CN105368859A - 一种嵌合抗原受体hCD87-CAR及载有hCD87-CAR基因结构的慢病毒及质粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗，特别涉及一种嵌合抗原受体hCD87-CAR及载有该基因结构的慢病毒及质粒及其应用。在嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构中，所述嵌合抗原受体hCD87表达为hCD87scFv；所述hCD87scFv包括或选自下述scFv:(a)包括SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2所示氨基酸序列的scFv；(b)与(a)所示的scFv具有相同功能；(c)与(a)所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性的scFv。所述hCD87-CAR用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于细胞膜表面CD87阳性的肿瘤的治疗。

Description

一种嵌合抗原受体hCD87-CAR及载有hCD87-CAR基因结构的慢病毒及质粒及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗，特别涉及一种嵌合抗原受体hCD87-CAR及载有该基因结构的慢病毒及质粒及其应用。
背景技术
垂体腺瘤是临床上常见的颅内良性肿瘤之一，在颅内肿瘤发病中占10％-15％。近年来，垂体瘤的发生率呈不断上升的趋势，垂体瘤通常发生于青壮年时期。无激素分泌异常的垂体腺瘤(non-functionpituitaryadenoma,NFPA)往往局部占位症状重,常导致失明等症状。垂体瘤分泌激素亢进，可导致患者催乳素(prolactin，PRL)，促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropichormone，ACTH)等激素水平的增高，从而引起患者满月脸、向心性肥胖、痤疮、毛发增多、高血压、继发性糖尿病和骨质疏松等症状，特别对于女性患者，可导致流产不孕，月经失调，未孕泌乳等后果，对患者及其家庭带来极大伤害。
对于垂体腺瘤患者，像其它肿瘤患者一样，临床上发现时，患者体内肿瘤细胞已占优势，机体的抗肿瘤免疫功能已失去平衡。在这样的免疫系统微环境下，专职抗原提呈细胞-树突状细胞的功能往往受到不同程度的损害，造成抗原提呈激活T细胞的效率降低，导致攻击肿瘤细胞能力不够，靶向性也不够精准；并且，肿瘤细胞通过低表达或不表达MHC基因的分子逃逸机制，能够逃脱免疫细胞的攻击。这就需要一种在抗肿瘤作用中，不仅能够克服MHC介导的细胞免疫机制缺损，同时具备较强特异性杀伤能力并能够对肿瘤细胞具有精准靶向性的免疫疗法。于是，通过嵌合抗原受体设计的细胞免疫疗法CAR-T应运而生。
CAR-T细胞疗法通过外源基因转导技术，把识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段(single—chainantibodyfragment，scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，这样scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联，经回输患者体内后大量扩增，能够以非MHC限制性的模式表现出较强的抗肿瘤作用。
发明内容
为了治疗垂体无功能腺瘤、垂体泌乳素腺瘤、垂体促肾上腺激素腺瘤，本发明提供一种嵌合抗原受体hCD87-CAR及载有hCD87-CAR基因结构的慢病毒及质粒及其应用。
本发明利用基因工程获得编码嵌合抗原受体hCD87-CAR的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体的hCD87scFv。这种嵌合hCD87scFv的T细胞能够识别肿瘤表面的抗原受体hCD87，特异性杀伤hCD87阳性的肿瘤细胞，用于肿瘤的治疗。
在垂体腺瘤细胞膜表面hCD87基因抗原高表达，而人类各正常组织中基因表达谱数据集GSE3526，GSE7307以及TCGA数据库中癌旁组织数据分析则表示，hCD87抗原基因在各正常组织中表达水平极低，几乎与基因芯片背景信号一致这也说明hCD87抗原在垂体腺瘤中具有较好的表达特异性。
本申请采用下述技术方案：
本发明提供一种嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构，所述嵌合抗原受体hCD87表达为hCD87scFv；所述hCD87scFv包括或选自下述scFv:
(a)包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示氨基酸序列的scFv；
