 포함한다.
본 발명의 해동, 희석된 CD3-고갈 세포 분획을 이를 필요로 하는 대상체에 주입하는 것은 일반적으로 환자의 중심 정맥 카테터를 통한 주입하는 방식으로 이루어지나, 개별 부위 시술의 제한이 있을 수 있다.
본 발명의 혈액 질환의 치료 방법은 MM 및 NHL을 포함하지만 이에 제한되지 않는 혈액 악성종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "혈액 질환을 치료하다" 또는 "혈액 악성종양을 치료하다"는 혈액 질환의 증상 또는 징후를 감소시키는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 혈액 질환 또는 혈액 악성종양의 치료는 시간 경과에 따른 증상 감소, 임상 파라미터의 개선, 입원 감소 및 재발 또는 사망 위험 감소에 따라 평가되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 주입은 배양 및/또는 투여되지 않은 NK 세포의 주입과 비교할 때 주입된 NK 세포의 성공적인 생체내 확장 확률을 증가시킨다. 여기에 설명된 방법을 참조하세요. 일부 구현예에서, 생체내 확장의 성공은 주입 후 7일 및 14일에 측정된다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 주입은 본원에 설명된 방법에 따라 배양 및/또는 투여되지 않은 NK 세포의 주입과 비교할 때 대상체의 말초 혈액 내 NK 세포의 기능을 증가시킨다. 일부 구현예에서, NK 세포 기능은 주입 후 7일 및 14일에 측정된다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획의 주입은 본원에 기술된 방법에 따라 배양 및/또는 투여되지 않은 NK 세포의 주입과 비교할 때 NK 세포 분획의 주입 후 유리한 질병 반응의 확률을 증가시킨다. 일부 구현예에서, NK 세포 기능은 주입 후 28일째 및 1년째에 측정된다. 특정 구현예에서, 혈액 악성종양은 NHL이고 NHL에 대한 질병 반응 기준은 NHL에 대한 Lugano 또는 국제 실무 그룹 반응 기준에 따라 평가된다 (자세한 내용은 Cheson, et al, J Clin Oncol 2014;32:3059-68 참조).
일부 구현예에서, 본 발명의 제조물, 조성물 또는 키트는 이식이 필요한 대상체에게 이식에 적합한 확장된 NK 세포 분획을 투여하기 위한 지침을 추가로 포함한다.
본 발명의 제조물, 조성물 또는 키트의 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에의 이식에 적합한 본 발명의 해동되고 희석된 CD3-고갈 세포 분획은 적어도 7X108개의 총 생존 가능한 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체로의 이식에 적합한 해동되고 희석된 확장된 세포 분획은 적어도 8X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 적어도 10X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 적어도 15X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 적어도 20X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 적어도 25X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 적어도 40X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 적어도 50X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 최소 60X108개의 총 생존 가능한 NK 세포, 최소 80X108개의 총 생존 가능한 NK 세포 또는 최소 100X108개의 총 생존 가능한 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 각각의 동결보존 백은 40-60X108개 범위의 총 생존 가능한 NK 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 냉동보존 백은 50X108개의 총 생존 가능한 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물, 제조물 또는 키트는 각각 적어도 50X108개의 총 생존 NK 세포를 갖는 최대 4개의 냉동보존 백을 포함한다.
본 발명의 선택된 세포 집단은 그 자체로 제공될 수 있고, 이를 함유하는 배양 배지와 함께 제공될 수 있고, 배양 배지로부터 분리되고, 약학적으로 허용되는 담체 및 세포 생착 및/또는 기관 기능을 촉진할 수 있는 추가 제제(예, 면역억제제, 항생제, 성장인자)와 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 집단은 멸균 식염수 및 수성 버퍼와 같은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제에 투여될 수 있다. 이러한 담체 및 희석제의 사용은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
원하는 경우, 본 발명의 조성물은 활성 성분(예, 세포)을 포함하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 FDA 승인 키트 또는 제조품과 같은 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩이나 디스펜서 장치에는 투여 지침이 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 통지가 첨부될 수도 있으며, 이 통지는 인간 또는 수의학 투여용 조성물 형태에 대한 해당 기관의 승인을 반영한다. 예를 들어, 이러한 통지에는 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 처방약 또는 승인된 제품 삽입물에 대한 라벨 표시가 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체에 제제화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 위에서 추가로 설명한 바와 같이 제조하여 적절한 용기에 넣고 표시된 상태의 치료를 위해 라벨을 붙일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 세포는 그 자체로 또는 적합한 담체 또는 부형제와 혼합된 약학적 조성물로 대상체에 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "약학적 조성물"은 본원에 기술된 하나 이상의 활성 성분의 제제를 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 함께 조제한 것을 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
이하, 상호교환적으로 사용될 수 있는 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약학적으로 허용되는 담체"라는 문구는 유기체에 심각한 자극을 일으키지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 이 문구 아래에 보조제가 포함된다.
본원에서, "부형제"라는 용어는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 약물의 제형 및 투여 기술은 본 명세서에 참고로 포함된 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA의 최신판에서 찾을 수 있다.
따라서 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 활성 성분을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 처리하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제형은 선택한 투여 경로에 따라 달라진다.
