CN101914497B - 临床用n-cik细胞培养、质量控制鉴定试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种临床用N-CIK细胞的诱导、培养以及产品质量控制鉴定的试剂盒体系及其应用。本发明包括外周血单个核细胞分离鉴定试剂盒、临床用N-CIK细胞培养、诱导扩增试剂盒以及产品质量控制鉴定试剂盒，提供了临床用N-CIK细胞的制备和质量控制相关试剂盒体系的设计和方法；本试剂盒体系能使N-CIK细胞临床应用更稳定、简单、高效；本发明提供了临床用T细胞制剂通用的稳定的以试剂盒形式生产、质量控制和鉴定的方法。本发明提供的方法，还包括由本发明试剂盒培养获得的NK和CIK细胞应用于临床肿瘤综合治疗，以清除残存病灶，提高治疗疗效，防止肿瘤的复发和转移。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和生物、免疫学领域。特别地，本发明涉及NK和CIK(即N-CIK)细胞的诱导、培养及产品质量控制鉴定的试剂盒及N-CIK细胞在肿瘤综合治疗中的应用。
背景技术
肿瘤作为人类死亡的重要病因之一，已经成为威胁人类健康的首要问题并受到社会的广泛关注。随着肿瘤治疗方法不断发展，目前手术治疗、放射治疗、化疗以及联合生物治疗的综合治疗已经成为肿瘤治疗的新观点。
虽然现有的肿瘤治疗方法仍不能彻底根治肿瘤，借助生物免疫学技术手段开展肿瘤免疫治疗提高肿瘤患者生活质量和生存期，已经越来越受到业界的认同。尤其是以自体来源的活化T细胞为代表的免疫治疗技术，因其毒副作用小，绿色、个性化的特点在临床上逐渐受到重视。
随着肿瘤学和免疫学的进步，肿瘤免疫治疗，包括特异性主动免疫治疗和过继免疫治疗两个方面的研究都有了很大的发展，前者包括以树突状细胞为基础的技术现已被国内外专家作为研究课题，但距临床大规模应用还有待时日。
然而肿瘤过继免疫治疗技术已得到了较快发展，先后出现了以几种免疫效应细胞为代表的治疗技术，并在临床上得到了较为广泛的推广应用。最早出现的淋巴因子激活的杀伤细胞((LAK细胞)(Rosenberg SA，et al.N.Engl.J.Med.1985，313(23)：1485-92.)，它主要是成分是NK细胞(CD3-CD56+)；其后出现了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)(Itoh K，et al.J Exp.Med.1988，168(4)：1419-41.)以及细胞毒T淋巴细胞(CTL)(Aruga A，et al. Int.J.Cancer.1991，49(1)：19-24.)，它们多是以大量CD8+或者CD4+T淋巴细胞为主要效应细胞；而1991年由斯坦福大学发明的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)的主要成分是CD3+CD56+，它兼有NK细胞和T淋巴细胞的功能特点，临床应用表现出更好的应用特性，尤其是NK细胞和CD8+T淋巴细胞(亦即毒性T淋巴细胞，Tc)的强细胞毒性作用，使该项细胞免疫技术在临床上显示出了良好疗效，受到临床上广泛推广。
目前现有技术已尝试在不同方面发展了CIK技术，如CN101506356是在LAK技术的基础上提高了CD3+CD56+的比例，而CN101519646A公开的结果显示获得了CD3+CD56+和CD8+T细胞的双提高，但细胞的有效成分都不够全面，而且对免疫细胞质量控制和鉴定无做相应规范要求，没有涉及试剂盒形式的诱导培养、制备N-CIK细胞以及产品质量控制鉴定；但事实上的临床应用中，受制备使用试剂和因子较多、周期较长、标准不一致的限制，出现了培养工艺繁琐、不稳定、细胞质量难以控制甚至污染的问题。而处在临床研究阶段的树突状细胞疫苗的制备，在CN16091095A中已经公开了一种简单的试剂盒制备方法，未来有望改善其临床应用中培养方法复杂的问题。
长期的N-CIK细胞临床应用实践提示我们，未形成简单的、格式化的试剂盒模式或者统一的培养工艺模式已成为束缚N-CIK细胞临床长期稳定应用的瓶颈，迫切需要开发高效、快速制备N-CIK细胞的方法和模式。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述N-CIK细胞(NK和CIK细胞)临床应用中存在的瓶颈问题，提供一种临床用N-CIK细胞的高效、快速制备的方法、相关组合物和试剂盒及其应用。
本发明人对细胞的诱导、培养以及产品的质量控制鉴定进行了优化和完善，通过一套N-CIK细胞的诱导、培养以及产品质量控制鉴定的试剂盒形式，规范了N-CIK细胞的临床高效安全应用，为N-CIK细胞高效快速制备和临床应用培养工艺控制、质量标准统一提出了新模式。此外，本发明还丰富了效应细胞有效成分，本方法获得的N-CIK细胞包含了NK细胞、CD3+CD56+和CD8+T细胞在内的多种对肿瘤细胞具有杀伤毒性的成分。