(b)与(a)所示的scFv具有相同功能；
(c)与(a)所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性的scFv。
hCD87scFv是抗人CD87单克隆抗体片段。
所述嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构可简称为hCD87-CAR基因结构。
所述hCD87-CAR基因结构用于修饰T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体的hCD87scFv。
本发明还提供一种核酸序列，所述核酸用于编码上述的hCD87scFv。
进一步的，所述嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构，其中，所述hCD87scFv包括轻链可变区和重链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.2所示。
上述hCD87scFv可通过CAR结构在T细胞表面表达，将T细胞导至肿瘤细胞。CAR结构是用于保证T细胞在体内存活和增殖的基因。CAR结构用于激活T细胞，使T细胞增殖的同时，特异性结合并杀伤肿瘤细胞。CAR结构还可使T细胞产生记忆，便于清除以后产生的肿瘤细胞。
将hCD87scFv进行密码子优化，优化后的基因片段，插入到合成慢病毒表达载体的骨架质粒中，构成hCD87scFv表达质粒，利用慢病毒的包装质粒将该骨架质粒在293T细胞中包装，构建完整的含有hCD87-CAR的慢病毒载体，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体hCD87的scFv。
进一步的，所述重链可变区的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.3所示。
进一步的，所述轻链可变区的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.4所示。
进一步的，在嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构中，所述结构由所述的嵌合抗原受体hCD87scFv和CAR结构串联而成。
进一步的，所述CAR结构包括CD8a铰链区、CD28、4-1BB、CD3z、和IL12，所述CD8a铰链区的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.5所示。
进一步的，所述CAR结构包括CD8a铰链区、CD28、4-1BB、CD3z、和IL12，所述CD8a铰链区的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.6所示。
进一步的，所述hCD87scFv的氨基末端含有一个CD8a信号肽，所述CD8a信号肽的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.7所示。
进一步的，所述hCD87scFv的氨基末端含有一个CD8a信号肽，所述CD8a信号肽的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.8所示。
进一步的，在hCD87scFv中，所述重链可变区和轻链可变区之间有连接肽。
进一步的，在hCD87scFv中，所述重链可变区和轻链可变区之间的连接肽的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.9所示。
进一步的，在hCD87scFv中，所述重链可变区和轻链可变区之间的连接肽的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.10所示。
进一步的，所述CAR结构中，所述IL12的核酸序列及连接序列如序列表中的SEQIDNO.13所示。
进一步的，所述hCD87-CAR基因结构由CD8a信号肽、hCD87scFv的重链可变区、连接肽、hCD87scFv的轻链可变区、连接肽、CD8a铰链区、CD28、4-1BB、CD3z、连接肽、和IL12(白介素)串联而成。
进一步的，所述hCD87-CAR的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.11所示。
进一步的，所述hCD87-CAR的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.12所示。
本发明还提供一种质粒，所述质粒载有所述的hCD87-CAR基因结构。
本发明还提供一种慢病毒，所述慢病毒载有所述的hCD87-CAR基因结构。