주사의 경우, 약학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 버퍼로 제제화될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용하기에 적합한 약학적 조성물에는 활성 성분이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물이 포함된다. 보다 구체적으로, "치료적으로 유효한 양"은 장애 증상(예, 백혈병, 다발성 골수종)을 예방, 완화 또는 개선하거나 치료받는 대상의 생존을 연장하는데 효과적인 활성 성분(예, 확장된 CD3-고갈 NK 세포)의 양을 의미한다. 치료적으로 유효한 양의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시 내용을 고려하여 당업자의 능력 내에 있다.
본원에 기술된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 시험관 내, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 시험관 내 및 세포 배양 분석과 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에게 사용할 수 있는 다양한 용량을 공식화하는데 사용될 수 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 복용량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사가 선택할 수 있다. (예, Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.1 참조)
치료할 상태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여는 단일 또는 복수 투여일 수 있다. 투여될 조성물의 양은 물론 치료 대상, 질환의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 용어 "약"은 ± 10%를 의미한다.
"함유하다", "함유하는", "포함하는", "포함하는", "가지는"이라는 용어와 이들의 결합형은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다.
"구성된"이라는 용어는 "포함하고 제한되는"을 의미한다.
"본질적으로 구성되는"이라는 용어는 조성물, 방법 또는 구조에 추가 성분, 단계 및/또는 부품이 포함될 수 있지만 추가 성분, 단계 및/또는 부품이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 새로운 특성을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 해당된다는 의미이다.
본원에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"이라는 용어는 이들의 혼합물을 포함하여 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시예가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 유연하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 점을 이해해야 한다. 따라서 범위의 설명은 해당 범위 내의 개별 수치뿐만 아니라 가능한 모든 하위 범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1에서 6까지의 범위의 설명은 1에서 3, 1에서 4, 1에서 5, 2에서 4, 2에서 6, 3에서 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 등을 구체적으로 공개한 것으로 간주해야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에서 숫자 범위가 표시될 때마다, 이는 표시된 범위 내의 인용된 숫자(분수 또는 적분)를 포함함을 의미한다. 제1 지시 숫자와 제2 지시 숫자의 "범위/범위 사이" 및 제1 지시 숫자와 제2 지시 숫자의 "범위/범위로부터"라는 문구는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 제1 및 제2 지시 숫자와 그 사이의 모든 분수 및 적분 숫자를 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용되는 "방법"이라는 용어는 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 종사자에게 공지되거나 공지된 방법, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발되는 방법, 수단, 기술 및 절차를 포함하되 이에 제한되지 않는 주어진 과제를 수행하기 위한 방법, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.
명확성을 위해, 개별 구현예의 맥락에서 설명되는 본 발명의 특정 특징들은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 반대로, 간결성을 위해 단일 구현예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 개별적으로 또는 적절한 하위 조합으로 또는 본 발명의 다른 설명된 구현예에서 적합한 대로 제공될 수도 있다. 다양한 구현예의 문맥에서 설명된 특정 특징들은, 해당 구현예가 그러한 요소들 없이 작동하지 않는 한, 해당 구현예의 필수적인 특징들로 간주되어서는 안 된다.
본 명세서에서 설명되고 아래의 청구범위 섹션에서 청구된 본 발명의 다양한 구현예 및 양태들은 다음 실시예에서 실험적 지원을 찾을 수 있다.
예시적인 구현예
구현예 1. 이를 필요로 하는 대상체를 위해 NK 세포 분획을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 다음을 포함합니다:
대상체와 동종인 NK 세포 및 CD3+ 세포를 포함하는 혈액성분채집(apheresis) 생성물을 얻는 단계;
(b) 혈액성분채집 생성물을 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획으로 분리하는 단계;
(c) 방사선 조사에 의해 상기 CD3+ 세포 분획의 세포를 불활성화시키는 단계;
(d) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 CD3-고갈 세포 분획을 불활성화되고 조사된 CD3+ 세포 분획과 함께 생체 외 배양하는 단계, 여기서 상기 조건은 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아미드를 1.0 mM 내지 10 mM 양으로 제공하는 것을 포함하고;
(e) 단계 (d) 이후 6~10일에 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드로 보충하여 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 생성하는 단계;
(f) 단계 (d) 이후 14-16일에 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 채취하는 단계; 및
(g) 상기 (f) 단계의 조합된 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획을 세척 및 농축하여 NK 세포 분획을 제조하는 단계
구현예 2. 상기 혈액성분채집 생성물은 인간 NK 및 CD3+ 세포 분획을 포함하는 인간 혈액성분채집 생성물인, 구현예 1의 방법.
구현예 3. 상기 혈청은 인간 혈청인, 구현예 1의 방법.
구현예 4. 상기 세포 증식을 허용하는 조건은 10% 인간 혈청을 제공하는 단계를 포함하는, 구현예 1의 방법.
구현예 5. 상기 IL-15는 20ng/ml 농도의 IL-15를 포함하는, 구현예 1의 방법.
구현예 6. 상기 CD3 작용제는 OKT3인, 구현예 1의 방법.
구현예 7. 상기 OKT3는 1 μg/ml OKT3을 포함하는, 구현예 1의 방법.
구현예 8. 상기 니코틴아미드는 7.0mM 니코틴아미드를 포함하는, 구현예 1의 방법.