本发明一方面提供一种临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基，它含有人体细胞生长必需的碳水化合物、氮源、维他命、矿物质和水，并添加一定体积比的细胞培养添加剂，包括非必须氨基酸、丙酮酸钠、青霉素钠以及硫酸链霉素。
本发明还提供一种N-CIK细胞诱导因子组合物NC-1，它含有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ和RPMI 1640，且人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ的质量体积浓度分别为：0.5～1mg/L和20～80mg/L。
在另一优选例中，所述人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ的质量体积浓度分别为：0.5～0.8mg/L和30～60mg/L；在N-CIK细胞诱导第1天，按照体积比1∶1000加入到细胞浓度为1×106个细胞/mL的临床用N-CIK细胞无血清完全培养基中，培养10～24小时，优选20～24小时。
本发明还提供一种N-CIK细胞诱导因子组合物NC-2，它含有人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗和RPMI 1640，且人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗的质量体积浓度分别为：5～50mg/L、10～50wU/L和5～30mg/L。
在另一的优选例中，所述人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗的质量体积优选浓度分别为：10～30mg/L、20～30wU/L和10～15mg/L；其应在N-CIK诱导第2天和第4天，按照体积比1∶1000和0.5∶1000加入到细胞浓度为1×106个细胞/mL的临床用N-CIK细胞无血清完全培养基中。
本发明还提供一种N-CIK细胞诱导因子组合物NC-3，它含有人白介素2、植物凝集素和RPMI 1640，且人白介素2和植物凝集素的质量体积浓度分别为：5～25wU/L和0.5～3g/L。
在另一优选例中，所述人白介素2和植物凝集素的优选质量体积浓度分别为：10～15wU/L和1～2g/L。
本发明还包括将上述无血清液态完全培养基和诱导因子组合物装入专用洁净容器而制备成试剂盒。
本发明另一方面提供一种临床用N-CIK细胞的诱导培养试剂盒、人外周血单个核细胞分离试剂盒以及产品鉴定试剂盒，所述产品鉴定试剂盒包括人外周血单个核细胞流式鉴定试剂盒和N-CIK细胞流式鉴定试剂盒。
所述临床用N-CIK细胞的诱导培养试剂盒包括专用容器和装在容器中的上述临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基和三种诱导因子组合物：NC-1、NC-2、NC-3；
所述人外周血单个核细胞分离试剂盒包含一次性使用的200mL肝素抗凝采血袋(带采血专用针)1个、内装150mL～240mL医用0.9％生理盐水的300mL密封洁净混合瓶1个和内装10mL～15mL淋巴分离液的50mL洁净离心管数个，25mL移液管数个。在另一优选例中，所述300mL密封洁净混合瓶内装180mL～200mL医用0.9％生理盐水。
所述人外周血单个核细胞流式鉴定试剂盒包含三组双色抗体组合物，分别是P-1：FITC-IgG\PE-IgG，P-2：FITC-CD3\PE-CD4，P-3：FITC-CD14\PE-CD19，100mL洗涤液1瓶，50mL固定液1瓶；所述抗体每两种抗体按照体积比1∶1混合并装于1支专用棕色管中且每5～10uL可检测一次细胞；P-1～3共计20～30套；所述洗涤液成是牛血清和医用生理盐水按照体积比2∶98装入专用容器中；所述固定液是按照每100mL磷酸缓冲液含1～2g多聚甲醛装于不透明试剂瓶中。
所述N-CIK细胞流式鉴定试剂盒包括：四组双色抗体组合物分别是C-1：FITC-IgG\PE-IgG，C-2：FITC-CD3\PE-CD56，C-3：FITC-CD3\PE-CD8，C-4：FITC-CD3\PE-CD4，100mL洗涤液1瓶，50mL固定液1瓶；所述抗体每两种抗体按照体积比1∶1混合并装于1支专用棕色管中且每5～10uL可检测一次细胞；C-1～4共计20～30套；所述洗涤液成是牛血清和医用生理盐水按照体积比2∶98装入专用棕色管中；所述固定液是按照每100mL磷酸缓冲液含1～2g多聚甲醛装于专用试剂瓶中。上述抗体的荧光只是其中两种，还可以是PerCP或PC5或APC，或者采用三色、四色方案标记细胞。