进一步的，所述的hCD87-CAR在制备hCD87-CAR-T细胞中的应用，及hCD87-CAR在肿瘤治疗药物中的应用。
用所述hCD87-CAR结构基因修饰后的T细胞，在hCD87scFv将T细胞导至肿瘤细胞后，T细胞活化、增殖，特异性结合并杀伤肿瘤细胞，并产生白介素12(Interleukin12，IL12)特异性杀伤肿瘤细胞。
进一步的，所述载有hCD87-CAR基因结构的质粒用于转染T细胞，使T细胞的表面表达有hCD87scFv。
本发明提供的嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于表面hCD87阳性的肿瘤的治疗。
与现有技术相比，本发明提供的hCD87-CAR基因结构用于修饰T细胞，修饰后的T细胞用于治疗实体肿瘤，主要用于治疗垂体腺瘤，特别用于治疗垂体无功能腺瘤、垂体泌乳素腺瘤、垂体促肾上腺激素腺瘤。
利用本发明所提供的hCD87-CAR基因结构改造后的T细胞获得了较强的特异性抗原激活能力，能有效的特异性杀伤肿瘤细胞。
附图说明
图1为本发明提供的hCD87-CAR的结构示意图；
图2为本发明提供的hCD87-CAR的结构示意图；
图3为本发明提供的Lenti-hCD87-CAR对T细胞进行感染的感染效率的共聚焦显微镜检测图；
图4A是共聚焦显微镜观察质粒转染T细胞的效率图；其中，纵坐标是转染效率，2D表示共聚焦显微镜二维成像；
图4B是共聚焦显微镜观察质粒转染T细胞的效率图；其中，纵坐标是转染效率，Z-Stack是三维荧光成像；
图5A是垂体腺瘤中的原代泌乳素瘤(PRL)肿瘤细胞、原代无功能性垂体腺瘤(NFPA)肿瘤细胞、和原代垂体促肾上腺激素腺瘤(Cushing)肿瘤细胞分别对hCD87-CAR-T细胞的诱导迁移作用的显微镜观察图；
图5B是hCD87抗原蛋白诱导hCD87-CAR-T细胞增殖的共聚焦检测图；
图5C是hCD87抗原蛋白诱导hCD87-CAR-T细胞增殖的MTT检测结果图；
图6A是流式细胞仪显示患者原代hCD87-CAR-T细胞对自身无功能垂体腺瘤肿瘤细胞的特异性杀伤效果图；
图6B是共聚焦显微镜显示患者原代hCD87-CAR-T细胞对自身无功能垂体腺瘤肿瘤细胞的特异性杀伤效果图；
图7是不同效靶比的患者原代hCD87-CAR-T细胞对垂体腺瘤NFPA，PRL和Cushing肿瘤细胞的的效靶比实验结果图；
图8A是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对人垂体无功能腺瘤组织块NOD-SCID移植瘤进行治疗的萤光素酶检测结果图；
图8B是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对自身垂体无功能腺瘤组织块NOD-SCID皮下移植瘤进行治疗后的包块直接测量结果图；
图9A是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对原代人垂体泌乳素腺瘤细胞进行体外共培养的萤光素酶检测结果图；
图9B是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对自身垂体泌乳素腺瘤组织块NOD-SCID移植瘤进行治疗的萤光素酶检测结果图；
图9C是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对自身垂体泌乳素腺瘤组织块NOD-SCID皮下移植瘤进行治疗后的包块直接测量结果图；
图10A是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对自身垂体促肾上腺激素腺瘤原代细胞的组织块NOD-SCID移植瘤进行治疗的萤光素酶检测结果图；
图10B是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对自身ACTH组织块NOD-SCID皮下移植瘤进行治疗后的包块直接测量结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，对本发明提供的技术方案进一步详细说明。
实施例1
制备hCD87-CAR基因结构。所述hCD87-CAR结构由人CD8a信号肽、重链可变区、连接肽、轻链可变区、连接肽、CD8a铰链区、CD28、4-1BB、CD3z、和IL12串联而成。hCD87-CAR基因结构可表示为：hCD87-scFv-CD8a-CD28-4-1BB-CD3z-IL12。
本实施例制得的hCD87-CAR基因结构的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.12所示。
实施例2
利用实施例1制得的hCD87-CAR基因结构包装慢病毒载体及对照载体。
分别表达为：
慢病毒载体：hCD87-CAR，
慢病毒对照载体：NC-CAR(NC：无hCD87scFv序列)。
