CN108484778A

CN108484778A - 人源化ghr106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用

Info

Publication number: CN108484778A
Application number: CN201810275498.0A
Authority: CN
Inventors: 李吉祐
Original assignee: Chi Yu Gregory Lee
Current assignee: Chi Yu Gregory Lee
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: CN108484778B

Abstract

本发明提供了人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用，所述构建体具有序列表7所示核苷酸序列，所述核酸包含该构建体，可应用于免疫细胞，对于肿瘤的治疗具有重要应用价值。

Description

人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用。

背景技术

促性腺激素释放激素(GnRH)受体位于特定细胞类型的外膜上。通过与GnRH受体的特异性结合，脑下垂体前叶会释放GnRH。GnRH为一种能够刺激促性腺激素(促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH))释放的十肽激素。研究发现，GnRH或其类似物可以对癌细胞具有抗增殖作用(Pati,D.,et a l.,Endocrin(1995)136:75-84；Choi,K.C.,et al.,J ClinEndocrinol&Metab(2001)86:5075-5078,)。GnRH类似物已被用于治疗人类不同的癌症和生育调节上的疾病。

GHR106单克隆抗体是由被对应于人类GnRH受体的细胞外结构域的合成肽免疫的老鼠所产生。GHR106表现为GnRH类似物，但GHR106拥有比本领域其它已知的GnRH类似物更长的半衰期。GnRH类似物在这数十年来已被用于治疗人类不同的癌症以及生育调节上的疾病。

美国专利号9,273,138(2016年3月1日)公开了鼠源化GHR106和人源化GHR106的核苷酸和氨基酸序列。生物化学和免疫学实验证实，鼠源化GHR106和人源化GHR106对人类GnRH受体的细胞外结构域具有高特异性和亲和力，而这些结构域在许多不同组织起源的癌细胞表面上都有表达。此外，这两种形式的GHR106与GnRH肽类似物雷同，可以诱导癌细胞的体外凋亡，但与GnRH肽类似物不同的是这两种形式的GHR106还可以诱导癌细胞的补体依赖性细胞毒性反应。

T细胞疗法(CAR-T)技术中的嵌合抗原受体(CAR)结合了T细胞免疫疗法，基因疗法和免疫疗法。CAR-T已被用于癌症治疗。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)修饰患者的T细胞，让T细胞表达CAR抗原受体，而让其识别肿瘤细胞上的表面抗原。使用CAR-T治疗癌症的尝试取得了一些成功。通过使用CD19相关的CAR平台去治疗不同类型的血液癌症就是一些成功的实例。US8916381公开了一种用CAR-T治疗白血病的方法。Brentijens等人(Molecular Therapy:Treatment of Chronic Lymphocytic Leukemia with GeneticallyTargeted Autologous T Cells:Case Report of an Unforeseen Adverse Event in aPhase I Clinical Trial.18Vol.Elsevier,04/01/2010)进行了用CAR-T治疗慢性淋巴细胞性白血病的临床试验。修饰过的T细胞能够识别在大多数B细胞恶性肿瘤上表达的CA19。

尽管如此，这些选择性靶向和杀死癌细胞的构建体和方法仍然有需要改进的地方。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供具有上述构建体的核酸分子。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述核酸分子的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体，为信号肽(Signalpeptide)–GHR106scFv–CD8-4-1BB-cD3Z-2A-IL7，其核苷酸序列为图2D所述序列，具有序列表7所示核苷酸序列。

优选的，上述人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体，其氨基酸为图2E所述序列，具有序列表8所示氨基酸序列。

上述人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体的核苷酸序列中：

信号肽(Signal peptide)所示核苷酸序列：

gccgccaccatggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccc

信号肽(Signal peptide)所示氨基酸序列：

AATMALPVTALLLPLALLLHAARP

GHR106scFv所示核苷酸序列：

aggttcagctgcaagagtctggccctggcctggtcaagcctagcgaaacactgagcctgacctgtaccgtgtccggcttcagcctgagcagatacagcgtgcactggatcagacagcctccaggcaaaggcctggaatggatcggcatgatttggggcggaggcagcaccgactacaaccctagcctgaagtccagagtgaccatcagcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgagcagcgtgacagccgccgacaccgccatgtactattgcgccagaggcaacgacggctactacagctttgcctattggggccagggcaccctggtcacagttagctctggaggcggaggttctggtggcggaggaagtggcggcggaggatctgacatcgtgatgacacagagccctgatagcctggccgtgtctctgggagagagagccaccatcaactgcaagagcagccagagcctgctgaacagccggaccagaaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggacagtctcccaagctgctgatctactgggccagcaccagagaaagcggcgtgcccgatagattttctggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaatttctagcctgcaagccgaggacgtggccgtgtactactgcaagcagagctacaacctgtacaccttcggccagggcaccaagctggaaatcaagaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccgga

GHR106scFv所示氨基酸序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSRYSVHWIRQPPGKGLEWIGMIWGGGSTDYNPSLKSRVTISKDNSKSQVFLKMSSVTAADTAMYYCARGNDGYYSFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLYTFGQGTKLEIK

CD8所示核苷酸序列：

ggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgta

CD8所示氨基酸序列：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

4-1BB所示核苷酸序列：

agcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaac

4-1BB所示氨基酸序列：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE

cD3Z所示核苷酸序列：

tgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggg

cD3Z所示氨基酸序列：

LRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

2A所示核苷酸序列：

agggcagaggcagcctgctgacatgtggcgacgtggaagagaaccctggcccca

2A所示氨基酸序列：

EGRGSLLTCGDVEENPGP

IL7所示核苷酸序列：

tgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacactaataa

IL7所示氨基酸序列：

MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

上述构建体包含人源化GHR106单克隆抗体或其中片段的核苷酸序列。

上述构建体用于在体外或体内转染和表达的人源化GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段。

一种被分离的核酸分子，包含上述构建体。

优选的，上述核酸分子，所述人源化GHR106单克隆抗体或其中片段具有序列表1所示氨基酸序列的重链。

优选的，上述核酸分子，所述人源化GHR106单克隆抗体或其片段的重链是由序列表2所示核苷酸序列编码而成。

优选的，上述核酸分子，所述人源化GHR106单克隆抗体或其片段具有序列表3所示氨基酸序列的轻链。

优选的，上述核酸分子，所述人源化GHR106单克隆抗体或其片段的轻链是由序列表4所示核苷酸序列编码而成。

优选的，上述核酸分子，所述人源化GHR106的重链可变区为序列表5所示氨基酸序列。

优选的，上述核酸分子，所述人源化GHR106的轻链可变区为序列表6所示氨基酸序列。

优选的，上述核酸分子，所述人源化GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段与人类的GnRH受体的细胞外结构域结合之特异性基本上等同于在美国专利第9273138号中公开的人源化GHR106单克隆抗体或其片段。

优选的，上述核酸分子，包含用于将表达出的蛋白质导向细胞膜的信号结构域的核苷酸序列，具有序列表9所示序列，所述信号结构域包含白介素2信号传导氨基酸序列，具有序列表10所示序列。

优选的，上述核酸分子，包含铰炼和跨膜结构域的核苷酸序列，具有序列表11所示序列，所述铰炼和跨膜结构域是用于连接细胞外人源化的GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段和细胞内共刺激结构域和信号结构域，所述铰炼和跨膜结构域包含来自CD8的铰炼和跨膜结构域，具有序列表12所示氨基酸序列。

优选的，上述核酸分子，包含共刺激结构域的核苷酸序列，具有序列表13所示序列，所述共刺激结构域共同刺激T细胞以改善体内CAR构建体的持续性，所述共刺激结构域可包含4-1BB共刺激结构域，具有序列表14所示氨基酸序列。

优选的，上述核酸分子，包含用于在T细胞内信号传导的信号结构域的核苷酸序列，具有序列表15所示序列，所述信号结构域包含CD3(TCR)分子的ζ亚基，具有序列表16所示氨基酸序列。

优选的，上述核酸分子，包含自切割肽的核苷酸序列，具有序列表17所示序列，所述自切割肽包含2A自切割肽，具有序列表18所示氨基酸序列。

优选的，上述核酸分子，包含细胞因子结构域的核苷酸序列，具有序列表19所示序列，所述细胞因子结构域可包含IL7结构域，具有序列表20所示氨基酸序列(具有如图2E所示的细胞因子结构域IL7的氨基酸序列)。