구현예 9. 상기 영양소가 최소 필수 세포 배양 배지를 포함하는, 구현예 1의 방법.
구현예 10. 상기 확장된 NK 세포 분획의 상기 NK 세포가 적어도 40-97%의 CD56+/CD3- 세포를 포함하는, 구현예 1의 방법.
구현예 11. 단계 (e)에 의해 생성된 상기 세척되고 농축된 확장된 NK 세포 분획은 다음 파라미터를 특징으로 하는, 구현예 1의 방법:
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70% 생존 가능함;
(c) 주입 시 1X106 CD3+/CD56- 세포/환자 질량 Kg 미만;
(d) 주입 시 5 EU 내독소/환자 질량 Kg 이하;
(e) 마이코플라스마가 없음,
(f) 무균.
구현예 12. 상기 CD3+ 세포는 주입 시 0.5X X106 CD3+/CD56- 세포/환자 질량 Kg 미만인, 구현예 11의 방법.
구현예 13. 상기 CD3-고갈 CD3+ 세포와 상기 방사선 조사된 CD3+ 세포는 단계 (d)에서 1:1 비율로 접종되는, 구현예 1의 방법.
구현예 14. 상기 단계 (d)의 배양은 플라스크에서 0.30-0.40X106 CD3-고갈 및 0.30-0.40X106 조사된 CD3+ 세포/ml로 영향을 받는, 구현예 13의 방법.
구현예 15. 단계 (d)의 배양이 플라스크에서 0.35X106 CD3-고갈 및 0.35X106 조사된 CD3+ 세포/ml로 영향을 받는, 구현예 13의 방법.
구현예 16. 단계 (d)의 배양이 플라스크에서 400-900X106 CD3-고갈 및 400-900X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크로 영향을 받는, 구현예 13의 방법.
구현예 17. 단계 (d)의 배양이 플라스크에서 700X106 CD3-고갈 및 700X106 조사된 CD3+ 세포/플라스크로 영향을 받는, 구현예 13의 방법.
구현예 18. 상기 확장된 CD3-고갈 세포가 상기 CD3+ 세포 분획이 없이 5 mM 니코틴아미드를 갖는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포와 비교하여 CD62L의 발현이 증가되는, 구현예 13의 방법.
구현예 19. 상기 확장된 CD3-고갈 세포는 상기 CD3+ 세포 분획이 없이 5 mM 니코틴아미드를 갖는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3-고갈 세포와 비교하여 항체 의존성 세포독성이 증가된, 구현예 13의 방법.
구현예 20. 다음을 포함하는 NK 세포 분획의 냉동보존 방법:
(a) NK 세포 분획의 NK 세포를 DMSO가 없는 냉동보존 버퍼에 현탁시키는 단계;
(b) DMSO를 10% v/v로 첨가하는 단계;
(c) 상기 세포의 온도를 -120℃로 낮추는 단계; 및
(d) 냉동보존된 NK 세포를 -120℃ 미만의 온도에서 보관하는 단계.
구현예 21. 구현예 1에 따라 제조된 NK 세포 분획.
구현예 22. 구현예 20에 따라 제조된 냉동보존된 NK 세포 분획.
구현예 23. 20ml의 부피에 2.5 X 108 총 세포/ml를 포함하는 냉동보존 백에 제공되는, 구현예 22의 냉동보존된 NK 세포 분획
구현예 24. 다음을 포함하는 투여용 냉동보존 NK 세포 분획의 제조방법:
(a) 냉동보존된 NK 세포 분획을 37 ℃ 수조에서 해동하는 단계;
(b) 상기 동결보존된 NK 세포 분획을 주입 용액으로 희석하여 이식을 위해 해동되고 냉동보존된 NK 세포 분획을 생성하는 단계.
구현예 25. 상기 냉동보존된 NK 세포 분획은 구현예 23의 냉동보존된 NK 세포 분획인, 구현예 24의 방법에 의해 생성된 이식용 해동된 냉동보존된 NK 세포 분획.
구현예 26. 상기 확장된 CD3 고갈 세포는 5mM 니코틴아미드가 있고 상기 CD3+ 세포 분획이 없는 동일한 조건 하에서 확장된 CD3 고갈 세포와 비교하여 방사선 조사된 마우스에 주입한 후 비장 및 골수에서 증가된 생체내 체류를 갖는, 구현예 25의 해동되고 냉동보존된 NK 세포 분획.
구현예 27. 다음 파라미터가 특징인, 구현예 25의 이식을 위한 해동되고 냉동보존된 NK 세포 분획.
(a) 적어도 70%의 CD56+/CD3- 세포;
(b) 적어도 70%가 생존 가능함;
(c) 주입 시 1X106 CD3+/CD56- 세포/환자 질량 Kg 미만;
(d) 주입 시 5 EU 내독소/환자 질량 Kg 이하;
(e) 마이코플라스마가 없음,
(f) 무균.
구현예 28. 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 냉동보존 백에 제공되는, 구현예 25의 해동된 냉동보존된 NK 세포 분획.
구현예 29. 2.5X108개 세포/ml를 포함하는, 구현예 28의 해동된 냉동보존된 NK 세포 분획.
구현예 30. 100ml의 부피로 제공되는, 구현예 28의 해동된 냉동보존된 NK 세포 분획.