慢病毒包装步骤
1、实验材料
包装质粒pMD2.G、psPAX和载体质粒:pCDH
293T细胞
DMEM完全培养基(美国Hyclone公司)：10％FBS、双抗
无血清培养基Opti-MEM(美国Invitrogen公司)
胎牛血清FBS(美国Gibco公司，货号：26140-079)
转染试剂：Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)
病毒浓缩试剂PEG-it(美国BioVision公司，货号：K904-50/200)
荧光显微镜
2、实验步骤
(1)慢病毒骨架质粒载体构建
1.1扩增实施例1提供的hCD87-CAR基因结构的hCD87scFv结构域，扩增产物带BamHI及EcoRI酶切位点；
1.2将PCR扩增产物与pYr-Lvsh载体分别用BamHI及EcoRI双酶切；
1.3酶切片段回收、连接、转化E.coliDH5α；
1.4提取质粒，将提取的质粒进行酶切鉴定。采用XhoI进行酶切，阳性质粒将切下约2kb的小片段。将酶切鉴定正确的质粒进一步测序验证；
1.5将鉴定正确的质粒测序验证，结果正确者为重组质粒pCDH-hCD87-CAR；
本步骤得到了包括hCD87-CAR基因结构的质粒。
(2)293T细胞接种
将生长状态良好的293T细胞用0.25％胰蛋白酶消化制备单细胞悬液并调整浓度为4×105个/ml，取10ml接种于10cm培养皿中。37℃，5％CO2培养箱内培养过夜，第二天细胞汇合度达到80％。
(3)病毒包装
将3μgpMD2G、6μgpsPAX和步骤(1)得到的载体质粒7.5μg加到150μlOPTI-MEM内混匀；取25μlLipo2000加入到500μlOPTI-MEM内混匀，室温静置5min，将质粒混合物缓慢加入Lipo2000，混匀后室温静置15分钟(min)。逐滴加入到培养皿内，充分混匀。6小时(h)后更换为含10％FBS的DMEM新鲜培养液。(质粒要求：浓度1μg/μl，纯度OD260/OD280的值在1.8-2.0范围内)。
本步骤正在生产慢病毒。
(4)收集上清浓缩病毒
细胞培养48h后荧光显微镜下检测感染效果，收集培养基(含慢病毒)，1500g，4℃，离心10min去细胞碎片。然后用0.45μm滤膜过滤病毒上清液。所得过滤液，按照过滤液：浓缩液为4：1的体积比，加入5×PEG-it病毒浓缩液。4℃静置过夜后，3200g，4℃，离心20min。弃去上清，用含5％FBS的DMEM培养液重悬病毒团块。200μl/管分装，-80℃保存，余下10μl病毒用于滴度测定。
本步骤得到了载有hCD87-CAR基因结构的慢病毒的浓缩液。
也得到了对照慢病毒载体。
实施例3
利用实施例2提供的慢病毒载体和对照载体，分别感染至人JurkatT细胞株或人外周血原代T细胞，
按照嵌合抗原受体的表达分为：
hCD87-CAR-T组，
NC-CAR-T组；(无hCD87scFv)
NS组(生理盐水组)。
人外周血原代或JurkathCD87-CAR-T细胞制备
1、分离T细胞
2、活化T细胞
2.1所需材料
PBS、灭菌水、OKT3(1mg/ml)(抗人CD3单克隆抗体)、CD28mAb(1mg/ml)、RetroNectin(重组人纤维连接蛋白)、hIL-2、24-孔板(非细胞培养板)、RPMI1640完全培养基(含10％FBS、100U/ml氨苄青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/lGlutaMAX-I)
2.2实验步骤
第0天抗体包被24孔板
(1)在非细胞培养板24孔板标记所需的孔位；
(2)抗体稀释：将OKT3和CD28mAb用灭菌水稀释至1μg/ml(例如，需要包被6个孔，取3ml灭菌水，然后分别加3μlOKT3和3μlCD28mAb，混匀)；
(3)在标记的孔内加0.5ml抗体稀释液；
(4)封口膜封闭培养板周边，4℃水平放置，过夜。
第1天活化PBMC
(1)弃去抗体包被液，用1mlRPMI1640培养液洗一遍；
(2)弃去培养液，每孔中加2ml新鲜制备的PBMC(5x105个/ml)；
(3)将培养板放入37℃，5％CO2培养箱培养24小时。
第2天PBMC换液和RetroNectin包被24孔培养板
(1)PBMC换液并添加IL-2，每孔吸去1ml培养液并添加1ml新鲜RPMI1640完全培养基(含有200U/mlIL-2)，然后放入37℃，5％CO2培养箱继续培养；
(2)RetroNectin包被，用PBS稀释RetroNectin，浓度为20ng/μl，每孔加0.5ml，根据实验需要包被合适孔数；
(3)封口膜封闭培养板周边，水平放置，4℃过夜。
3、包含有hCD87-CAR的慢病毒载体(简称为Lenti-hCD87-CAR)感染活化T细胞
第3天Lenti-hCD87-CAR感染活化人原代T细胞或人JurkatT细胞株
