CN117980470A - 治疗性nk细胞群 - Google Patents

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Abstract

提供了用于扩增和冷冻保存自然杀伤(NK)细胞部分以供临床使用的方法，特别是提供了扩增的、冷冻保存的NK细胞部分及其使用方案的方法，其可用于细胞移植和输注以治疗癌症和其它疾病。

Description

治疗性NK细胞群
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年7月18日提交的美国临时申请63/223,024的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域和背景技术
输注(infusion)自然杀伤(NK)细胞是一种免疫治疗癌症(包括血液恶性肿瘤(hematologic malignancies))患者有吸引力的方法。然而，由于NK细胞的短期持久性(short-term persistence)及其输注后效应子功能(effector function)受损，其疗效受到限制。外周血单核细胞中NK细胞的数量不足、过继转移的NK细胞在体内增殖，以及归巢(home)和保留在肿瘤微环境中的能力有限，可能是迄今为止其疗效有限的原因。因此，本领域需要涉及培养和扩增NK细胞的方法，使得在体内输注时所得NK细胞级分(cellfraction)显示出增加的归巢、保留和增殖活性，同时保持其杀伤活性。
本发明涉及培养自然杀伤(NK)细胞的方法，选择扩增的NK细胞群以施用于有需要的对象的方法，以及合适的离体扩增的NK细胞级分在临床环境(clinical setting)中移植(transplantation)，用于治疗血液恶性肿瘤(hematological malignancy)和其它(例如恶性)病症的治疗用途。本发明还设想了包含扩增的NK细胞级分的组合物和试剂盒。
发明内容
本公开提供包含有核细胞群(a population of nucleated cells)的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞(nucleated cell)，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的(viable)，其中：所述群中至少约70％的细胞是CD56+；所述群中不超过约0.5％的细胞是CD3+；所述群中不超过约10％的细胞是CD19+；所述群中不超过约10％的细胞是CD14+；所述群中至少约44％的细胞是CD49a+；所述群中不超过约27％的细胞是LAG3+；所述群中不超过约32％的细胞是CD200R+；所述群中不超过约25％的细胞是CD57+；所述群中的至少约10％的细胞是CD16+；所述群中至少约10％的细胞为CD62L+。
在一些方面，所述群中至少约90％的细胞是CD56+。
在一些方面，所述群中约90％至约95％的细胞是CD56+。
在一些方面，所述群中约0.2％至约0.3％的细胞是CD3+。
在一些方面，所述群中至少约70％的细胞是CD56+/CD3-，并且所述群中不超过约0.5％的细胞是CD56-/CD3+。
在一些方面，所述群中至少约99％的细胞是CD56+/CD3-。
在一些方面，所述群中至少约15％的细胞是CD62L+。
在一些方面，所述群中约18％至约70％的细胞是CD62L+。
在一些方面，所述群中至少约20％的细胞是CD16+。
在一些方面，所述群中约20％至约60％的细胞是CD16+。
在一些方面，所述群中不超过约1％的细胞是LAG3+，所述群中不超过约1.5％的细胞是CD200R+，所述群中不超过约2.5％的细胞是CD57+。
在一些方面，所述群中不超过约3％的细胞是CD56+/LAG3+，所述群中不超过约11％的细胞是CD56+/CD200R+，所述群中不超过约4％的细胞是CD56+/CD57+。
在一些方面，所述群中至少约43％的细胞是CD56+/CD16+。
在一些方面，所述群中至少约57％的细胞是CD56+/CD16+。
在一些方面，所述群中至少约78％的细胞是CD56+/CD62L+。
在一些方面，所述群中不超过约77％的细胞是NKp80+。在一些方面，所述群中不超过约15.77％的细胞是NKp80+。
在一些方面，NK细胞级分包含：i)至少约17.5×108有核细胞；ii)至少约35×108有核细胞；iii)至少约2.5×109有核细胞；iv)至少约5×109有核细胞；v)至少约1.25×107有核细胞；vi)至少约2.5×107有核细胞；vii)至少约5×107有核细胞；或viii)至少约1×108有核细胞。
在一些方面，NK细胞级分已经预先冷冻并随后解冻。
本公开提供了冷冻保存(cryopreserve)的NK细胞级分，其包含本公开的NK细胞级分和DMSO，其中DMSO的浓度为约10％v/v。
在一些方面，所述冷冻保存的NK细胞级分是稳定的：i)在约-80℃下稳定至少约6周；和/或ii)在约-150℃下稳定至少约12个月。
本公开提供了制备NK细胞级分的方法，所述方法包括：(a)获得包含与对象同种异体的(allogeneic)NK细胞和CD3+细胞的单采产物(apheresis product)；(b)将所述单采产物分离成CD3-耗尽的(CD3-depleted)细胞级分和CD3+细胞级分；(c)通过辐射灭活(irradiation)所述CD3+细胞级分的细胞；(d)在允许细胞增殖的条件下，离体培养所述CD3-耗尽的细胞级分和灭活的、经辐射的CD3+细胞级分，其中所述条件包括：提供含量介于1.0mM至10mM之间的营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺；(e)在步骤(d)之后6至10天，用新鲜的营养物、血清、IL-15和烟酰胺补充所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，以产生扩增的CD3-耗尽的细胞级分；(f)在步骤(d)之后14至16天，收获所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；和(g)洗涤并浓缩步骤(f)的所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，从而产生NK细胞级分。
在一些方面，所述单采产物是包含人NK和CD3+细胞级分的人单采产物。
在一些方面，所述CD3激动剂是OKT3。
在一些方面，允许细胞增殖的所述条件包括：i)浓度为约10％(v/v)的人血清；ii)浓度为约20ng/ml的IL-15；iii)浓度为约1μg/ml的OKT3；iv)浓度为约7.0mM的烟酰胺；和v)含有最低必需细胞培养基的营养物。
在一些方面，在步骤(d)中以1:1的比例接种所述CD3-耗尽的细胞和所述经辐射的CD3+细胞。
在一些方面，步骤(d)的所述培养在如下条件下在培养瓶中进行：i)0.30×106至0.40×106CD3-耗尽的和0.30×106至0.40×106个经辐射的CD3+细胞/ml；ii)0.35×106CD3-耗尽的和0.35×106经辐射的CD3+细胞/ml；iii)每个培养瓶400×106至900×106CD3-耗尽的和400×106至900×106经辐射的CD3+细胞；或iv)每个培养瓶700×106CD3-耗尽的和700×106经辐射的CD3+细胞。
本公开提供了用于冷冻保存(cryopreservation)NK细胞级分的方法，所述方法包括：将本公开的NK细胞级分悬浮于不含DMSO的冷冻保存缓冲液中；(b)添加DMSO至10％v/v；(c)将细胞的温度降低至-120℃；和(d)在小于或等于-120℃的温度下储存所述冷冻保存的NK细胞。
本公开提供了用于制备解冻的NK细胞级分的方法，所述方法包括：在37℃水浴中解冻本公开的所述冷冻保存的NK细胞级分；(b)用输注溶液稀释在步骤(a)中解冻的所述冷冻保存的NK细胞级分，从而产生解冻的冷冻保存的NK细胞级分用于移植。
本公开提供了治疗有需要的人类对象的血液疾病的方法，所述方法包括：(a)向所述对象施用至少一种抗癌单克隆抗体；(b)向所述对象施用至少一种免疫抑制剂；(c)施用本公开的NK细胞级分；和(d)向所述对象施用IL-2。
在一些方面，步骤(c)包括施用第一剂量的所述NK细胞部分或解冻的NK细胞级分，并且两天后施用第二剂量的所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分。
在一些方面：(i)所述第一剂量和所述第二剂量各自包含至少约1.25×107细胞/kg，总剂量为2.5×107细胞/kg；(ii)所述第一剂量和所述第二剂量各自包含至少约2.5×107细胞/kg，总剂量为5×107细胞/kg；(iii)所述第一剂量和所述第二剂量的所述NK细胞级分各自包含5×107细胞/kg，总剂量为1×108细胞/kg；或(iv)所述第一剂量和所述第二剂量的所述NK细胞级分各自包含1×108细胞/kg，总剂量为2×108细胞/kg。
在一些方面，其中所述免疫抑制剂是化学治疗免疫抑制剂、辐射或其任何组合。
在一些方面，所述血液疾病是血液恶性肿瘤。
在一些方面，所述血液疾病是多发性骨髓瘤。
在一些方面，所述血液疾病是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)。在一些方面，NHL是：i)CD20阳性B细胞NHL；ii)滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)；iii)高级别B细胞淋巴瘤(high grade B-cell lymphoma，HGBCL)；iv)HGBCL，未另外指定的(HGBCL，NOS)；v)原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(primary mediastinal large B-celllymphoma，PMBCL)；或vi)弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)。
在一些方面，所述NHL的特征是以下特征中的至少一个：a)常规疗法失败的复发/难治性疾病；b)已经接受至少两种现有疗法的患者，优选地，其中所述至少两种现有疗法中的至少一种包括施用化疗，并且所述至少两种现有疗法中的至少一种包括施用抗-CD20单克隆抗体；c)根据卢加诺反应标准(Lugano response criteria)定义的可测量疾病；和d)其中所述NLH是FL转化为HGBCL，在转化为HGBCL后，所述对象先前已经接受了至少一种治疗。
在一些方面，所述血液疾病是NHL，并且所述抗癌单克隆抗体是利妥昔单抗(rituximab)，优选地，其中以约375mg/m2的剂量施用利妥昔单抗至少一次，优选地，其中施用利妥昔单抗至少三次。
在一些方面，将所述至少一种抗癌单克隆抗体施用给所述对象至少三次，优选地，其中施用所述至少一种抗癌单克隆抗体：在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约10天；在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约3天；以及在所述施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之后12至16天。
在一些方面，所述至少一种免疫抑制剂包括环磷酰胺(cyclophosphamide)和/或氟达拉滨(fludarabine)。
在一些方面，所述至少一种免疫抑制剂包含环磷酰胺(400mg/m2)和氟达拉滨(30mg/m2)，其中所述环磷酰胺以400mg/m2的剂量施用，氟达拉滨以30mg/m2的剂量施用，并且其中所述环磷酰胺和所述氟达拉滨被施用：在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约5天；在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约4天；以及在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约4天。
在一些方面，步骤(d)包括在输注以下所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后分别施用6×106单位的IL-2：(i)在第一次施用NK细胞级分或解冻的NK细胞级分的当天；(ii)在第一次施用NK细胞级分或解冻的NK细胞级分后两天；和(iii)在第一次施用NK细胞级分或解冻的NK细胞级分后4天。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了为有需要的对象制备NK细胞级分的方法，所述方法包括：
(a)获得包含与对象同种异体的NK细胞和CD3+细胞的单采产物；
(b)将所述单采产物分离成CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；
(c)通过辐射灭活所述CD3+细胞级分的细胞；
(d)在允许细胞增殖的条件下，离体培养所述CD3-耗尽的细胞级分和灭活的、经辐射的CD3+细胞级分，其中所述条件包括：提供介于1.0mM至10mM之间的量的营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺；
(e)在步骤(d)之后6至10天，用新鲜的营养物、血清、IL-15和烟酰胺补充所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，以产生扩增的CD3-耗尽的细胞级分；
(f)在步骤(d)之后14至16天，收获所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；和
(g)洗涤并浓缩步骤(f)的所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，
从而生产用于在对象中移植的扩增的NK细胞级分。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了根据本发明方法制备的NK细胞级分。
根据本发明的一些实施方式的另一方面，提供了一种用于冷冻保存NK细胞级分的方法，所述方法包括：
(a)将NK细胞级分的NK细胞悬浮于不含DMSO的冷冻保存缓冲液中；
(b)添加DMSO至10％v/v，
(c)将细胞的温度降低至-120℃，
(d)在小于-120℃下储存所述冷冻保存的NK细胞。
根据本发明一些实施方式的其它方面，提供了一种制备用于施用的冷冻保存NK细胞级分的方法，其包括
(a)在37℃水浴中解冻冷冻保存的NK细胞级分；
(b)用输注溶液稀释冷冻保存的NK细胞级分。
从而产生用于移植的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了根据本发明方法制备的冷冻保存的NK细胞级分。
根据本发明的一些实施方式，提供了通过本发明的方法生产的用于施用(也称为移植)的解冻的、冷冻保存NK细胞级分，其中所述冷冻保存的NK细胞级分是通过本发明的方法生产的冷冻保存的NK细胞级分。
根据本发明的一些实施方式，冷冻保存的NK细胞级分是20ml体积的，包含2.5×108总细胞/ml的冷冻保存袋。因此，根据本发明的一些实施方式，冷冻保存的NK细胞级分是20ml体积的，包含50×108细胞的冷冻保存袋。
根据本发明的一些实施方式，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，在输注给经辐射的小鼠后，解冻的、冷冻保存的NK细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞在脾脏(spleen)和骨髓中的体内保留增加。
根据本发明的一些实施方式，用于移植的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分的特征是以下参数：
(a)至少70％ CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力(viability)；
(c)输注后，少于1×106CD3+CD56-细胞/Kg患者体重；
(d)输注后，不超过5EU内毒素/Kg患者体重；
(e)无支原体；并且
(f)无菌(sterile)。
根据本发明的一些实施方式，用于移植的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分的特征是以下参数：
(a)至少70％ CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)少于0.5％的细胞是CD3+/CD56-；
(d)不超过0.5内毒素单位(Endotoxin Units，EU)/mL；
(e)无支原体；并且
(f)无菌。
根据本发明的一些实施方式，解冻的冷冻保存的NK细胞级分被提供在氟化乙烯丙烯(fluorinated ethylene propylene，FEP)冷冻保存袋中。
根据本发明的一些实施方式，解冻的冷冻保存的NK细胞级分包含2.5×108细胞/ml。
根据本发明的一些实施方式，解冻的冷冻保存的NK细胞级分以100ml的体积提供。
根据本发明的一些实施方式，所述单采产物是包含人NK和CD3+细胞级分的人单采产物。
根据本发明的一些实施方式，血清是人血清。
根据本发明的一些实施方式，允许细胞增殖的条件包括提供10％的人血清。
根据本发明的一些实施方式，IL-15包含20ng/ml的IL-15。
根据本发明的一些实施方式，CD3激动剂是OKT3，并且OKT3包含1μg/ml的OKT3。
根据本发明的一些实施方式，烟酰胺包含7.0mM烟酰胺。
根据本发明的一些实施方式，营养物包括最低必需细胞培养基(minimalessential cell culture medium)。
根据本发明的一些实施方式，扩增的NK细胞级分的NK细胞包含至少40％至97％的CD56+/CD3-细胞。
根据本发明的一些实施方式，在由用于为有需要的对象制备的NK细胞级分的方法中，步骤(e)产生的经洗涤和浓缩的扩增的NK细胞级分的特征在于以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)输注时，少于1×106CD3+/CD56-细胞/Kg患者体重；
(d)输注时，不超过5EU内毒素/Kg患者体重；
(e)无支原体；并且
(f)无菌。
根据本发明的一些实施方式，在由用于为有需要的对象制备NK细胞级分的方法中，步骤(e)产生的经洗涤和浓缩的扩增的NK细胞级分的特征在于以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)少于0.5％的细胞是CD3+/CD56-；
(d)不超过0.5内毒素单位(EU)/mL；
(e)无支原体；并且
(f)无菌。
根据本发明的一些实施方式，输注时，CD3+细胞少于0.5×106CD3+/CD56-细胞/Kg患者质量。
根据本发明的一些实施方式，以1:1的比率接种CD3-耗尽的细胞和经辐射的CD3+细胞。
根据本发明的一些实施方式，在培养瓶中，以0.30×106至0.40×106的CD3-耗尽的和0.30×106至0.40×106至的经辐射的CD3+细胞/ml进行培养。
根据本发明的一些实施方式，在培养瓶中，以0.35×106CD3-耗尽的和0.35×106经辐射的CD3+细胞/ml进行培养。
根据本发明的一些实施方式，在培养瓶中，以每瓶400×106至900×106CD3-耗尽的和400×106至900×106经辐射的CD3+细胞进行培养。
根据本发明的一些实施方式，在培养瓶中，以每瓶700×106CD3-耗尽的细胞和700×106经辐射的CD3+细胞进行培养。
根据本发明的一些实施方式，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，扩增的CD3-耗尽的细胞的CD62L表达增加。
根据本发明的一些实施方式，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，扩增的CD3-耗尽的细胞的抗体依赖性细胞毒性增加。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了治疗有需要的人类对象的血液疾病的方法，所述方法包括：
(a)向对象施用抗癌单克隆抗体；
(b)向对象施用至少一种免疫抑制剂(immunosuppressive agent)；
(c)将同种异体解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分移植给有需要的对象，其中所述同种异体解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分已经，通过用介于1.0mM至10mM之间的量的CD3+细胞、营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺，离体培养而扩增；和
(d)向对象施用IL-2,
从而治疗对象的血液疾病。
根据本发明的一些实施方式，免疫抑制剂是化学治疗免疫抑制剂(chemotherapeutic immunosuppressive agent)和/或辐射。
根据本发明的一些实施方式，血液疾病是血液恶性肿瘤。根据本发明的一些实施方式，血液疾病是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
根据本发明的一些实施方式，血液疾病是滤泡性淋巴瘤(FL)或高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)。根据本发明的一些实施方式，血液疾病是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。根据本发明的一些实施方式，血液疾病是套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)。根据本发明的一些实施方式，血液疾病是HGBCL，未另外指定的(HGBCL,NOS)。根据本发明的一些实施方式，血液疾病是原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。
根据本发明的一些实施方式，NHL是CD20阳性B细胞NHL。
根据本发明的一些实施方式，NHL的特征是以下中的至少一个：
(a)常规疗法失败的复发/难治性疾病；
(b)已经接受至少两种现有疗法(其中至少一种含有化疗，并且其中至少一种含有抗-CD20单克隆抗体)的患者；
(c)根据卢加诺(Lugano)反应标准定义的可测量疾病；
(d)其中NLH是FL转化为HGBCL，在转化为HGBCL后必须接受至少一种治疗。
根据本发明的一些实施方式，血液恶性肿瘤是NHL，并且抗癌单克隆抗体是利妥昔(rituximab)(375mg/m2)。
根据本发明的一些实施方式，向对象施用抗癌单克隆抗体三次。
根据本发明的一些实施方式，施用包括施用第一剂量的同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的细胞级分，两天后施用第二剂量的同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分。
根据本发明的一些实施方式，施用抗癌抗体三次：在第一次给药前10天，在第一次给药前3天，以及在第一次给药同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分后12至16天。
根据本发明的一些实施方式，细胞级分包含1×107至5×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象。
根据本发明的一些实施方式，细胞级分包含2×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象。
根据本发明的一些实施方式，组合的第一和第二剂量包含2×107/kg至2×108/kg的总同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞。
根据本发明的一些实施方式，
·(a)NK细胞级分的第一剂量和第二剂量各自包含2.5×107同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象，总剂量为5×107同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg，或
·(b)NK细胞级分的第一剂量和第二剂量各自包含5×107同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象，总剂量为1×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg，或
·(c)NK细胞级分的第一剂量和第二剂量各自包含1×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象，总剂量为2×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg。
根据本发明的一些实施方式，在解冻后不超过4小时向对象施用同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分。
根据本发明的一些实施方式，通过输注(无需过滤器或泵)，将同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分，以不大于10cc/kg患者体重/小时的速率施用于所述对象。
根据本发明的一些实施方式，通过输注或泵，将同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分，以不大于10cc/kg患者体重/小时的速率施用于所述对象。
根据本发明的一些实施方式，通过输注(需要过滤器或泵)，将同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分，以不大于10cc/kg患者体重/小时的速率施用于所述对象。在一些方面，过滤器可的孔径为约170至约260微米。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种免疫抑制剂包括环磷酰胺和/或氟达拉滨。
根据本发明的一些实施方式，
·(i)所述至少一种免疫抑制剂包含环磷酰胺(400mg/m2)和氟达拉滨(30mg/m2)；并且
·(ii)其中在输注所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞之前第5天、第4天和第3天中的每一天施用所述环磷酰胺和所述氟达拉滨。
根据本发明的一些实施方式，施用(步骤(d))包括在输注所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后分别施用6×106单位的IL-2：
·(i)在输注同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞的当天；和
·(ii)在输注同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后2天；和
·(iii)在输注同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后4天。
根据本发明的一些实施方式，所述方法包括移植根据任何方法制备的可移植NK细胞级分。
除非另有限定，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本发明的实施方式的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的方法和材料，但是下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括限定)为准。此外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意味着必须是限制性的。
附图简要说明
通过下面结合附图的详细描述，可以更清楚地理解上述和进一步的特征。
图1是示出与不含烟酰胺或不含经辐射的饲养细胞(feeder cell)培养的细胞相比，根据本文公开的方法培养、冷冻保存和解冻的扩增细胞中保持优异的NK细胞功能的柱状图。用5mM NAM(不含饲养细胞)、5mM NAM(含有饲养细胞)或7mM NAM(含有饲养细胞)培养细胞，并冷冻保存。使用标记的BL2细胞进行ADCC检测(assay)。通过FACS将BL2细胞的杀伤作用确定为总标记细胞中碘化丙啶(propidium-iodine，PI)阳性(死亡)的百分比。
图2是示出与不含烟酰胺或不含经辐射的饲养细胞培养的细胞相比，根据本文公开的方法培养、冷冻保存和解冻的扩增细胞中增强的NK细胞效力的柱状图。用5mM NAM(不含饲养细胞)、5mM NAM(含有饲养细胞)或7mM NAM(含有饲养细胞)培养细胞2周，并冷冻保存。将细胞解冻，解冻后2小时取样，进行CD62L染色，并通过FACS分析。
图3是示出根据本文公开的方法培养、冷冻保存和解冻对NK细胞免疫检查点受体的有益效果的柱状图。在不含NAM和含有2.5mM、5mM NAM或7mM NAM的条件下培养细胞2周。通过FACS分析针对CD200R染色的样品。
图4是示出根据本文公开的方法培养、冷冻保存和解冻对输注至经辐射的NSG小鼠后NK细胞归巢的有益效果的柱状图。用含有和不含NAM的情况下培养CD3-耗尽的细胞。在GDA-201输注和IL2和IL15 IP注射前24小时对NSG小鼠进行亚致死性辐射(sub-lethallyirradiated)。将细胞解冻，解冻后2小时输注给小鼠。7天后收获小鼠，并通过对人CD45APC和CD56FITC染色来分析人NK细胞的存在。使用7AAD染料排除死细胞。
图5A和5B是说明根据本文公开的方法培养、冷冻保存和解冻的扩增细胞的植入(engraftment)潜力增强的柱状图。用5mM NAM(不含饲养细胞)、5mM NAM(含有饲养细胞)或7mM NAM(含有饲养细胞)培养细胞，并冷冻保存。在NK输注和IL2和IL15 IP注射前24小时对NSG小鼠进行亚致死性辐射。将细胞解冻，并在解冻后2小时输注给小鼠。3天后收获小鼠，并通过人CD45APC和CD56FITC染色来分析人NK细胞的存在。使用7AAD染料排除死细胞。5A：脾脏中NK事件的绝对数量。5B：骨髓中NK的百分比(Fraction)。
图6A-6C示出了通过施用根据本文公开的方法培养、冷冻保存和解冻的扩增细胞，小鼠肺癌A549模型中实体瘤体积(solid tumor volume)的减少。用含有CD3+饲养细胞的7mM NAM培养细胞，然后将IV施用给接受5×106A549细胞(含有或不含抗Her2抗体赫塞汀(Herceptin))的亚致死性辐射小鼠(图6A和6B)。NK细胞的施用在降低肿瘤负荷方面明显有效(6C,C-NK)，并且当与抗Her2抗体组合时具有协同作用(6C,D-NK+Her2)。
图7A-7C示出通过重复施用根据本文公开的方法培养、冷冻保存和解冻的扩增细胞，小鼠肺癌A549模型中实体瘤体积增加的减少。用含有CD3+饲养细胞的7mM NAM培养细胞，然后将IV施用给接受5×106A549细胞(含有或不含抗Her2抗体赫塞汀(Herceptin))的亚致死性辐射小鼠(图7A和7B)。NK细胞的多次施用在降低肿瘤负荷方面明显更有效(7C,C-NK)，并且当与抗Her2抗体组合时具有强烈的协同作用(6C,D-NK+Her2)。
图8是示出在不存在烟酰胺(NAM0)或存在7mM烟酰胺(NAM7)的情况下，使用本公开的方法产生的细胞中不同细胞表面标记物(cell surface marker)的表达的一系列图，如通过FAC所测量的。
图9是示出在不存在烟酰胺(NAM0)或存在7mM烟酰胺(Nam7)的情况下，使用本公开的方法产生的细胞中的不同细胞表面标记的表达的一系列代表性FACs图，如通过FACs所测量的。
具体实施方式
本发明涉及从CD3-耗尽的细胞级分中扩增自然杀伤(NK)细胞(在本文中也称为移植)以通过输注施用给对象的方法(可以被有效地冷冻保存和解冻)，同时在体外和/或体内保持或增强细胞的功能。在一个实施方式中，包含具有烟酰胺和/或其它烟酰胺部分(moiety)的NK细胞、NK细胞生长因子和来自相应CD3+级分的灭活细胞的单采产物的CD3-耗尽级分的离体培养，促进了用作治疗性离体扩增的NK细胞制剂的NK细胞群的生产(production)，其包括具有适于输注到对象的参数的功能性NK细胞的扩增群(例如NK细胞的大量扩增，而CD3+T细胞降低)，在冷冻保存下保持了优异的生存力和功能。具体而言，本发明可用于提供NK细胞级分及其冷冻保存和使用方案，其可用于细胞移植和输注以治疗癌症和其它疾病。非限制性应用可以包括同种异体过继免疫疗法(allogeneic adoptiveimmunotherapy)和联合免疫疗法以及敏化剂和其它抗癌模式。
参考下文的描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明在其应用中不必限于在下文中阐述的详细描述。本发明能够具有其它实施方式或者能够以各种方式实践或实现。