구현예 31. 혈액 질환의 치료가 필요한 인간 대상체에서 혈액 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 상기 대상체에게 항암 단일클론 항체를 투여하는 단계;
(b) 상기 대상체에게 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 단계;
(c) 동종 해동되고 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획을 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 이식하는 단계, 여기서 상기 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포 분획은 CD3+ 세포, 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 1.0mM 내지 10mM 양의 니코틴아미드와 함께 생체외 배양아혀 확장되었으며; 그리고
(d) 상기 대상체에게 IL-2를 투여하여 상기 대상체의 상기 혈액 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
구현예 32. 상기 면역억제제는 화학요법적 면역억제제 및/또는 방사선 조사인, 구현예 31의 방법.
구현예 33. 상기 혈액 질환은 혈액 악성종양인, 구현예 31의 방법.
구현예 34. 상기 혈액 질환은 비호지킨 림프종(NHL)인 구현예 31의 방법.
구현예 35. 상기 혈액 질환은 여포성 림프종(FL) 또는 고등급 B 세포 림프종(HGBCL)인, 구현예 34의 방법.
구현예 36. 상기 NHL은 CD20 양성 B 세포 NHL인, 구현예 34의 방법.
구현예 37. 상기 NHL은 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는, 구현예 34의 방법:
(a) 기존 치료법에 실패한 재발성/불응성 질환;
(b) 이전에 2가지 이상의 치료법을 받은 환자(이 중 적어도 하나는 화학요법을 포함하고 적어도 하나는 항-CD20 단일클론 항체를 포함함);
c) 루가노 반응 기준에 의해 정의된 측정 가능한 질병;
d) 상기 NLH는 HGBCL로 변환된 FL이고, HGBCL로 변환된 후 적어도 한 가지 치료를 받아야 한다.
구현예 38. 상기 혈액 악성종양은 NHL이고, 상기 항암 단일클론 항체는 리툭시맙(375mg/m2)인, 구현예 33의 방법.
구현예 39. 단계 (a)가 3회 수행되는,구현예 31의 방법.
구현예 40. 단계 (c)가 상기 동종 해동, 냉동보존 확장된 세포 분획의 제 1 용량을 투여하고, 2일 후에 상기 동종 해동, 냉동보존 획장된 NK 세포 분획의 제 2 용량을 투여하는 것을 포함하는, 구현예 31의 방법.
구현예 41. 단계 (a)는 상기 동종 해동, 냉동보존된 확장된 NK 세포 분획의 상기 제1 투여 전 10일, 상기 제1 투여 전 3일 및 상기 제1 투여 후 12-16일에, 3회 수행되는, 구현예 40의 방법.
구현예 42. 상기 세포 분획이 대상체 kg당 1X107 내지 5X108 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포를 포함하는, 구현예 31의 방법.
구현예 43. 상기 세포 분획이 대상체 kg당 2X108 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포를 포함하는, 구현예 31의 방법.
구현예 44. 상기 제 1 및 제 2 용량의 조합이 2X107/kg 내지 2X108/kg의 총 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포를 포함하는, 구현예 41의 방법.
구현예 45. (a) 상기 NK 세포 분획의 상기 제 1 용량 및 상기 제 2 용량은 각각 2.5 x 107 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포/대상체 kg을 포함하고, 총 용량은 5 x 107 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포/대상체 kg이거나; 또는
(b) 상기 NK 세포 분획의 상기 제 1 용량 및 상기 제 2 용량은 각각 개체 kg당 5 x 107 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포/대상체 kg를 포함하고, 총 용량은 1 x 108 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포/대상체 kg이거나, 또는
(c) 상기 NK 세포 분획의 상기 제 1 용량 및 상기 제 2 용량은 각각 1 x 108 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포/대상체 kg를 포함하며, 총 용량은 총 용량은 2 x 108 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포/대상체 kg인, 구현예 40의 방법.
구현예 46. 상기 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포 분획은 해동 후 4시간 이내에 상기 대상체에게 투여되는, 구현예 31의 방법.
구현예 47. 상기 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포 분획은 필터나 펌프 없이 주입에 의해 환자 체중 kg당 10 cc 이하의 속도로 상기 대상체에게 투여되는, 구현예 31의 방법.
구현예 48. 상기 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈을 포함하는, 구현예 31의 방법.
구현예 49. (i) 상기 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드(400 mg/m2) 및 플루다라빈(30 mg/m2)을 모두 포함하고; 그리고
(ii) 상기 사이클로포스파미드 및 상기 플루다라빈은 상기 동종 해동, 냉동보존 확장된 NK 세포의 수혈 전 5일, 4일 및 3일 중 각각 하루에 투여되는, 구현예 48의 방법.
구현예 50. 상기 단계 (d)는 상기 동종 해동 냉동보존 확장된 NK 세포의 수혈 후 (i) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 일; (ii) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 후 2일; 및 (iii) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 후 4일에, 6 x 106 단위의 IL-2를 각각 하나씩 투여하는 단계를 포함하는, 구현예 31의 방법.
구현예 51. 단계 (c)는 구현예 24의 방법에 따라 제조된 이식 가능한 NK 세포 분획을 이식하는 단계를 포함하는, 구현예 31의 방법.
