CN105640991A - 一种治疗前列腺癌的car-t细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂及其制备方法，本发明的制剂由CAR-T细胞、人血白蛋白、生理盐水按一定比例配制而成。本发明所制备嵌合抗原受体（CAR）是hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ，该嵌合抗原受体由抗人PSA单克隆抗体anti-PSA轻链和重链可变区（hPSAscFv）、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内区、以及CD3ζ胞内信号区串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞（CAR-T细胞）用来治疗PSA阳性的前列腺癌，治疗效果显著，从根本上提供了一种治疗前列腺癌的方法。

Description

一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂及其制备方法。

背景技术

嵌合抗原受体是模拟T细胞受体功能的人工受体，由抗原识别结构域（配体或单链抗体）和T细胞的一系列信号结构域依次连接而成。利用嵌合抗原受体修饰T细胞能够将配体或抗体的特异识别作用与T细胞的效应功能联合起来，进行肿瘤靶向免疫治疗。此疗法是对人体自身T细胞加以改造后用于治疗，相对于放和化疗，其毒副作用较弱。由于嵌合抗原受体修的T细胞通过其抗原识别结构域识别肿瘤细胞表面抗原，然后启动杀伤作用，因此其治疗具有靶向性。由于该种T细胞通过其嵌合抗原受体直接识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过其信号结构域直接将识别信号传速至胞内，激活T细胞的杀伤活性，因此可以绕开常规细胞免疫的主要组织相容复合体（MHC）限制性，从而有效克服肿瘤细胞MHC表达量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白质肿瘤抗原。

前列腺癌（ProstateCancer，PCa）是常见男性泌尿系统恶性肿瘤，其死亡率已超过肺癌，成为严重威胁男性健康第二大恶性肿瘤。虽然早期PCa易治疗，生产率高，但是三期、四期PCa死亡率高，且易出现骨转移。PCa目前的治疗方式主要有手术，放疗和化疗。PCa切除术手术创伤大、术后尿失禁和勃起功能障碍的发生率极高，且手术死亡率亦高；而放疗和化疗带来的副作用大，会严重影响患者的生活质量。

PSA是一种含有237个氨基酸的单链多肽，具有组织特异性，只存在于人前列腺腺泡及导管上皮细胞胞浆中，不表达于其它细胞，血清PSA是前列腺癌的特异性标志物，而在正常细胞不表达。因此，PSA是前列腺癌靶向治疗的潜在位点。国外已有报道抗CD19-CAR-T细胞在B细胞肿瘤中的应用取得了良好的治疗效果，因此利用抗PSA-CAR-T细胞构建的嵌合抗原受体hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ表达于T细胞表面，使T细胞特异性杀伤PSA阳性的肿癌细胞，提高前列腺癌的治疗效果和晚期前列腺癌症患者的生存率，为前列腺癌患者的临床治疗提供一种新的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种新的有效的前列腺癌治疗方法，利用抗PSAscFv构建出的抗PSA嵌合抗原受体（hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ），表达该嵌合抗原受体的CAR-T细胞也具有其独特性，初步研究其肿瘤特异性杀伤功能，以进一步探讨其在临床治疗中的应用。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂，由嵌合了靶细胞抗原受体hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ的CAR-T细胞、人血白蛋白、生理盐水按一定比例配制而成。制剂的优选配比为：CAR-T细胞的浓度为（4～6）×107个/ml，质量体积比为2%的人血白蛋白，余量为生理盐水。

进一步的，所述CAR-T细胞中CAR为hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ，具体组成为：由抗人PSA单克隆抗体anti-PSA轻链和重链可变区hPSAscFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内区、以及CD3ζ胞内信号区串联构成；

进一步的，所述CAR-T细胞的靶细胞抗原为PSA。

进一步的，所述CAR-T细胞由一种表达载体所表达，其中，表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒的一种，优选慢病毒。

一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤：

（1）载体构建：构建能够表达hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ的载体；

（2）转染T细胞的病毒的包装：采用步骤（1）中构建的载体包装慢病毒，获得经过包装的慢病毒；

（3）T细胞分离与扩增培养：抽取患者自身血液，从中分离出T细胞并进行扩增培养；

（4）T细胞的转染与制备：采用步骤（2）中经过包装的慢病毒对步骤（3）中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；