(1)收集活化T细胞，将活化T细胞收集于15ml离心管，400g，离心5min，并用RPMI1640完全培养基重悬细胞，计数，然后均分至5个1.5ml离心管，每管400μl；
(2)设置不同的MOI感染组，为了获得满意的感染效率，设置5组不同的MOI值(MOI分别为1、5、10、20、40)，并根据MOI值、每组T细胞数量以及Lenti-hCD87-CAR病毒滴度(TU)计算每组感染所需要添加的病毒量；
(3)病毒感染根据计算结果每管加入相应的病毒液，将1.5ml离心管置于37℃培养箱静止30min；
(4)将1.5ml离心管的细胞和病毒混合液转移至RetroNectin包被的培养孔，每孔添加1mlRPMI1640完全培养基和终浓度100U的IL-2；
(5)将24孔培养板置于37℃培养箱继续培养。
4、包含有hCD87-CAR的慢病毒载体感染效率检测
第6天T细胞感染效率检测
在T细胞感染后72小时，可对T细胞感染效率进行检测，因为Lenti-hCD87-CAR带有2A-eGFP序列，可以在荧光显微镜下初步判断感染效率。
(1)轻轻吹打孔内细胞，转移至1.5ml离心管，400g，离心5min，弃去上清后先用PBS重悬细胞；
(2)取出大约1×106个细胞进行共聚焦显微镜检测，通过GFP信号判断感染效率。
如图3所示，荧光显微镜下初步判断感染效率，病毒对T细胞的感染效率是62％。
5、包含有hCD87-CAR的慢病毒载体(Lenti-hCD87-CAR)的保存
收到病毒液后于-80℃或更低温度的环境中保存(若存放于4℃，需于一周内用完)。如需多次使用，由分装后保存，避免反复冻融，以免降低病毒滴度。通常情况病毒可于-80℃稳定保存约6个月，超过此期限后，需要重新检测病毒滴度。
慢病毒单位标识为TU/ml，即每毫升慢病毒液中含有具有生物活性的慢病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1×108TU/ml，即每毫升病毒液中至少含有1×108个具有生物活性的病毒颗粒。“TU”为“TransducingUnits”的缩写，中文为转导单位，表示可以感染并进入到目标细胞群中的病毒基因组数。
3、hCD87-CAR基因结构表达的测序验证
取1×106个细胞，TRIzoL提取细胞总RNA，并逆转录合成cDNA第一链后，PCR扩增含hCD87-CAR基因结构片段。hCD87scFv的DNA片断上游引物为5’-CCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTT3’，如序列表中的SEQIDNO.14所示；下游引物为5’-CAGGAAGACCGGCACGAAGGATCCG3’，如序列表中的SEQIDNO.15所示；扩增产物为787bp。
直接测序后对扩增片段进行序列比对，结果证明转hCD87-CAR-T细胞模型准确。
实施例4
利用实施例2的步骤(1)得到的质粒直接转染人原代T细胞，得到人原代hCD87-CAR-T细胞。
如图4A和图4B所示，质粒转染T细胞的效率为20％。
实施例5
利用实施例3制备的人JurkathCD87-CAR-T细胞，Transwell检测原代垂体腺瘤肿瘤细胞对人JurkathCD87-CAR-T细胞的迁移作用。
具体方法如下：
所有细胞培养试剂和Transwellchamber放在37℃温育，待测细胞培养生长24小时后用10％血清培养基1640悬浮细胞，计数，调整浓度为5×105细胞/ml；在Transwell下室(即24孔板底部)加入1.25ml含相应比例的原代垂体腺瘤肿瘤细胞，上室加入200μl细胞悬液，继续在孵箱培养10-24小时；用镊子小心取出chamber(小室)，吸干上室液体，移到预先加入约600μl甲醛的孔中，室温固定5-10分钟；取出chamber，吸干上室固定液，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，移到预先加入约600μl台盼蓝染液的孔中，室温染色3-5分钟；轻轻用PBS冲洗浸泡二次，取出chamber，吸去上室液体，底面朝上晾干；用小镊子小心揭下膜，移至载玻片上，盖上盖玻片；显微镜下取4个随机视野计数，统计结果，取平均值。
Transwell检测垂体腺瘤细胞对hCD87-CAR-T细胞的诱导迁移作用，检测结果如图5A所示。
如图5A所示，垂体腺瘤中的原代泌乳素瘤(PRL)肿瘤细胞、原代无功能性垂体腺瘤(NFPA)肿瘤细胞、原代垂体促肾上腺激素腺瘤(Cushing)肿瘤细胞对hCD87-CAR-T细胞的诱导迁移作用较强。
利用实施例3制备的人JurkathCD87-CAR-T细胞，检测hCD87抗原蛋白诱导人JurkathCD87-CAR-T细胞的增值作用