优选的，上述核酸分子，具有如图3所示的一般结构。

优选的，上述核酸分子，序列如图2D所示，包含序列表7所示的核苷酸序列。

优选的，上述核酸分子，序列如图2E所示，包含序列表8所示的氨基酸序列所编码而成的多肽。

优选的，上述核酸分子，具有由序列7的核苷酸序列所表达的蛋白质的氨基酸序列所编码而成的多肽。

优选的，上述核酸分子，包含多肽的核苷酸序列，所述多肽具有：

信号结构域；

跨膜结构域；

CD3-zeta信号结构域；与

细胞因子结构域；

其中所述多肽从N末端至C末端包含

信号结构域，人源化GHR106单克隆抗体或其片段，跨膜结构域，CD3-zeta信号结构域和细胞因子结构域；

所述细胞因子结构域可包含IL-7或其片段。

一种用于在免疫细胞中转染和表达人源化GHR106单克隆抗体或其片段的载体，包含任一项前述核酸分子。

优选的，上述载体，包含核苷酸序列如图2D所示、氨基酸序列如图2E所示。

所述载体可包含质粒。

所述载体具有CAR构建体。

一种适于转染到T细胞或NK细胞的慢病毒载体，具有任一项前述核酸分子。

优选的，上述慢病毒载体，包含序列7所述的核苷酸序列。

优选的，上述慢病毒载体，具有由序列8所述氨基酸序列所编码而成的多肽。

一种免疫细胞，包括T细胞或天然杀伤(NK)细胞，具有如前述任一项要求中的核酸分子，载体或慢病毒载体。

优选的，上述免疫细胞，包括T细胞或天然杀伤(NK)细胞，利用CAR-T免疫疗法或群聚且有规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)基因编辑技术嵌入核酸分子于T或NK免疫细胞中。

上述免疫细胞(T或NK免疫细胞)在制备癌症治疗药物方面的应用。

优选的，上述免疫细胞的应用，所述癌症的癌细胞表面拥有GHR106癌性免疫球蛋白的高表达。

上述免疫细胞(T或NK免疫细胞)在制备涉及高表面表达GnRH受体的疾病治疗药物方面的应用。

优选的，上述免疫细胞的应用，所述药物的治疗作用是利用被核酸分子、载体、或慢病毒载体转染的免疫细胞(其中所述免疫细胞可包含T细胞或NK细胞)，该转染促使免疫细胞在体外或体内都能够表达人源化GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段在表面上。

优选的，上述免疫细胞的应用，所述药物的治疗作用是人源化GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段在免疫细胞表面上的表达会导致对癌细胞的选择性杀伤，而此选择性杀伤可包含诱导癌细胞凋亡或引起细胞毒性进而杀死癌细胞。

优选的，上述免疫细胞的应用，所述癌症包括卵巢癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，胰腺癌，食管癌，结肠癌，肺癌或肾癌。

优选的，上述免疫细胞的应用，转染细胞作为癌症治疗药物重新导入患者体内。

优选的，上述免疫细胞的应用，将转染细胞(T或NK免疫细胞)分离出来并将细胞储存在冷冻状态，可以是长期的储存；所述冷冻细胞可以在未来可能发生的自发性癌症中为特定个人解冻，并进行紧急治疗。

优选的，上述免疫细胞的应用，转染细胞为T细胞或NK细胞，是哺乳动物细胞或人类细胞。

优选的，上述免疫细胞的应用，药物使用受体为哺乳动物或人类。

优选的，上述免疫细胞的应用，所述方法为：

修饰T细胞以表达CAR，其中CAR包括

信号结构域；

跨膜结构域；

CD3-zeta信号结构域；与

抗原结合结构域，此抗原结合结构域包含

与GHR106有同等亲和力的多肽而使能与人类GnRH受体的细胞外结构域结合；和

以此修饰过的人类T细胞用予人类。

本发明的有益效果是：

本发明提供了人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子，可应用于免疫细胞，对于肿瘤的治疗具有重要应用价值。

附图说明

图1A-图1D显示从抗体稳定细胞系(UY464-GHR106)推导的人源化GHR106基因(SEQID NOs.:1-4)的核苷酸和氨基酸序列。为了产生稳定的细胞系载体DNA，GHR106抗体的重链和轻链被克隆到专门用于生产稳定细胞系的LakePharma载体中。这质粒DNA被放大转染，并存放在-20℃的DNA库存中；此DNA的一部分会用于稳定细胞系的发育。

图2A显示含有GHR106基因(GHR106-4-1BB-CD3Z-2A-IL7)CAR慢病毒载体的构建示意图；图2B和2C分别显示了GHR106重链和轻链的单链变异区片的蛋白质序列(序列5和6)；图2D显示了GHR106 CAR盒构建体的核苷酸序列(序列7)；图2E显示了GHR106 CAR盒构建体(序列8)的蛋白质序列。虽然图2D和2E的序列被分成不同部分以说明所得CAR构建体的不同结构域，但序列是连续的。

图3显示在慢病毒构建体中的GHR106 CAR以公开GHR106 CAR盒构建体(GHR106-scFv-4-1BB-CD3Z-2A-IL7)的基因序列。在该示例中，GHR106 CAR盒构建体的基因序列以质粒的形式存在，这质粒被称为转移质粒因为它含有嵌入物。它将与其他三种带有不同慢病毒部分序列的质粒一起用于转染293T细胞以产生病毒。

CAR组件的缩写：

EF-1 alpha promoter:用于启动T细胞CAR表达的启动子。

IL2ss:白细胞介素2信号序列，用于引导细胞膜上的CAR表达。

GHR106 scFv:GHR106单克隆抗体的单链可变结构域。scFv是由重链可变结构域和轻链可变结构域所组成的单肽链。这是CAR构建的核心，因为它赋予CAR其特异性。