本发明最后一方面还提供一种采用上述试剂盒制备临床用N-CIK细胞的方法以及试剂盒制备中或者制备的细胞产品的质量控制鉴定方法。
所述采用上述试剂盒制备临床用N-CIK细胞方法，其步骤包括：
①采集患者外周血并分离纯化获得单个核细胞，并对产品实施无菌内毒素检测以及表型鉴定；
②第1天用临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基和诱导因子组合物NC-1(含体积比1∶1000)，细胞浓度为1×106个/mL外周血单个核细胞，置于75cm2培养瓶或培养袋、在37℃，5％CO2培养箱中诱导培养20～24小时；
③第2天和第4天在上述培养液中按体积比1∶1000和0.5∶1000添加到N-CIK细胞诱导因子组合物NC-2；
④第5天以后，采用所述临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基和诱导因子组合物NC-3(含体积比1∶1000)对N-CIK细胞的实施扩增培养；
⑤经过10～12天的扩增培养，收获达到临床应用标准的N-CIK细胞，并对产品实施无菌内毒素以及表型鉴定；细胞鉴定结果表明同时包含较高比例的NK、CD3+CD56+以及CD3+CD8+的细胞。
⑥将所述N-CIK细胞重悬入80mL～100mL生理盐水/个体，浓度5×106～1×107个/mL，采用静脉滴注，配合肿瘤综合治疗和疗效评价的需要，实施临床回输治疗；
所述试剂盒制备中的质量控制鉴定方法，包括按照GMP要求，将相关洁净容器和装有相关试剂的专用洁净容器，密封包装入试剂盒中；还包括必要时接受按照《中国药典》规定进行无菌、内毒素的检测；
所述制备的细胞产品的质量控制鉴定方法，包括按照《中国药典》规定的方法进行无菌、内毒素的检测；还包括细胞培养液按照规定进行培养检测结果为阴性，内毒素检测结果小于5EU/mL，以保证临床应用时的安全性。
本发明最后还提供一种N-CIK细胞组合物的临床应用和疗效评价的方法。
附图说明
图1为实施例5的分离纯化的单个核细胞流式图；
图2为实施例6、7中的N-CIK细胞培养中状态照片(放大倍100)；
图3为实施例6的N-CIK细胞流式图
图4为实施例7的N-CIK细胞流式图
具体实施方式
本发明提供了一种采用试剂盒的方法的制备临床用N-CIK细胞方法。研究中发现，改变N-CIK细胞诱导因子组合物中特定因子的浓度能优化N-CIK细胞中NK细胞、CD3+CD56+和CD8+T细胞的比例；而且还发现，在分离人外周血单个核细胞中，除了离心力影响单个核细胞的得率外，血细胞分散到稀释液中浓度也是重要的因素。本发明通过研究优化试剂盒制备参数获得了较高比例的上述主要效应细胞和外周血单个核细胞分离得率。
此外，由于试剂盒的生产简单、高效、安全可控，采用试剂盒的形式用于临床用N-CIK细胞的生产制备，极大提高了临床制备细胞产品的效率，简化了细胞分离、培养的程序，稳定了临床用N-CIK细胞的生产工艺，保证了临床用N-CIK细胞质量安全。
本发明提供一种人外周血单个核细胞分离试剂盒，包含一次性使用的200mL肝素抗凝采血袋(带采血专用针)1个、内装150mL～240mL医用0.9％生理盐水的300mL密封洁净混合瓶1个和内装10mL～15mL淋巴分离液的50mL洁净离心管8～10个，25mL移液管数个。
在另一优选例中，所述300mL密封洁净混合瓶内装内装180mL～200mL医用0.9％生理盐水。外周血单个核细胞分离试剂盒事先在符合GMP标准条件下包装制备而成，可供1例患者采集外周血进行1次外周血单个核细胞的分离。
在本发明中还提供一种外周血单个核细胞流式鉴定试剂盒，该试剂盒包括：三组双色抗体组合物分别是P-1：FITC-IgG\PE-IgG，P-2：FITC-CD3\PE-CD4，P-3：FITC-CD14\PE-CD19，100mL洗涤液1瓶，50mL固定液1瓶；以及一种N-CIK细胞流式鉴定试剂盒，该试剂盒包括：四组双色抗体组合物分别是C-1：FITC-IgG\PE-IgG，C-2：FITC-CD3\PE-CD56，C-3：FITC-CD3\PE-CD8，C-4：FITC-CD3\PE-CD4，100mL洗涤液1瓶，50mL固定液1瓶；
上述两套细胞流式鉴定试剂盒的所有试剂耗材均在符合GMP标准条件下包装制备，供混合的每两种抗体采用FITC和PE按照体积比1∶1混合并装于1支专用棕色管中，洗涤液成分是牛血清和医用生理盐水体积比2∶98，固定液成分是每100mL磷酸缓冲液含1～2g多聚甲醛，装于不透明试剂瓶中，可用于细胞在14天内保存。采用20～30人份的包装规格。