人JurkathCD87-CAR-T细胞用1×106个/孔接种到6孔板中过夜，每孔添加1mlRPMI1640完全培养基和终浓度100U的IL-2每孔加入hCD87抗原蛋白终浓度0.1μM，37℃5％CO2孵箱孵育72小时，在激光共聚焦显微镜下检测荧光蛋白(EGFP)表达绿色荧光并拍照(图5B)，并使用MTT比色法检测hCD87抗原蛋白诱导人JurkathCD87-CAR-T细胞的增值情况，并在490nm处记录光密度值(OD)(图5C)。
如图5B所示，共聚焦显微镜显示，12小时，hCD87抗原蛋白诱导hCD87-CAR-T细胞增殖较明显。
如图5C所示，hCD87抗原蛋白诱导hCD87-CAR-T细胞增殖的MTT检测表明，hCD87抗原蛋白浓度在100-1000ng/ml时，诱导hCD87-CAR-T细胞增殖的MTT检测细胞增殖效果最强。
实施例6
利用实施例2制备的慢病毒感染患者外周血中分离的原代T细胞，得到该患者原代hCD87-CAR-T细胞，检测此原代CD87-CAR-T细胞对该患者自身原代无功能垂体腺瘤肿瘤细胞的特异性杀伤效果。患者已签署知情同意书。
6孔板每孔添加1mlRPMI1640完全培养基，将手术所得该患者自身肿瘤组织进行原代培养，得到人原代垂体无功能腺瘤细胞1×106个/孔接种到6孔板中，37℃5％CO2孵箱孵育24小时后，PBS清洗一次，每孔加入2000个人原代hCD87-CAR-T细胞进行共培养，添加RPMI1640完全培养基和终浓度100U的IL-2，37℃5％CO2孵箱孵育72小时，分别使用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测该患者原代hCD87-CAR-T细胞对自身无功能垂体腺瘤肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
该患者原代hCD87-CAR-T细胞对自身原代无功能垂体腺瘤肿瘤细胞的特异性杀伤效果如图6A和图6B所示。
如图6A所示，流式细胞仪显示该患者原代hCD87-CAR-T细胞对自身无功能垂体腺瘤肿瘤细胞的特异性杀伤效果，在24-48小时，肿瘤细胞大量凋亡。
如图6B所示，共聚焦显微镜显示，患者原代hCD87-CAR-T细胞对自身无功能垂体腺瘤肿瘤细胞的特异性杀伤效果，72小时，肿瘤细胞大量死亡。实施例7
利用实施例2制备的慢病毒感染不同患者原代T细胞，得到不同患者原代hCD87-CAR-T细胞。患者已签署知情同意书。
不同患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对各自垂体腺瘤NFPA，PRL或Cushing肿瘤细胞的效靶比检测。
根据乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒的步骤：接种100μl1×104个/孔的靶细胞(垂体腺瘤细胞)到96孔板中，按不同效靶比ET值(0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1、16:1)加入人原代hCD87-CAR-T细胞补培养液至200μl37℃5％CO2共培养72小时后，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在接种靶细胞的培养孔中加入试剂盒提供的乳酸脱氢酶LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％(20μl)。加入LDH释放试剂后反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育1小时后，将细胞培养板用多孔板离心机400×离心5min，分别取各孔的上清液120μl加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入60μlLDH检测工作液。混匀室温约25℃，避光孵育30min，可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，然后在490nm波长处测定光密度值。在效靶比ET值＝2：1时，人原代hCD87-CAR-T细胞就能达到较好的杀瘤效果，约为ET＝0.5:1时的两倍(见图7)。此体外实验说明我们构建的人原代hCD87-CAR-T细胞具有所期望的良好杀瘤效果。
实施例8
利用实施例2制备的慢病毒感染患者原代T细胞，得到患者原代hCD87-CAR-T细胞，利用患者原代hCD87-CAR-T细胞，对患者自身垂体无功能腺瘤重型免疫缺陷鼠NOD-SCID组织块皮下移植瘤模型进行干预实验。重型免疫缺陷鼠NOD-SCID购买自维通利华生物科技有限公司。患者已签署知情同意书。
实验结果表明我们构建的患者原代hCD87-CAR-T细胞具有所期望的良好的杀伤垂体无功能腺瘤效果。
实验步骤如下：