自然杀伤细胞(下文也简称为“NK细胞”)是参与免疫反应的淋巴细胞，对肿瘤细胞表现出自发的非MHC限制性细胞毒活性。因此，开发临床级方案以有效地在体外扩增活的NK细胞的数量并且有效地增强其功能和冷冻保存的适用性，以及归巢至淋巴结的可能性及其输注后在体内稳态增殖的可能性，可提高采用NK细胞的过继免疫疗法治疗癌症病症(如实体瘤、造血系统恶性肿瘤(hematopoietic malignancies)等)的成功率。
本发明提供了用于制备和表征适于在临床环境中通过输注进行移植的扩增的NK细胞级分的临床适宜条件，其基于在高于一定浓度的烟酰胺下培养CD3-耗尽的细胞级分，所述CD3-耗尽的细胞级分包含具有烟酰胺的NK细胞以及相应CD3+级分的灭活细胞，并进一步冷冻保存扩增的细胞级分，本文将进一步详述。因此，在其实施方式中，本发明提供了用于生产功能上成熟的NK细胞的扩增的NK细胞级分的临床合适的培养条件，具有最小的非NK细胞(例如CD3+/CD56-)增殖，治疗性NK级分及其选择、冷冻保存和解冻的标准，以及用于治疗癌症疾病，特别是血液恶性肿瘤的临床方案。
本公开的NK细胞级分
本公开提供了包含NK细胞级分的组合物，所述NK细胞级分包含有核细胞群。
在一些方面，有核细胞群可包含如下有核细胞：至少约1.0×106，或至少约5.0×106，或至少约1.0×107，或至少约5.0×107，或至少约1.0×108，或至少约5.0×108，或至少约1.0×109，或至少约5.0×109，或至少约1.0×1010。或至少约5.0×1010，或至少约1.0×1011，或至少约5.0×1011，或至少约1.0×1012，或至少约5.0×1012。在一些方面，有核细胞体群可包含至少约1.0×106细胞。在一些方面，有核细胞体群可包含至少约17.5×108细胞。在一些方面，有核细胞体群可包含至少约35×108细胞。在一些方面，有核细胞群可包含至少约2.5×109细胞。在一些方面，有核细胞群可包含至少约5×109细胞。
在一些方面，有核细胞群中，至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约99％的细胞是存活的。在一些方面，有核细胞群中至少约70％的细胞是存活的。
在一些方面，有核细胞群中，至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约99％的细胞是CD56+。在一些方面，有核细胞群中至少约70％的细胞是CD56+。
在一些方面，有核细胞群中，约80％至约99％，或约85％至约95％，或约90％至约95％的细胞是CD56+。在一些方面，有核细胞群中，约90％至约95％的细胞是CD56+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.1％，或不超过约0.2％，或不超过约0.3％，或不超过约0.4％，或不超过约0.5％，或不超过约0.6％，或不超过约0.7％，或不超过约0.8％，或不超过约0.9％，或不超过约1.0％的细胞是CD3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过0.5％的细胞是CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.1％，或约0.01％至约0.2％，或约0.01％至约0.3％，或约0.01％至约0.4％，或约0.01％至约0.5％，或约0.01％至约0.6％，或约0.01％至约0.7％，或约0.01％至约0.8％，或约0.01％至约0.9％，或约0.01％至约1.0％的细胞是CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.5％的细胞是CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.5％，或约0.2％至约0.3％的细胞是CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.2％至约0.3％的细胞是CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约99％的细胞是CD56+/CD3-。在一些方面，有核细胞群中，至少约70％的细胞是CD56+/CD3-。在一些方面，有核细胞群中，至少约99％的细胞是CD56+/CD3-。
在一些方面，有核细胞群中，约80％至约99％，或约85％至约95％，或约90％至约95％的细胞是CD56+/CD3-。在一些方面，有核细胞群中，约90％至约95％的细胞是CD56+/CD3-。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.1％，或不超过约0.2％，或不超过约0.3％，或不超过约0.4％，或不超过约0.5％，或不超过约0.6％，或不超过约0.7％，或不超过约0.8％，或不超过约0.9％，或不超过约1.0％的细胞是CD56-/CD3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过0.5％的细胞是CD56-/CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.1％，或约0.01％至约0.2％，或约0.01％至约0.3％，或约0.01％至约0.4％，或约0.01％至约0.5％，或约0.01％至约0.6％，或约0.01％至约0.7％，或约0.01％至约0.8％，或约0.01％至约0.9％，或约0.01％至约1.0％的细胞是CD56-/CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至0.5％的细胞是CD56-/CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.5％，或约0.2％至约0.3％的细胞是CD56-/CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.2％至约0.3％的细胞是CD56-/CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约5％，或至少约10％，或至少约15％，或至少约20％，或至少约25％，或至少约30％，或至少约35％，或至少约40％，或至少约45％，或至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％的细胞是CD62L+。在一些方面，有核细胞群中，至少约10％的细胞是CD62L+。在一些方面，有核细胞群中，至少约15％的细胞是CD62L+。在一些方面，有核细胞群中，至少约13％的细胞是CD62L+。
在一些方面，有核细胞群中，约8％至约80％，或约13％至约75％，或约18％至约70％的细胞是CD62L+。在一些方面，有核细胞群中，约13％至约88％的细胞是CD62L+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约5％，或至少约10％，或至少约15％，或至少约20％，或至少约25％，或至少约30％，或至少约35％，或至少约40％，或至少约45％，或至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％的细胞是CD16+。在一些方面，有核细胞群中，至少约10％的细胞是CD16+。在一些方面，有核细胞群中，至少约20％的细胞是CD16+。在一些方面，有核细胞群中，至少30％的细胞是CD16+。
在一些方面，有核细胞群中，约10％至约70％，或约15％至约65％，或约20％至约60％的细胞是CD16+。在一些方面，有核细胞群中，约20％至约60％的细胞是CD16+。在一些方面，有核细胞群中，约30％至约88％的细胞是CD16+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约5％，或不超过约10％，或不超过约15％，或不超过约20％，或不超过约25％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.7％的细胞是CD19+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约5％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约20％，或约0.01％至约25％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约10％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.7％的细胞是CD19+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约5％，或约0.1％至约10％，或约0.1％至约15％，或约0.1％至约20％，或约0.1％至约25％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约10％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.7％的细胞是CD19+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约5％，或不超过约10％，或不超过约15％，或不超过约20％，或不超过约25％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.05％的细胞是CD14+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约5％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约20％，或约0.01％至约25％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约10％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.05％的细胞是CD14+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约5％，或约0.1％至约10％，或约0.1％至约15％，或约0.1％至约20％，或约0.1％至约25％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约10％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.05％的细胞是CD14+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约44.99％的细胞是CD49a+。在一些方面，有核细胞群中，至少约45％的细胞是CD49a+。在一些方面，有核细胞群中，至少约96％的细胞是CD49a+。在一些方面，有核细胞群中，至少约35％，或至少约40％，或至少约45％，或至少约50％，或至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％的细胞是CD49a+。在一些方面，有核细胞群中，约44％至约96％的细胞是CD49a+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过26.39％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约27％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约76.68％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约76％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约25％，或不超过约30％，或不超过约35％，或不超过约40％，或不超过约45％，或不超过约50％，或不超过约55％，或不超过约60％，或不超过约65％，或不超过约70％，或不超过约75％，或不超过约77％，或不超过约80％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约26％至约77％的细胞是NKp80+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约26.39％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约27％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约76.68％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约76％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约25％，或约0.01％至约30％，或约0.01％至约35％，或约0.01％至约40％，或约0.01％至约45％，或约0.01％至约50％，或约0.01％至约55％，或约0.01％至约60％，或约0.01％至约65％，或约0.01％至约70％，或约0.01％至约75％，或约0.01％至约77％，或约0.01％至约80％的细胞是NKp80+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约26.39％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约27％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约76.68％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约76％的细胞是NKp80+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约25％，或约0.01％至约30％，或约0.01％至约35％，或约0.1％至约40％，或约0.1％至约45％，或约0.1％至约50％，或约0.1％至约55％，或约0.1％至约60％，或约0.1％至约65％，或约0.1％至约70％，或约0.1％至约75％，或约0.1％至约77％，或约0.1％至约80％的细胞是NKp80+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.57％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约1％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约2％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约26.89％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约27％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约2.5％、或不超过约5％、或不超过约10％、或不超过约15％、或不超过约20％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.5％至约27％的细胞是LAG3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.57％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约1％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约2％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约26.89％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约27％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约2.5％，或约0.01％至约5％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约20％，或约0.01％至约30％，或约0.01％至约35％，或约0.01％至约40％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约10％的细胞是LAG3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.57％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中约0.1％至约1％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约2％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约26.89％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约27％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约2.5％，或约0.1％至约5％，或约0.1％至约10％，或约0.1％至约15％，或约0.1％至约20％，或约0.1％至约30％，或约0.1％至约35％，或约0.1％至约40％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约10％的细胞是LAG3+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约1.03％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约2％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约3.68％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约31.8％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约32％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约2.5％，或不超过约5％，或不超过约10％，或不超过约15％，或不超过约20％，或不超过约30％，或不超过约35％，或不超过约40％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是CD200R+。在一些方面，细胞群体中约1％至约32％的细胞是CD200R+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约1.03％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约2％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约3.68％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约31.8％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约32％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约2.5％，或约0.01％至约5％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约20％，或约0.01％至约30％，或约0.01％至约35％，或约0.01％至约40％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约10％的细胞是CD200R+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约1.03％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约2％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约3.68％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约31.8％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约32％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约2.5％，或约0.1％至约5％，或约0.1％至约10％，或约0.1％至约15％，或约0.1％至约20％，或约0.1％至约30％，或约0.1％至约35％，或约0.1％至约40％的细胞是CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约10％的细胞是CD200R+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约2.05％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中，不超过约2.5％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中不超过约3.6％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中不超过约4％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中不超过约24.59％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中不超过约25％的细胞是CD57+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约2.5％，或不超过约5％，或不超过约10％，或不超过约15％，或不超过约20％，或不超过约30％，或不超过约35％，或不超过约40％的细胞是CD57+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是CD57+。在一些方面，有核细胞群中，约2％至约25％的细胞是CD57+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约2.05％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.01％至约2.5％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.01％至约3.6％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.01％至约4％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.01％至约24.59％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.01％至约25％的细胞是CD57+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约2.5％，或约0.01％至约5％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约20％，或约0.01％至约30％，或约0.01％至约35％，或约0.01％至约40％的细胞是CD57+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约10％的细胞是CD57+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约2.05％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.1％至约2.5％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.1％至约3.6％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.1％至约4％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.1％至约24.59％的细胞是CD57+。在一些方面，细胞群中约0.1％至约25％的细胞是CD57+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约2.5％，或约0.1％至约5％，或约0.1％至约10％，或约0.1％至约15％，或约0.1％至约20％，或约0.1％至约30％，或约0.1％至约35％，或约0.1％至约40％的细胞是CD57+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约10％的细胞是CD57+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约1％，或不超过约2％，或不超过约3％，或不超过约4％，或不超过约5％，或不超过约6％，或不超过约7％，或不超过约8％，或不超过约9％，或不超过约10％，或不超过约11％，或不超过约12％，或不超过约13％，或不超过约14％，或不超过约15％，或不超过约16％，或不超过约17％，或不超过约18％，或不超过约19％，或不超过约20％的细胞是CD56+/LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约3％的细胞是CD56+/LAG3+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约1％，或不超过约2％，或不超过约3％，或不超过约4％，或不超过约5％，或不超过约6％，或不超过约7％，或不超过约8％，或不超过约9％，或不超过约10％，或不超过约11％，或不超过约12％，或不超过约13％，或不超过约14％，或不超过约15％，或不超过约16％，或不超过约17％，或不超过约18％，或不超过约19％，或不超过约20％的细胞是CD56+/CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约11％的细胞是CD56+/CD200R+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约1％，或不超过约2％，或不超过约3％，或不超过约4％，或不超过约5％，或不超过约6％，或不超过约7％，或不超过约8％，或不超过约9％，或不超过约10％，或不超过约11％，或不超过约12％，或不超过约13％，或不超过约14％，或不超过约15％，或不超过约16％，或不超过约17％，或不超过约18％，或不超过约19％，或不超过约20％的细胞是CD56+/CD57+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约4％的细胞是CD56+/CD57+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约1％，或约0.01％至约2％，或约0.01％至约3％，或约0.01％至约4％，或约0.01％至约5％，或约0.01％至约6％，或约0.01％至约7％，或约0.01％至约8％，或约0.01％至约9％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约11％，或约0.01％至约12％，或约0.01％至约13％，或约0.01％至约14％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约16％，或约0.01％至约17％，或约0.01％至约18％，或约0.01％至约19％，或约0.01％至约20％的细胞是CD56+/LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约3％的细胞是CD56+/LAG3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约1％，或约0.01％至约2％，或约0.01％至约3％，或约0.01％至约4％，或约0.01％至约5％，或约0.01％至约6％，或约0.01％至约7％，或约0.01％至约8％，或约0.01％至约9％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约11％，或约0.01％至约12％，或约0.01％至约13％，或约0.01％至约14％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约16％，或约0.01％至约17％，或约0.01％至约18％，或约0.01％至约19％，或约0.01％至约20％的细胞是CD56+/CD200R+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约11％的细胞是CD56+/CD200R+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约1％，或约0.01％至约2％，或约0.01％至约3％，或约0.01％至约4％，或约0.01％至约5％，或约0.01％至约6％，或约0.01％至约7％，或约0.01％至约8％，或约0.01％至约9％，或约0.01％至约10％，或约0.01％至约11％，或约0.01％至约12％，或约0.01％至约13％，或约0.01％至约14％，或约0.01％至约15％，或约0.01％至约16％，或约0.01％至约17％，或约0.01％至约18％，或约0.01％至约19％，或约0.01％至约20％的细胞是CD56+/CD57+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约4％的细胞是CD56+/CD57+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约30％，或至少约35％，或至少约40％，或至少约45％，或至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％的细胞是CD56+/CD16+。在一些方面，有核细胞群中，至少约43％的细胞是CD56+/CD16+。在一些方面，有核细胞群中，至少约57％的细胞是CD56+/CD16+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约30％，或至少约35％，或至少约40％，或至少约45％，或至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％的细胞是CD56+/CD62L+。在一些方面，有核细胞群中，至少约78％的细胞是CD56+/CD62L+。
任何上述表型参数(phenotypic parameter)可以与任何其它上述表型参数组合。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中不超过约0.5％的细胞是CD3+；
群中不超过约10％的细胞是CD19+；
群中不超过约10％的细胞是CD14+；
群中的至少约44％的细胞是CD49a+；
群中不超过约10％的细胞是LAG3+；
群中不超过约20％的细胞是CD200R+；
群中不超过约10％的细胞是CD57+；
群中的至少约10％的细胞是CD16+；并且
群中至少约10％的细胞是CD62L+。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中不超过约0.5％的细胞是CD3+
群中不超过约1％的细胞是CD19+；
群中不超过约0.05％的细胞是CD14+；
群中的至少约44％的细胞是CD49a+；
群中不超过约27％的细胞是LAG3+；
群中不超过约32％的细胞是CD200R+；
群中不超过约25％的细胞是CD57+；
群中的至少约30％的细胞是CD16+；并且
群中至少约13％的细胞是CD62L+。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中约0.01％至约0.5％的细胞是CD3+
群中约0.01％至约10％的细胞是CD19+；
群中约0.01％至约10％的细胞是CD14+；
群中的至少约44％的细胞是CD49a+；
群中约0.01％至约10％的细胞是LAG3+；
群中约0.01％至约20％的细胞是CD200R+；
群中约0.01％至约10％的细胞是CD57+；
群中的至少约10％的细胞是CD16+；并且