按照所述方法制备的外周血单个核细胞分离试剂盒和细胞流式鉴定试剂盒可以用来分离获得外周血单个核细胞，以及对其和N-CIK细胞进行流式鉴定。本发明获得N-CIK细胞鉴定结果显示：CD3-CD56+(NK细胞)为(20±10)％，CD3+CD56+(CIK细胞)为(40±15)％CD3+CD8+为(65±10)％。
本发明第二个方面还提供一种临床用N-CIK细胞(NK和CIK细胞)无血清完全培养基，它含有人体细胞生长必需的碳水化合物、氮源、维他命、矿物质和水，并添体积比为1～2％的细胞培养添加剂，包括非必须氨基酸、丙酮酸钠、青霉素钠以及硫酸链霉素。
本发明第三个方面还提供三组N-CIK细胞诱导因子组合物：NC-1、NC-2和NC-3。
所述诱导因子组合物NC-1含有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ和RPMI 1640，且人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ的质量体积浓度分别为：0.5～1mg/L和20～80mg/L。
在另一优选例中，所述人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ的质量体积浓度分别为：0.5～0.8mg/L和30～60mg/L；其在N-CIK细胞诱导第1天，按照体积比1∶1000加入到细胞浓度为1×106个单个核细胞/mL的临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基中，培养10～24小时，且优选20～24小时。
所述N-CIK细胞诱导因子组合物NC-2含有人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗和RPMI 1640，且人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗的质量体积浓度分别为：5～50mg/L、10～50wU/L和5～30mg/L。
优选地，所述人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗的质量体积优选浓度分别为：10～30mg/L、20～30wU/L和10～15mg/L；其应在N-CIK细胞诱导第2天和第4天，按照体积比0.5∶1000和1∶1000加入到细胞浓度为1×106个单个核细胞/mL的临床用N-CIK细胞无血清完全培养基中。
所述N-CIK细胞诱导因子组合物NC-3，它含有人白介素2、植物凝集素和RPMI 1640，且人白介素2和植物凝集素的质量体积浓度分别为：5～25wU/L和0.5～3g/L。
在另一优选例中，所述人白介素2和植物凝集素的优选质量体积浓度分别为：10～15wU/L和1～2g/L。当N-CIK细胞浓度大于3×106个细胞/mL时，配制含诱导因子组合物NC-3体积比为0.1％的N-CIK细胞无血清完全培养基，对N-CIK细胞添液、扩增培养。
本发明还在另一优选例中采用75cm2培养瓶或者1L培养袋生产获得了临床用N-CIK细胞。
优选地，本发明还提供了用于制备上述相关试剂盒的专用容器和培养细胞用的培养瓶、培养袋；同时本发明不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养。上述诱导因子组合物中的药物可以在市场购得，诱导因子组合物中除含有药物成分外还可能含有水、防腐剂、抗氧化剂。
本发明第三个方面还包括本发明的上述无血清完全培养基和诱导因子组合物在符合GMP标准条件下包装入专用容器中制备成试剂盒，并可以采用下面所述的N-CIK细胞的培养制备方法生产本发明的临床用N-CIK细胞。
第四个方面本发明还提供采用本发明试剂盒生产制备临床用N-CIK细胞方法及其制剂的应用，其步骤可以分为四个部分：
①前体细胞即外周血单个核细胞的分离、纯化、鉴定；
②由重悬到上述无血清完全培养基中的单个核细胞经过所述诱导因子组合物诱导培养，获得一定量的本发明的N-CIK细胞。
③N-CIK细胞的大量扩增培养，经鉴定获得满足临床应用要求的细胞。
④质量检测鉴定合格的本发明N-CIK细胞采用每次80-100mL生理盐水悬浮并制备成相应组合物，配合肿瘤综合治疗实施临床回输。
上述方法中在获得本发明N-CIK细胞制剂之前，用生理盐水洗涤并重悬所述N-CIK细胞3～4次直至满足《中国药典》要求的无菌、内毒素的检测指标，保证本发明的N-CIK细胞在回输给患者时残留的本发明所述的培养基组分和诱导因子组合物不会引起患者不适反映。所述N-CIK细胞组合物包括1×105～5×107个/mL本发明的N-CIK细胞；优选为5×106～1×107个/mL。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的质量体积含量为1～5％，优选为2～3％。