실시예
이제 위의 설명과 함께 비제한적인 방식으로 본 발명의 일부 구현예를 설명하는 다음 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본 발명에 사용된 명명법과 본 발명에 사용된 실험실 절차에는 분자, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술이 포함된다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어 다음을 참조하세요.
"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허. 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 명시된 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용 가능한 면역분석법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 설명되어 있다. 예를 들어 다음을 참조하세요.U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1, 2, 317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 이들 모두는 본 명세서에 완전히 설명된 것처럼 참조로 포함된다. 이 문서 전반에 걸쳐 기타 일반 참조 자료가 제공된다. 그 절차는 해당 분야에 잘 알려져 있는 것으로 여겨지며 독자의 편의를 위해 제공된다. 여기에 포함된 모든 정보는 참조로 여기에 포함된다.
실시예 1 - 생체 외 확장된 NK 세포의 확장 및 시험관 내 기능에 대한 CD3+ 피더 세포의 효과
불활성화 후 OKT3와 같은 CD3 작용제의 존재 하에 자가 방사선 조사된 CD3+ 세포 분획 피더 세포가 생체 외 확장된 냉동보존되고 해동된 NK 세포의 확장 및 기능에 미치는 영향을 평가하였다.
본 발명의 방법에 따른 배양 2주 후, OKT3 및 NAM이 보충된 비활성화된 자가 CD3+ 세포를 피더로 사용하는 변형된 절차는 배수 확장을 개선하여 수확 시 얻은 생존 세포의 총 수를 증가시켰다. 사멸 및 ADCC에서 세포의 기능성은 NK 세포와 표적 세포 BL2(버킷 림프종 세포주)를 다양한 비율로 조합하여 평가하였다. 비활성화된 CD3+ 피더 세포와 함께 CD-고갈 분획의 배양은 더 높은 NAM 농도(7mM)에서 세포를 배양함으로써 부분적으로 극복된 세포 독성 분석에서 성능 감소로 이어졌다(도 1). 7mM NAM에서 배양하면 CD62L의 발현도 증가하였다(도 2).
NK 세포는 감염되고 악성으로 형질전환된 세포를 조사하고 제거하는데 중요한 역할을 한다. 그들은 또한 표적 세포를 직접 죽일 수 있을 뿐만 아니라 IgG 항체의 Fc 부분에 결합하는 막 수용체 FcγRIII(CD16)을 통해 ADCC를 중재하는 능력도 가지고 있다.
세포독성 활성에 대한 NAM의 영향을 테스트하기 위해, NK 세포를 피더가 있거나 없는 5- 또는 7-mM NAM에서 2주 동안 본 발명의 방법에 따라 배양하였다. ADCC 분석은 표지된 BL2 세포를 사용하여 수행되었다. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석에서는 NAM 단독으로 배양한 세포에 비해 7mM NAM 및 피더와 함께 배양한 NK 세포의 세포독성 활성이 증가한 것으로 나타났다(도 1).
본 개시내용의 방법을 사용한 배양 후, 생산된 세포의 표현형을 FACS를 사용하여 분석하였다. 결과를 도 8 및 9에 나타내었다. 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 생산 방법은 CD16, CD57, CD62L, NKp80, CD200R, CD16, CD57, CD62L, NKp80, CD200R, LAG3 및 CD56.
FACS와 CEDEX의 조합을 사용하여 본원에 기술된 배양 방법에 따라 수확된 세포의 여러 배치에 대해 세포 표현형, 특정 세포의 생존력 및 배수 확장에 대한 추가 분석을 수행하였다. 이들 분석의 결과는 하기 표 I, IIa 및 IIb에 제시되어 있다.
표 I: 표현형 - 수확(NAM을 이용한 배양 14일차)
표 IIa: 표현형 - 수확(NAM을 이용한 배양 14일차)
표 IIb: 표현형 - NAM 유무
세포 표현형 외에도, 위에서 설명한 세포 배치의 효능은 본원에 설명된 1차 및 2차 효능 분석을 사용하여 측정되었다. 이들 분석의 결과는 하기 표 III 및 IV에 제시되어 있다.
표 III: 효능 - 수확(14일)
표 IV: 효능 - 수확(14일)
표 3-5는 본원에 기술된 방법에 따라 배양, 동결 및 해동된 예시적인 냉동보존되고 해동된 CD3-고갈되고 방사선 조사된 CD3+ 세포의 세포 수, 생존력 및 표현형 특징 분석의 평가 결과를 보여준다. T=0은 분획의 동결 후 7±2일의 해동에 해당한다.
표 3 - 배양 및 동결보존 후 동결보존되고 해동된 확장된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더 세포의 프로필.
*1 250ml 백에 냉동된 총 유핵 세포 = 5000X106(20ml 용량)
**50ml 백 1개에 냉동된 총 유핵 세포 = 2500X106(10ml 부피)
표 4 - 배양 및 냉동보존 후 냉동보존 해동 확장된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더세포의 프로필.
표 5 - 배양 및 냉동보존 후 냉동보존 해동 확장된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더세포의 프로필.
표 6-8은 예시적인 냉동보존되고 해동된 CD3-고갈되고 방사선 조사된 CD3+ 세포의 세포 기능(각각 본원에 기술된 1차 효능 분석 및 2차 효능 분석에 의해 측정된 세포 사멸 및 효능)의 평가 결과를 보여준다. 여기에 설명된 방법에 따라 배양되었습니다. T=0은 분획의 동결 후 7±2일의 해동에 해당한다.