（5）将步骤（4）制备的CAR-T细胞与人血白蛋白按比例混匀，余量用生理盐水补足，制备成CAR-T细胞制剂。

本发明相对于现有技术具有以下优点和效果：

（1）本发明首次将嵌合了前列腺癌细胞抗原受体的CAR-T细胞，用来治疗前列腺癌，治疗效果显著，从根本上提供了一种治疗前列腺癌的方法；

（2）本发明首次将嵌合了前列腺癌细胞抗原受体的CAR-T细胞与人血白蛋白联合制作成一种靶向治疗前列腺癌的免疫细胞制剂，人血白蛋白可以维持CAR-T细胞的活性。本制剂成分明确，制作简便，为CAR-T细胞的临床推广应用提供了更便捷的方法；

（3）本发明所选用的靶细胞抗原为PSA：PSA是前列腺癌的最重要的特异性标志物。70-80%的前列腺癌病人在发病期间都有PSA基因高表达的特征，PSA几乎表达于所有的前列腺癌细胞表面，而在其他细胞表面几乎不表达，在临床上被认为是前列腺癌的经典肿瘤标记物。因此采用PSA作为靶细胞抗原可以大大提高使CAR-T细胞特异性识别和杀伤前列腺癌细胞的能力，降低前列腺癌患者的复发和提高治疗效果；

（4）本发明采用的是第三代CAR，第三代CAR的重组T细胞能够增加γ-干扰素和抗细胞凋亡蛋白的分泌，在抗肿瘤活性、存活周期及细胞因子释放方面均显著提高。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施案例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

图1表示从患者外周血分离得到的T细胞体外培养扩增曲线。

图2体外培养扩增所得T细胞的活力测定。

图3显示用不同MOI值的慢病毒感染T细胞的感染效率（用FITC-标记的蛋白检测scFv在T细胞上的表达率）。

图4显示CAR-T细胞对PSA表达阳性的前列腺癌细胞PC3的特异性杀伤率。

具体实施方式

实施例1CAR-T细胞表达载体构建：

（1）PCR扩增目的片段抗PSA抗体以pCDNA3-scBW431/26-hFc质粒为模板设计引物，在其5'、3'端分别加上NheⅠ、SalⅠ限制性内切酶位点，CEAUpNheⅠ上游引物5'-AGGCTAGCATGGGATAGGAGCTGTATCAT-3'，PSA-HER2DnSalⅠ下游引物5'-AGGTCGACGGTATCGAATAAGCTTTG-3'，反应条件95℃预变性5min，95℃变性10s，68℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，扩增完成后取出2μL样品进行鉴定；

（2）双酶切LV-EF1α-Luciferase-PGK-FP635-WPRE载体、目的片段PSA--CD3-2A-GFP载体酶切体系为50μL：10×Greenbuffer5μL，载体3μL，NheⅠ酶1μL，SalⅠ酶1μL，H2O40μL；目的片段酶切体系为50μL：10×Greenbuffer5μL，目的片段回收产物2.5μL，NheⅠ酶1μL，EcoRV酶1μL，H2O39.5μL，37℃水浴锅3h。酶切完成后取出2μL样品进行鉴定；

（3）重组慢病毒载体LV-EF1α-PSA-2A-GFPWPＲE连接、转化、抽提及酶切鉴定连接体系为10μL:T4DNAligase10×buffer1μL，载体片段2μL，目的片段6μL，T4DNAligase1μL，连接过夜。将连接产物取出5μL加入装有感受态细菌（冰水混合状态）TOP10的1.5mLEP管中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴3min，加入800μLLB液体培养基，30℃，280r/min振荡培养1h；5000r/min离心2min，弃上清，留200μL吹打混匀后加入氨苄抗性的LB固体培养基上，用三角形玻璃棒涂匀，平板放入30℃恒温箱中培养过夜。挑取饱满的菌落于1∶1000的氨苄LB液体培养基中，30℃，280r/min，振荡培养12h。抽提方法参照美国Invitrogen公司质粒抽提试剂盒抽提，完成后取出2μL样品进行鉴定。

实施例2CAR-T病毒包装：

采用4质粒系统进行病毒包装，4质粒系统分别表达病毒载体包装所需的gag/pol，Rev，VSV-G，及工程稳定的单链抗体构成的人工嵌合抗原受体。将4质粒按比例进行瞬时转染。总质量为10μg。将上述质粒加入至一定体积的无菌水中，随后加入100μl2.5mmol/L的