本发明第五个方面还提供了一种本发明N-CIK细胞组合物的临床应用和疗效评价方法。
本发明提供了本发明N-CIK细胞在临床肿瘤综合治疗中的应用方法，其包括让患者知晓本发明N-CIK细胞的治疗作用并签署同意书后，适时施用自由选择本发明N-CIK细胞作为辅助手段在肿瘤综合治疗中的联合应用。
优选所述N-CIK细胞组合物施用的方式为滴注。具体地，施用所述N-CIK细胞组合物的方式为采用7号或者8号针头、输液器或输血器、静脉注射或静脉滴注。优选施用所述N-CIK细胞组合物的方式为在手臂或者下肢采用8号针头输血器进行静脉滴注。
所述N-CIK细胞组合物优选包含5×106～1×107个/mL的本发明N-CIK细胞，其有效量为80mL～100mL/个体的生理盐水组合物。
以上所述N-CIK细胞及其组合物都是一次静脉滴注的剂量，一个疗程四次静脉滴注治疗，从第一次开始期间每间隔一到两天再回输下一次。一个疗程结束后，可以间隔两到三个月后继续给药，可以实施多疗程回输治疗；如有必要，间隔时间为六个月或一年还可继续再治疗。
所述疗效评价的标准有：
①起免疫增强作用的细胞因子如白介素2、白介素12、干扰素γ和肿瘤坏死因子α在内的Th1类细胞因子变化水平，一般升高为有效；
②起免疫抑制作用的细胞因子如白介素6、白介素10、转化生长因子β和表皮细胞生长因子的变化水平，一般降低为有效；
③T淋巴细胞亚群变化，即：CD3、CD4、CD8的阳性率的升高或改善，CD16/56阳性率的升高，以及CD4Foxp3双阳性率的降低。
④其他疗效评价指标还有：患者肿瘤标志物检测，如甲胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白在内的肿瘤特异抗原的表达的降低，主要是通过酶免和化学发光检测；影像学检测，如核磁共振、CT和B超检测；以及患者生存期统计。
优选本发明的N-CIK细胞用于自体或者同一患者的治疗，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。此外，本发明提及的诱导因子或者PRMI 1640或者淋巴分离液或者用于制备本发明无血清完全培养基的原料可以从商业市场上购得。并且现有长期冷冻保藏细胞和小分子蛋白的技术已经非常成熟，例如脐带血细胞保藏或者人白蛋白产品的保藏。本领域技术人员完成可以利用上述技术保藏本发明涉及细胞或者组成本发明试剂盒的培养基或者组合物。
下面结合具体实施例，对本发明的进行进一步说明，但本发明的技术范围不限于这些示例，凡是试剂盒方法制备鉴定NK、CIK细胞的技术都在本发明要求保护之列。应理解，下列实施例中未表明具体实验条件的，通常按照GMP条件的实验室常规条件或者按照制造厂商建议的条件。
实施例1：人外周血单个核细胞分离试剂盒制备
将从市场上购得的一次性医用的含肝素抗凝剂的200ml采血袋(带采血专用针)1个、医用0.9％生理盐水和淋巴分离液各适量，连同实验室器械、需用一次性耗材，如移液或分液器、50mL离心管、25mL移液管、300mL密封洁净混合瓶，经过清洁、消毒或者灭菌，带入到GMP要求的百级洁净室待用。
其制备步骤如下：
①将医用0.9％胜利盐水180mL～200mL，转入到300mL密封洁净混合瓶，旋紧盖子并密封；
②将淋巴分离液转移到洁净的50mL离心管，每管近底部加10mL～15mL，旋紧盖子并密封；
③另取上述一次性采血袋(带采专用血针)1个和25mL移液管1个，以及上述已封装好的混合瓶1个和已封装好的离心管8个，包装于专用洁净盒中，消毒密封。
上述液体的转移采用一次性洁净的移液管或分液器，在百级洁净室或操作台完成，所用液体在转移中严禁污染或干扰，并留样检测无菌、内毒素含量。
实施例2：人外周血单个核和N-CIK细胞荧光鉴定试剂盒制备
按照表1购买试剂：荧光抗体(FITC-IgG\PE-IgG，FITC-CD3\PE-CD4，FITC-CD14\PE-CD19，FITC-CD3\PE-CD56，FITC-CD3\PE-CD8)，牛血清(FCS)，医用0.9％生理盐(NS)，磷酸缓冲液(PBS)和多聚甲醛(PFA)，并在洁净室内准备相关液体转移器具和一次性使用耗材；通过以下方法完成制备：
制备例1：外周血单个核细胞荧光鉴定试剂盒，包含20～30套装有P-1～3专用荧光抗体管(棕色避光)和洗涤液、固定液各1瓶，其中P-1～3的每个抗体管装有相应荧光抗体的比例和体积如表1所示。
制备例2：N-CIK细胞荧光鉴定试剂盒，包含20～30套装有C-1～4专用荧光抗体管(棕色避光)和洗涤液、固定液各1瓶，其中C-1～3的每个抗体管装有相应荧光抗体的比例和体积见如表1。
制备例中液体的转移采用一次性洁净的移液管或分液器，上述所有试剂耗材均在符合GMP标准洁净室或操作台包装完成，所用液体在转移中严禁污染或干扰，并留样进行无菌、内毒素检测。