1、NOD-SCID2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mg/kg)，将带有无功能腺瘤细胞的新鲜组织切成3×3×3mm3的组织块移植于NOD-SCID左腋窝皮下，建立对应人垂体无功能腺瘤手术组织块重型免疫缺陷鼠NOD-SCID移植瘤模型。分别在移植后第5、10、15、20、和25天进行历史和影象分析。对移植部位皮下肿块进行测量，明确肿瘤包块大小。当肿瘤包块长到体积为3cm3左右，进行下面第2步实验。
2、NOD-SCID2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mg/kg)，将200μl1×106hCD87-CAR-T细胞在NOD-SCID移植瘤模型包块形成的第1、2和3周分别进行尾静脉注射。分别在首次注射后第5、10、15、20、25天进行FX-PRO活体成像分析。并对移植部位皮下肿块进行测量。结果如图8A和图8B所示。
图8B中的纵坐标为肿瘤包块的体积。对于NOD-SCID皮下的包块，能够利用游标卡尺测量，得出包块的体积。
如图8A所示，患者原代hCD87-CAR-T细胞模型在体内第25天达到特异性杀伤肿瘤的最佳效果，肿瘤缩小了95％以上，而对照组可能由于T细胞缺少膜表面的hCD87scFv，对肿瘤抗原hCD87特异性结合不强，或未能有效激活T细胞的肿瘤特异性杀伤作用造成无效。如图8A和图8B所示，上述实验结果验证了患者原代hCD87-CAR-T在体内对垂体无功能腺瘤NOD-SCID移植瘤的特异性杀伤能力较强。
实施例9
利用实施例4制得的患者原代hCD87-CAR-T细胞进行体外肿瘤细胞杀伤实验和体内NOD-SCID移植瘤实验。患者已签署知情同意书。
实验结果表明患者原代hCD87-CAR-T能够有效地特异性杀伤患者自身垂体泌乳素腺瘤。
实验步骤如下：
1、NOD-SCID2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mg/kg)，将带有垂体泌乳素腺瘤细胞的新鲜组织切成3×3×3mm3的组织块移植于重型免疫缺陷鼠NOD-SCID左腋窝皮下，建立对应人垂体泌乳素腺瘤手术组织块重型免疫缺陷鼠NOD-SCID移植瘤模型。分别在移植后第5、10、15、20、25天进行历史和影象分析。对移植部位皮下肿块进行测量，明确肿瘤包块大小。当肿瘤包块长到体积为3cm3左右，进行下面第2步实验。
2、NOD-SCID2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mg/kg)，将200μl1×106hCD87-CAR-T细胞在重型免疫缺陷鼠NOD-SCID移植瘤模型包块形成的第1、2和3周分别进行尾静脉注射。分别在首次注射后第5、10、15、20、25天进行FX-PRO活体成像分析。并对移植部位皮下肿块进行测量。结果如图9B和图9C所示。
图9A是患者原代hCD87-CAR-T细胞模型对患者自身原代人垂体泌乳素腺瘤细胞进行体外共培养的萤光素酶检测结果图；体外肿瘤细胞杀伤实验如图9A所示，hCD87-CAR-T细胞对原代人垂体泌乳素腺瘤细胞有杀伤作用，能使原代人垂体泌乳素腺瘤细胞过早死亡。
如图9B所示，在人垂体泌乳素腺瘤手术组织块NOD-SCID移植瘤模型上，患者原代hCD87-CAR-T细胞模型在体内第25天达到特异性杀伤肿瘤的最佳效果，肿瘤缩小了95％以上，而对照组可能由于T细胞缺少膜表面的hCD87scFv，对肿瘤抗原CD87特异性结合不强，或未能有效激活T细胞的肿瘤特异性杀伤作用造成无效。图9C中的纵坐标为肿瘤包块的体积。对于NOD-SCID皮下的包块，能够利用游标卡尺测量，得出包块的体积。如图9A、图9B和图9C所示，患者原代hCD87-CAR-T细胞能够有效地特异性杀伤肿瘤。上述实验结果验证了患者原代hCD87-CAR-T在体内对患者自身垂体泌乳素腺瘤原代细胞的特异性杀伤能力较强。
实施例10
利用实施例4制得的患者原代hCD87-CAR-T细胞进行NOD-SCID移植瘤实验。患者已签署知情同意书。
实验结果表明患者原代hCD87-CAR-T能够有效特异性杀伤垂体促肾上腺激素腺瘤。
实验步骤与实施例8相同，检测结果如图10A和图10B所示。
如图10A所示，患者原代hCD87-CAR-T细胞模型在体内第25天达到特异性杀伤肿瘤的最佳果，肿瘤缩小了75％，而对照组可能由于T细胞缺少膜表面的hCD87scFv，对肿瘤抗原hCD87特异性结合不强，或未能有效激活T细胞的肿瘤特异性杀伤作用造成无效。图10B中的纵坐标为肿瘤包块的体积。对于NOD-SCID皮下的包块，能够利用游标卡尺测量，得出包块的体积。如图10A和图10B所示，患者原代hCD87-CAR-T细胞能够有效地特异性杀伤肿瘤。上述实验结果验证了患者原代hCD87-CAR-T在体内对患者自身垂体促肾上腺激素腺瘤的特异性杀伤能力较强。