群中至少约10％的细胞是CD62L+。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中约0.01％至约0.5％的细胞是CD3+
群中约0.01％至约1％的细胞是CD19+；
群中约0.01％至约0.05％的细胞是CD14+；
群中的至少约44％的细胞是CD49a+；
群中约0.01％至约27％的细胞是LAG3+；
群中约0.01％至约32％的细胞是CD200R+；
群中约0.01％至约25％的细胞是CD57+；
群中的至少约30％的细胞是CD16+；并且
群中至少约13％的细胞是CD62L+。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中约0.1％至约0.5％的细胞是CD3+
群中约0.1％至约10％的细胞是CD19+；
群中约0.1％至约10％的细胞是CD14+；
群中的至少约44％的细胞是CD49a+；
群中约0.1％至约10％的细胞是LAG3+；
群中约0.1％至约20％的细胞是CD200R+；
群中约0.1％至约10％的细胞是CD57+；
群中的至少约10％的细胞是CD16+；并且
群中至少约10％的细胞是CD62L+。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中约0.1％至约0.5％的细胞是CD3+
群中约0.1％至约1％的细胞是CD19+；
群中约0.1％至约0.05％的细胞是CD14+；
群中的至少约44％的细胞是CD49a+；
群中约0.1％至约27％的细胞是LAG3+；
群中约0.1％至约32％的细胞是CD200R+；
群中约0.1％至约25％的细胞是CD57+；
群中的至少约30％的细胞是CD16+；并且
群中至少约13％的细胞是CD62L+。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞级分，其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中不超过约0.5％的细胞是CD3+
群中约0％至约1％的细胞是CD19+；
群中约0％至约0.05％的细胞是CD14+；
群中约44％至约96％的细胞是CD49a+；
群中约0.5％至约27％的细胞是LAG3+；
群中约1％至约32％的细胞是CD200R+；
群中约2％至约25％的细胞是CD57+；
群中约30％至约88％的细胞是CD16+；和
群中约13％至约88％的细胞是CD62L+。
本公开的NK细胞级分的表型参数的组合的其它非限制性示例呈现在表A至表D中。
表A
表型参数 ％的有核细胞
CD3-/CD56+ ≥70％
CD3+/CD56- <0.5％
CD19+ <10％
CD14+ <10％
CD16+ >10％
CD62L+ >10％
表B
表C
表D
本公开还提供了冷冻保存的NK细胞级分，其包含本文所述的任何NK细胞级分和DMSO。在一些方面，DMSO的浓度可以是约1％v/v，或约2％v/v，或约3％v/v，或约4％v/v，或约5％v/v，或约6％v/v，或约7％v/v，或约8％v/v，或约9％v/v，或约10％v/v。或约11％v/v，或约12％v/v，或约13％v/v，或约14％v/v，或约15％v/v。在一些方面，DMSO的浓度可以是约10％v/v。
在一些方面，冷冻保存的NK细胞级分可以稳定至少约6周，或至少约1个月，或至少约2个月，或至少约3个月，或至少约4个月，或至少约5个月，或至少约6个月，或至少约7个月，或至少约9个月，或至少约10个月，或至少约11个月，或至少约12个月。在一些方面，冷冻保存的NK细胞级分可以在约-80℃下稳定至少约6周，约1个月，或至少约2个月，或至少约3个月，或至少约4个月，或至少约5个月，或至少约6个月，或至少约7个月，或至少约9个月，或至少约10个月，或至少约11个月，或至少约12个月。在一些方面，冷冻保存的NK细胞级分可以在约-80℃稳定至少约6周。在一些方面，冷冻保存的NK细胞级分可以在约-150℃下稳定至少约6周，约1个月，或至少约2个月，或至少约3个月，或至少约4个月，或至少约5个月，或至少约6个月，或至少约7个月，或至少约9个月，或至少约10个月，或至少约11个月，或至少约12个月。在一些方面，冷冻保存的NK细胞级分可以在约-150℃稳定至少约12个月。
本公开的效价测定(Potency Assay)
本公开提供了第一效价测定，该测定包括以下步骤：
a)温育本公开的NK细胞级分和多个靶细胞，其中用至少一种增殖染料(proliferation stain)对所述多个靶细胞进行染色；
b)测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比。
在第一效价测定的一些方面，步骤(a)的温育条件可进一步包含至少一种抗癌治疗性单克隆抗体(anti-cancer therapeutic monoclonal antibody，表5)。
在第一效价测定的一些方面，靶细胞可以是K562细胞。
在第一效价测定的一些方面，靶细胞可以是Raji(CCL-86)细胞。
在第一效价测定的一些方面，靶细胞可以是Raji(CCL-86)细胞，并且步骤(a)的温育条件可以进一步包含利妥昔单抗。在一些方面，利妥昔单抗可以以约1μg/ml的浓度存在。
如本领域技术人员所理解的，可以使用本领域已知的用于测定细胞死亡百分比的任何标准技术，来完成在第一效价测定的步骤(b)中测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比。在非限制性示例中，测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比可以包括：i)用至少一种活性染料(viability stain)对步骤(a)中温育的NK细胞级分和多个靶细胞进行染色；ii)使用荧光激活细胞分选(fluorescent activated cell sorting，FACS)将所述多个靶细胞与NK细胞级分分离；以及iii)使用活性染料来测定在步骤(ii)中分选(sort)分离的多个靶细胞中的细胞死亡百分比。在一些方面，使用活性染料来测定在步骤(ii)中分选分离的多个靶细胞中的细胞死亡百分比还包括使用增殖染料结合活性染料来测定细胞死亡百分比。
如本领域技术人员所理解的，可以使用本领域已知的用于测定细胞死亡百分比的任何标准技术，来完成在第一效价测定的步骤(b)中测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比。在非限制性示例中，测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比可以包括：i)用至少一种活性染料对步骤(a)中温育的NK细胞级分和多个靶细胞进行染色；ii)使用活细胞分析系统(live-cell analysis system)来检测活性染料，从而测定在步骤(ii)中分选分离的多个靶细胞中的细胞死亡百分比。在一些方面，使用活性染料来测定在步骤(ii)中分选分离的多个靶细胞中的细胞死亡百分比还包括使用增殖染料结合活性染料来测定细胞死亡百分比。
在一些方面，所述至少一种增殖染料可以是羧基荧光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate)、琥珀酰亚胺基酯(succinimidyl ester，CFSE)。如本领域技术人员所理解的，本领域已知的任何增殖染料均可以用于本文所述的第一效价测定中。
在一些方面，所述至少一种活性染料可以是Helix NPTM Blue(也称为SYTOXTMBlue)。如本领域技术人员所理解的，本领域已知的任何增殖染料均可以用于第一效价测定中。
在一些方面，如本领域技术人员所理解的，活细胞分析系统可以是系统。
在一些方面，第一效价测定的步骤(a)中的温育可以在约37℃下进行。
在一些方面，第一效价测定的步骤(a)中的温育可以进行至少约3小时。
在一些方面，第一效价测定的步骤(a)中，NK细胞级分中的细胞数量与多个靶细胞中的细胞数量的比率可以是约2.5:1，或约5:1，或约10:1。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是K562细胞，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少约10％。在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是K562细胞，靶细胞中的细胞死亡百分比是至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是K562细胞，其中第一效价测定的步骤(a)中，NK细胞级分中的细胞数量与多个靶细胞中的细胞数量的比率为约5:1，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少约10％。在一些方面，在NK细胞级分与靶细胞温育约12小时后测定细胞死亡百分比。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是K562细胞，其中第一效价测定的步骤(a)中，NK细胞级分中的细胞数量与多个靶细胞中的细胞数量的比率为约10:1，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少约10％。在一些方面，在NK细胞级分与靶细胞温育约3小时后测定细胞死亡百分比。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是Raji细胞，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是Raji细胞，并且步骤(a)的温育条件还包含利妥昔单抗，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征是，当使用如下条件测试NK细胞级分时：如上的第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是Raji细胞；如上的第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中所述靶细胞是Raji细胞并且步骤(a)的温育条件还包含利妥昔单抗，没有利妥昔单抗的靶细胞中的细胞死亡百分数小于具有利妥昔单抗的靶细胞中的细胞死亡百分数。
本公开提供了第二效价测定，该测定包括以下步骤：
a)温育本公开的NK细胞级分和多个靶细胞，其中用至少一种包含可检测标签(detectable label)的抗-CD107α抗体对所述NK细胞级分进行染色；
b)用一种或多种蛋白质运输抑制剂(protein trafficking inhibitor)处理在步骤(a)中温育的NK细胞级分和多个靶细胞，并进一步温育NK细胞级分和多个靶细胞；
c)用以下物质对NK细胞级分和多个靶细胞进行染色：
至少一种活性染料；
包含可检测标签的至少一种抗-CD56抗体
d)固定所述NK细胞级分和所述多个靶细胞；
e)使NK细胞级分和多个靶细胞透化(permeabilizing)；
f)用以下物质对NK细胞级分和多个靶细胞进行染色：
i)包含可检测标签的至少一种抗-IFNγ抗体；
ii)包含可检测标签的至少一种抗-TNFα抗体；
g)测定以下各项中的至少一项：
g1)用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CD107α抗体染色的活细胞的百分比(即CD107a+/CD56+细胞的数量÷CD56+细胞的数量×100％)；
g2)用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-IFNγ抗体染色的活细胞的百分比(即IFNγ+/CD56+细胞的数量÷CD56+细胞的数量×100％)；和
g3)用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-TNFα抗体染色的活细胞的百分比(即TNFα+/CD56+细胞的数量÷CD56+细胞的数量×100％)。
在第二效价测定的一些方面，靶细胞可以是K562细胞。
在第二效价测定的一些方面，靶细胞可以是Raji(CCL-86)细胞。
在第二效价测定的一些方面，靶细胞可以是Raji(CCL-86)细胞，并且步骤(a)和步骤(b)的温育条件可以进一步包含利妥昔单抗。在一些方面，利妥昔单抗可以以约0.5μg/ml的浓度存在。
在一些方面，至少一种活性染料可以是Zombie VioletTM活性染料。如本领域技术人员所理解的，本领域已知的任何增殖染料均可以用于第一效价测定。
在一些方面，所述一种或多种蛋白质运输抑制剂可包含布雷菲德菌素(brefeldin)、GolgiStopTM蛋白质运输抑制剂(BD)、布雷菲德菌素和GolgiStopTM蛋白质运输抑制剂的组合或本领域已知的任何其它蛋白追踪抑制剂(protein trackinginhibitor)。
在第二效价测定的一些方面，步骤(b)中的进一步温育在约37℃下进行。
在第二效价测定的一些方面，步骤(b)中的进一步温育在至少约37℃下进行。
如本领域技术人员所理解的，可以使用本领域已知的用于测定用包含可检测标签的抗体标记的细胞的百分比的任何标准技术，包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)，来完成测定步骤(g)中(g1)至(g3)的至少一个。
在第二效价测定的一些方面，步骤(g)可以包括测定(g1)至(g3)中的每一个。
在第二效价测定的一些方面，在第二效价测定的步骤(a)中，NK细胞级分中的细胞数量与多个靶细胞中的细胞数量的比率可以是约1:3。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征可以是，当使用上述第二效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是K562细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CD107α抗体染色的活细胞的百分比为至少10％。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征可以是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是Raji细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CD107α抗体染色的活细胞的百分比为至少4％。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征可以是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是K562细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-IFNγ抗体染色的活细胞的百分比为至少10％。
在一些方面，本公开的NK细胞级分的特征可以是，当使用上述第一效价测定来测试NK细胞级分时，其中靶细胞是K562细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-TNFα抗体染色的活细胞的百分比为至少10％。
因此，根据本发明的一个实施方式的一个方面，提供了一种为有需要的对象制备扩增的NK细胞级分的方法，所述方法包括：
·(a)获得包含与对象同种异体的NK细胞和CD3+细胞的单采产物；
·(b)将所述单采产物分离成CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；
·(c)通过辐射灭活所述CD3+细胞级分的细胞；
·(d)在允许细胞增殖的条件下，离体培养所述CD3-耗尽的细胞级分和灭活的、经辐射的CD3+细胞级分，其中所述条件包括：提供介于1.0mM至10mM之间的量的营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺；
·(e)在步骤(d)之后6至10天，用新鲜的营养物、血清、IL-15和烟酰胺补充所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，以产生扩增的CD3-耗尽的细胞级分；
·(f)在步骤(d)之后14至16天，收获所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；和
·(g)洗涤并浓缩步骤(f)的所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，从而产生扩增的NK细胞级分，以施用于所述对象。
如本文所用，术语自然杀伤(NK)细胞是指参与先天免疫反应的大颗粒淋巴细胞。在功能上，NK细胞通过细胞质颗粒的胞吐作用表现出针对多种靶标的细胞溶解活性，所述细胞质颗粒含有多种蛋白质，包括穿孔素(perforin)和颗粒酶蛋白酶(granzymeproteases)。杀伤(Killing)是在接触依赖的非吞噬过程中触发的，该过程不需要预先对抗原致敏。人NK细胞的特征是存在细胞表面标记物CD16和CD56，但不存在T细胞受体(CD3)。人骨髓来源的NK细胞进一步具有CD2+CD16+CD56+CD3表型特征，还含有T细胞受体ζ链[ζ-TCR]，并且通常以NKp46、NKp30或NKp44为特征。非NK细胞，例如NKT细胞或CD8NKT，具有T细胞和NK细胞的特征和细胞表面标记物。在一个实施方式中，本发明的方法用于从细胞群中在体外繁殖成熟的NK细胞。如本文所用，术语“成熟的NK细胞”被定义为坚定的(committed)NK细胞，具有特征性表面标记物和NK细胞功能，并且缺乏进一步分化的潜力。本文所用，成熟的NK细胞包括但不限于可增殖并产生大量细胞因子的CD56bright细胞、表现出很强细胞毒性的CD56dim细胞、CD56brightCD94high和CD56dimCD94high细胞。在另一个实施方式中，繁殖NK祖细胞(progenitor cell)，或NK祖细胞和成熟d NK细胞的混合群。CD56、CD3、CD94和其它标记物的细胞表面表达可以例如通过FACS分析或免疫组织学染色技术来确定。
如本文所用，术语“祖细胞”是指能够分裂和/或经历分化成一种或多种成熟效应子细胞的未成熟细胞。淋巴细胞祖细胞包括，例如，能够产生B细胞、T细胞和NK系(lineage)的成熟细胞的多能造血干细胞。在B细胞系中(即，在产生成熟B细胞的发育途径中)，祖细胞还包括以免疫球蛋白基因重排和表达为特征的祖B细胞(pro-B cell)和前B细胞(pre-Bcellp)。在T和NK细胞系中，祖细胞还包括骨髓衍生的双能T/NK细胞祖细胞[例如，CD34(+)CD45RA(hi)CD7(+)和CD34(+)CD45RA(hi)Lin(-)CD10(+)细胞]，以及胸腺内祖细胞，包括双阴性(相对于CD4和CD8)和双阳性胸腺细胞(T细胞系)和定型的DTT NK细胞祖细胞。
本发明的NK细胞可以来源于包含这种细胞的任何来源。NK细胞存在于许多组织中，并且可以从例如淋巴结、脾、肝、肺、肠、蜕膜(deciduas)获得，也可以从iPS细胞或胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)获得。通常，含有异质淋巴细胞(heterogeneouslymphocyte cell)群的脐带血、外周血、流动的外周血(mobilized peripheral blood)和骨髓,为研究和临床使用提供大量的NK细胞。在具体的实施方式中，本发明的NK细胞是单采产物或白细胞分离产物(leukapheresis product)的NK细胞级分。
在单采术中，通常通过离心将全供体血液(wholedonor blood)分离成血液成分(blood component)(例如血浆、白细胞和红细胞)，抽取选定的成分进行操作(例如白细胞级分的培养)，并将剩余级分返回供体。单采术的优点是可以大量提供特定的血液级分(例如，白细胞级分)，而不会耗尽体液(例如血浆)和其他血液成分。单采术可基于连续流动离心，其需要较低的体外体积，或基于血液的间歇流动离心，其在循环中分离成分，但通常更耗时，并且特征是供体血液的更大体外体积。许多合适的单采术装置是市售的。通常，单采术适用于从所述供体的外周血中分离血液成分。
如本文所用，术语“单采产物”是指通过单采术从供体的循环血液中收集的细胞。NK细胞输注的临床经验表明，同种异体的NK细胞可以成功植入(engraft)宿主，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发生率更低。如本文所用，“与对象同种异体的单采产物”是指从除对象本人以外的供体收集的细胞。在具体的实施方式中，所述一种或多种单采产物是与对象同种异体的单采产物。在一些实施方式中，可以识别特定的一个或多个供体，以为已知对象提供单采产物。在其它实施方式中，同种异体的单采产物选自合适的单采产物的“库(bank)”，而不考虑供体身份(identity)。
在一些方面，所述单采产物含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板以外的细胞。本领域已知多种单采方法，例如在美国专利US20160184361、US20180043082、US20170021083、US20060116271、US20050155932、US20050143684和US20030195455中公开的那些方法，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，洗涤从供体收集的细胞，例如以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施方式中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并重悬于PBS中。在一些实施方式中，在一种或多种试剂的存在下，洗涤、离心和/或温育细胞，例如，以除去不需要的成分、富集所需的成分、裂解或除去对特定试剂敏感的细胞。在一些实实施方式中，基于一种或多种性质来分离细胞，例如密度、粘附特性(adherent properties)、尺寸、敏感性和/或对特定成分的抗性。在一些实施方式中，所述方法包括用RBC裂解缓冲液(例如氯化铵-钾(ACK)缓冲液)裂解红细胞，重复洗涤并离心，直至澄清或浅粉色。
因此，根据本发明一个实施方式的一个方面，所述方法包括培养包含NK细胞的CD3-耗尽的细胞级分，其中该CD3-耗尽的细胞级分来自单采术。在具体实施方式中，CD3-耗尽的细胞级分来自-使用PCS2或MCS8150 Haemonetics单采机(apheresis machine)(Haemonetics,Boston,MA)--从供体获得的单采单元。在一些实施方式中，CD3-耗尽的细胞级分来自从供体的外周血获得的单采单元。在单采之前，可以用已知的组合物(例如，Plerixafor)处理供体，以从造血细胞源(例如骨髓和脾)动员(mobilize)所需的细胞群(例如淋巴细胞)。
应当理解，由于扩增的NK细胞群旨在用于临床环境(例如输注给患者)，根据本文所述的方法选择用于细胞选择和扩增的单采产物是临床级单采单元。
在一些实施方式中，单采产物可以是新鲜细胞群，而在其它实施方式中，细胞是从储存的单采细胞群(如冷藏和解冻细胞)中培养的。在其它实施方式中，细胞是从先前培养的细胞群中培养的。
在一些实施方式中，在分离CD3-和CD3+细胞之前，评估单采产物的生存力和细胞表型。在具体的实施方式中，单采产物的细胞是至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％存活的。在一些实施方式中，通过FACS和/或Cedex(自动台盼蓝拒染实验(automated Trypan Blue exclusion assay))评估细胞生存力。在具体实施方式中，单采产物的细胞90％以上是存活的。
应当理解，对总细胞数量、生存力、表型、效价和/或功能的评估可以在该过程中的任何时间点针对任何细胞群进行-例如，CD3-耗尽前或后、预扩增、接种、培养期间的任何时间、收获、冷冻保存前、冷冻保存后、储存期间、解冻前、解冻期间和/或解冻后、输注前或输注过程中。所得概况(profile)(细胞数量、生存力、表型和/或功能)可用于监测细胞群，或可用于识别选择或释放标准--例如用于在要求保护的方法中的任何点选择或排除细胞群或制剂，或用于修改方案(例如，单元中的细胞数量可确定是否需要组合单元以进行方案的下一步)。
可以针对所要求保护的方法评估的相关参数，包括：细胞数量、细胞生存力(例如，Cedex，参见上文)、污染(例如，支原体、细菌、内毒素水平)、无菌性(sterility)、NK相关细胞功能(例如，细胞杀伤试验(cell killing assay)、抗体依赖性细胞毒性(antibodydependent cellular cytotoxicity)-ADCC、植入潜力)、表型(例如，细胞标记物如CD56、CD3、CD16、CD107a、CD62L)、效价(CD107a和CD62L、细胞因子分泌-例如INF-γ、TNF-α、GM-CSF)、外观和温度。在具体实施方式中，可以通过流式细胞术(FACS)分析或使用特异性抗体进行ELISA，来评估本发明方法的任何步骤中处理之前、期间和/或之后的细胞群的效价，包括生存力(例如使用Zombie Violet活性染料(Biolegend))；表面标记物CD107a、CD56和CD16以及INF-γ、TNF-α，并评估NK功能(ADCC和细胞杀伤)。
可以处理淋巴细胞级分，例如“血沉棕黄层(buffy coat)”或单采单元可以富集或纯化或分离具体限定的细胞群。术语“纯化”和“分离”不需要绝对的纯度；相反，这些只是作为相对术语。因此，例如，纯化的淋巴细胞群是其中特定细胞比其源组织中的细胞更富集的细胞群。可以富集基本上纯的淋巴细胞的制剂，使得所需细胞占制剂中存在的总细胞的至少50％。在一些实施方式中，基本上纯的细胞群占制剂中总细胞的至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％或更多。在一些实施方式中，所述单采产物包含CD3-(例如CD3-CD56+NK细胞)和CD3+细胞(例如T细胞和NKT细胞)。
富集和分离淋巴细胞的方法是本领域公知的，可以基于所需的群选择合适的方法。例如，在一种方法中，通过除去红细胞来富集原材料中的淋巴细胞。基于密度，将红细胞与淋巴细胞和其它细胞分离。然后可选择性地回收富含淋巴细胞的级分。淋巴细胞及其祖细胞也可以通过使用分离培养基(separation medium)如可从多种商业来源获得的标准淋巴细胞分离培养基(LSM)进行离心来富集。或者，可以使用基于各种亲和力的方法来富集淋巴细胞/祖细胞。许多抗体介导的亲和性制备方法是本领域已知的，例如抗体偶联磁珠(antibody conjugated magnetic bead)。淋巴细胞富集也可以使用商业上可获得的用于负选择不需要的细胞的制剂进行,例如FICOLL-HypaqueTM和其他为富集全淋巴细胞、T细胞或NK细胞而配制的密度梯度培养基。
在本发明的一些实施方式中，将单采产物分离成CD3-耗尽的和含有CD3的(CD3+)细胞级分。从血液、骨髓、淋巴细胞制剂(例如单采单元)或组织样品中选择CD3-细胞的方法是本领域公知的。最常用的是基于单核细胞分级分离(fractionation)和非NK细胞(例如CD3+)耗尽的方案。也可进行其它细胞类型如CD34+和CD133+的耗尽(Depletion)。可以使用两种或多种方案的组合，以从非NK污染物提供更高纯度的CD3-耗尽的细胞群。用于分离CD3阴性细胞(CD3-negative cell)的市售试剂盒包括一步法(one-step procedure)和多步法，包括CD3+的耗尽或级分耗尽，或识别和去除T细胞的非NK细胞抗体的耗尽。在具体实施方式中，通过免疫磁性选择(immunomagnetic selection)来耗尽NK细胞级分的CD3细胞，例如，使用CliniMACS T细胞耗尽组((LS耗尽组(261-01)Miltenyi Biotec，使用CliniMACSCD3试剂(Miltenyi REF 273-01,Miltenyi Biotech))。在具体实施方式中，分别洗涤并离心CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分。
在一些实施方式中，CD3-耗尽级分包含CD56+CD16+CD3-细胞和/或CD56+CD16-CD3-细胞。在具体实施方式中，CD3-耗尽级分包含至少10％ CD56+/CD3-细胞，至少20％的CD56+/CD3-细胞，至少30％的CD56+/CD3-细胞，至少40％的CD56+/CD3-细胞，至少50％的CD56+/CD3-细胞，至少60％的CD56+/CD3-细胞，至少70％的CD56+/CD3-细胞，至少80％的CD56+/CD3-细胞或至少90％的CD56+/CD3-细胞。在一些实施方式中，CD3-耗尽级分包含40％至97％的CD56+/CD3-细胞，30％至90％的CD56+/CD3-细胞，40％至80％的CD56+/CD3-细胞，55％至75％的CD56+/CD3-细胞，60％至70％的CD56+/CD3-细胞。在一些实施方式中，CD3-耗尽级分包含15％至90％的CD56+/CD3-细胞。在一些实施方式中，CD3-耗尽级分包含少于5％，少于2％，少于1％，少于0.8％，少于0.5％，少于0.25％，少于0.1％，少于0.05％，少于0.025％的CD3+细胞。
根据表型选择细胞的方法包括但不限于免疫检测(例如ELISA)和FACS分析。
在一些实施方式中，通过向培养物中加入饲养细胞，如非分裂饲养细胞，来扩增CD3-耗尽的细胞级分。合适的饲养细胞包括但不限于T细胞、基质细胞、外周血单核细胞(PBMC)、成纤维细胞等，经辐射或以其它方式使其灭活，以防止它们在培养物中增殖，同时保持它们对NK细胞培养条件的贡献。在具体实施方式中，灭活分离后的单采产物的CD3+细胞级分，以提供饲养细胞，用于培养CD3-耗尽的细胞。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包括γ-或X-射线辐射的CD3+饲养细胞。可以使用任何市售的细胞辐射装置完成辐射，例如CELLRAD辐射器(Precision X-Ray,N Branford CT)。在一些实施方式中，用约30至50Gy、130kV范围内的X射线辐射CD3+细胞级分细胞，以防止细胞分裂。在具体实施方式中，使用CELLRAD辐射器，以40Gy，130kV，5mA的目标剂量辐射CD3+级分。辐射后，CD3+细胞级分可以被洗涤，通过离心浓缩，并重悬，例如在接种前重悬于培养基中。CD3+细胞的灭活可以通过为细胞提供培养条件(培养基、温度和湿度)并监测其生长或不存在来进行评价。
本发明人已经发现，包括NK细胞以及非增殖饲养细胞的CD3-细胞级分的培养，为扩增的NK细胞群提供了更大的扩增和增强的功能。因此，在一些方面，将包含NK细胞的CD3-细胞级分与灭活的(例如辐射的)饲养细胞一起接种，用于培养。在具体实施方式中，接种包含NK细胞的CD3-细胞级分，用于与经辐射的CD3+细胞一起培养。在一个具体实施方式中，接种包含NK细胞的CD3-细胞级分，用于与来自相同的单采产物的相应的CD3+细胞级分一起培养。
在一些实施方式中，以0.1:1至5:1的CD3-细胞与CD3+细胞的(数值)比率接种CD3-细胞和CD3+细胞，用于培养。在一些实施方式中，用于接种的CD3-与CD3+细胞比率是0.2:1、0.5:1、0.75:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.4:1、1.8:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1或5:1。在具体实施方式中，CD3+细胞与来自CD3级分的细胞以1:1的比率接种。
在本发明的一些方面，以0.20-0.60×106细胞/ml的范围接种细胞。在一些实施方式中，以0.25×106细胞/ml、0.30×106细胞/ml、0.35×106细胞/ml、0.40×106细胞/ml、0.45×106细胞/ml、0.50×106细胞/ml、0.55×106细胞/ml或0.60×106细胞/ml的浓度接种细胞。在具体实施方式中，以0.30-0.40×106细胞/ml，特别是0.35×106细胞/ml的浓度接种细胞。在具体实施方式中，在0.35×106CD3-耗尽的和0.35×106经辐射的CD3+细胞/ml的条件下，接种细胞用于培养。
用于培养的细胞可以接种在细胞培养瓶或其它合适的容器中。在一些实施方式中，将细胞接种在透气细胞培养瓶中，例如G-Rex瓶(WilsonWolf,St Paul MN)，特别是G-Rex瓶。可以根据需要选择培养瓶体积-在具体实施方式中，将细胞接种到G-Rex500MCS，GMP级培养瓶中。
在一些实施方式中，接种全部体积的CD3-耗尽的和CD3+细胞级分(从分离单采单元获得)，用于培养。因此，在一些实施方式中，需要接种于不止一个培养瓶中。例如，当使用含有2升体积培养基的烧瓶，以0.35×106CD3-耗尽的和0.35×106经辐射的CD3+细胞/ml接种细胞用于培养时，如果CD3-耗尽的和/或CD3+细胞级分中的细胞数量超过700×106细胞/级分，则需要额外的培养瓶以接种全部体积的CD3-耗尽和CD3+细胞级分。因此，在一些实施方式中，在培养瓶中，以每瓶400-900×106CD3-耗尽的和400-900×106经辐射的CD3+细胞，特别是以每瓶700×106CD3-耗尽的和700×106经辐射的CD3+细胞，进行细胞的培养。