供混合的每两种抗体按照表1装量比例装于1支专用棕色管中，固定液装于不透明试剂瓶中，可用于细胞在14天内保存。试剂盒采用20～30人份的包装规格。按照所述方法制备的细胞流式鉴定试剂盒可以用来对获得分离外周血单个核细胞和N-CIK细胞进行检测鉴定。
表1
实施例3：临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基制备
本实施例采用RPMI 1640和其他添加成分如：非必须氨基酸(100倍)、丙酮酸钠(100倍)、青霉素钠(1wIU/mL)以及硫酸链霉素(10mg/mL)制备而成，上述各试剂均可以购得，并在使用前取样进行无菌、内毒素相关检测。
本完全培养基含有人体细胞生长必需的碳水化合物、氮源、维他命、矿物质和水，其中添加成分包括：非必须氨基酸、丙酮酸钠、青霉素钠以及硫酸链霉素，分别添加总体积的1～2％。其中各种主要成分的含量见表2所示。
制备中液体的转移采用一次性洁净的移液管或分液器，所有试剂耗材均在符合GMP百级标准的洁净室或操作台包装完成，所用液体在转移中严禁污染或相互干扰，并留样检测无菌、内毒素含量，保证临床应用安全。
表2
实施例4：N-CIK诱导因子组合物试剂盒制备
本实施例包括N-CIK诱导因子组合物3套试剂盒NC-1～3，所有诱导因子或相关试剂都可向Peprotech、Invitrogen、Gibco、Hyclone生产商购得。
在制备之前需准备实验室器械、一次性洁净耗材，如移液或分液器、离心管、移液尖头、专用试剂瓶，经过清洁、消毒或者灭菌，入百级洁净室待用。
本实施例具体制备方法如下：
制备例3：N-CIK细胞诱导因子组合物NC-1。将检验合格的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和人干扰素γ用适当体积的RPMI 1640充分溶解且质量体积浓度分别控制在：0.5～1mg/L和20～80mg/L。根据表3所示的体积比例混合制备因子组合物。
制备例4：N-CIK细胞诱导因子组合物NC-2。将检验合格的人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗用适当体积的RPMI 1640充分溶解且质量体积浓度分别控制在：5～50mg/L、1～50wU/L和5～30mg/L。根据表4所示的体积比例混合制备因子组合物。
制备例5：N-CIK细胞诱导因子组合物NC-3，将检验合格的人白介素2、植物凝集素用适当体积的RPMI 1640充分溶解、混匀且质量体积浓度分别控制在：5-25wU/L和0.5-3g/L。根据表5所示的体积比例混合制备因子组合物。
表3
| 制备例3 | 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | 人干扰素γ |
| 配方A1 | 1 | 50 |
| 配方A2 | 0.2 | 15 |
表4
| 制备例4 | 人白介素1 | 抗CD3膜单抗 | 人白介素2 |
| 配方B1 | 1 | 1 | 2 |
| 配方B2 | 4 | 2.5 | 5 |
表5
| 制备例5 | 人白介素2 | 植物凝集素 |
| 配方C1 | 10 | 1 |
| 配方C2 | 7 | 0.8 |
制备在符合GMP百级标准的洁净室或操作台中进行，采用一次性洁净的移液管或移液尖头将上述制备中的相关试剂均包装入专用因子组合物管，所用液体在转移中严禁污染或相互干扰，并留样检测无菌、内毒素含量，保证临床应用安全。
实施例5：人外周血单个核细胞制备
制备开始前应自备如下试剂耗材：0.9％医用生理盐水、50mL离心管、25mL和10mL移液管、电动移液器或分液器。操作步骤如下：
①将实施例1制备的试剂盒经清洁消毒带入GMP百级洁净室中，取出其中一次性医用的含肝素抗凝剂采血袋，按照采集外周血操作要求采集患者外周血200mL，带回洁净室。
②将血液混匀转移到自备的洁净50mL离心管中，离心：200g、10分钟。
③离心后收集上清，灭活制备自体血浆。沉淀转入实施例1制备的试剂盒中的300mL密封洁净混合瓶中，充分混匀液体总体积为200mL～240mL；
④将稀释的血细胞用25mL移液管小心加到实施例1制备的试剂盒中的8支离心管的液体上方，严禁破坏两液体界面，配平后离心，170g、20分钟。
⑤分离后能够看到界面清晰地白膜(单个核细胞层)，用10mL移液管小心吸出白膜层细胞，放入另外自备的洁净的50mL离心管中，加入0.9％医用生理盐水洗涤4次，离心分别采用：200g、8分钟，180g、10分钟，180g、10分钟和170g、10分钟。
⑥收集并合并细胞沉淀，取样计数并留样进行细胞鉴定、无菌内毒素检测。
上述步骤中制备自体血浆的方法是：采用56℃、30分钟灭活，并适当离心去除包括补体在内的杂蛋白沉淀，最后取样进行无菌、内毒素检测。