표 6 - 배양 및 냉동보존 후 냉동보존되고 해동된 확장된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더 세포의 기능 및 효능.
표 7 - 배양 및 냉동보존 후 냉동보존 해동 확장된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더 세포의 기능 및 효능.
표 8 - 배양 및 냉동보존 후 냉동보존 해동 확장된 CD3-고갈 및 CD3+ 피더 세포의 기능 및 효능.
실시예 2 - 생체 외 확장된 NK 세포의 표현형 특성화에 대한 NAM 및 CD3+ 피더 세포의 효과
면역 체크포인트 수용체인 CD200R 및 프로그램 사망 수용체-1(PD-1)은 림프구의 항종양 활성을 억제하기 위해 리간드를 과발현하는 종양 세포에 의해 이용된다. NK 세포에서 면역 체크포인트 수용체 발현에 대한 니코틴아미드(NAM) 확장 효과를 평가하였다.
FACS 분석을 사용한 면역표현형 분석은 NAM이 확장된 NK 세포에서 발현된 CD200R의 발현을 하향 조절한다는 것을 입증하였다(도 3).
실시예 3 - 생체 외 확장된 NK 세포의 생체 내 귀소에 대한 NAM 및 CD3+ 피더 세포의 효과
배양에서 활성화되는 동안, NK 세포는 임상 효능에 직접적인 영향을 미치는 생체 내 이동, 국소화 및 증식 능력 중 일부를 잃는다. 생체 외 확장된 NK 세포의 유지 및 유지 효능에 대한 NAM 유무에 관계없이 CD3+ 피더 세포를 사용한 배양, 냉동보존 및 해동의 효과를 평가하였다.
생체내 체류 모델(비장)은 본원에 기술된 방법에 따라 냉동 보존 및 해동한 후, NAM 및 조사된 CD3+ 피더 세포와 함께 배양된 CD3-고갈 배양물로부터의 NK 세포의 전체 체류가 체류와 비교할 때 더 높다는 것을 보여주었다. 사이토카인만 배양된 세포이다(도 4).
실시예 4 - 생체 외 확장된 NK 세포의 생체 내 기능성에 대한 CD3+ 피더 세포의 효과
NK 세포 기능에 대한 CD3+ 피더 세포 배양, 동결보존 및 해동의 효과는 시험관 내에서 나타났다(실시예 1 참조).
5mM 또는 7mM NAM에서 피더가 있거나 없는 NK 확장을 두 가지 다른 생체내 분석에서 비교하였다. 잔류 분석에서 방사선 조사된 NSG 마우스(그룹당 n= 6-7마리 마우스)에게 20x106 인간 NK 세포/마우스를 IV 주사하였다. 피더 및 7mM NAM으로 확장된 NK 세포는 비장 내 NK 세포의 전체 수 측면에서 증가된 보유를 나타냈으며(도 5A), 3일 후 골수 내 NK 세포의 비율이 증가하였다(도 5B).
실시예 5 - 생체외 확장, 냉동보존 및 해동된 CD3 제거(NK) 세포
NK 세포 기능에 대한 CD3+ 피더 세포의 배양, 냉동보존 및 해동의 효과는 시험관 내(실시예 1 참조) 및 생체 내(실시예 4)에서 나타났다. 확장된 NK 세포의 종양 성장 억제 가능성을 A549(인간 폐 선암 상피 종양) 세포에서 평가하였다.
도 6 및 도 7은 최소한의 NK 세포 투여(9일 및 11일)(도 6B 및 6C) 및 다수의 연장된 NK 세포 투여(9일, 12일, 15일 및 18일)(도 7B 및 7C) 모두에서 항-Her2 항체 투여와 결합된 NK 세포 투여의 시너지 효과를 나타낸다.
이론에 구애됨이 없이, 종합적으로 고려하면, 니코틴아마이드, 조사된 CD+ 피더 세포 및 CD3 작용제(예, OKT3)를 본원에 기술된 방법에 따라 냉동보존 및 해동하면, 냉동 및 해동의 부정적인 영향을 극복하고 암 및 기타 질병의 치료에 사용하기에 적합한 향상된 생체 외 및 생체 내 기능을 갖는 효과적으로 저장 가능한 확장된 NK 세포 집단을 제공할 수 있다.