NK细胞可以通过短期或长期培养来进行体外培养。本发明人已经证明，NK细胞可以与生长因子和烟酰胺和/或其它烟酰胺部分一起培养，培养少至7天，或者多达3周，与用细胞因子但含有少于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分的细胞培养相比，导致培养的NK细胞的优先增殖和/或功能性增强(参见PCT公开WO2011/080740)。在临床试验中，将新鲜制备的、单倍相合的(haploidentical)NK细胞(从含有烟酰胺的阳性选择CD56+/CD3细胞级分扩增14-16天)，输注给NHL和MM患者，可实现有效的植入和显著比例的无进展生存期(progression free survival)(参见Bachanova等人，2019年，血液(Blood)，第134卷，第1增补版，第777页)。然而，由于新鲜扩增的细胞的使用收到严格限制，因此需要提供更大的离体NK细胞扩增，同时保留扩增的NK细胞级分的治疗上有利的功能，适于冷冻保存和储存。
因此，在具体实施方式中，CD3-耗尽的细胞和CD3+细胞级分培养14至16天。
根据本发明的这一方面，通过为CD3-耗尽的细胞提供体外细胞增殖的条件，并在体外培养具有烟酰胺部分的CD3-耗尽的细胞，从而体外扩增NK细胞的群，可以实现包含NK细胞的CD3-耗尽级分的体外培养。
应当理解，当与经辐射的CD3+级分结合时，培养CD3-耗尽的级分有助于NK细胞级分的增殖和功能增强，并且灭活的CD3+级分在本文所述方法的培养条件下不增殖并且不经历显著扩增。
“培养”包括提供NK细胞维持和生长因子所需的化学和物理条件(例如，温度、气体)。在一个实施方式中，培养组合的CD3-耗尽的细胞和CD3+细胞级分包括为NK细胞提供NK细胞增殖的条件。可支持NK细胞增殖的化学条件的示例包括但不限于缓冲液、营养素、血清、维生素和抗生素以及细胞因子和其他生长因子，其通常被提供在生长(即培养)培养基中。在一个具体实施方式中，细胞增殖的条件包含营养素、血清和细胞因子。在一个实施方式中，NK培养基包括最低必需培养基(minimal essential medium，MEM)，例如MEMα(BI、BetHaEmek、Israel)和血清。在一些实施方式中，以培养基的2-20％、5-15％或5-10％提供血清。在具体实施方式中，血清是人类血清，以培养基的10％提供。在一个具体实施方式中，培养基是包含10％人类AB血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的MEMα。适用于本发明的其他培养基包括但不限于格拉斯科培养基(Glascow'smedium，Gibco Carlsbad CA)、RPMI培养基(Sigma-Aldrich，StLouis MO)或DMEM(Sigma-Aldrich，St Louis MO)。值得注意的是，许多培养基都含有烟酰胺作为维生素补充物，例如，MEMα(8.19μM烟酰胺)、RPMI(8.19μM烟酰胺)、DMEM(32.78μM烟酰胺)和格拉斯科培养基(16.39μM烟酰胺)，然而，本发明的方法涉及外源(exogenously)添加的烟酰胺，以补充培养基配方中所含有的烟酰胺和/或烟酰胺部分，或者由培养基成分浓度的整体调整所产生的烟酰胺和/或烟酰胺部分。
根据本发明的一些实施方式，在允许细胞增殖的条件下培养CD3-耗尽的细胞和CD3+细胞级分包括为细胞提供营养素、血清和细胞因子。在一些实施方式中，至少一种生长因子包括细胞因子和/或趋化因子(chemokines)。细胞因子和其他生长因子通常以0.5ng/ml至100ng/ml，或1.0ng/ml至80ng/ml，更通常是5ng/ml至750ng/ml，再更通常5.0ng/ml至50ng/ml的浓度范围来提供(可以考虑高达10倍的此类浓度)，并且可以从商业上获得，例如，从Perpo Tech,Inc.,Rocky Hill,NJ,USA获得。在一个实施方式中，允许细胞增殖的条件包括提供细胞因子白细胞介素15(IL-15)。在具体实施方式中，CD3-耗尽的细胞与20ng/ml的IL-15一起培养。
在培养中NK细胞增殖的其它条件包括提供谷氨酰胺作为能量和氮的辅助来源。在一些实施方式中，培养基包含0.5mM至5mM的谷氨酰胺。在具体实施方式中，培养基包含2mM的谷氨酰胺。谷氨酰胺可以作为谷氨酰胺或作为二肽L-丙氨酸-L-谷氨酰胺提供，以便在培养中具有更高的稳定性。
培养基通常还包含抗生素(例如庆大霉素、青霉素、链霉素)；在一些实施方式中，培养基包含0.01mg/ml至1.0mg/ml的庆大霉素。在具体实施方式中，在培养基中提供0.05mg/ml的庆大霉素。
在与非增殖(例如辐射)CD3+细胞一起培养的细胞中，需要刺激T细胞以分泌对CD3-耗尽的细胞级分有益的生长因子。因此，在一些实施方式中，将CD3-耗尽的细胞和CD3+细胞级分接种在补充有CD3激动剂的培养基中。适用于本发明方法的CD3激动剂尤其包括抗CD3单克隆-CD3激动剂抗体，例如OKT-3(也称为Muromonab-CD3)、mAb145-2C11、MGA031和ChAglyCD3。在具体实施方式中，在接种时以0.1μg/ml至5μg/ml的浓度范围提供CD3激动剂OKT-3。在具体实施方式中，接种时在培养基中以1μg/ml的浓度提供OKT-3(作为GMP CD3pure,Milentyi 170-076-116获得)。
此外，在这方面应该理解的是，新的细胞因子不断被发现，其中一些细胞因子可用于本发明的NK细胞增殖方法。
根据一个实施方式，CD3-耗尽的细胞和CD3+细胞与营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺和/或烟酰胺部分一起培养。如本文所用，术语“烟酰胺部分”是指烟酰胺以及衍生自烟酰胺、其衍生物、类似物和代谢物的产物，例如，NAD、NADH和NADPH，它们能够有效并优先增强NK细胞增殖和/或活化(activation)。烟酰胺衍生物、类似物和代谢物可以通过添加到如下所述维持的NK培养物、添加到功能性分析(如杀伤和移动性分析(motilityassay))或以本领域公知的设计用于高通量检测(high-throughput assay)的自动筛选方案进行筛选和评估，以评估它们在培养物中对体外NK增殖的作用。
如本文所用，短语“烟酰胺类似物”是指已知在上述或类似分析中与烟酰胺作用类似的任何分子。烟酰胺类似物的代表性示例可包括但不限于苯甲酰胺、烟碱硫酰胺(nicotinethioamide)(烟酰胺的硫醇类似物)、烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酸(α-amino-3-indolepropionic acid)。
短语“烟酰胺衍生物”还指烟酰胺本身或烟酰胺类似物的任何结构衍生物。此类衍生物的示例包括但不限于取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺和烟碱硫酰胺(nicotinthioamide)以及N-取代的烟酰胺和硫烟酰胺(nicotinthioamide)、3-乙酰基吡啶和烟酸钠(sodium nicotinate)。在本发明的一个具体实施方式中，烟酰胺部分是烟酰胺。
适用于本发明一些实施方式的烟酰胺或烟酰胺部分的浓度范围通常为约0.5mM至约50mM，约1.0mM至约25mM，约1.0mM至约25mM，约2.5mM至约10mM，约5.0mM至约10mM。基于烟酰胺的这些浓度对增殖和NK细胞功能的影响，烟酰胺的示例性有效浓度可以为约0.5mM至约15mM,1.0mM至10.0mM，通常为2.5mM或5.0mM。根据本发明的一些实施方式，提供的烟酰胺的浓度范围为约0.5、约0.75、约1.0、约1.25、约1.5、约1.75、约2.0、约2.25、约2.5、约2.75、约3.0、约3.25、约3.5、约3.75、约4.0、约4.25、约4.5、约4.75、约5.0、约5.25、约5.5、约5.75、约6.0、约6.25、约6.5、约6.75、约7.0、约7.25、约7.5、约7.75、约8.0、约8.25、约8.5、约8.75、约9.0、约9.25、约9.5、约9.75、约10.0、约11.0、约12.0、约13.0、约14.0、约15.0、约16.0、约17.0、约18.0和约20.0mM。考虑了所有有效的中间浓度。在具体实施方式中，允许增殖的条件包括介于1.0mM至10.0mM之间的烟酰胺。在其它实施方式中，允许增殖的条件包括7.0mM的烟酰胺。
可以根据NK增殖、细胞表型和/或活性的任何试验，例如细胞培养或功能(例如效价)，来确定所述烟酰胺和/或烟酰胺部分的合适浓度。烟酰胺的合适浓度是这样的浓度，在相同的试验和相似的培养条件(暴露于烟酰胺的持续时间)下，与含有少于0.1mM烟酰胺且来自相同NK细胞来源(例如脐带血、骨髓或外周血制备物)的“对照”培养物相比，在培养物中使用烟酰胺“增强”或导致培养物中NK细胞的增殖、特定表型和/或功能的净增加。
在一些研究中，通过用营养素、血清、细胞因子和烟酰胺培养来体外扩增NK细胞，不需要在培养期间补充培养基或操作，而其它研究则主张在NK细胞培养过程中以不同的时间间隔补充(“再补料(re-feeding)”)培养基。在本发明的一些实施方式中，在培养期间“再补料”CD3-耗尽的细胞级分。因此，在具体实施方式中，培养CD3-耗尽的细胞包括，在体外培养开始6-10天后用新鲜的营养素、血清、IL-15和烟酰胺补充CD3-耗尽的和CD3+细胞级分(参见步骤“e”)。在一些实施方式中，在体外培养开始后6至7天之间，在体外培养开始后7至8天之间，在体外培养开始后8至9天之间，在体外培养开始后9至10天之间(接种)，或在CD3-耗尽的细胞的培养开始后6至10天之间，提供补充。在一些实施方式中，补充(或“再补料”)包括除去细胞培养物的约30％至80％，约40％至70％或约45％至55％的培养基，并用与除去的培养基具有相同组成和水平的营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺的相似(例如等量)体积的新鲜培养基替换。在一些实施方式中，补充(或“再补料”)包括除去NK细胞级分培养物的约50％的培养基，并用具有相同组成和营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺水平的相似(例如等量)体积的新鲜培养基替换除去的培养基。在具体实施方式中，不除去培养基用于再补料，并且加入包含相同组成和水平的营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)、抗生素、谷氨酰胺和烟酰胺的新鲜培养基，直到培养物体积达到CD3-耗尽的细胞培养物(“接种”)起始时原始培养物体积的约两倍。在具体实施方式中，用于“再补料”的培养基不含有CD3受体激动剂(例如，没有OKT-3)。
可以使用多种方法和设备培养NK细胞群。培养器具的选择通常基于培养的规模和目的。细胞培养的放大优选包括使用专用设备。用于大规模、临床级NK细胞生产的器具详细描述于如下文献：例如Spanholtz等人，(PLoS ONE 2010；5:e9221)和Sutlu等人(Cytotherapy 2010,Cytotherapy 12(8):1044-55)。在一些实施方式中，在培养瓶中，以每瓶100×106至4000×106细胞的细胞密度培养NK细胞级分(例如，方法的步骤(b)和/或(c))。在具体实施方式中，在培养瓶中，以每瓶200×106至300×106细胞的细胞密度进行NK细胞级分的培养(例如，体外培养的起始和/或“再补料”)。在一些实施方式中，培养瓶是包含透气膜(gas-permeable membrane)的培养瓶，例如G-Rex培养设备(G-Rex 100M或封闭系统G-Rex MCS、WolfWilson、St Paul MN)。
可以理解的是，培养瓶中的细胞密度在培养过程中随着细胞的增殖而增加。因此，尽管通过以每瓶400×106至900×106CD3-耗尽的细胞和400×106至900×106经辐射的CD3+细胞接种，特别是以每瓶700×106CD3-耗尽的细胞和700×106经辐射的CD3+细胞接种，但在培养过程中，以如下细胞密度培养CD3-耗尽的细胞级分：每瓶100×106至4000×106细胞、每瓶150×106至3500×106细胞，每瓶200×106至4000×106细胞，每瓶300×106至4000×106细胞，每瓶200×106至3000×106细胞，每瓶300×106至2000×106细胞，每瓶400×106至1000×106细胞，每瓶250×106至800×106细胞，每瓶100×106至600×106细胞，或每瓶150×106至500×106细胞。在具体实施方式中，在培养瓶中培养的持续时间内，以每瓶100×107至3000×107细胞的细胞密度培养NK细胞级分的NK细胞。在一些实施方式中，在扩增的、组合的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞级分内的NK级分的扩增倍数为原始细胞数量是2至15倍。在具体实施方式中，NK细胞扩增约为扩增循环完成细胞的90％，并且倍数增加是2至10倍。在具体实施方式中，扩增过程中NK细胞的倍数增加是培养前单采单元中NK细胞数量的2至6倍，3至5倍，4至6倍或4至5倍。
NK细胞的培养可以在有或没有饲养细胞或饲养细胞层的情况下进行。本发明人已经表明，培养CD3-耗尽的级分及其灭活的相应CD3+级分增强了扩增的NK细胞群的增殖和功能。因此，根据一个实施方式，用饲养层或饲养细胞培养NK细胞群。
在一些实施方式中，在开始CD3-耗尽的和CD3+级分细胞培养(步骤(b))之后14至16天，从所述培养物中收获所述CD3-耗尽的NK细胞(步骤(b))。细胞的收获可以手动进行，通过释放附着的细胞(例如“刮擦”培养容器表面)或通过细胞收获设备进行，所述设备设计用以有效率地将细胞从其培养容器中清除并自动收集细胞。在具体实施例中，通过细胞收获设备(例如Fresenius RKabi(Hamburg，德国)的LOVO细胞处理设备)从培养容器中收获扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分。
在一些实施方式中，从培养物中收获的扩增的CD3-耗尽的、NK细胞富集(通过扩增)的级分，从培养容器中去除了大部分或几乎所有细胞(包括辐射的CD3+饲养细胞)。在其它实施方式中，收获可以分两步或多步进行，从而允许未收获的细胞继续培养，直至稍后收获。在一些实施方式中，扩增的CD3-耗尽的含有NK细胞的级分是分两步收获的，包括收获第一部分的扩增的CD3-耗尽的含有NK细胞的级分，然后是收获第二部分的扩增的CD3-耗尽的含有NK细胞的级分。可以在收获第一部分和收获第二部分之间间隔数小时、数天或更长时间来收获两个部分。在一些实施方式中，收获包括在步骤(b)(开始培养)后约14天收获扩增CD3-耗尽的NK细胞的第一部分，以及在约2天后收获扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分的第二部分。在一个具体实施方式中，在开始体外培养后14天收获所述第一部分，在开始体外培养后16天收获所述第二部分。
在一些实施方式中，第一和第二部分大致相等，即第一(收获的)部分包含约50％的扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分，第二(收获的)部分包含扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分的其余部分。
在具体实施方式中，同时收获培养容器(例如培养瓶)的全部细胞内容物。在一些实施方式中，在接种后第14天或15或16天收获细胞。
为了制备扩增的组合的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞群以供进一步使用(例如移植(输注)或冷冻保存)，需要将收获的细胞洗去培养基，评估关键参数，并将体积调整至适于进一步处理的浓度。
在收获之后，可以手动洗涤扩增的组合的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞群，以除去培养基，或者使用采用封闭系统的自动化装置，优选地用于临床应用。为了立即使用，洗涤的细胞可以用输注溶液重构(适合用于本文所述方法的示例性输注溶液包括但不限于CSB缓冲液(Biolife Solutions,Bothell,WA)、2-8Cellsius缓冲液(ProtidePharmaceuticals,Lake Zurich,IL)以及8％w/v的HSA和6.8％w/v的葡聚糖-40(Dextran-40))、盐水或其它重构/输注缓冲液如PlasmaLyte(Baxter Healthcare Ltd)。在本公开的方法的一些方面，输注溶液可以是PlasmaLyte。如本领域技术人员所理解的，PlasmaLyte包含浓度为5.26g/l的氯化钠、浓度为0.37g/l的氯化钾、浓度为0.30g/l的六水合氯化镁、浓度为3.68g/l的三水合乙酸钠和浓度为5.02g/l的葡萄糖酸钠，并且pH为约7.4(在6.5至8.0的范围内)。
因此，在一些实施方式中，提供了根据本文所述方法制备的包含扩增的NK细胞的CD3-耗尽的细胞级分，其适于输注给对象。
对于冷冻保存，可以用冷冻保存缓冲液重构洗涤的细胞。在一些实施方式中，首先将细胞洗涤并在不含DMSO的冷冻保存缓冲溶液(例如CSB缓冲液，Biolife)中重构(例如悬浮)。然后根据本文详细描述的方法，在降低温度之前，对洗涤的细胞取样，以评估生存力、功能、效价、无菌细胞计数等。
本发明人已经表明，根据本文所述的方法，用烟酰胺和CD3+饲养细胞扩增的NK细胞可以被有效地冷冻保存，同时保持它们的表型、功能和生存力，适于在低温储存后解冻和治疗用途。
因此，根据本发明的一些方面，提供了一种用于冷冻保存NK细胞级分的方法，该方法包括：
·(a)将NK细胞级分的NK细胞悬浮于不含DMSO的冷冻保存缓冲液中；
·(b)将细胞在4℃下冷却10至30分钟；
·(c)添加DMSO至10％w/v；
·(d)将细胞的温度降低至-120℃
·(e)在<120℃下储存冷冻保存的NK细胞
在具体实施方式中，用于冷冻保存的NK细胞级分是扩增的NK细胞级分。在具体实施方式中，用于冷冻保存的NK细胞级分是根据本文所述的方法培养、收获和洗涤的CD3-耗尽的和灭活的CD3+饲养细胞的扩增的NK细胞级分。
因此，根据本发明的一些方面，提供了一种用于为有需要的对象制备冷冻保存的NK细胞级分的方法，该方法包括：
(a)获得包含与对象同种异体的NK细胞和CD3+细胞的单采产物；
(b)将所述单采产物分离成CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；
(c)通过辐射灭活所述CD3+细胞级分的细胞；
(d)在允许细胞增殖的条件下，在体外培养所述CD3-耗尽的细胞级分和灭活的、经辐射的CD3+细胞级分，其中所述条件包括：提供介于1.0mM至10mM之间的量的营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺；
(e)在步骤(d)之后6至10天，用新鲜的营养素、血清、IL-15和烟酰胺补充所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，以产生扩增的CD3-耗尽的细胞级分；
(f)在步骤(d)之后14至16天，收获所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；和
(g)洗涤并浓缩步骤(f)的所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，从而产生扩增的NK细胞级分，以施用于所述对象；并
(h)冷冻和冷冻保存步骤(g)的组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，从而为有需要的对象产生冷冻保存的NK细胞级分。根据所述方法制备的冷冻保存的NK细胞级分适于在临床环境中施用。
在降低温度进行冷冻之前，向细胞中加入合适的低温保护剂(cryoprotectant)(例如人血清白蛋白和/或DMSO)，以完成冷冻保存缓冲液。在一些实施方式中，冷冻保存溶液(cryopreservative solution)是或含有例如至少或约1％至30％的DMSO。在一些实施方式中，用含有1.0％至30％DMSO溶液，例如5％至20％DMSO溶液或5％至10％DMSO溶液的冷冻保存溶液配制细胞。在一些实施方式中，包含冷冻保存剂的冷冻保存溶液是或含有，例如，含有10％ DMSO的CSB缓冲液(Biolife Solutions,Bothell,WA)，或其它合适的细胞冷冻介质。
在一些实施方式中，所述处理可包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，例如单位剂量形式的组合物，其包括用于以给定剂量或其分数施用的细胞数量。在一些实施方式中，处理步骤可以包括体积减小，从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方式中，处理步骤可以包括体积添加(volume-addition)，从而根据需要降低细胞浓度。
在一些实施方式中，用于冷冻保存的处理包括将一定体积的冷冻保存缓冲液加入到扩增的细胞中，或将体积补充至冷冻保存袋中所需的最终体积。在一些实施方式中，制剂缓冲液的体积为约10mL至1000mL，例如至少为或约至少为或约为20mL、30mL、40mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。在具体实施方式中，用于冷冻保存的悬浮细胞(包括缓冲液)的体积为20ml。
在一些实施方式中，将扩增的CD3-耗尽的和CD3+饲养层细胞转移到容器中，例如可操作地连接作为封闭细胞处理系统的一部分的袋子。在一些实施方式中，容器(例如袋子)在输出线或输出位置处连接到系统。在一些实施方式中，袋子是冷冻保存袋，特别是氟化乙烯丙烯冷冻保存袋。各种合适的冷冻保存袋是市售的，例如冷冻保存袋(Miltenyi Biotech)或Orige冷冻保存袋(Abacus)。在具体实施方式中，冷冻保存袋是CryoMACS冷冻保存袋。在一些方面，冷冻保存袋袋可以是250ml的冷冻保存袋。在一些方面，冷冻保存袋可以是50ml的冷冻保存袋。
在一些实施方式中，封闭系统，例如与细胞处理系统相关的封闭系统，包括单端口出口，或多端口输出套件，该多端口输出套件包含在管线各端与端口相关联的多通路管道歧管(multi-way tubing manifold)，一个或多个容器可连接到所述端口以转移扩增的细胞组合物。在一些方面，所需数量的或多个输出容器，例如冷冻保存袋，可以无菌地连接到多端口输出的一个或多端口个，通常两个或更多个端口，例如至少3、4、5、6、7、8个或更多个端口。例如，在一些实施方式中，一个或多个容器，例如袋子，可以连接到端口，或者连接到少于所有端口。因此，在一些实施方式中，系统可以实现将培养和扩增的CD3-耗尽的细胞转移到多个输出袋中，并且如果需要的话，转移给对象。
在一些实施方式中，每个容器，例如袋子，单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方式中，每个容器包括相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方式中，单位剂量包括等于或约5×108、2.5×108、1×108、5×107、2×106或小于约5×105总细胞/ml。在一些实施方式中，每个袋中的细胞加上冷冻保存缓冲液的体积为10mL至100mL，例如至少为或约至少为20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方式中，每个单位剂量在20ml体积的冷藏保护剂缓冲液(例如CSB缓冲液)中含有约2.5×108总细胞。
如本文所用，术语低温冷冻(cryogenically freezing)是指将样品(例如含有细胞的样品)的温度降低至-80℃至-210℃。
扩增的CD3-耗尽的和经辐射的CD3+饲养细胞群的冷冻分阶段进行：首先，将细胞(在密封的冷冻保存袋中)的温度降低至-120℃。温度的降低是逐渐进行的，以防止对细胞的冲击和损害。在一些实施方式中，降低至-120℃分两个阶段进行：逐渐冷冻，例如以-1℃/min，降低至-60℃，随后更快速地冷冻，例如以-5℃/min，直至降低到目标温度(-120℃)。然后将包含冷冻保存的细胞的冷冻的冷冻保存袋转移到冷冻保存装置，例如液氮瓶(例如液氮瓶的气相)或超低温冰箱中，在低于-120℃下存储，并在一些实施方式中，在低于-140℃或低于或等于-150℃下储存。
在一些实施方式中，在温度逐渐降低过程中(例如，在达到-60℃之前)，引入“快速冷冻”的中间步骤，包括快速突然降低温度，然后返回到逐渐冷冻。
如本文所用，术语“低温储存(cryogenically storing或cryogenic storage)”通常是指，在-80℃至-210℃的温度下，以及在这样的条件下存储样品，例如含有细胞的样品，所述条件是使得细胞能够在这样储存一段时间后解冻，从而在解冻时或解冻后，样品中细胞的至少一部分或大部分保持存活和/或保留其至少一部分生物功能。在一个方面，细胞样品能够解冻，使得样品中至少一定百分比，例如约或大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞仍然存活。
因此，在一些实施方式中，提供了根据本文所述的方法制备的适于施用(例如通过输注)的包含扩增的NK细胞的冷冻保存的CD3-耗尽的细胞级分。在一些实施方式中，包含扩增的NK细胞的冷冻保存的CD3-耗尽的细胞级分提供在氟化乙烯丙烯冷冻保存袋中，所述冷冻保存袋包含0.5×108总细胞/ml,1.0×108总细胞/ml,1.5×108总细胞/ml,2.0×108总细胞/ml,2.5×108总细胞/ml,3.0×108总细胞/ml,3.5×108总细胞/ml或4.0×108总细胞/ml，体积为5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、90、100ml或更大。在一些实施方式中，冷冻保存袋的体积可以为10、20、30、40、50、60、70、80、100ml，或介于50ml至1000ml、50ml至500ml、100ml至500ml、50ml至250ml。在具体实施方式中，在250ml或50ml的冷冻保存袋中提供包含扩增的NK细胞的冷冻保存的CD-耗尽的细胞级分。在具体实施方式中，包含扩增的NK细胞的冷冻保存的CD3-耗尽的细胞级分提供在氟化乙烯丙烯冷冻保存袋中，所述冷冻保存袋的体积为20ml，包含2.5×108总细胞/ml。
应当理解，在冷冻保存后的不同时间，可以将一些冷冻保存的级分解冻和取样，以便在保存期间监测生存力、特征、功能、效价和细胞密度(数量/体积)。取样可以定期进行(每月一次、两个月一次、六个月或更长时间一次)。
在一些方面，单个冷冻保存袋仅解冻一次。
为了提供储存的、冷冻保存的细胞群的准确表征，可以记录各个冷冻保存级分的参数(效价、污染、无菌性、生存力、外观、表型，供体统计数据等)，以供日后选择冷冻保存单位解冻时参考。
细胞可以根据上述实施方式的方式低温储存，例如在液氮储存罐的气相中，并且例如储存1天至12年的时间。在一些实施方式中，将细胞储存或保存大于或等于12小时、24小时、36小时或48小时。在一些实施方式中，将细胞储存或保存大于或等于1周、2周、3周或4周的时间段。在一些实施方式中，将细胞置于长期储存或长期“保存”中。在一些方面，细胞储存的时间段大于或等于1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年或更长。
在一些实施方式中，在储存期之后，将细胞解冻。在一些实施方式中，通过将细胞的温度升高至0℃或0℃以上来解冻细胞，以便恢复细胞的至少一部分生物功能。在一些实施方式中，通过将细胞的温度升高至37℃来解冻细胞，以便恢复细胞的至少一部分生物功能。
在一些实施方式中，快速解冻细胞，例如，尽可能快速解冻细胞，而不使细胞过热或暴露于高温，例如37℃以上。在一些实施方式中，快速解冻减少和/或防止细胞暴露于高浓度的冷藏保护剂和/或DMSO。在具体实施方式中，解冻发生的速率可能受到细胞在其中冷冻和解冻的容器(例如小瓶(vial)和/或袋子)性质的影响。
在一些实施方式中，在加热块上、在干解冻器中或在水浴中，细胞解冻。在一些实施方式中，在加热块上、在干解冻器或水浴中，细胞不解冻。在一些实施方式中，细胞在室温下解冻。在具体实施方式中，细胞在如下温度或温度范围下解冻：约或小于37℃、35℃、32℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃或15℃，或15℃至30℃，23℃至28℃，或24℃至26℃，各个范围均包含两端值。
在一些实施方式中，快速解冻冷冻细胞。在具体实施方式中，细胞解冻时间为约120分钟、90分钟、60分钟、45分钟、30分钟、25分钟、20分钟、5分钟或10分钟。在一些实施方式中，细胞解冻时间为10分钟至60分钟，15分钟至45分钟，或15分钟至25分钟，各个范围均包含两端值。在具体实施方式中，细胞解冻时间为约20分钟，或少于20分钟。
在一些实施方式中，在加热块上、在干解冻器中或在水浴中，细胞解冻。在一些实施方式中，在加热块上、在干解冻器或水浴中，细胞不解冻。在一些实施方式中，细胞在室温下解冻。在具体实施方式中，细胞在室温下温育2-15分钟。在具体实施方式中，将具有细胞的冷冻保存袋在室温(例如15-25℃)下温育5分钟，然后在37℃水浴中解冻直至解冻，例如所有固体已经完全溶解成溶液。
在一些实施方式中，在施用之前或在任何后续的工程化和/或加工步骤之前，将解冻的细胞静置，例如温育或培养。在一些实施方式中，细胞在低量和/或不可检测量的冷藏保护剂中或在不存在冷藏保护剂(例如DMSO)的情况下静置。在具体实施方式中，在洗涤步骤之后或洗涤步骤后立即静置，例如以除去冷藏保护剂和/或DMSO。在一些实施方式中，细胞静置约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、18小时或24小时，或静置至少5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、18小时或24小时。在一些实施方式中，细胞静置约2小时，或静置至少2小时。
解冻的细胞可以用任何合适的输注、缓冲液、盐水、PlasmaLyte等溶液进行重建。在一些实施方式中，在彻底解冻后，用输注溶液(例如(Baxter)或乳酸林格氏溶液(lactated Ringer’s solution)等)稀释细胞，从而允许直接用于治疗。在其它实施方式中，用包含葡聚糖-40和人血清白蛋白(HSA)的溶液稀释细胞。
在具体实施方式中，在解冻后，用市售的电解质输注溶液(例如PlasmaLyte(Baxter)，乳酸林格氏溶液等)稀释细胞。在一些实施方式中，用PlasmaLyte(Baxter)，以细胞与稀释剂1:4的比例稀释解冻的细胞。在一些实施方式中，用80ml PlasmaLyte血，将20ml解冻的细胞稀释至最终体积为100ml。
在一些实施例中，在封闭系统中执行重构。在一些实施方式中，筛选适于与本发明的方法和组合物一起使用的输注溶液。用于选择合适的输注溶液的示例性标准包括安全测试，其指示没有细菌，酵母或霉菌生长，内毒素含量小于0.5Eu/ml和透明的，无外来颗粒的外观。在一些方面，本公开的NK细胞级分和包含NK级分的组合物包含不超过约0.5内毒素单位(EU)/ml。
如本文所用，术语“繁殖(propagation)”或“增殖(proliferation)”是指生长，例如细胞生长和细胞数量的倍增。如本文所用，繁殖和增殖涉及在温育期间累积的NK细胞数量的增加。显示NK细胞表型的细胞，受到刺激(例如用IL-2、Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞系等刺激)之后，在体外或体内繁殖是一种已知的现象。
显示NK细胞表型的细胞的体外或体内增殖是一种已知的刺激后的现象。
本领域众所周知的细胞增殖试验(Assay)，包括但不限于克隆形成试验(clonogenic assay)，其中细胞以低密度接种和生长，并对菌落(colonies)进行计数；机械试验[流式细胞术(例如，FACSTM)，碘化丙啶]，其机械测量细胞数量；代谢试验(例如掺入四唑盐(tetrazolium)，例如XTT、MTT等)，其测量活细胞的数量；直接增殖试验(例如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine)、胸苷掺入(thymidine incorporation)等)，其测量生长群的DNA合成。在一个实施方式中，在将CD3-耗尽的细胞接种到培养物中后的预定时间(如，约10小时、12小时，约1、2、3、4、5、6、7天，约1、2、3、4、5周，2个月或更长时间)，用有效浓度的根据本发明的烟酰胺和/或其他烟酰胺部分一起培养的NK细胞的群的细胞增殖通过FACS分析确定，使用抗-CD56和抗-CD3标记物来识别和定量群的CD56+CD3-NK细胞级分。与培养前的原始NK细胞级分相比，NK细胞的增殖可以表达为NK细胞的倍数增加(例如，扩增或倍数扩增)。在一些实施方式中，在培养约5、约7、约12、约14、约16、约18、约21、约25、约30或更多天后，暴露于根据本发明的有效浓度的烟酰胺的NK细胞的群后，NK细胞群的倍数增加了至少2倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150X，至少250倍和至少500倍或更多倍。在另一个实施方式中，通过FACSTM测定，暴露于有效浓度的烟酰胺的NK细胞群的扩增倍数比在相同条件下用少于0.1mM烟酰胺和/或其他烟酰胺部分培养的NK细胞的扩增倍数高至少约1.2倍、约1.3倍、约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍。