统计实验：利用本发明实施例2提供的载有hCD87-CAR基因结构的慢病毒或质粒分别感染或转染200位患者的T细胞，分别构建hCD87-CAR-T细胞模型，再用hCD87-CAR-T细胞模型分别进行NOD-SCID移植瘤实验。这200位患者分别患有垂体促肾上腺激素腺瘤、或者垂体泌乳素腺瘤、或者垂体无功能腺瘤。患者均签署知情同意书。统计实验的结果均与上面实施例8-10的实验结果相似。统计实验的实验结果验证了患者原代hCD87-CAR-T在体内对患者自身垂体促肾上腺激素腺瘤、或者垂体泌乳素腺瘤、或者垂体无功能腺瘤的特异性杀伤能力较强。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。

Claims (15)

1.一种嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述嵌合抗原受体hCD87表达为hCD87scFv；所述hCD87scFv包括或选自下述scFv:
(a)包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示氨基酸序列的scFv；
(b)与(a)所示的scFv具有相同功能的scFv；
(c)与(a)所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性的scFv。
2.一种核酸序列，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1所示的hCD87scFv。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述hCD87scFv包括轻链可变区和重链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.2所示。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述重链可变区的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.3所示。
5.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述轻链可变区的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.4所示。
6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述结构由权利要求1所示的hCD87scFv和CAR结构串联而成。
7.根据权利要求6所述的hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述CAR结构包括CD8a铰链区、CD28、4-1BB、CD3z、和IL12，所述CD8a铰链区的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.5所示。
8.根据权利要求6所述的hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述CAR结构包括CD8a铰链区、CD28、4-1BB、CD3z、和IL12，所述CD8a铰链区的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.6所示。
9.根据权利要求6所述的hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述hCD87scFv的氨基末端含有一个CD8a信号肽，所述CD8a信号肽的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.7所示。
10.根据权利要求6所述的hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述hCD87scFv的氨基末端含有一个CD8a信号肽，所述CD8a信号肽的核酸序列如序列表中的SEQIDNO.8所示。
11.根据权利要求3所述的hCD87-CAR基因结构，其特征在于，在hCD87scFv中，所述重链可变区和轻链可变区之间有连接肽。
12.根据权利要求7所述的hCD87-CAR基因结构，其特征在于，所述IL12的核酸序列及连接序列如序列表中的SEQIDNO.13所示。
13.一种质粒，其特征在于，所述质粒载有权利要求1所述的hCD87-CAR基因结构。
14.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒载有权利要求1所述的hCD87-CAR基因结构。
15.根据权利要求1所述的hCD87-CAR在制备CD87-CAR-T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用。
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