Claims (41)

  1. 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획으로서,
    상기 집단은 적어도 1.0 x 106개의 유핵 세포를 포함하고, 상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 생존 가능하며,
    여기서;
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 CD56+이고;
    상기 집단 내 세포의 약 0.5% 이하가 CD3+이며;
    상기 집단 내 세포의 약 10% 이하가 CD19+이고;
    상기 집단 내 세포의 약 10% 이하가 CD14+이며;
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 44%가 CD49a+이고;
    상기 집단 내 세포의 약 27% 이하가 LAG3+이며;
    상기 집단 내 세포의 약 32% 이하가 CD200R+이고;
    상기 집단 내 세포의 약 25% 이하가 CD57+이며;
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD16+이고;
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 10%가 CD62L+인, NK 세포 분획.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 90%가 CD56+인, NK 세포 분획.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 90 내지 약 95%가 CD56+인, NK 세포 분획.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 0.2 내지 약 0.3%가 CD3+인, NK 세포 분획.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 70% 이상이 CD56+/CD3-이고, 그리고
    상기 집단 내 세포의 약 0.5% 이하가 CD56-/CD3+인, NK 세포 분획.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 99%가 CD56+/CD3-인, NK 세포 분획.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 15% 이상이 CD62L+인, NK 세포 분획.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 18% 내지 약 70%가 CD62L+인, NK 세포 분획.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 20%가 CD16+인, NK 세포 분획.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 20% 내지 약 60%가 CD16+인, NK 세포 분획.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 1% 이하가 LAG3+이고,
    상기 집단 내 세포의 약 1.5% 이하가 CD200R+이고,
    상기 집단 내 세포의 약 2.5% 이하가 CD57+인, NK 세포 분획.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 3% 이하가 CD56+/LAG3+이고,
    상기 집단 내 세포의 약 11% 이하가 CD56+/CD200R+이고,
    상기 집단 내 세포의 약 4% 이하가 CD56+/CD57+인, NK 세포 분획.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 43%가 CD56+/CD16+인, NK 세포 분획.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 57%가 CD56+/CD16+인, NK 세포 분획.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 적어도 약 78%가 CD56+/CD62L+인, NK 세포 분획.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단 내 세포의 약 77% 이하가 NKp80+이며, 바람직하게 집단 내 세포의 약 15.77% 이하가 NKp80+인, NK 세포 분획.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 분획은
    i) 적어도 약 17.5 x 108개의 유핵 세포;
    ii) 적어도 약 35 x 108개의 유핵 세포;
    iii) 적어도 약 2.5 x 109개의 유핵 세포;
    iv) 적어도 약 5 x 109개의 유핵 세포;
    v) 적어도 약 1.25 x 107개의 유핵 세포;
    vi) 적어도 약 2.5 x 107개의 유핵 세포;
    vii) 적어도 약 5 x 107개의 유핵 세포; 또는
    viii) 적어도 약 1 x 108개의 유핵 세포를 포함하는 NK 세포 분획.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 분획은 사전에 냉동되고 이후에 해동된, NK 세포 분획.
  19. i) 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 NK 세포 분획; 및
    ii) DMSO을 포함하되, 여기서 상기 DMSO의 농도는 약 10% v/v인, 냉동보존된 NK 세포 분획.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 냉동보존된 NK 세포 분획은
    i) 적어도 약 6주 동안 약 -80℃에서; 및/또는
    ii) 적어도 약 12개월 동안 약 -150℃에서
    안정한 것인, 냉동보존된 NK 세포 분획.
  21. (a) 대상체와 동종인 NK 세포 및 CD3+ 세포를 포함하는 혈액성분채집(apheresis) 생성물을 얻는 단계;
    (b) 혈액성분채집 생성물을 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획으로 분리하는 단계;
    (c) 방사선 조사에 의해 상기 CD3+ 세포 분획의 세포를 불활성화시키는 단계;
    (d) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 CD3-고갈 세포 분획을 비활성화되고 조사된 CD3+ 세포 분획과 함께 생체 외 배양하는 단계, 여기서 상기 조건은 영양소, 혈청, IL-15, CD3 작용제 및 니코틴아미드를 1.0 mM 내지 10 mM 양으로 제공하는 것을 포함하고;
    (e) 단계 (d) 이후 6~10일에 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드로 보충하여 확장된 CD3-고갈 세포 분획을 생성하는 단계;
    (f) 단계 (d) 이후 14-16일에 상기 조합된 CD3-고갈 및 CD3+ 세포 분획을 채취하는 단계; 및
    (g) 상기 (f) 단계의 조합된 CD3-고갈 세포 분획과 CD3+ 세포 분획을 세척 및 농축하여 NK 세포 분획을 제조하는 단계
    를 포함하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 NK 세포 분획의 제조방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 혈액성분채집 생성물은 인간 NK 및 CD3+ 세포 분획을 포함하는 인간 혈액성분채집 생성물인, 방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
    상기 CD3 작용제는 OKT3인, 방법.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 증식을 허용하는 조건은
    i) 약 10%(v/v) 농도의 인간 혈청;
    ii) 약 20ng/ml 농도의 IL-15;
    iii) 약 1μg/ml 농도의 OKT3;
    iv) 약 7.0 mM 농도의 니코틴아미드; 및
    v) 최소 필수 세포 배양 배지를 포함하는 영양소
    를 포함하는, 방법.
  25. 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3-고갈 및 상기 조사된 CD3+ 세포는 단계 (d)에서 1:1 비율로 접종된, 방법.
  26. 제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (d) 단계의 배양은 플라스크에서
    i) 0.30-0.40 x 106 CD3-고갈 및 0.30-0.40x106 조사된 CD3+ 세포/ml;
    ii) 0.35 x 106 CD3-고갈 및 0.35 x 106 조사된 CD3+ 세포/ml;
    iii) 400-900 x 106 CD3-고갈 및 400-900 x 106 조사된 CD3+ 세포/플라스크; 또는
    iv) 700 x 106 CD3-고갈 및 700 x 106 조사된 CD3+ 세포/플라스크
    로 영향을 받는, 방법.