本方法每100mL外周血可以获得60～80×106个外周血单个核细胞，采用实施例2的试剂盒对细胞进行鉴定，结果CD3+占60～70％、CD3+CD8+占20～40％，见附图1。
实施例6：N-CIK细胞诱导培养、扩增
操作开始前，需准备实施例3所述的试剂盒、必要操作器械和试剂耗材(见实施例5)，具体步骤如下：
①取实施例5中的检测合格的细胞，用实施例3的培养基调整为1×106个细胞/mL，加入体积比5％上述制备的合格的自体血浆和体积比0.1％实施例4中的因子组合物NC-1(配方A1)。放37℃、5％CO2条件下培养20～24小时。
②20～24小时后，向①中的细胞培养液中添加体积比0.1％的实施例4中的因子组合物NC-2(配方B1)。继续放37℃、5％CO2条件下培养48小时。
③72小时后，向①中的细胞培养液中添加体积比0.1％的实施例4中的因子组合物NC-2(配方B1)。同样条件继续培养。
④从诱导开始的第5天起，对细胞培养液进行添加新鲜培养液或者分瓶扩增培养，补充的新鲜培养基成分是含5％自体血浆和0.1％的实施例4中的因子组合物NC-3(配方C1)。
⑤重复添液、分瓶操作使细胞持续增殖，培养10～12天可得到培养液400mL～500mL，细胞浓度2～4×106个/mL。
⑥将上述细胞培养液收获总体积的一半。将细胞液转移到50mL洁净离心管中，离心180g、10分钟，收获并合并细胞沉淀，并采用同样的离心参数洗涤2次。期间取细胞液离心的上清做无菌检测，取细胞沉淀做细胞荧光鉴定。
在上述培养过成中，应在第4天取细胞培养液做无菌内毒素检测，在收获细胞的前一天取细胞液做内毒素检测。在收获并离心步骤中，采用自备0.9％医用生理盐水重悬和洗涤细胞。
上述方法获得的N-CIK细胞鉴定显示：CD3-CD56+(NK细胞)为(20±10)％，CD3+CD56+(CIK细胞)为(40±15)％CD3+CD8+为(65±10)％，见附图3
还应该理解，上述细胞培养过程及以下实施例中N-CIK细胞组合物制备都应在GMP要求的百级洁净室或者操作台进行，严格保证细胞及其制剂的质量安全。
实施例7：N-CIK细胞诱导培养、扩增
在上述实施例中用N-CIK细胞诱导因子组合物NC-1～3中的配方A2、B2、C2替换相应的诱导因子组合物添加量，重复相应操作诱导培养N-CIK细胞。
在上述实施例6、7中，也包括采用培养袋培养；此外应理解，本发明的实施例中涉及到的添加剂或者因子加入量只明示了其中某个比例，凡是试剂盒涉及NK和CIK细胞培养或鉴定、以及添加相关添加剂或者因子比例能满足在上述权利要求的浓度范围的都应属本发明要求保护之列。
实施例8：N-CIK细胞组合物制备以及临床应用
将上实施例中获得N-CIK细胞用0.9％医用生理盐水重悬，计数，在细胞重悬液中添加人白蛋白含量质量体积为2～3％，调整使总体积为100mL。
事先准备临床用100mL装0.9％医用生理盐水袋或者瓶，将上述细胞组合物装入其中，贴上说明标签。
待细胞组合物相应检测合格后，送临床实施自体N-CIK细胞治疗回输。
临床应用方法说明如下：
①N-CIK细胞组合物给药的途径优选：在手臂或者下肢采用8号针头输血器进行静脉滴注。
②所述N-CIK细胞组合物临床有效剂量包括：组合物含5×106～1×107个/mL细胞，体积80mL～100mL/个体，一疗程连续回输4次。
③从第一次回输治疗开始，每间隔一到两天再回输下一次。一个疗程结束后，可以间隔两到三个月后继续给药，建议实施多疗程回输治疗；如有必要，间隔时间为六个月或一年还可继续再治疗。
④N-CIK细胞临床回输治疗后进行疗效评价。
经过N-CIK细胞治疗1～2个疗程后，较治疗前患者生活质量明显改善，卡是平分提高10～20分；患者免疫功能有不同程度改善，其中细胞因子检测显示能够使Th1类细胞因子水平提高2～5倍。
Claims (2)
1.一种临床用单个核细胞的分离、N-CIK细胞的诱导培养以及产品质量控制鉴定的试剂盒体系，其特征还在于，包含人外周血单个核细胞分离试剂盒、诱导培养试剂盒和产品鉴定试剂盒，所述的N-CIK为NK细胞和CIK细胞；
人外周血单个核细胞分离试剂盒内包含一次性使用的带采血专用针的200mL肝素抗凝采血袋1个、内装150mL～240mL医用0.9％生理盐水的300mL密封洁净混合瓶和内装10mL～15mL淋巴分离液的50mL洁净离心管，25mL移液管；试剂耗材在符合GMP标准条件下包装于容器中；
产品鉴定试剂盒包括人外周血单个核细胞流式鉴定试剂盒和N-CIK细胞流式鉴定试剂盒；
人外周血单个核细胞流式鉴定试剂盒包含三组双色抗体组合物：三组双色抗体组合物分别是P-1：FITC-IgG\PE-IgG，P-2：FITC-CD3\PE-CD4，P-3：FITC-CD14\PE-CD19，100mL洗涤液1瓶，50mL固定液1瓶；