如本文所用，术语“功能”或“NK细胞功能”是指归因于(ascribed to)NK细胞的任何生物学功能。NK细胞功能的非限制性列表包括，例如，细胞毒性、细胞凋亡的诱导、细胞运动性(cell motility)、定向迁移、细胞因子和其他细胞信号应答(cell signalresponse)、细胞因子/趋化因子的产生和分泌、体外活化和抑制细胞表面分子的表达、移植植宿主中的细胞归巢和植入(体内保留)，以及体内疾病或疾病过程的改变。在一些实施方式中，通过暴露于烟酰胺和/或其他烟酰胺部分而增强的NK细胞功能，包括CD62L表面标记物、CD107a的表达增加；迁移应答(migration response)的提高和NK细胞的更大细胞毒活性，以及输注的NK细胞的归巢和体内保留的升高中的至少一种。
粘附和迁移分子如CD62L、CXCR-4、CD49e等的测定，对于归巢/植入和移植中的细胞保留很重要，这在本领域中是众所周知的。细胞中CD62L表达可以通过例如流式细胞术、免疫检测、定量cDNA扩增、杂交等来测定。在一个实施方式中，通过将细胞暴露于荧光标记的特异性抗人CD62L单克隆抗体[例如，CD62L PE，目录号：304806，来自BioLegend(美国加利福尼亚州圣地亚哥)]，并通过荧光激活细胞分选(FACS)对细胞进行分选。
细胞迁移的测定是本领域众所周知的。可以通过迁移测定(transmigrationassay)或间隙封闭分析(gap closure assay)来测定细胞的迁移。在迁移测定(例如双室技术)中，通过屏障(例如，过滤器)将细胞与刺激物分离，并通过在特定的时间间隔内对来自起点的细胞损失和/或穿过屏障的细胞累积进行计数来检测细胞的迁移。在间隙封闭分析中，将细胞放置在可见间隙的外围(有划痕的琼脂板，围绕圆圈等)，并与刺激物一起温育。使用细胞计数(cytometry)、免疫检测、显微镜/形态计量学等，可以观察到响应于细胞运动所造成的细胞空间的闭合。在一个实施方式中，不同NK细胞群响应于SDF(250ng/ml)的迁移潜力通过"Transwell"TM迁移测定来进行测定。
输入(transfuse)或移植细胞的归巢和体内保留的测定是本领域众所周知的。如本文所用，术语“归巢”是指输入或移植的细胞到达宿主靶器官，并在其中存活的能力。例如，NK细胞靶器官可以是淋巴组织，肝细胞靶器官可以是肝实质(liver parenchyma)，肺泡细胞靶器官可以是肺实质等。如本文所用，术语“体内保留(in-vivo retention)”(也称为“植入”)指输入或移植的细胞在靶器官中增殖并保持活力的能力。用于测定移植的NK细胞的归巢和体内保留的动物模型，包括但不限于，免疫缺陷的小型哺乳动物(例如SCID和IL2Rγnull小鼠等)。SCID-Hu小鼠模型采用移植人胎胸腺(human fetal thymus)和肝组织或胎儿BM组织的C.B-17scid/scid(SCID)小鼠，为评估移植的人NK细胞的保留和治疗潜力提供了合适的模型。移植细胞的归巢和体内保留也可以在人类宿主对象中进行评估。在一个实施方式中，在经辐射的NOD/SCID小鼠中测定了归巢和体内保留，该小鼠输入了例如，约15×104、约15×105、约15×106、约15×107或更多个人NK细胞，这些细胞是用根据本发明的有效浓度的烟酰胺培养的，并在输入后的预定时间(例如输入后约5小时、10小时、12小时，1、2、3、4、5、6、7天，1、2、3、4、5周，2、3、4个月或更长时间)杀死(sacrificed)小鼠。在杀死小鼠后，使用人特异性Abs，通过FACS评估脾脏、骨髓、外周血和其他器官的人NK细胞(CD56+CD45+)的存在。体内保留百分比表示为显示供体表型的器官的细胞百分比(例如，人细胞的CD45)。在具体实施方式中，与不含烟酰胺和CD3+饲养层培养的NK细胞相比，根据本文所述的方法扩增、冷冻保存和解冻的NK细胞的体内保留增加了在脾脏中的保留。
细胞毒性分析(“细胞杀伤”)是本领域众所周知的。用于重定向杀伤试验的合适靶细胞的示例是癌症细胞系、原发性癌症细胞实体瘤细胞、白血病细胞或病毒感染的细胞。特别地，可以使用K562、BL-2、colo250、RAJI(淋巴母细胞样伯基特氏淋巴瘤细胞)和原代白血病细胞(primary leukemic cell)，但可以使用许多其他细胞类型中的任何一种，并且是本领域众所周知的(参见，例如，Sivori等人(1997)J.Exp.Med.186:1129-1136；Vitale等人(1998)J.Exp.Med.187:2065-2072；Pessino等人(1998)J.Exp.Med.188:953-960；Neri等人(2001)Clin.Diag.Lab.Immun.8:1131-1135)。通过细胞生存力试验(例如，染料排斥、铬释放、CFSE)、代谢测定(例如，四唑盐)和直接观察，来评估细胞杀伤。
一旦扩增的CD3-耗尽细胞级分被解冻和稀释，就可评估扩增的级分是否适合用于移植。选择合适的可移植NK细胞制剂的典型标准包括：CD56+/CD3-细胞的百分比、细胞生存力，CD3+细胞级分的量、内毒素的存在、微生物污染等。应当注意，扩增的NK细胞级分的CD56+、CD3+和CD56+/CD3-细胞含量对于输注的NK细胞的成功归巢和保留至关重要，因此是进行输注的核心标准。因此，在具体实施方式中，解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是：约60％至约90％的CD56+/CD3-细胞，约68％至约85％的CD56+/CD3-细胞，约72％至约82％的CD56+/CD3-细胞和约76％至79％的CD56+/CD3-细胞。在一个实施方式中，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是：至少60％，至少64％，至少70％，至少74％，至少80％或至少85％的CD56+/CD3-细胞。在另一个实施方式中，通过本发明的方法产生的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是至少70％的CD56+/CD3-细胞。上文详细描述了根据CD56和CD3细胞标记物识别NK细胞表型。
用于移植的细胞组级分中同种异体T(CD3+)细胞的存在是有问题的，因为它们会大大增加GVHD的风险。因此，扩增的NK细胞级分是否适合临床应用的一个重要参数是CD3+(特别是CD3+/CD56-细胞)的量或级分。因此，在具体实施方式中，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是每Kg患者体重1.0×105至1.0×106CD3+/CD56-细胞。在进一步的实施方式中，通过本发明的方法产生的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是每Kg患者体重少于7.0×105CD3+/CD56-细胞，每Kg患者体重少于6.5×105CD3+/CD56-细胞，每Kg患者体重少于6.0×105CD3+/CD56-细胞，每Kg患者体重少于5.5×105CD3+/CD56-细胞、每Kg患者体重少于5.0×105CD3+细胞、每Kg患者体重少于4.5×105CD3+/CD56-细胞、每Kg患者体重少于4.0×105CD3+/CD56-细胞、每Kg患者体重少于3.5×105CD3+细胞或每Kg患者体重少于3.0×105CD3+/CD56-细胞。在一个实施方式中，通过本发明的方法产生的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是每Kg患者质量少于1×106CD3+CD56-细胞。在其它实施方式中，通过本发明的方法产生的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是每Kg患者体重少于0.5×106CD3+CD56-细胞。应当注意，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的CD3+CD56-级分、部分或含量的计算(每Kg患者体重表示)与移植(例如输注)到患者(即对象)中的CD3+CD56-细胞的总量有关。本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分中CD3+CD56-细胞的级分、部分或量也可以表示为CD56+/CD3-与CD3+CD56-细胞的比率，或者表示为本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的体积分数(例如CD3+/CD56-细胞/mL)或重量分数(CD3+/CD56-细胞/100g)。CD3+细胞标记物的识别在上文有详细描述。
通过监测内毒素含量，特别是细菌、真菌、病毒和支原体污染的存在，确保用于移植的扩增的、CD3-耗尽的NK细胞级分的无菌性和安全性。在一些实施方式中，选择用于移植的扩增的NK细胞级分在解冻和稀释后具有不超过5Eu/ml的内毒素含量。在一些实施方式中，用于移植的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是在解冻和稀释后不含微生物(例如革兰氏阳性微生物)。在具体实施方式中，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分是无菌的，并且在解冻和稀释后不含支原体。
在一些实施方式中，扩增的NK细胞级分的特征是约50％至约85％的生存力。在一些实施方式中，选择具有如下生存力的增的NK细胞级分：约55％、约60％、约63％、约65％、约68％、约70％、约75％、约78％、约80％、约82％、约83％、约84％至约85％或更高。在进一步的实施方式中，选择用于离体扩增的NK细胞部分(例如，CD3-耗尽的级分)具有至少70％的活细胞。在进一步的实施方式中，适于临床应用的扩增的NK细胞级分(例如，组合的CD3-耗尽的和CD3+细胞)的特征是洗涤和浓缩后具有至少70％的活细胞。在进一步的实施方式中，适于移植的扩增的NK细胞级分具有至少85％的活细胞。
如本文所用，术语“生存力”是指活细胞和非活细胞之间的区别。细胞生存力可以通过形态学变化或通过膜渗透性和/或生理状态的变化来判断，所述变化是通过排除某些染料或其吸收和保留它染料来推断的。细胞生存力评估是本领域众所周知的，包括但不限于测定(例如染料排除、铬释放)、代谢测定(例如四唑盐)和直接观察(Coder,D.,Currentprotocols in cytometry,1997,John Wiley and sons,Inc.，9.2,9.2.1-9.2.14单元)。
在一些实施方式中，在接种用于细胞培养之前、在细胞培养过程中、在收获之后、在洗涤之后和浓缩扩增的CD3-耗尽的细胞级分之后、在冷冻保存之后、在储存之后，以及在本发明的CD3-耗尽的细胞级分的解冻和稀释中，在抽取的样品中监测CD56+/CD3-细胞级分、CD3+细胞部分、生存力、内毒素和微生物含量，以及表型、NK细胞功能、效价和外观的参数。在一些实施方式中，在处理前(例如100×106细胞)、柱后(CD3-耗尽)预培养样品(例如10×106细胞)、扩增预洗涤(例如10ml样品)、最终扩增、洗涤和浓缩的CD3-耗尽的细胞产物(10×106细胞)、冷冻保存后、储存期间、解冻和稀释后，和/或在第一次输注的当天(第0天)，并且如果需要，在任何进一步输注的当天，或其任何组合，从任何单采单元取出样品。
本发明人已经表明，用烟酰胺和经辐射的CD3+饲养细胞培养CD3-耗尽的细胞，使得导NK细胞级分稳定扩增(robust expansion)，并且NK细胞功能和归巢/移植潜力的增强(参见实施例1-4)。因此，在一些实施方式中，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有所述CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，扩增的CD3-耗尽的细胞的CD62L表达增加。在一些实施方式中，与在具有5mM烟酰胺且不具有所述CD3+细胞级分的相同条件下扩增的CD3-耗尽的细胞相比，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的CD62L表达增加。
在其它实施方式中，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有所述CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，在输注给经辐射的小鼠后，扩增的CD3-耗尽的细胞在脾脏和骨髓中的体内保留增加。在进一步的实施方式中，权利要求25的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分，其中与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有所述CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，在输注给经辐射的小鼠后，所述扩增的CD3-耗尽的细胞在脾脏和骨髓中的体内保留增加。
因此，根据具体实施方式，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)输注后，少于1×106CD3+CD56-细胞/Kg患者体重；
(d)输注后，不超过5EU内毒素/Kg患者体重；
(e)无支原体，并且
(f)无菌。
因此，根据具体实施方式，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)少于0.5％的细胞是CD3+/CD56-；
(d)不超过0.5内毒素单位(EU)/mL；
(e)无支原体，并且
(f)无菌。
符合上述标准的扩增的CD3-耗尽的细胞级分可用于输注给有需要的对象(例如患者)。上文描述的用于离体扩增(培养)、选择和制备用于施用的CD3-耗尽的细胞级分的任何方法，以及其单独或以各种组合的实施方式中的每一个可用于影响施用(例如移植、输注)扩增的CD3-耗尽的细胞级分的方法，如本部分和后续各节中所述。
因此，在一些实施方式中，提供了根据本文所述的用于制备本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的任何方法制备的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分。在具体实施方式中，解冻的、冷冻保存的CD3-耗尽的NK细胞级分的特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)输注后，少于1×106CD3+/CD56-细胞/Kg患者体重；
(d)输注后，不超过5EU内毒素/Kg患者体重；
(e)无支原体，并且
(f)无菌。
因此，在一些实施方式中，提供了根据本文所述的用于制备本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的任何方法制备的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分。在具体实施方式中，解冻的、冷冻保存的CD3-耗尽的NK细胞级分的特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)少于0.5％的细胞是CD3+/CD56-；
(d)不超过0.5内毒素单位(EU)/mL；
(e)无支原体，并且
(f)无菌。
在一些实施方式中，在解冻和稀释后，在容器中提供NK细胞级分(例如用于转移至移植部位(输注))。在一些实施方式中，容器是培养袋。培养袋由惰性材料制成，具有高透气性和低失水性、柔韧性和高透光性是理想的。在具体实施方式中，在氟化乙烯丙烯(FEP)培养袋中提供本发明的解冻的冷冻保存并稀释的CD3-耗尽的细胞级分可移植的扩增NK细胞级分。
在其它实施方式中，提供了一种可移植的人NK细胞级分，其特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)输注后，少于5.0×105CD3+/CD56-细胞/Kg患者体重；
(d)输注后，不超过5EU内毒素/Kg患者体重；和
(e)无支原体，并且
(f)无菌。
在一些实施方式中，在解冻和稀释后，在容器中提供NK细胞级分(例如用于转移至移植部位(输注))。在一些实施方式中，容器是培养袋。培养袋由惰性材料制成，具有高透气性和低失水性、柔韧性和高透光性是理想的。在具体实施方式中，在氟化乙烯丙烯(FEP)培养袋中提供本发明的解冻的冷冻保存并稀释的CD3-耗尽的细胞级分可移植的扩增NK细胞级分。
在其它实施方式中，提供了一种可移植的人NK细胞级分，其特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)少于0.5％的细胞是CD3+/CD56-；
(d)不超过0.5内毒素单位(EU)/mL；
(e)无支原体，并且
(f)无菌。
本发明的扩增的CD3-耗尽的细胞级分可用于输注给需要其的对象。在一些实施方式中，扩增的CD3-耗尽的细胞级分是本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分。
如本文所用，术语“移植”，在细胞疗法(cell therapy)、过继转移、细胞免疫疗法等的上下文中，是指将具有预期治疗效果的细胞施用给对象，优选地施用给有需要的对象，例如，治疗患者的疾病或病症。由于这种细胞疗法包括通过血管连接将治疗性细胞级分引入到对象的体内，因此如本文所用，NK细胞的“移植”和“施用”等同于“输注”。通常，治疗性细胞级分，例如通过中心静脉导管(central venous catheter)(例如Hickman导管)，以静脉输注到对象体内。输注给对象的治疗性细胞级分的速率可以由泵控制，或者无需辅助，通过重力供给并通过细胞级分和入口导管之间的高度差调节。在一些实施方式中，扩增的NK细胞级分是通过重力供给静脉内移植(输注、施用)，而无需一个或多个泵和/或无需过滤器。在一些方面，使用过滤器移植(输注/施用)扩增的NK细胞级分。在一些方面，过滤器的孔径可以为约170至约260微米。
在一些实施方式中，需要移植的对象患有血液病。在一些实施方式中，对象患有血液恶性肿瘤。在具体实施方式中，适合用本文所述的本发明的CD3-耗尽的、扩增的NK细胞级分，解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分或方法治疗的血液恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。具体地，适合用本发明的细胞级分或方法治疗的血液恶性肿瘤是表达CD20+的NHL，包括但不限于滤泡性淋巴瘤(FL)和高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)。在一些方面，NHL可以是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些方面，NHL可以是套细胞淋巴瘤(MCL)。在一些方面，HGBCL可以是未另外指定的HGBCL(HGBCL,NOS)。在一些方面，NHL可以是原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。
因此，在一些实施方式中，提供了一种治疗有需要的对象的血液疾病的方法，该方法包括：
(a)向对象施用抗癌单克隆抗体；
(b)向对象施用至少一种免疫抑制剂；
(c)将同种异体解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分移植给有需要的对象，其中所述同种异体解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分已经，通过用介于1.0mM至10mM之间的量的CD3+细胞、营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺，离体培养而扩增；和
(d)向所述对象施用IL-2，
从而治疗对象的血液病。
如本文所用，“对象”或“患者”可以是任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、骆驼。在一个具体实施方式中，对象是人。在进一步的实施方式中，对象是人，并且CD3-耗尽的细胞级分是人CD3-耗尽的细胞级分。
如本文所用，“有需要的对象”是需要移植、输注、输入或植入本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分以治疗或改善疾病、病症或病状的对象。在一个实施方式中，对象已经(被诊断为患有)或患有血液病。在一些实施方式中，血液病是细胞增殖性病症。在其它实施方式中，血液病是血液恶性肿瘤。
如本文所用，术语“……的风险(risk of)”或“……的概率(probability of)”是指发生的可能性。在一些实施方式中，个体中发生的风险或概率(例如肿瘤缩小(tumorshrinkage)、应答(response)、无进展存活等)是指根据接受治疗的组与未接受相同治疗的组之间的比较数据计算的风险。在一些实施方式中，增加或减少的风险或概率反映了治疗组和对照组之间所考虑的结果的差异。在一些实施方式中，特定发生或状况的风险或概率的增加或减少仅是相对的，并且不以数值表示。
如本文所用，术语“细胞增殖性病症”是指其中细胞的不受调节或异常生长或两者可导致不希望的病症或疾病的发展的病症，其可能是癌性的也可能不是癌性的。本发明的示例性细胞增殖性疾病包括其中细胞分裂失调的多种病症。如本文所用，术语“快速分裂细胞(rapidly dividing cell)”定义为以超过或大于在同一组织内相邻或并列的(juxtaposed)细胞中所预期或观察到的速率分裂的任何细胞。细胞增殖性病症包括癌症前期或癌前期病症。细胞增殖性疾病包括癌症。在具体实施方式中，本文提供的方法和细胞组合物用于治疗或缓解癌症的症状。术语“癌症”包括实体瘤，以及血液肿瘤和/或恶性肿瘤。在具体实施方式中，血液恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)或多发性骨髓瘤(MM)。
根据本发明一个实施方式的另一方面，提供了一种抑制需要的对象中的肿瘤生长的方法。根据本发明这一方面的方法通过对所述对象施用治疗有效量的本发明NK细胞群来实现。
“治疗(Treating或treatment)”包括但不限于，施用本发明富集的、活化的或培养的NK细胞组合物或群，而预防或延迟疾病的症状、并发症或生化标记的发作，缓解症状或阻止或抑制疾病、病症或失调(例如癌症、转移性癌症或转移性实体瘤)的进一步发展。治疗可以是预防性的，即，在疾病出现后辅助(预防或延迟疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓解症状。
在一个实施方式中，以有效减少或消除癌症(如实体瘤或恶性肿瘤)或预防其发生或复发的量施用NK细胞群。“有效减少或消除实体肿瘤或预防其发生或复发的量”或“有效减少或消除过度增殖性疾病或预防其发生或复发的量”是指治疗组合物的量，该治疗组合物改善了肿瘤疾病状态或过度增殖性疾病治疗后的患者结果或存活率，这通过患者测试数据、存活率数据、肿瘤标志物水平的升高或抑制、基于遗传谱的易感性降低或暴露于环境因素来测量。“抑制肿瘤生长”是指减少肿瘤细胞的尺寸或生存力或数量。“癌症”、“恶性肿瘤”、“实体瘤”或“过度增殖性病症”都作为同名术语使用，并且是指以不受控制的异常增殖的细胞、受影响细胞局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体其他部位(即转移)的能力，以及多种特征性结构和/或分子特征中的任一种为特征的许多疾病中的任何一种。“癌性的”或“恶性细胞”或“实体瘤细胞”应该理解为具有特定结构特性、缺乏分化，并能够侵袭和转移的的细胞。“癌症”是指在哺乳动物内发现的所有类型的癌症或赘生物(neoplasm)或恶性肿瘤，包括癌(carcinomas)和肉瘤。示例有乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、骨癌、肝癌、结肠癌、泌尿生殖系统癌(genitourinary)、膀胱癌、泌尿癌(urinary)、肾癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、黑色素瘤、间皮瘤、肉瘤(参见DeVita等人(编辑)，2001，癌症原理和肿瘤学实践(Cancer Principles and Practice of Oncology)，第6版，Lippincott Williams&Wilkins，费城，宾夕法尼亚州；该参考文献通过引用并入本文)。
“癌症相关的”是指核酸及其表达，或其缺失，或蛋白及其水平或活性，或其缺失，与对象细胞中恶性肿瘤发作的关系。例如，癌症可能与正常健康细胞中不表达，或低水平表达的特定基因的表达有关。相反，癌症相关的基因可以是在恶性细胞(或正在转化的细胞)中不表达的基因，或以低于在正常健康细胞中表达的水平表达的基因。
“过度增殖性疾病”是指其中细胞增殖比正常组织生长更快的任何疾病或病症。因此，过度增殖细胞是比正常细胞增殖更快的细胞。
“晚期癌症(advanced cancer)”是指不再局限于原发肿瘤位置的癌症，或根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的III期或IV期的癌症。
“耐受性良好(Well tolerated)”是指不存在因治疗而导致的、会影响治疗决策的健康状况不良变化。
“转移癌”是指肿瘤细胞，例如人实体瘤或泌尿生殖系统恶性肿瘤，其在注射到乳腺脂肪垫(mammary fat pad)和/或循环系统中后能够在免疫缺陷小鼠的肺、肝、骨或脑中形成继发性肿瘤病病变(secondary tumor lesion)。
“实体瘤”包括但不限于，肉瘤、黑色素瘤、恶性瘤、癌或其它实体瘤癌症。“肉瘤”是指由类似胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，通常由包埋在纤维状或均质物质(homogeneoussubstance)中的紧密堆积的细胞组成。肉瘤，包括但不仅限于，软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肉瘤(adiposesarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、肺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤(chloroma sarcoma)、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、肾母细胞瘤(Wilms tumor)、子宫内膜肉瘤(endometrial sarcoma)、间质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤(Hodgkin's sarcoma)、特发性多色素出血性肉瘤(idiopathicmultiple pigmented hemorrhagic sarcoma)、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T-细胞免疫母细胞肉瘤、延森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶肉瘤(malignantmesenchymoma sarcoma)、骨膜外肉瘤(parosteal sarcoma)、网状细胞肉瘤、劳氏肉瘤、浆液囊肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)，和毛细管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
“黑色素瘤”是指源自皮肤和其它器官的黑色素细胞系统的肿瘤。黑色素瘤包括，例如，肢端雀斑样黑色素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无色素性黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤(cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年黑色素瘤、恶性雀斑性黑色素瘤(lentigo malignamelanoma)、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和浅表扩散性黑色素瘤(superficial spreading melanoma)。
“癌”是指由易于渗透周围组织并产生转移的上脾细胞构成的恶性新肿瘤。典型的癌包括，例如，腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡状癌(acinous carcinoma)、线样囊状癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌(carcinomaadenomatosum)、肾上腺皮质癌(carcinoma of adrenal cortex)、肺泡癌(alveolarcarcinoma)、胞状细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare)、基底细胞样癌(basaloid carcinoma)、基底鳞状细胞癌(basosquamouscell carcinoma)、细支气管肺泡癌、细支气管癌(bronchiolar carcinoma)、支气管肺癌(bronchogenic carcinoma)、脑样癌(cerebriform carcinoma)、胆管细胞癌(cholangiocellular carcinoma)、绒膜癌(chorionic carcinoma)、胶样癌(colloidcarcinoma)、粉刺性癌(comedo carcinoma)、子宫体癌(corpus carcinoma)、筛状癌(cribriform carcinoma)、铠甲状癌(carcinoma en cuirasse)、癌疮(carcinomacutaneum)、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱形细胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌(epiermoid carcinoma)、腺样上皮癌(carcinomaepitheliale adenoides)、外生性癌(exophytic carcinoma)、溃疡性癌(carcinoma exulcere)、纤维癌(carcinoma fibrosum)、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、颗粒细胞癌(granulosa cellcarcinoma)、基底细胞癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌(hematoid carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、许特莱氏细胞腺癌(Hurthle cell carcinoma)、胶样癌(hyaline carcinoma)、增生性癌(hypemephroid carcinoma)、幼稚型胚胎性癌(幼稚型胚胎性癌)、原位癌(carcinoma in situ)、表皮内癌(intraepidermal carcinoma)、上皮内癌(intraepithelial carcinoma)、克罗姆佩柯赫尔肿瘤(Krompecher'scarcinoma)、库尔奇茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelial carcinoma)、髓样癌(carcinoma medullare)、髓状癌(medullary carcinoma)、黑色素癌(melanotic carcinoma)、软癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinomamucocellulare)、黏液表皮样癌(mucoepidernoid carcinoma)、粘液癌(carcinomamucosum)、似粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌(naspharyngeal carcinoma)、燕麦细胞癌(oat cell carcinoma)、骨化性癌(carcinomaossificans)、骨化性癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、门脉周癌(periportal carcinoma)、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘细胞癌(prickle cellcarcinoma)、脑样癌(pultaceous carcinoma)，肾细胞癌(renal cell carcinoma ofkidney)、贮备细胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤样癌(carcinoma sarcomatodes)、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌(carcinomascroti)、印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma)、单纯癌(carcinoma simplex)、小细胞癌(small-cell carcinoma)、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌(spheroidal cell carcinoma)、梭状细胞癌(spindle cell carcinoma)、海绵体癌(carcinoma spongiosum)、鳞状细胞癌(squamous carcinoma)、鳞状细胞癌(squamouscell carcinoma)、串状癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌(transitional cell carcinoma)、结节性癌(carcinoma tuberosum)、结节性癌(tuberouscarcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)和绒毛状癌(carcinoma viflosum)。