CaCl2，向混合液中缓慢滴加2×HBS溶液500μl，将上述溶液加入至铺有293T细胞的培养皿中，轻轻混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中培养12h，加入含10%FBS的DMEM液体培养基8mL，继续培养48小时。收集转染后48h后的T细胞上清液，于4℃，2000r/min，离心5分钟，除去细胞碎片，用0.45μm滤器过滤上清液并分装，保存在-70℃。

实施例3T细胞的分离与扩增培养：

1）原血预处理：抽取患者外周血100ml并加入100μL肝素抗凝剂，然后分装到4个50ml的离心管；用生理盐水1：1对血液进行稀释并用移液管吹打混匀；

2）Ficoll法分离：将稀释后的血液小心加到含有15mlFicoll淋巴细胞分离液的50ml离心管中，每管约35ml，室温2000rpm离心20分钟；

3）T细胞的收集与洗涤：吸取两液面交接处的细胞层到50ml离心管内，用生理盐水补充至30ml混匀，室温2000rpm离心10分钟，待细胞沉淀后洗涤两次；

4）T细胞的扩增培养：将T细胞浓度调整为2×106个/皿接种到100mm培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待融合至80-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，扩大培养T细胞数为108-109，收集T细胞备用。

结果如图1所示，经过扩增培养12天后，T细胞扩增比例高于初始T细胞100倍以上，说明了经过上述培养方式，可以在短时间内扩增T细胞；用台盼蓝染色测定T细胞活力，结果如图2所示，细胞活力逐渐提高。

实施例4CAR-T细胞的转染与制备：

1）将20μg的RetroNectin，包备于6孔板内，置于37℃、5%CO2培养箱内培养3h；

2）吸取RetroNectin，利用含2.5%BSA的Hank’s封闭包备后的6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱内培养1h；

3）吸取封闭液，利用含2%Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板。加入含10%FBS的DMEM液体培养基，并加入适量的经过包装的病毒溶液，2000r/min，离心5分钟；

4）弃上清，加入2×106的T细胞，1500r/min，离心5分钟。置于37℃、5%CO2培养箱内培养，12h后重复上述步骤。感染5天后进行细胞收集，制备CAR-T细胞，感染后5天测定scFv的表达，通过流式细胞仪检测scFv的表达。结果如图3所示，经过慢病毒感染后的T细胞表面表达高阳性scFv，同时再次培养15天后，其scFv的表达任有91.9%，并未丢失表达。

实施例5CAR-T细胞对前列腺癌细胞杀伤率检测：

将本发明制备CAR-T细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定，实验组靶细胞为PSA表达阳性的前列腺癌细胞PC3，对照组靶细胞为PSA表达阴性的前列腺癌细胞PC3。按照效应细胞与靶细胞比例为5:1加入96孔培养板中，在37℃5%CO2培养过夜，采用MTT法测定波长为570nm处吸光度，结果如图3所示。

结果显示，本发明实验组所制备的CAR-T细胞对PSA表达阳性的前列腺癌细胞PC3的特异性杀伤活性74.9%，显著高于对照组21.4%（P<0.01）。说明本发明制备的PSA特异性的CAR-T细胞具有杀伤PSA阳性细胞的功能。

Claims (4)

1.一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂，其特征在于：由嵌合了靶细胞抗原受体hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ的CAR-T细胞、人血白蛋白、生理盐水按一定比例配制而成，制剂的优选配比为：CAR-T细胞的浓度为（4～6）×107个/ml，质量体积比为2%的人血白蛋白，余量为生理盐水。

2.根据权利要求1所述CAR-T细胞中CAR为hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ，CAR的具体组成为：由抗人PSA单克隆抗体anti-PSA轻链和重链可变区hPSAscFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内区、以及CD3ζ胞内信号区串联构成。

3.根据权利要求1所述一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤：

（1）载体构建：构建能够表达hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ的载体；

（2）转染T细胞的病毒的包装：采用步骤（1）中构建的载体包装慢病毒，获得经过包装的慢病毒；

（3）T细胞分离与扩增培养：抽取患者自身血液，从中分离出T细胞并进行扩增培养；

（4）T细胞的转染与制备：采用步骤（2）中经过包装的慢病毒对步骤（3）中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；

（5）将步骤（4）制备的CAR-T细胞与人血白蛋白按比例混匀，余量用生理盐水补足，制备成CAR-T细胞制剂。

4.如权利要求2所述的嵌合抗原受体hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ在制备嵌合抗原受体T细胞及其在前列腺癌治疗药物中的应用。