N-CIK细胞流式鉴定试剂盒包含四组双色抗体组合物：四组双色抗体组合物分别是C-1：
FITC-IgG\PE-IgG，C-2：FITC-CD3\PE-CD56，C-3：FITC-CD3\PE-CD8，C-4：FITC-CD3\PE-CD4，100mL洗涤液1瓶，50mL固定液1瓶；
人外周血单个核细胞流式鉴定试剂盒和N-CIK细胞流式鉴定试剂盒的所有试剂耗材均在符合GMP标准条件下包装制备，供混合的每两种抗体采用FITC和PE按照体积比1∶1混合并装于1支专用棕色管中，洗涤液成分是牛血清和医用生理盐水体积比2∶98，固定液成分是每100mL磷酸缓冲液含1～2g多聚甲醛；
诱导培养试剂盒内包括容器和装入容器中的临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基和三种诱导因子组合物：NC-1、NC-2、NC-3；
临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基含有人体细胞生长必需的碳水化合物、氮源、维他命、矿物质和水；并添加1～2％体积比的细胞培养添加剂，包括非必 需氨基酸、丙酮酸钠、青霉素钠以及硫酸链霉素；
N-CIK细胞诱导因子组合物NC-1，它含有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ和RPMI1640，且人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人干扰素γ的质量体积浓度分别为：0.5～1mg/L和20～80mg/L；
N-CIK细胞诱导因子组合物NC-2，它含有人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗和RPMI1640，且人白介素1、人白介素2、抗CD3膜单抗的质量体积浓度分别为：5～50mg/L、1～50wU/L和5～30mg/L；
N-CIK细胞诱导因子组合物NC-3，它含有人白介素2、植物凝集素和RPMI1640，且人白介素2和植物凝集素的质量体积浓度分别为：5-25wU/L和0.5-3g/L。
2.应用权利要求1所述的试剂盒体系制备N-CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①人外周血单个核细胞制备：采集患者外周血并分离纯化获得外周血单个核细胞，并对产品实施无菌内毒素检测以及表型鉴定；具体步骤如下：
(1)将权利要求1中的人外周血单个核细胞分离试剂盒经清洁消毒带入GMP百级洁净室中，取出其中一次性医用的含肝素抗凝剂采血袋，按照采集外周血操作要求采集患者外周血200mL，带回洁净室；
(2)将血液混匀转移到自备的洁净50mL离心管中，离心：200g、10分钟；
(3)离心后收集上清，灭活制备自体血浆；沉淀转入权利要求1中的人外周血单个核细胞分离试剂盒中的300mL密封洁净混合瓶中，充分混匀液体总体积为200mL～240mL；
(4)将稀释的血细胞用25mL移液管小心加到权利要求1中的人外周血单个核细胞分离试剂盒中的8支离心管的液体上方，严禁破坏两液体界面，配平后离心，170g、20分钟；
(5)分离后能够看到界面清晰地白膜，用10mL移液管小心吸出白膜层细胞，放入另外自备的洁净的50mL离心管中，加入0.9％医用生理盐水洗涤4次，离心分别采用：200g、8分钟，180g、10分钟，180g、10分钟和170g、10分钟；
(6)收集并合并细胞沉淀，取样计数并留样进行细胞鉴定、无菌内毒素检测；采用权利要求1中的产品鉴定试剂盒对细胞进行鉴定；
②取步骤①中的检测合格的细胞，第1天用权利要求1中的临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基和权利要求1中的诱导因子组合物NC-1，用权利要求1中的临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基调整细胞浓度为1×106个/mL外周血单个核细胞，加入体积比5％的自体血浆和体积比0.1％的权利要求1中的诱导因子组合物NC-1，置于75cm2培养瓶或培养袋在37℃，5％CO2培养箱中诱导培养10～24小时；
③第2天和第4天在上述培养液中添加权利要求1中的诱导因子组合物NC-2；
④按照权利要求1中的诱导因子组合物NC-3和临床用N-CIK细胞无血清液态完全培养基对N-CIK细胞的实施扩增培养；
⑤经过10～12天的扩增培养，收获达到临床应用标准的N-CIK细胞，并对产品实施无菌、内毒素检测以及表型鉴定。
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