“白血病(Leukemia)”是指造血器官的进行性恶性疾病，通常以血液和骨髓中白细胞及其前体的异常增殖和发育为特征。白血病的临床分类通常基于(1)疾病的持续时间和特征--急性或慢性；(2)涉及的细胞类型：骨髓样(粒细胞)、淋巴样(淋巴细胞)，或单核细胞样；和(3)血液中异常细胞数量的增加或不增加-白血病或白血病(亚白血病)。白血病包括，例如，急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、成年T细胞白血病、非白血性白血病、白细胞白血病(leukocythemic leukemia)、嗜碱性白血病(basophylic leukemia)、急变细胞白血病(blast cell leukemia)、牛白血病、慢性粒细胞性白血病(chronic myelocyticleukemia)、皮肤白血病(leukemia cutis)、胚胎性白血病(embryonal leukemia)、嗜酸性粒细胞白血病(eosinophilic leukemia)、格罗斯白血病(Gross'leukemia)、毛细胞白血病(hairy-cell leukemia)、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、血母细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病(histiocytic leukemia)、干细胞白血病(stem cell leukemia)、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia)、白细胞减少性白血病(leukopenic leukemia)、淋巴白血病(lymphatic leukemia)、淋巴细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴细胞白血病(lymphocytic leukemia)、淋巴性白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤细胞性白血病(lymphosarcoma cell leukemia)、肥大细胞白血病(mast cell leukemia)、巨核细胞白血病(megakaryocytic leukemia)、小原粒細胞性白血病(micromyeloblastic leukemia)、单核细胞白血病(monocytic leukemia)、成髓细胞性白血病(myeloblastic leukemia)、髓细胞性白血病(myelocytic leukemia)、骨髓性粒细胞性白血病(myeloid granulocytic leukemia)、慢性骨髓单核细胞性白血病(myelomonocytic leukemia)、内格利型白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病(plasma cell leukemia)、浆细胞性白血病(plasmacytic leukemia)、早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia)、李德尔氏细胞性白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏性白血病(Schilling's leukemia)、干细胞白血病(stem cell leukemia)、亚白血病型白血病(subleukemic leukemia)和未分化细胞白血病(undifferentiated cell leukemia)。在具体实施方式中，血液恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
其它癌症包括，例如，霍奇金病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌(ovariancancer)、肺癌、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、原发性血小板增多症(primarythrombocytosis)、原发性巨球蛋白血症(primary macroglobulinemia)、小细胞肺癌瘤(small-cell lung tumor)、原发性脑肿瘤(primary brain tumor)、胃癌、结肠癌、恶性胰腺岛瘤(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌(malignant carcinoid)、膀胱癌(urinary bladder cancer)、癌前皮肤病变(premalignant skin lesions)、睾丸癌(testicular cancer)、淋巴瘤(lymphomas)、甲状腺癌(thyroid cancer)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、食道癌、生殖泌尿道癌(genitourinary tract cancer)、恶性高钙血症(malignant hypercalcemia)、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
在本发明这方面的另一具体实施方式中，在将造血细胞、造血祖细胞或造血干细胞移植到所述对象中的同时、之后或之前实施该方法。在进一步的实施方式中，对象同时接受敏化剂或增效剂(例如，蛋白酶体抑制剂、IL-2、IL-15等)的治疗，进一步增强输注的NK细胞的体内功能(详情参见，例如，Childs等人的美国专利申请US20090104170)。
已经观察到自身免疫患者中NK细胞的数量和功能减少，这表明NK细胞疗法在多种自身免疫性疾病和病症中的可能性(参见，Schleinitz等人，免疫学(Immunology)，2010；131:451-58，以及French和Yokohama，Arthrit Res Ther 2004；6:8-14)。因此，在本发明另一实施方式中，提供了一种治疗需要其的对象的自身免疫性疾病或病症的方法。根据本发明该方面的方法通过向所述对象施用治疗量的本发明NK细胞群来实现。
可以通过本发明的方法能够治疗的自身免疫性疾病，包括但不限于，心血管疾病、类风湿疾病、腺体疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、肌肉疾病、肾脏疾病、与生殖相关的疾病、结缔组织疾病和全身性疾病。
自身免疫性心血管疾病的例子包括，但不限于，动脉粥样硬化、心肌梗塞(myocardial infarction)、血栓形成(thrombosis)、韦格纳氏肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、多发性大动脉炎(Takayasu’s arteritis)、川崎综合症(Kawasakisyndrome)、抗因子VIII自身免疫性疾病(anti-factor VIII autoimmune disease)、坏死性小血管炎(necrotizing small vessel vasculitis)、显微镜下多血管炎(microscopicpolyangiitis)、查格-施特劳斯综合征(Churg and Strauss syndrome)、寡免疫局灶性坏死和新月体性肾小球肾炎(pauci-immune focal necrotizing and crescenticglomerulonephritis)、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome)、抗体诱发的心脏衰竭(antibody-induced heart failure)、血小板减少性紫癜(thrombocytopenicpurpura)、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)、恰加斯病中的心脏自身免疫性疾病(cardiac autoimmunity in Chagas’disease)和抗辅助性T淋巴细胞自身免疫性疾病。
自身免疫性类风湿病的示例包括但不限于类风湿关节炎和强直性脊柱炎。
自身免疫性腺体疾病的示例包括但不限于，胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎(spontaneous autoimmunethyroiditis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、特发性粘液性水肿(idiopathic myxedema)、卵巢自身免疫性疾病(ovarian autoimmunity)、自身免疫性抗精子不育症(autoimmune anti-sperm infertility)、自身免疫性前列腺炎(autoimmuneprostatitis)和I型自身免疫性多腺体综合征(Type I autoimmune polyglandularsyndrome)。这些疾病包括，但不仅限于，胰腺的自身免疫性疾病、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、特发性粘液性水肿、卵巢自身免疫性疾病、自身免疫性抗精子不育症、自身免疫性前列腺炎和Ⅰ型自身免疫性多腺体综合征。
自身免疫性胃肠疾病(autoimmune cutaneous disease)的示例包括但不限于，慢性炎性肠道疾病(chronic inflammatory intestinal disease)、腹腔疾病(celiacdisease)，结肠炎(colitis)，回肠炎(ileitis)和克罗恩病(Crohn’s disease)。
自身免疫性皮肤疾病(autoimmune hepatic disease)的示例，包括但不限于，自身免疫性大疱性皮肤病(autoimmune bullous skin disease)，例如但不限于，寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)和落叶型天疱疮(pemphigus foliaceus)。
自身免疫性肝病的示例，包括但不限于，肝炎、自身免疫性慢性活性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎。
自身免疫性神经系统疾病的示例，包括但不限于，多发性硬化症、阿尔茨海默氏症、重症肌无力、神经病、运动神经病变(motor neuropathies)；格林-巴利综合征和自身免疫性神经病、重症肌无力、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenicsyndrome)；副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩症、副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合征；非副肿瘤性僵人综合征、渐进性小脑萎缩、脑炎、拉斯穆森脑炎(Rasmussen’s encephalitis)、肌萎缩性侧索硬化症、西登哈姆舞蹈病(Sydeham chorea)、抽动秽语综合征(Gilles de laTourette syndrome)和自身免疫性内分泌腺病综合征(autoimmunepolyendocrinopathies)；免疫异常神经病(dysimmune neuropathies)；获得性神经性肌强直、先天性多发性关节挛缩症、神经炎、视神经炎和神经退行性疾病。
自身免疫性肌肉疾病的示例，包括但不限于，肌炎、自身免疫性肌炎和原发性干燥综合征和平滑肌自身免疫性疾病。
自身免疫性肾脏疾病的示例，包括但不限于，肾炎和自身免疫性间质性肾炎。
与生殖相关的自身免疫性疾病的示例，包括但不限于，反复流产(repeated fetalloss)。
自身免疫性结缔组织病的示例，包括但不限于，耳疾、自身免疫性耳疾病和内耳的自身免疫性疾病。
自身免疫系统性疾病(autoimmune systemic disease)的示例，包括但不限于，全身性红斑狼疮和全身性硬化症。
在本发明另一实施方式中，提供了一种抑制需要其的对象的病毒性感染的方法。根据本发明这方面的方法通过以下方式实现：(a)如本文所述，用NK细胞生长因子、CD3+饲养细胞和有效浓度的烟酰胺离体培养NK细胞群，其中与用不含所述浓度烟酰胺的生长因子培养的所述细胞群相比，所述有效浓度的烟酰胺增强了NK细胞的增殖；以及(b)向所述对象施用治疗有效量的所述培养的NK细胞。适合采用本发明NK细胞或NK细胞组合物治疗的病毒性感染，包括但不限于，HIV、淋巴脉络膜脑膜炎病毒(lymphatic choriomenengitisvirus，LCMV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、牛痘病毒、流感和副流感病毒、肝炎(包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、非-A非-B型等)、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、泰累尔氏病毒(Theiler's virus)和HSV-1。适合采用本发明NK细胞或NK细胞制剂治疗的其它传染病，包括但不限于，寄生虫感染，如疟原虫、利什曼虫和弓形虫感染；以及细菌感染，如分枝杆菌和李斯特氏杆菌(关于NK细胞在治疗病毒、细菌和原生动物疾病的综述，参见Zucchini等人，Exp Rev Anti-Infect Ther 2008；6:867-85，其通过引用并入本文作为参考)。
在一些实施方式中，本发明的方法和组合物和试剂盒可用于治疗所有年龄组的对象。在具体实施方式中，所述对象或患者大于18岁且小于70岁。
在一些实施方式中，有需要的对象可以患有多发性骨髓瘤。在进一步的实施方式中，多发性骨髓瘤(MM)的特征是以下标准中的至少一个：(a)首次自体干细胞移植后2至18个月内复发的疾病，(b)在异体干细胞移植后至少4个月内复发的疾病，无活性移植物抗宿主病(GVHD)的证据，(c)在至少两种疗法(包括蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物(IMiD))后的复发/难治性疾病，(d)血清IgG、IgA、IgM或IgD骨髓瘤蛋白(M-蛋白)大于或等于0.5g/dL；以及(e)尿液M-蛋白大于或等于200mg/24次采集。在一些实施方式中，所述多发性骨髓瘤的特征还有：血清IgE骨髓瘤蛋白(M-蛋白)大于或等于0.5g/dL，并且在用本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分进行细胞疗法治疗之前不少于4周已经进行了血浆除去法。在一些实施方式中，有需要的对象患有以一种以上本文所述标准的特征的多发性骨髓瘤。
有需要的对象可以患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些实施方式中，非霍奇金淋巴瘤是CD20阳性B细胞NHL，通过流式细胞术或免疫组织化学证实CD20表达。在进一步的实施方式中，NHL的特征是以下特征中的至少一个：(a)常规疗法失败的复发/难治性疾病，(b)在自体干细胞移植后至少60天有复发的疾病，(c)同种异体干细胞移植后至少4个月复发的疾病，且没有活性移植物抗宿主疾病的证据，(d)接受至少2种类型的现有疗法(priortherapy)，至少一种是化疗，至少一种含有抗CD20单克隆抗体，(e)根据卢加诺反应标准(Lugano response criteria)定义的可测量疾病(对于脾肿大，脾脏的垂直长度)大于13厘米；对于可测量的淋巴结病，淋巴结长轴直径大于1.5厘米(一维测量)。
在一些实施方式中，有需要的对象患有以一种以上本文所述标准的特征的NHL。在具体实施方式中，对象或患者患有具有如下特征的NHL：
·(a)常规疗法失败的复发/难治性疾病；
·(b)接受过至少2种既往治疗(其中至少一种含有化疗，且至少一种含有抗CD20单克隆抗体)；
·(c)如根据卢加诺反应标准定义的可测量疾病(Cheson等人2014，J.ClinOncol32(27):3059-3067)；
·(d)对于转化为HGBCL的FL，在转化为HGBCL后必须接受至少一种疗法。
在一些实施方式中，还可以根据以下标准进一步定义有需要的对象：卡诺夫斯基(Karnofsky)的表现评分(performance score)为至少60％，并且适当的器官功能定义为：a.心脏功能：通过超声心动图、辐射性核素扫描或心脏MRI检查左心室射血分数(Leftventricular ejection fraction(LVEF))≥40％；b.肺功能：室内空气的氧饱和度至少为90％，肺功能测试表明FVC和FEV1≥50％的预测年龄和cDLCO>预测的50％；c.肾功能：肌酐清除率测试(通过Cockcroft-Gault方程)≥40mL/min或肌酐<1.5mg/dL，d.肝功能：肝总胆红素<1.5倍机构正常范围上限，肝转氨酶(ALT和AST)<3倍机构正常范围上限；e.血液学：总白血液细胞(WBC)计数≥3000/μL，绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1000/μL，血小板计数≥75,000/μL和血红蛋白≥8.0g/dL(如果异常是由与疾病相关的骨髓涉及所引起，则可以免除)，以及f.钙(仅适用于多发性骨髓瘤患者)：入组治疗前2周内校正钙<11.5mg/dL。
在一些实施方式中，符合条件的对象应该能够在细胞输注之前至少3天停用泼尼松(prednisone)或其他免疫抑制药物(不包括治疗前的准备方案)。可能要求有生育能力的性活跃女性和有生育能力伴侣的男性同意在治疗期间和治疗结束后4个月内使用有效的避孕措施。
在一些实施方式中，可以将对象排除在以下任何一种治疗之外：
1.高滴度的供体特异性抗HLA抗体(MFI>1000)；
2.主动的、未经治疗的中枢神经系统受累(CNS involvement)；
3.慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，或高级别淋巴瘤(伯基特淋巴瘤/淋巴母细胞淋巴瘤((Burkittt’slymphoma/Lymphoblastic lymphoma))；
4.怀孕或哺乳；
5.QT/QTc间期基线显著延长(例如，证明QTc间隔大于500毫秒)；
6.II类或更高级别的纽约心脏病协会功能分类标准(附录III)或可能增加细胞因子治疗的心脏并发症风险的严重心律失常(例如，室性心动过速、频繁的室性心律失常或需要慢性治疗的室上性快速性心律失常)；
7.需要免疫抑制疗法的活动性自身免疫性疾病；
8.目前正在接受慢性药物治疗的严重哮喘病史(仅需吸入类固醇的轻度哮喘病史符合条件)；
9.筛查胸部X光或胸部CT扫描时出现新的或进行性肺部浸润[除非经肺科专家批准进行研究。经过1周的适当治疗(假定或记录的真菌感染4周)，感染引起的浸润必须稳定/改善(伴随相关的临床改善)]；
10.活性不受控制的细菌、真菌或病毒感染--所有先前的感染必须在最佳治疗后得到解决；
11.已知对本发明方法中使用的任何治疗剂过敏；
12.在开始NK细胞级分治疗前14天内接受研究药物治疗。
在一些实施方式中，根据以下标准选择NK细胞供体(例如，用于单采的候选者)：
1.12至70岁，应优先考虑年龄(<35岁)，然后进行HLA匹配(单倍相合，如果没有，则完全配错的供体)；
3.至少40公斤体重；
4.由评估医疗提供者确定的总体健康状况良好；
5.适当的器官功能定义为：血液学：血红蛋白、WBC、血小板在正常测试范围上下限的10％以内(基于性别的血红蛋白)，肝脏：ALT<2倍正常范围的上限，肾脏：血清肌酐<1.8mg/dL；
6.完成供体传染病筛查小组，包括CMV抗体、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗体、丙型肝炎抗体、HIV PCR、HIV1/2抗体、HTLVA1/2抗体、快速血浆(RPR)密螺旋体、克氏锥虫(Trypanosoma Cruzi，T.Cruzi)、HIV(经NAT)和WNV(西尼罗河病毒(West Nile Virus))或根据当前小组--必须对HIV和活性乙型肝炎呈阴性；
7、未怀孕--具有生育能力的女性必须在单采后7天内进行妊娠试验呈阴性；
8.能够并愿意接受单采术；
9.自愿书面同意(如果供体<18岁，则使用同意书)。
在一些实施方式中，有需要对象接受淋巴清除预备方案。在具体实施方式中，在移植或施用本发明的组合物之前，对象接受淋巴清除预备方案。该方案可包括环磷酰胺、氟达拉滨或其他化疗和/或免疫抑制疗法。
组合疗法
在一些实施方式中，使用本文描述的所述扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分结合另外的癌症疗法来治疗有需要的对象。在一些实施方式中，另外的癌症疗法包括细胞毒性剂(cytotoxic agent)和/或非细胞毒性剂。“细胞毒性剂”是指抑制或防止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括辐射性同位素(例如131I、125I、90Y和186Re)、化疗试剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或合成毒素或其片段。非细胞毒性剂是指不抑制或阻止细胞功能和/或不引起细胞破坏的物质。“非细胞毒性剂”可包括可被激活为具有细胞毒性的药剂。非细胞毒性剂可以包括珠、脂质体、基质或颗粒(参见，例如，美国专利公开US2003/0028071和US2003/0032995，其通过引用并入本文)。此类药剂可以与本文所述的扩增的CD3-耗尽NK细胞级分组合物相结合、耦合、连接或关联。
在一些实施方式中，常规癌症药物与本文所述的组合物一起施用。在一些情况下，用本文所述的解冻的、冷冻保存的扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分与一种或多种针对靶癌细胞的其它药剂联合治疗有需要的对象。非常合适的药剂包括那些促进癌细胞中DNA损伤(例如细胞DNA双链断裂)的药物。可以使用本领域技术人员已知的任何形式的DNA损伤剂。DNA损伤通常是由辐射疗法和/或化学疗法造成的。DNA损伤剂也称为基因毒性剂。如本文所用，“与……结合”是指在施用一种或多种另外的疗法之前或之后，将扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分与一或多种其他疗法同时(同时或分别但接近地)施用于对象。
辐射疗法的示例包括但不限于外部辐射疗法和内部辐射疗法(也称为近距离辐射疗法)。外部辐射疗法的能量源包括：X射线、伽马射线和粒子束、内部辐射使用的能量源包括辐射性碘(碘125或碘131)、锶89或磷、钯、铯、铟、磷酸盐或钴的辐射性同位素。施用辐射疗法的方法是本领域技术人员众所周知的。
可能特别有用的DNA损伤化疗剂(DNA-damaging chemotherapeutic agent)的示例，包括但不限于：白消安(Myleran)、卡铂(Paraplatin)、卡莫斯丁(Carmustme，BCNU)、氯丁酸氮芥(Chlorambucil，Leukeran)、顺铂(Cisplatin，Platmol)、环磷酰胺(Cyclophosphamide，Cytoxan，Neosar)、达卡巴嗪(Dacarbazme(DTIC-Dome))、异环磷酰胺(Ifosfamide，Ifex)、洛莫司汀(Lomustme，CCNU)、二氯甲二乙胺(Mechlorethamme，氮芥，Mustargen)、美法仑(Melphalan，Alkeran)和甲基苄肼(Procarbazine，Matulane)。
许多其他化疗药剂也可以单独或组合地用于本文所述的方法。这些包括：甲氨蝶呤(methotrexate)、长春新碱(vincristine)、阿霉素、顺铂、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、葡甲胺GLA(Meglamine GLA)、戊柔比星(valrubicin)、卡莫司坦(carmustaine)和泊利沙坦(poliferposan)、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂(RAS farnesyltransferase inhibitor)、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美特索(Lometexol)、格拉莫莱克(Glamolec)、CI-994、TNP-470、海康汀/拓扑替康(Hycamtin/Topotecan)、PKC412、瓦尔斯波达尔(Valspodar)/PSC833、诺凡酮/米托蒽醌(Novantrone/Mitroxantrone)、梅塔雷/苏拉明(Metaret/Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA2516/马米司他(Marmistat)、BB2516/马米司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、吡巴尼(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星、梅斯特朗(Metastron)/锶衍生物、特莫代尔(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、阿霉素脂质体(Evacet)/脂质体多柔比星、紫杉醇(Yewtaxan/Paclitaxel)、紫杉醇(Taxol/Paclitaxel)、截瘤达(Xeload/Capecitabine)、氟铁龙/去氧氟尿苷(Furtulon/Doxifluridine)、Cyclopax/口服紫杉醇(oral paclitaxel)、口服紫杉醇(Oral Taxoid)、SPU-077/顺铂(Cisplatin)、HMR 1275/氟哌啶醇(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT[替加氟/尿嘧啶(Tegafur/Uracil)]、麦角咪唑/左旋咪唑(Ergamisol/Levamisole)、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强剂、坎普托/左旋咪唑(Campto/Levamisole)、坎普托沙/伊立替康(Camptosar/Irinotecan)、图莫得斯/雷力崔斯(Tumodex/Ralitrex)、亮司他汀/克拉屈滨(Leustatin/Cladribine)、帕克斯/紫杉醇(Paxex/Paclitaxel)、多西尔/阿霉素脂质体(Doxil/liposomal doxorubicin)、凯利克斯/阿霉素脂质体(Caelyx/liposomal doxorubicin)、氟达拉(Fludara)/氟达拉滨、药红霉素/表柔比星(Pharmarubicin/Epirubicin)、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/双萘二甲酰亚胺(Bis-Naphtalimide)、LU 103793/Dolastain、Caetyx/脂质体多柔比星(liposomaldoxorubicin)、健择/吉西他滨(Gemzar/Gemcitabine)、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘种子、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/右磷酰胺(Dexifosamide)、异环磷酰胺(Ifes/Mesnex/Ifosamide)、Vumon/替尼泊苷(Vumon/Teniposide)、对铂/卡铂(Paraplatin/Carboplatin)、植物醇/顺铂(Plantinol/cisplatin)、Vepeside/依托泊苷(Etoposide)、ZD9331、泰素帝/多西他赛(Taxotere/Docetaxel)、鸟嘌呤阿糖苷前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲类、烷化剂(如马法兰(melphalan)和环磷酰胺)、氨基谷乙酰亚胺(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、白消安(Busulfan)、卡铂(Carboplatin)、氯霉素(Chlorombucil)、顺铂、盐酸阿糖胞苷(Cytarabine HCl)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin HCl)、磷酸钠达霉素(Estramustine phosphate sodium)、依托泊苷[Etoposide(VP16-213)]、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶[Fluorouracil(5-FU)]、氟他胺(Flutamide)、羟基脲(羟基脲)[Hydroxyurea(hydroxycarbamide)]、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林[Leuprolide acetate(LHRH释放因子类似物)]、洛莫司汀[Lomustine(CCNU)]、盐酸甲氯乙胺[Mechlorethamine HCl(氮芥)]、巯嘌呤(Mercaptopurine)、美司纳(Mesna)、米托坦[Mitotane(o.p'-DDD)]、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone HCl)、奥曲肽(Octreotide)、普卡霉素(Plicamycin)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine HCl)、链脲佐菌素(Streptozocin)、他莫昔芬柠檬酸盐(Tamoxifencitrate)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、硫替哌(Thiotepa)、硫酸长春碱(Vinblastinesulfate)、安吖啶(Amsacrine(m-AMSA))、阿扎胞苷(Azacitidine)、促红细胞生成素(Erthropoietin)、六甲基三聚氰胺[Hexamethylmelamine(HMM)]、白介素2、米托瓜松[Mitoguazone(methyl-GAG；methyl glyoxal bis-guanylhydrazone；MGBG)]、喷司他丁[Pentostatin(2'deoxycoformycin)]、司莫司汀[Semustine(methyl-CCNU)]、替尼泊苷[Teniposide(VM-26)]和硫酸长春地辛(Vindesine sulfate)，但不限于此。