  27. (a) 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 NK 세포 분획 또는 제 21 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 NK 세포 분획을 DMSO가 없는 냉동보존 버퍼에 현탁시키는 단계;
    (b) DMSO를 10% v/v로 첨가하는 단계;
    (c) 상기 세포의 온도를 -120℃로 낮추는 단계; 및
    (d) 냉동보존된 NK 세포를 -120℃ 이하의 온도에서 보관하는 단계
    를 포함하는 NK 세포 분획의 냉동보존 방법.
  28. (a) 제 19 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 냉동보존된 NK 세포 분획 또는 제 27 항의 방법에 의해 제조된 냉동보존된 NK 세포 분획을 37℃ 수조에서 해동하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 해동된 냉동보존 NK 세포 분획을 주사 액으로 희석하여 해동, 냉동보존된 NK 세포 분획을 생성하는 단계;
    를 포함하는 해동된 NK 세포 분획의 제조방법.
  29. (a) 상기 대상체에게 적어도 하나의 항암 단일클론 항체를 투여하는 단계;
    (b) 상기 대상체에게 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 단계;
    (c) 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 NK 세포 분획, 제 21 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 NK 세포 분획, 또는 제 28 항의 방법으로 제조된 해동된 NK 세포 분획을 투여하는 단계; 및
    (d) 상기 대상체에게 IL-2를 투여하는 단계
    를 포함하는 혈액 질환의 치료가 필요한 인간 대상체에서 혈액 질환을 치료하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    단계 (c)가 상기 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획의 제 1 용량을 투여하고, 2일 후에 상기 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획의 제 2 용량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    (i) 상기 제 1 용량 및 상기 제 2 용량은 각각 적어도 약 1.25 x 107 세포/kg을 포함하여 총 용량은 2.5 x 107 세포/kg이고;
    (ii) 상기 제 1 용량 및 상기 제 2 용량은 각각 적어도 약 2.5 x 107 세포/kg을 포함하고, 총 용량은 적어도 약 5 x 107 세포/kg이고;
    (iii) 상기 NK 세포 분획의 상기 제 1 용량과 제 2 용량은 각각 5 x 107 세포/kg을 포함하여 총 용량은 1 x 108 세포/kg이고; 또는
    (iv) 상기 NK 세포 분획의 상기 제 1 용량과 제 2 용량은 각각 1 x 108 세포/kg을 포함하여 총 용량은 2 x 108 세포/kg인, 방법.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역억제제는 화학요법적 면역억제제, 방사선 조사 또는 이들의 조합인, 방법.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 질환은 혈액 악성종양인, 방법.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 질환은 다발성 골수종인, 방법.
  35. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 질환은 비호지킨 림프종(NHL)이고, 바람직하게는 NHL은
    i) CD20 양성 B 세포 NHL;
    ii) 여포성 림프종(FL);
    iii) 고등급 B세포 림프종(HGBCL);
    iv) 달리 명시되지 않은 HGBCL(HGBCL, NOS);
    v) 원발성 종격동 거대 B세포 림프종(PMBCL); 또는
    vi) 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)인, 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 NHL은 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는 방법:
    a) 기존 치료법에 실패한 재발성/불응성 질환;
    b) 이전에 최소한 두 가지 종류의 치료를 받은 환자, 바람직하게 적어도 2개의 이전 치료법 중 적어도 하나는 화학요법의 투여를 포함하고, 적어도 2개의 이전 치료법 중 적어도 하나는 항-CD20 단클론 항체의 투여를 포함하고;
    c) 루가노 반응 기준(Lugano response criteria)에 의해 정의된 측정 가능한 질병;
    d) 상기 NLH가 HGBCL로 변환된 FL인 경우, 대상체는 이전에 HGBCL로 변환된 후 적어도 한 차례 치료받은 적이 있다.
  37. 제 29 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 질환이 NHL이고, 상기 항암 단일클론 항체가 리툭시맙이며, 바람직하게 리툭시맙은 약 375mg/m2의 용량으로 적어도 1회 투여되고, 바람직하게 리툭시맙은 적어도 3회 투여되는, 방법.
  38. 제 29 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 항암 단일클론 항체는 대상체에 적어도 3회 투여되고, 바람직하게 적어도 하나의 항암 단일클론 항체는 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 10일 전; NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 3일 전; 및 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 후 12~16일에 투여되는, 방법.
  39. 제 29 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈을 포함하는, 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 면역억제제는 사이클로포스파미드(400 mg/m2) 및 플루다라빈(30 mg/m2)을 모두 포함하고,
    상기 사이클로포스파미드는 400mg/m2의 용량으로 투여되고, 플루다라빈은 30mg/m2의 용량으로 투여되고,
    상기 사이클로포스파미드 및 상기 플루다라빈은 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 5일 전; NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 4일 전; 및 NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 약 4일 전에 투여되는, 방법.
  41. 제 29 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (d)는 상기 동종 해동 냉동보존 확장된 NK 세포의 수혈 후 (i) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 일; (ii) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 후 2일; 및 (iii) NK 세포 분획 또는 해동된 NK 세포 분획을 최초 투여 후 4일에, 6 x 106 단위의 IL-2를 각각 하나씩 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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