此外，以下药剂也可用于本发明：烷化剂(例如卡铂和顺铂)、氮芥烷化剂、亚硝基脲烷化剂(例如卡莫司汀[carmustine(BCNU)])、抗代谢药(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、亚叶酸(folinic acid))、嘌呤类似物抗代谢药(purine analog antimetabolites)、巯嘌呤(mercaptopurine)、嘧啶类似物抗代谢物(如氟尿嘧啶[fluorouracil(5-FU)]和吉西他滨(gemcitabine)、激素类抗肿瘤药(如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)和他莫昔芬(tamoxifen))、天然抗肿瘤药(如阿地白介素(aldesleukin)、白介素-2、多西紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷[etoposide(VP-16)]、干扰素α、紫杉醇[paclitaxel/>]和维甲酸[tretinoin(ATRA)])、抗生素天然抗肿瘤药(例如博来霉素(bleomycin)、达克霉素(dactmomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素)，和丝裂霉素(mitomycins，包括丝裂霉素C)，以及天然长春碱生物碱(如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、羟基脲(hydroxyurea)、丙酮、阿霉素(adriamycin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、依西他滨(enocitabine)、表硫醇(epitiostanol)、阿柔比星(aclarubicin)、安西他滨(ancitabine)、尼莫司汀(nimustine)、盐酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)、卡波醌(carboquone)、卡铂(carboplatin)、卡莫氟(carmofur)、色霉素A3(chromomycinA3))、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺(cyclophosphamide/>)、环磷酰胺裂叶多糖(Schizophyllan)、阿糖胞苷(阿糖胞苷)[cytarabine(cytosinearabinoside)]、达卡巴肼(dacarbazine)、硫莫辛(thiomosine)、噻替哌(thiotepa)、替加氟(tegafur)、多拉司他汀(dolastatins)、阿糖胞苷类似物如耳他汀(auristatin)、CPT-11[伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitozantrone)、长春瑞滨(vinorelbine)、替尼泊苷(teniposide)、氨基蝶呤(aminopterin)、卡霉素(carbomycin)、埃斯霉素[esperamicins(参见，例如，美国专利US4,675,187，通过引用并入本文)]、新制癌素(neocarzinostatin)、OK 432、博来霉素(bleomycin)、呋土隆(furtulon)、溴舒定(broxundine)、白消安、二磷酸已烯雌酚四钠(honvan)、培普霉素(peplomycin)、贝他汀[bestatin/>]、干扰素-0、美匹司坦(mepitiostane)、米托溴索(mitobromtol)、马法兰(melphalan)、香豆素肽(laminin peptides)、香菇多糖(lentinan)、云芝提取物(Coriolus versicolor extract)、替加氟/尿嘧啶(tegafur/uracil)、雌莫司汀(雌激素/甲氯乙胺)[estramustine(estrogen/mechlorethamine)]、沙利度胺(thalidomide)和来那度胺[lenalidomide]。
其他合适的化疗包括蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体抑制剂会阻障蛋白酶体的作用、降解蛋白质的细胞复合物的作用，尤其是那些参与细胞维持、生长、分裂和细胞死亡的短寿命蛋白质。蛋白酶体抑制剂的示例包括：硼替佐米[bortezomibbortomib]、乳胞素[lactacystin(AG Scientific,Inc,San Diego,CA)]、MG132(Biomol International,Pmouth Meeting,PA)PS-519、埃坡霉素(eponemycin)、环氧酶素(epoxomicin)、阿克拉霉素A(aclacinomycin A)、二肽苯甲酰胺(dipeptide benzamide)、CVT-617和乙烯基砜三肽蛋白酶体抑制剂。
在一些实施方式中，本文描述的方法与一或多种其他癌症治疗联合使用，包括癌症免疫疗法。癌症免疫疗法是利用免疫系统来排斥癌症。主要前提是刺激对象的免疫系统攻击导致疾病的肿瘤细胞。这可以通过对对象进行免疫化来实现，在这种情况下，对象自身的免疫系统被赋予将肿瘤细胞识别为要被破坏的靶标，或者通过施用治疗剂，例如抗体，作为药物，在这种情况下，对象的免疫系统被治疗剂招募来破坏肿瘤细胞。癌症免疫疗法包括基于抗体的疗法和基于细胞因子的疗法。
基于细胞因子的癌症疗法利用一种或多种细胞因子来调节对象的免疫反应。可用于癌症治疗的细胞因子的非限制性示例包括干扰素-α(IFN-α)、白介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)]和白介素-12(IL-12)。
为了促进肿瘤靶向和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在一些实施方式中，可以将疾病特异性单克隆抗体与本文所述的扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分联合(例如，在扩增之前、同时或之后)施用给有需要的对象。
下表5中提供了适合与本发明的方法和扩增的CD3-耗尽的NK细胞级分和组合物一起使用的单克隆抗体、它们的癌细胞靶标和目前指明用于它们的一些特定疾病的非限制性列表
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为了促进肿瘤靶向和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在一些实施方式中，可以将疾病特异性单克隆抗体施用给有需要的对象。其中血液恶性肿瘤是NHL，将一种或多种NHL特异性单克隆抗体(例如利妥昔单抗)施用给需要其的对象。用于本发明方法的利妥昔单抗的示例性剂量是375mg/m2对象(患者)。在具体实施方式中，疾病特异性单克隆抗体治疗包括以三种剂量施用单克隆抗体：施用(输注，移植)NK细胞级分之前10天施用第一剂量，施用(输注，移植)NK细胞级分之前3天施用第二剂量，施用(输注，移植)NK细胞级分之后11天施用第三剂量和最终剂量，并且在一些实施方式中，施用(输注，移植)最终的(第二)NK细胞级分之后约1周施用最终剂量。在一些实施方式中，疾病特异性单克隆抗体在施用第一剂量前9至11天，施用第一剂量前3天，以及在施用第一剂量后12至16天，施用同种异体的、解冻的冷冻保存的扩增的CD3-耗尽的细胞级分的第一剂量。
遵循单克隆抗体施用的输注、监测反应和毒性的标准指南。在开始输注之前，埃罗妥珠单抗通常与包括地塞米松、H1阻断剂(如苯海拉明)、H2阻断剂(如雷尼替丁)和对乙酰氨基酚在内的术前用药方案一起施用。
在一些实施方式中，有需要的对象在施用(输注、移植)本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分之前接受免疫抑制疗法的制备方案。合适的免疫抑制剂包括但不限于烷化剂、嘌呤类似物、抗代谢物等。一些免疫抑制剂也被认为是化学治疗免疫抑制剂。在具体实施方式中，免疫抑制疗法包括施用环磷酰胺和氟达拉滨。用于本发明方法的环磷酰胺的示例性剂量是400mg/m2对象(患者)，用于本发明方法的氟达拉滨的示例性剂量是25mg/m2对象(患者)。在具体实施方式中，在施用(移植，输注)本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分之前5天施用(通过IV)环磷酰胺，并且在施用(移植，输注)本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分之前第5、4、3天的每一天施用(IV)氟达拉滨。或者，可以调节氟达拉滨和环磷酰胺的施用，使得在开始施用细胞级分前2或3天完成最终剂量(最后一剂)的免疫抑制剂。
根据本发明的方法，在一些实施方式中，将本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分以单剂量或多剂量施用给需要其的对象。在具体实施方式中，施用本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分包括施用单剂量的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分。如本文所用，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的“单剂量”是指在单次治疗访视(single treatment visit)期间施用，并且应当理解的是，“单剂量”可以包括，输注多个解冻并稀释的、冷冻保存的扩增的CD3-耗尽的细胞冷冻保存袋的内容物，这取决于每个袋中细胞的数量(即CD56+/CD3-)并根据每个患者/对象的个体参数(体重，表面积)。
在一些实施方式中，用于施用给对象(患者)的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的总剂量包括：每千克对象1×107/细胞至每千克对象5×108/细胞，每千克对象2×107/细胞至每千克对象2×108个/细胞，每千克对象5×107/细胞至2×108/细胞，或每千克对象的2×107至5×107/细胞的扩增的同种异体解冻的NK细胞。在一些实施方式中，用于施用给对象(患者)的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的总剂量包括：每kg对象1×107、5×107、1×108或2×108扩增的同种异体解冻的NK细胞。在具体实施方式中，用于施用给对象(患者)的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的总剂量包括，每kg对象2×108扩增的同种异体解冻的冷冻保存的NK细胞。
在一些实施方式中，本发明的同种异体解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分以第一剂量和第二剂量提供(例如在两次单独的治疗访视中，两次剂量之间至少间隔12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、1周、2周或更长)。
在一些实施方式中，组合的所述第一和所述第二剂量包括：每千克对象1×107/细胞至每千克对象5×108/细胞，每千克对象2×107/细胞至每千克对象2×108/细胞，每千克对象5×107/细胞至2×108/细胞，或每千克对象2×107/细胞至5×107/细胞的扩增的同种异体解冻的NK细胞。在一些实施方式中，用于施用给对象(患者)的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的组合的第一和第二剂量包括：每kg对象1×107、5×107、1×108或2×108扩增的同种异体解冻的NK细胞。在具体实施方式中，用于施用给对象(患者)的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的组合的第一和第二剂量包括每kg对象2×108扩增的同种异体解冻的冷冻保存的NK细胞。
本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的施用可以作为住院患者或门诊患者手术进行。本文所述的CD3-耗尽的NK细胞级分的施用是通过输注进行的，并且在具体实施方式中，在冷冻保存CD3-耗尽的细胞级分解冻和稀释后1小时内且不迟于解冻并稀释的扩增的CD3-耗尽的细胞级分的最终产物释放后4小时内，将解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分输注到对象(患者)体内。在具体实施方式中，本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分在施用前保持在室温下，并且在使用前不冷藏。
因此，在一些实施方式中，在准备移植后不超过1小时并且在解冻并稀释的细胞级分的最终产物释放后不超过4小时，将解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分输注给对象。在一些实施方式中，将解冻并稀释的扩增的CD3-耗尽的同种异体细胞级分通过静脉内输注(无需过滤器或泵)施用给对象，每次输注的持续时间不少于15分钟并且不超过60分钟。在具体实施方式中，以不大于10cc/kg患者体重/hr的速率施用细胞级分。
在一些实施方式中，将解冻并稀释的扩增的CD3-耗尽的同种异体细胞级分通过静脉内输注(无需泵，需要过滤器)施用给对象，每次输注的持续时间持续不少于15分钟并且不超过60分钟。在具体实施方式中，以不大于10cc/kg患者体重/hr的速率施用细胞级分。
在一些实施方式中，有需要的对象在施用解冻并稀释的细胞级分后接受白介素2(IL-2)的支持方案。
在一些实施方式中，在施用本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分的当天，2天后和后4天，以6MU的剂量(对于体重<45千克的患者，IL-2剂量为3MU/m2)皮下(SC)施用IL-2。在一些实施方式中，在细胞输注当天，在解冻并稀释的本发明的CD3-耗尽的细胞级分后4小时内施用IL-2。在一些实施方式中，前两剂IL-2作为细胞输注住院治疗的一部分施用。第三剂IL-2可以在门诊患者的情况下施用。因此，在具体实施方式中，IL-2施用包括，在输注扩增的CD3-耗尽的NK细胞后施用6×106单位IL-2：
(i)在输注本发明的所述解冻并稀释的扩增的同种异体CD3-耗尽的细胞级分的当天
(ii)在输注所述解冻并稀释的扩增的同种异体CD3-耗尽的细胞后两天，
(iii)在输注所述解冻并稀释的扩增的同种异体CD3-耗尽的细胞后4天。
为了降低发热和寒冷的强度，建议在每次服用IL-2之前和之后4小时预先服用对乙酰氨基酚/扑热息痛500mg至1000mg和苯海拉明25mg至50mg。
此外，如果患者经历了3级毒性，并且毒性在48小时内消退为2级或更好，则可以以减少的剂量(例如，每平方米2至4百万单位)恢复IL-2。如果病情恶化，应停用IL-2。如果患者在第一或第二剂时出现了2级或或更高级别的IL-2输注相关毒性，则IL-2的剂量可以保持长达48小时。如果毒性在48小时内消退为1级或更好，则可以施用所有计划的IL-2的剂量；然而，剩余剂量的施用至少间隔24小时。
在一些实施方式中，对象可以接受以下的任何或全部：输注支持(例如苯海拉明或右氯苯那敏、氢化可的松和对乙酰氨基酚)、支持性细胞因子(例如G-CSF)、所需的血液产品、抗病毒药、抗菌药、PCP和/或真菌预防药、CMV、EBV和HHV6监测药和所需的IV免疫球蛋白。
在一些实施方式中，对象接受血液疾病的任何或所有其他治疗。所述治疗可以是选自免疫抑制治疗、化疗和放疗的治疗。
因此，在一些实施方式中，提供了一种治疗有需要的对象的血液疾病的方法，该方法包括：
(i)获得包含与对象同种异体的NK细胞和CD3+细胞的单采产物；
(ii)将单采产物分离成CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；
(iii)通过辐射灭活所述CD3+细胞级分的细胞；
(iv)在允许细胞增殖的条件下，离体培养所述CD3-耗尽的细胞级分与灭活的、经辐射的CD3+细胞级分，其中所述条件包括：提供介于1.0mM至10mM之间的量的营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺；
(v)在步骤(d)之后6至10天，用新鲜的营养物、血清、IL-15和烟酰胺补充所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，以产生扩增的CD3-耗尽的细胞级分；
(vi)在步骤(d)之后14至16天，收获所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；和
(vii)洗涤并浓缩步骤(vi)的所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，
(viii)将(vii)的经洗涤和浓缩的细胞悬浮于不含DMSO的冷冻保存缓冲液中；
(ix)将DMSO添加至10％v/v；
(x)将细胞的温度降低至-120℃；
(xi)在<-120℃下储存冷冻保存的细胞；
由此产生冷冻保存的扩增的CD3-耗尽的细胞级分；
(xii)在37℃水浴中解冻(xi)的冷冻保存的细胞级分；
(xiii)用输注溶液稀释(xii)的解冻的细胞级分；
由此产生用于移植的解冻并稀释的冷冻保存的NK细胞级分；
(xiv)向对象施用抗癌单克隆抗体；
(xv)向对象施用至少一种免疫抑制剂；
(xvi)将解冻并稀释的冷冻保存的NK细胞级分(xiii)施用给需要其的对象；和
(xix)向对象施用IL-2,
从而治疗对象的血液疾病。
在一些具体实施方式中，在移植(施用、输注)本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分之前，在细胞移植当天对有需要的对象进行安全性评估，通常包括体格检查、CBC、血液化学(例如，至少血清肌酸酐、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和镁)、生命体征(体重、温度、血压、脉搏和呼吸频率)，以及伴随药物的施用，包括RBC和血小板输注。
将本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分输注给需要其的对象中，通常通过经由患者的中心静脉导管输注来完成，这受到个体部位实践的限制。
本发明的血液疾病的治疗方法可用于治疗血液恶性肿瘤，包括但不限于MM和NHL。如本文所用，术语“治疗血液疾病”或“治疗血液恶性肿瘤”是指减轻血液疾病的症状或体征。在一些实施方式中，根据但不排他地根据随时间推移症状的减轻、临床参数的改善、住院治疗的减少，以及复发或死亡风险的降低来评估血液疾病或血液恶性肿瘤的治疗。
在一些实施方式中，与未根据本文所述的方法培养和/或施用的NK细胞的输注相比，输注本文所述的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分，增加了输注的NK细胞在体内成功扩增的可能性。在一些实施方式中，在输注后第7天和第14天测量体内扩增的成功。
在其它实施方式中，与未根据本文所述的方法培养和/或施用的NK细胞的输注相比，输注本文所述的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分，增加了对象外周血中NK细胞的功能。在一些实施方式中，在输注后第7天和第14天测量NK细胞功能。
根据本发明方法的一些实施方式，与未根据本文所述方法培养和/或施用的NK细胞的输注相比，输注本文所述的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分，增加了输注NK细胞级分后的有利疾病应答的可能性。在一些实施方式中，在输注后第28天和一年测量NK细胞功能。在具体实施方式中，血液恶性肿瘤是NHL，并且根据NHL的卢加诺或国际工作组响应标准评估NHL的疾病反应标准(详情参见，Cheson等人，J Clin Oncol 2014；32:3059-68)。
在一些实施方式中，本发明的制品、组合物或试剂盒还包含用于将适于移植的扩增的NK细胞级分施用给需要其的对象的说明书。
在本发明的制品、组合物或试剂盒的一些实施方式中，适于移植到有需要的对象中的本发明的解冻并稀释的CD3-耗尽的细胞级分包含，至少7×108个总存活NK细胞。在一些实施方式中，适于移植到有需要的对象中的解冻并稀释的扩增细胞级分包含：至少8×108总存活NK细胞、至少10×108总存活NK细胞、至少15×108总存活NK细胞、至少20×108总存活NK细胞、至少25×108总存活NK细胞、至少40×108总存活NK细胞。至少50×108总存活NK细胞，至少60×108总存活NK细胞，至少80×108总存活NK细胞，或至少100×108总存活NK细胞。在一些实施方式中，组合物的每个冷冻保存袋包含40×108至60×108总存活NK细胞。在具体实施方式中，每个冷冻保存袋包含50×108总存活NK细胞。在一些实施方式中，组合物、制品或试剂盒包含最多4个冷冻保存袋，每个冷冻保存袋具有至少50×108总存活NK细胞。
本发明的所选细胞群本身可以与含有其的培养基一起提供，从培养基中分离，并且与药学上可接受的载体以及可以促进细胞移植和/或器官功能的另外的试剂(例如免疫抑制剂、抗生素、生长因子)组合。因此，本发明的细胞群可以在药学上可接受的载体或稀释剂中施用，例如无菌盐水和水性缓冲溶液。这种载体和稀释剂的使用是本领域是众所周知的。
如果需要，本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒或制品，其可以含有一种或多种含有活性成分(例如细胞)的单位剂型。该包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有给药说明书。包装或分配器装置还可以附有由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了该机构对用于人或兽医给药的组合物形式的批准。例如，此类通知可能包括美国食品和药品监督管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。还可以制备包含在药学上可接受的载体中配制的本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并贴上用于治疗适应症的标签，如上文进一步详述的。
根据本发明的方法制备的细胞可以本身给药于对象，或者以与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物的形式给药于对象。
如本文所用，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学成分(例如生理学上合适的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
下文中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语中包括佐剂。
本文中，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。可以在在最新版本的“雷明登氏药学全书(Remington's PharmaceuticalSciences)”(麦克出版公司(Mack Publishing Co.)Easton,PA，最新版)中找到药物的配制和给药技术，其通过引用并入本文。
因此，根据本发明的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包含赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可药用的制剂。合适的制剂取决于所选的给药途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液中配制，例如汉克氏液(Hank’s solution)、林格氏液(Ringer’s solution)或生理盐缓冲液。
适用于本发明上下文的药物组合物包括其中活性成分的含量能有效达到预期目的的组合物。更具体地，“治疗有效量”是指有效预防、减轻或改善病症(例如白血病、多发性骨髓瘤)的症状或延长接受治疗的对象的存活的活性成分(例如扩增的CD3-耗尽的NK细胞)的量。
本领域技术人员完全有能力确定治疗有效量，特别是根据本文提供的详细公开内容。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究获得的数据可用于配制一系列用于人的剂量范围。剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。鉴于患者状况，各个医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量(例如参见Fingl等人所著，1975，“治疗药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”，Ch.1p.1)。
根据待治疗疾病的严重性和响应性，给药可以是单次或多次给药。当然，组合物的给药量将取决于被治疗的对象、疾病的严重程度、给药方式、处方医生的判断等。
如本文所用，术语“约(about)”是指±10％。
术语“包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(has、having)”及其同源词意为“包括但不限于”。
术语“由……组成(consisting of)”是为“包括并限于”。
术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”意为组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但前提是另外的成分、步骤和/或部件不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性。
如本文所使用的，单数形式“一个(a、an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确的指示。例如，术语“化合物(a compound)”或“至少一种化合物(at least onecompound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个申请中，本发明的各个实施方式可以以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，都适用。
每当本文指出数值范围(例如“10至15”、“10至15”或由这些另一个这样的范围指示所连接的任何数字对)时，其意为包括在所指出的范围界限内的任何数字(分数或整数)，除非上下文另外清楚地指示。短语“第一指示数和第二指示数之间的范围(range/ranging/ranges)”和“从第一指示数到(“to”、“up to”、“until”或“through”)第二指示数的范围”在本文中可互换使用，意为包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的或者容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本本发明的各个特征也可以单独提供，或者以任何合适的子组合提供，或者以本本发明的任何其它描述的实施方式中的合适的方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有这些元件的情况下不起作用。
如上文所述以及如以下权利要求部分所要求的本发明的各个实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
示例性实施方式
实施方式1.一种为有需要的对象制备NK细胞级分的方法，所述方法包括：
(a)获得包含与对象同种异体的NK细胞和CD3+细胞的单采产物；
(b)将所述单采产物分离成CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；
(c)通过辐射灭活所述CD3+细胞级分的细胞；
(d)在允许细胞增殖的条件下，离体培养所述CD3-耗尽的细胞级分和灭活的、经辐射的CD3+细胞级分，其中所述条件包括：提供介于1.0mM至10mM之间的量的营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺；
(e)步骤(d)之后6至10天，用新鲜的营养物、血清、IL-15和烟酰胺补充所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，以产生扩增的CD3-耗尽的细胞级分；
(f)步骤(d)之后14至16天，收获所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；和
(g)洗涤并浓缩步骤(f)的所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，
由此产生用于在所述对象中移植的扩增的NK细胞级分。
实施方式2.根据实施方式1的方法，其中所述单采产物是包含人NK和CD3+细胞级分的人单采产物。
实施方式3.根据实施方式1的方法，其中所述血清是人血清。
实施方式4.根据实施方式3的方法，其中允许细胞增殖的所述条件包括提供10％的人血清。
实施方式5.根据实施方式1的方法，其中所述IL-15包含20ng/ml的IL-15。
实施方式6.根据实施方式1的方法，其中所述CD3激动剂是OKT3。
实施方式7.根据实施例6所述的方法，其中所述OKT3包含1μg/ml OKT3。
实施方式8.根据实施方式1的方法，其中所述烟酰胺包含7.0mM烟酰胺。
实施方式9.根据实施例1所述的方法，其中所述营养物包含最低必需细胞培养基。
实施方式10.根据实施方式1的方法，其中所述扩增的NK细胞级分的所述NK细胞包含至少40％至97％的CD56+/CD3-细胞。
实施方式11.根据实施方式1的方法，其中由步骤(e)产生的所述经洗涤和浓缩的扩增的NK细胞级分的特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)输注后，少于1×106CD3+CD56-细胞/Kg患者体重；
(d)输注后，不超过5EU内毒素/Kg患者体重；
(e)无支原体；并且
(f)无菌。
实施方式12.根据实施方式11的方法，其中输注后，CD3+细胞少于0.5×106CD3+/CD56-细胞/Kg患者质量。
实施方式13.根据实施方式1的方法，其中以1:1的比率接种CD3-耗尽的细胞和经辐射的CD3+细胞。
实施方式14.根据实施方式13的方法，其中步骤(d)的所述培养，是在培养瓶中以0.30×106至0.40×106的CD3-耗尽的和0.30×106至0.40×106至的经辐射的CD3+细胞/ml进行的。
实施方式15.根据实施方式13的方法，其中步骤(d)的所述培养，是以0.35×106CD3-耗尽的和0.35×106经辐射的CD3+细胞/ml进行培养进行的。
实施方式16.根据实施方式13的方法，其中步骤(d)的所述培养，是在烧瓶中以每瓶400×106至900×106CD3-耗尽的和400×106至900×106经辐射的CD3+细胞进行的。
实施方式17.根据实施方式13的方法，其中步骤(d)的所述培养，是在烧瓶中以每瓶700×106CD3-耗尽的细胞和700×106经辐射的CD3+细胞进行的。
实施方式18.实施方式13的方法，其中，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，扩增的CD3-耗尽的细胞的CD62L表达增加。
实施方式19.根据实施例13所述的方法，其中，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，扩增的CD3-耗尽的细胞的抗体依赖性细胞毒性增加。
实施方式20.一种用于冷冻保存NK细胞级分的方法，包括：
(a)将NK细胞级分的NK细胞悬浮于不含DMSO的冷冻保存缓冲液中；
(b)添加DMSO至10％v/v；
(c)将细胞的温度降低至-120℃；和
(d)在小于-120℃的温度下储存所述冷冻保存的NK细胞。
实施方式21.根据实施方式1制备的NK细胞级分。
实施方式22.根据实施方式20制备的冷冻保存的NK细胞级分。
实施方式23.根据实施方式22的冷冻保存的NK细胞级分，提供于冷冻保存袋中，所述冷冻保存袋在20ml的体积中包含2.5×108总细胞/ml。
实施方式24.一种制备用于施用的冷冻保存的NK细胞级分的方法，所述方法包括
(a)在37℃水浴中解冻冷冻保存的NK细胞级分；
(b)用输注溶液稀释所述冷冻保存的NK细胞级分；
从而产生用于移植的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分。
实施方式25.通过实施方式24的方法生产的用于移植的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分，其中所述冷冻保存的NK细胞级分是实施方式23的冷冻保存的NK细胞级分。
实施方式26.根据实施方式25的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分，其中，与在相同条件下具有5mM烟酰胺且不具有所述CD3+细胞级分的扩增的CD3-耗尽的细胞相比，在输注给经辐射的小鼠后，所述扩增的CD3-耗尽的细胞在脾脏和骨髓中的体内保留增加。
实施方式27.根据实施方式25的用于移植的解冻的、冷冻保存的NK细胞级分，其特征是以下参数：
(a)至少70％的CD56+/CD3-细胞；
(b)至少70％的生存力；
(c)输注后，少于1×106CD3+CD56-细胞/Kg患者体重；
(d)输注后，不超过5EU内毒素/Kg患者体重；
(e)无支原体；并且
(f)无菌。
实施方式28.根据实施方式25的解冻的冷冻保存的NK细胞级分，被提供在氟化乙烯丙烯(FEP)冷冻保存袋中。
实施方式29.根据实施方式28的解冻的冷冻保存的NK细胞级分，包含2.5×108细胞/ml。
实施方式30.根据实施方式28的解冻的冷冻保存的NK细胞级分，以100ml的体积提供。
实施方式31.一种治疗有需要的人类对象的血液疾病的方法，所述方法包括：
(a)向所述对象施用抗癌单克隆抗体；
(b)向所述对象施用至少一种免疫抑制剂；
(c)将同种异体解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分移植给有需要的对象，其中所述同种异体解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分已经，通过用介于1.0mM至10mM之间的量的CD3+细胞、营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺，离体培养而扩增；和
(d)向所述对象施用IL-2,
从而治疗所述对象的所述血液疾病。
实施方式32.根据实施方式31的方法，其中所述免疫抑制剂是化学治疗免疫抑制剂和/或辐射。
实施方式33.根据实施方式31的方法，其中所述血液疾病是血液恶性肿瘤。
实施方式34.根据实施方式31的方法，其中所述血液疾病是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
实施方式35.根据实施方式34的方法，其中所述血液疾病是滤泡性淋巴瘤(FL)或高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)。
实施方式36.根据实施方式34的方法，其中所述NHL是CD20阳性B细胞NHL。
实施方式37.根据实施例34所述的方法，其中所述NHL的特征是以下各项中的至少一个：
(a)常规疗法失败的复发/难治性疾病；
(b)已经接受至少两种现有疗法(其中至少一种含有化疗，并且其中至少一种含有抗-CD20单克隆抗体)的患者；
(c)根据卢加诺反应标准定义的可测量疾病；
(d)其中NLH是FL转化为HGBCL，在转化为HGBCL后必须接受至少一种治疗。
实施方式38.根据实施方式33的方法，其中所述血液恶性肿瘤是NHL，并且抗癌单克隆抗体是利妥昔单抗(375mg/m2)。
实施方式39.根据实施例31的方法，其中步骤(a)进行三次。
实施方式40.根据实施方式31的方法，其中步骤(c)包括施用第一剂量的同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的细胞级分，两天后施用第二剂量的同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分。
实施方式41.根据实施方式40的方法，其中步骤(a)进行三次：在第一次给药前10天，在第一次给药前3天，以及在第一次给药同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分后12至16天。
实施方式42.根据实施方式31的方法，其中所述细胞级分包含1×107至5×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象。
实施方式43.根据实施方式31的方法，其中细胞级分包含2×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象。
实施方式44.根据实施方式41的方法，其中所述组合的第一和第二剂量包含2×107/kg至2×108/kg的总同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞。
实施方式45.根据实施例40的方法，其中：
(a)所述NK细胞级分的所述第一剂量和所述第二剂量各自包含2.5×107同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象，总剂量为5×107同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg；或
(b)所述NK细胞级分的所述第一剂量和所述第二剂量各自包含5×107同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象，总剂量为1×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg；或
(c)所述NK细胞级分的所述第一剂量和所述第二剂量各自包含1×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg对象，总剂量为2×108同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞/kg。
实施方式46.根据实施方式31的方法，其中在解冻后不超过4小时向所述对象施用所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分。
实施方式47.根据实施方式31的方法，其中，通过输注(无需过滤器或泵)，将所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞级分，以不大于10cc/kg患者体重/小时的速率施用于所述对象。
实施方式48.根据实施方式31的方法，其中所述至少一种免疫抑制剂包括环磷酰胺和/或氟达拉滨。
实施方式49.根据实施例48所述的方法，其中：
(i)至少一种免疫抑制剂包含环磷酰胺(400mg/m2)和氟达拉滨(30mg/m2)；并且
(ii)其中在输注所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞之前第5天、第4天和第3天中的每一天施用所述环磷酰胺和所述氟达拉滨。
实施方式50.根据实施方式31的方法，其中步骤(d)包括在输注所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后分别施用6×106单位的IL-2：
(i)在输注同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞的当天；和
(ii)在输注同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后两天；和
(iii)在输注同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后4天。
实施方式51.根据实施方式31的方法，其中步骤(c)包括移植根据实施方式24的方法制备的可移植的NK细胞级分。
实施例
现在参考下面的实施例，这些实施例与上面的描述一起以非限制性的方式说明了本发明的一些实施方式。
通常，本文使用的命名和本发明中使用的实验室方法包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A laboratory Manual)”Sambrook等人，(1989)；“分子生物学实验(Current Protocols in Molecular Biology)”，第I-III卷，Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等人，“分子生物学实验(Current Protocols in Molecular Biology)”，约翰威立国际出版公司(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Perbal，“分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，约翰威立国际出版公司，纽约(1988)；Watson等人，“重组DNA(Recombinant DNA)”，科学美国人书籍(Scientific American Books)，纽约；Birren等人(编辑)，“基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Press)，纽约(1998)；如以下美国专利US4,666,828；US4,683,202；US4,801,531；US5,192,659和US5,272,057中所述的方法论；“细胞生物学：实验室手册(CellBiology:A Laboratory Handbook)”，第I-III卷，Cellis,J.E.编辑(1994)；Freshney的“动物细胞的培养-基本技术手册(Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique)”，Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；“当前免疫学方案”卷I-III，Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等人编辑，“基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)”(第八版)，Appleton&Lange出版社，诺沃克，CT(1994)；Mishell和Shiigi编辑，“细胞免疫学中的选定方法(Selected Methods in Cellular Immunology)”，曼出版公司，纽约(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中被广泛描述，参见，例如：美国专利US3,791,932、US3,839,153、US3,850,752、US3,850,578、US3,853,987、US3,867,517、US3,879,262、US3,901,654、US3,935,074、US3,984,533、US3,996,345、US4,034,074、US4,098,876、US4,879,219、US5,011,771和US5,281,521；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”，Gait,M.J.编辑(1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”，Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1985)；“转录与翻译(Transcription and Translation)”，Hames,B.D.,and HigginsS.J.编辑(1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”，Freshney,R.I.编辑(1986)；“固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)”，IRL出版社(1986)；“分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，Perbal,B.(1984)和“酶学方法”，2、2、317卷，美国学术出版社；“PCR方案：方法和应用指南(A Guide To Methods AndApplications)”，美国学术出版社，圣地亚哥，CA(1990)；Marshak等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册(Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual)”，CSHL出版社(1996)；所有这些都通过引用的方式并入本文，如同在本文中完全阐述一样。在本文中还提供了其它的一般参考资料。其中的过程被认为是本领域公知的，是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息通过引用并入本文。
实施例1-CD3+饲养细胞对离体扩增的NK细胞的扩增和体外功能的影响
评估了灭活后和在CD3激动剂(如OKT3)的存在下，自体辐射的CD3+细胞级分饲养细胞对离体扩增的冷冻保存并解冻的NK细胞的扩增和功能的影响。
在根据本发明的方法培养2周后，使用灭活的自体CD3+细胞作为饲养细胞并补充OKT3和NAM的改良程序，提高了扩增倍数，这增加了收获时获得的活细胞总数。通过NK细胞与靶细胞BL2(伯基特淋巴瘤细胞系)以不同比率组合来评估细胞在杀伤和ADCC中的功能性。在细胞毒性测定中，CD3-耗尽的级分与灭活的CD3+饲养细胞一起的培养导致性能降低，通过在较高的NAM浓度(7mM)下培养细胞可以部分地克服这一问题(图1)。在7mM NAM中培养也导致CD62L表达增加(图2)。
NK细胞在调查和消除感染和恶性转化的细胞方面发挥着关键作用。它们还具有直接杀死靶细胞的能力，以及通过与IgG抗体的Fc部分结合的膜受体FcγRIII(CD16)介导ADCC。
为了测试NAM对细胞毒性活性的影响，根据本发明的方法在5mM或7mM NAM(含有或部含有饲养细胞)中培养NK细胞2周。使用标记的BL2细胞进行ADCC测定。荧光活化细胞分选(FACS)分析显示，与单独用NAM培养的细胞相比，用7mM NAM和饲养细胞培养的NK细胞的细胞毒性活性增加(图1)。
在使用本公开的方法培养之后，使用FACS分析产生的细胞的表型。结果如图8和9所述。如图8和9所示，本文所述的生产方法产生具有表面标记物的独特表型的细胞，包括CD16、CD57、CD62L、NKp80、CD200R、LAG3和CD56的独特表达模式。
使用FACS和CEDEX的组合，对按照本文所述的培养方法收获的几批细胞进行了某些细胞的细胞表型、生存力和扩增倍数的进一步分析。这些分析的结果列于下表I、IIa和IIb中。
表I：表现型—收获(HARVEST)(用NAM培养的第14天)
表IIa：表型--收获(用NAM培养的第14天)
表IIb：表型--具有或不具有NAM
除了细胞表型之外，使用本文所述的第一和第二效价测定来测量上述细胞批次的效价。这些分析的结果在下表III和IV中给出。
表III：效价—收获(第14天)
表IV：效价—收获(第14天)
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表3-5显示了根据本文所述的方法培养、冷冻和解冻的示例性冷冻保存、解冻的CD3-耗尽的和经辐射的CD3+细胞的细胞数量、生存力和表型表征的评估结果。t＝0对应于级分冷冻后7±2天的解冻。
表3--在培养和冷冻保存后，冷冻保存并解冻的扩增的CD3-耗尽的细胞和CD3+饲养细胞的概况。
*250ml袋中冷冻的有核细胞总数＝5000×106(20ml体积)
**50ml袋中冷冻的有核细胞总数＝2500×106(10ml体积)
表4--培养和冷冻保存后，冷冻保存并解冻的扩增的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞的概况。
表5--培养和冷冻保存后，冷冻保存并解冻的扩增的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞的概况。
表6-8显示了根据本文所述的方法培养的示例性冷冻保存的、解冻的扩增的CD3-耗尽的和经辐射的CD3+细胞的细胞功能(细胞杀伤和效价，分别通过本文所述的第一效价测定和第二效价测定测量)的评估结果。t＝0对应于级分冷冻后7±2天的解冻。
表6—培养和冷冻保存后，冷冻保存并解冻的扩增的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞的功能和效价。
表7--培养和冷冻保存后，冷冻保存并解冻的扩增的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞的功能和效价。
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表8--培养和冷冻保存后，冷冻保存并解冻的扩增的CD3-耗尽的和CD3+饲养细胞的功能和效价。
实施例2--NAM和CD3+饲养细胞对离体扩增的NK细胞的表型表征的影响
肿瘤细胞利用免疫检查点受体CD200R和程序性死亡受体-1(PD-1)过度表达其配体，以抑制淋巴细胞的抗肿瘤活性。评估了烟酰胺(NAM)扩增对NK细胞中免疫检查点受体表达的影响。
使用FACS分析进行的免疫表型分析表明，NAM下调了在扩增的NK细胞上表达的CD200R的表达(图3)。
实施例3 NAM和CD3+饲养细胞对离体扩增的NK细胞的体内归巢的影响
在培养物的活化过程中，NK细胞失去了一些在体内运输、定位和增殖的能力，直接影响其临床疗效。评估了与CD3+饲养细胞一起培养、冷冻保存以及在有和没有NAM的情况下解冻对体外扩增的NK细胞的保留和保留效力的影响。
体内保留模型(脾脏)表明，与仅保留细胞因子培养的细胞相比，在根据本文所述的方法冷冻保存并解冻后，来自用NAM和经辐射的CD3+饲养细胞培养的CD3-耗尽的培养物的NK细胞的总体保留较高(图4)。
实施例4--CD3+饲养细胞对离体扩增的NK细胞的体内功能的影响
用CD3+饲养细胞培养，以及冷冻保存和解冻对NK细胞功能的影响已经在体外示出(参见实施例1)。
在两种不同的体内测定中比较了5mM或7mM NAM(含有或不含饲养细胞)中的NK扩增。在保留测定中，将20×106人NK细胞/小鼠静脉内注射到经辐射的NSG小鼠(每组n＝6至7只小鼠)。用饲养细胞和7mM NAM扩增的NK细胞显示，脾脏中NK细胞总数的保留增加(图5A)，并且3天后骨髓中NK细胞的百分比增加(图5B)。
实施例5—离外扩增、冷冻保存并解冻的CD3-耗尽的(NK)细胞
用CD3+饲养细胞培养，冷冻保存和解冻对NK细胞功能的影响已经在体外(参见实施例1)和体内(实施例4)示出。在A549(人肺腺癌上皮肿瘤)细胞中评估了扩增的NK细胞的肿瘤生长抑制潜力。
图6和7显示了NK细胞施用与抗Her2抗体施用(NK+AHer2)联合的协同作用，两者均具有最少的NK细胞施用(第9天和第11天)(图6B和6C)和多次扩增的NK细胞施用(第9、12、15和18天)(图7B和7C)。
不希望受理论束缚，当综合考虑时，本文呈现的结果表明，根据本文所述的方法，用烟酰胺、经辐射的CD+饲养细胞和CD3激动剂(例如OKT3)对CD3-耗尽的细胞级分中的NK细胞在进行离体培养，如所述进行冷冻保存并解冻，可以提供有效储存的扩增的NK细胞群，其具有增强的离体和体内功能性，克服了冷冻和解冻的负面影响，并适用于治疗癌症和其他疾病。

Claims (41)

1.一种NK细胞级分，包含有核细胞群，
其中所述群包含至少1.0×106有核细胞，
其中所述群中至少约70％的细胞是存活的，
其中：
所述群中至少约70％的细胞是CD56+；
所述群中不超过约0.5％的细胞是CD3+；
所述群中不超过约10％的细胞是CD19+；
所述群中不超过约10％的细胞是CD14+；
所述群中至少约44％的细胞是CD49a+；
所述群中不超过约27％的细胞是LAG3+；
所述群中不超过约32％的细胞是CD200R+；
所述群中不超过约25％的细胞是CD57+；
所述群中至少约10％的细胞是CD16+；并且
所述群中至少约10％的细胞是CD62L+。
2.根据权利要求1所述的NK细胞级分，其中所述群中至少约90％的细胞是CD56+。
3.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中约90％至约95％的细胞是CD56+。
4.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中约0.2％至约0.3％的细胞是CD3+。
5.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中
所述群中至少约70％的细胞是CD56+/CD3-；并且
所述群中不超过约0.5％的细胞是CD56-/CD3+。
6.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中至少约99％的细胞是CD56+/CD3-。
7.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中至少约15％的细胞是CD62L+。
8.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中约18％至约70％的细胞是CD62L+。
9.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中至少约20％的细胞是CD16+。
10.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中约20％至约60％的细胞是CD16+。
11.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中
所述群中不超过约1％的细胞是LAG3+；
所述群中不超过约1.5％的细胞是CD200R+；
所述群中不超过约2.5％的细胞是CD57+。
12.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中
所述群中不超过约3％的细胞是CD56+/LAG3+；
所述群中不超过约11％的细胞是CD56+/CD200R+；
所述群中不超过约4％的细胞是CD56+/CD57+。
13.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中至少约43％的细胞是CD56+/CD16+。
14.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中至少约57％的细胞是CD56+/CD16+。
15.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中至少约78％的细胞是CD56+/CD62L+。
16.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述群中不超过约77％的细胞是NKp80+，优选地，其中所述群中不超过约15.77％的细胞是NKp80+。
17.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述NK细胞级分含有：
i)至少约17.5×108有核细胞；
ii)至少约35×108有核细胞；
iii)至少约2.5×109有核细胞；
iv)至少约5×109有核细胞；
v)至少约1.25×107有核细胞；
vi)至少约2.5×107有核细胞；
vii)至少约5×107有核细胞；或
viii)至少约1×108有核细胞。
18.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞级分，其中所述NK细胞级分已经预先冷冻并随后解冻。
19.一种冷冻保存的NK细胞级分，包含：
i)权利要求1至17中任一项所述的NK细胞级分；和
ii)DMSO，其中DMSO的浓度为约10％v/v。
20.根据权利要求18所述的冷冻保存的NK细胞级分，其中所述冷冻保存的NK细胞级分在以下情况下是稳定的：
i)在约-80℃下至少约6周；和/或
ii)在约-150℃下至少约12个月。
21.一种制备权利要求1至7中任一项所述的NK细胞级分的方法，所述方法包括：
(a)获得包含与对象同种异体的NK细胞和CD3+细胞的单采产物；
(b)将所述单采产物分离成CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；
(c)通过辐射灭活所述CD3+细胞级分的细胞；
(d)在允许细胞增殖的条件下，离体培养所述CD3-耗尽的细胞级分和灭活的、经辐射的CD3+细胞级分，其中所述条件包括：提供含量介于1.0mM至10mM之间的营养物、血清、IL-15、CD3激动剂和烟酰胺；
(e)在步骤(d)之后6至10天，用新鲜的营养物、血清、IL-15和烟酰胺补充所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，以产生扩增的CD3-耗尽的细胞级分；
(f)在步骤(d)之后14至16天，收获所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分；和
(g)洗涤并浓缩步骤(f)的所述组合的CD3-耗尽的细胞级分和CD3+细胞级分，
由此产生所述NK细胞级分。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述单采产物是包含人NK和CD3+细胞级分的人单采产物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述CD3激动剂是OKT3。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中允许细胞增殖的所述条件包括：
i)浓度为约10％(v/v)的人血清。
ii)浓度为约20ng/ml的IL-15；
iii)浓度为约1μg/ml的OKT3；
iv)浓度为约7.0mM的烟酰胺；
v)含有最低必需细胞培养基的营养物。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中以1:1的比例接种所述CD3-耗尽的细胞和所述经辐射的CD3+细胞。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述培养在如下条件下在培养瓶中进行
i)0.30×106至0.40×106CD3-耗尽的和0.30×106至0.40×106经辐射的CD3+细胞/ml；
ii)0.35×106CD3-耗尽的和0.35×106个经辐射的CD3+细胞/ml；
iii)每个培养瓶400×106至900×106CD3-耗尽的和400×106至900×106经辐射的CD3+细胞；或
iv)每个培养瓶700×106CD3-耗尽的和700×106经辐射的CD3+细胞。
27.一种用于冷冻保存NK细胞级分的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求1至17中任一项所述的NK细胞级分或通过权利要求21至26中任一项所述的方法生产的NK细胞级分悬浮于不含DMSO的冷冻保存缓冲液中；
(b)添加DMSO至10％v/v；
(c)将细胞的温度降低至-120℃；和
(d)在小于或等于-120℃的温度下储存所述冷冻保存的NK细胞。
28.一种用于制备解冻的NK细胞级分的方法，所述方法包括：
(a)在37℃水浴中解冻权利要求19至20中任一项所述的所述冷冻保存的NK细胞级分或通过权利要求27所述的方法生产的冷冻保存的NK细胞级分；
(b)用输注溶液稀释在步骤(a)中解冻的所述冷冻保存的NK细胞级分；
由此生产解冻的、冷冻保存的NK细胞级分。
29.一种治疗有需要的人类对象的血液疾病的方法，所述方法包括：
(a)向所述对象施用至少一种抗癌单克隆抗体；
(b)向所述对象施用至少一种免疫抑制剂；
(c)施用权利要求1至18中任一项所述的NK细胞级分、通过权利要求21至26中任一项所述的方法生产的NK细胞级分、或通过权利要求28所述的方法生产的解冻的NK细胞级分；和
(d)向所述对象施用IL-2。
30.根据权利要求29所述的方法，其中步骤(c)包括施用第一剂量的所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分，并且两天后施用第二剂量的所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中：
(i)所述第一剂量和所述第二剂量各自包含至少约1.25×107细胞/kg，总剂量为2.5×107细胞/kg；
(ii)所述第一剂量和所述第二剂量各自包含至少约2.5×107细胞/kg，总剂量为5×107细胞/kg；
(iii)所述第一剂量和所述第二剂量的所述NK细胞级分各自包含5×107细胞/kg，总剂量为1×108细胞/kg；或
(iv)所述第一剂量和所述第二剂量的所述NK细胞级分各自包含1×108细胞/kg，总剂量为2×108细胞/kg。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂是化学治疗免疫抑制剂、辐射或其任何组合。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述血液疾病是血液恶性肿瘤。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述血液疾病是多发性骨髓瘤。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述血液疾病是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，优选地，其中所述NHL是：
i)ECD20阳性B细胞NHL；
ii)滤泡性淋巴瘤(FL)；
iii)高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)；
iv)HGBCL，未另外指定的(HGBCL，NOS)；
v)原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；或
vi)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述NHL的特征是以下特征中的至少一个：
a)常规疗法失败的复发/难治性疾病；
b)已经接受至少两种现有疗法的患者，优选地，其中所述至少两种现有疗法中的至少一种包括施用化疗，并且所述至少两种现有疗法中的至少一种包括施用抗CD20单克隆抗体；
c)根据卢加诺反应标准定义的可测量疾病；
d)其中所述NLH是FL转化为HGBCL，在转化为HGBCL后，所述对象先前已经接受了至少一种治疗。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述血液疾病是NHL，并且所述抗癌单克隆抗体是利妥昔单抗，优选地，其中以约375mg/m2的剂量施用利妥昔单抗至少一次，优选地，其中施用利妥昔单抗至少三次。
38.根据权利要求29至37中任一项所述的方法，其中将所述至少一种抗癌单克隆抗体施用给所述对象至少三次，优选地，其中施用所述至少一种抗癌单克隆抗体：
在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约10天；
在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约3天；
以及在所述施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之后12至16天。
39.根据权利要求29至38中任一项所述的方法，其中所述至少一种免疫抑制剂包括环磷酰胺和/或氟达拉滨。
40.根据权利要求39所述的方法，其中：
所述至少一种免疫抑制剂包含环磷酰胺(400mg/m2)和氟达拉滨(30mg/m2)，
其中所述环磷酰胺以400mg/m2的剂量施用，氟达拉滨以30mg/m2的剂量施用，并且
其中所述环磷酰胺和所述氟达拉滨的施用为：
在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约5天；
在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约4天；和
在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之前约4天。
41.根据权利要求29至40中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括在输注所述同种异体的解冻的冷冻保存的扩增的NK细胞后分别施用6×106单位的IL-2：
(i)在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分的当天；
(ii)在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之后2天；和
(iii)在第一次施用所述NK细胞级分或解冻的NK细胞级分之后4天。
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