CD8 hinge&TM:CD8分子的铰炼和跨膜结构域，用于连接细胞外的scFv和细胞内的共刺激结构域和信号结构域。

4-1BB costimu latory domain:4-1BB分子的一个结构域，用于共同刺激T细胞以改善体内CAR-T的持久性。

CD3 zeta:CD3(TCR)分子的ζ亚基，负责T细胞内的信号传导。

2A:一个短的自切割肽序列，让一个相同的RNA得以表达两种蛋白质。经过翻译后，含有两种蛋白质的长肽在2A序列区域进行自切割。

IL7:一种对T细胞发育有重要影响的细胞因子。

构造上其他组件的缩写：

WPRE:土拨鼠肝炎病毒转录后的调控组件。通过增加核出口以刺激转基因表达的序列。

3’LTR:通过在R序列之后添加多腺苷酸以终止从5'LTR开始的转录。

RSV:组成型启动子。

5’LTR:与RNA pol II启动子有相同功能。根据定义，转录本从R开始被加帽，并通过U5和原病毒的其他地方。

Gag:带有Matrix，Capsid和Nucleocapsid的慢病毒颗粒的前体结构蛋白。

RRE:响应元素，与Rev蛋白结合的序列。

env:VSV-G包膜蛋白。

cppt:聚嘌呤区中心；原病毒DNA合成的识别位点。提高转导效率和转基因表达。

图4显示通过核酸内切酶消化的hGHR106BBZ构建体验证。

图5A和5B显示通过慢病毒滴定显示滴度的qPCR标准曲线。图5A显示了WPRE的标准曲线，图5B显示了ALB的标准曲线。

图6A和6B显示利用Ct值所制定的标准曲线以测定拷贝数，进而验证CAR的表达。图6A显示了ALB的标准曲线，图6B显示了LTR的标准曲线。

图7A-图7C显示了以LDH测定法(BID4G-CAR-IL15＝RP215-CAR-T；BIG4G-CAR-IL15＝GHR106-CAR-T)所验证的CAR-T可行性。此方法利用CAR-T去裂解靶肿瘤细胞。此LDH测定重复了三次，结果示于图7A-C。

图8A-图8C显示了以ELISA测定法(BID4G-CAR-IL15＝RP215-CAR-T；BIG4G-CAR-IL15＝GHR106-CAR-T)所验证的CAR-T构建体的可行性。此方法利用细胞因子的脱落来验证。

图8D-图8F显示了以ELISA测定法(BID4G-CAR-IL15＝RP215-CAR-T；BIG4G-CAR-IL15＝GHR106-CAR-T)所验证的CAR-T构建体的可行性。此方法利用细胞因子的脱落来验证。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

本发明提供了人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体(CAR)构建体。这种CAR构建体在转染T细胞后会表达人源化GHR106的scFv片段，这些scFv片段与通过细胞培养研究进行体外验证后的人源化GHR106对癌细胞上的人类GnRH受体有相似的亲和力和特异性。

人源化GHR106是人源化形式的GHR106单克隆抗体，它能够特异性地识别出在许多不同组织起源的癌细胞表面上都有高度表达的人类GnRH受体的细胞外结构域。在将本发明所述带有人源化GHR106基因的慢病毒CAR(嵌合抗原受体)构建体转染到从个体患者分离的T细胞或NK细胞中时，被CAR转染的免疫细胞会表达人源化GHR106的scFv链。这种免疫球蛋白链会与癌细胞表面上表达的GnRH受体反应并导致癌细胞的细胞毒性杀伤。因此，此CAR系统可用于人类激素敏感型癌症的治疗应用。

与GHR106相关的CAR-T技术在癌症免疫治疗中的应用可以利用CAR转染过的T细胞来实现。转染过的T细胞可以表达GHR106的scFv，并与癌细胞表面的GnRH受体反应，进而在体外和体内诱导肿瘤细胞的凋亡和相关的细胞毒性杀伤。

可将带有GHR106的CAR构建体转染至从个别患者分离出来的T细胞。这些来自特定患者并有修饰过的T细胞可以通过体外培养来扩增，然后将这些T细胞再输回到相同的患者。这项带有GHR106的CAR构建体的癌症免疫疗法的疗效可以通过肿瘤生长的抑制或减缓来证实或临床观察(实施例1-4(特别是实施例3)间接或直接证明了CAR-T细胞能够杀死靶肿瘤细胞，进而证实这项带有GHR106的CAR构建体的癌症免疫疗法的疗效)。

鉴于几乎所有人类癌细胞表面都有表达GnRH受体，可以预期带有GHR106的CAR构建体可以被广泛的应用于具有高GnRH受体表达的所有人类癌症的治疗上。

一些具体方案中，可以使用CAR-T以外的其它基因疗法。这些疗法可让免疫细胞表达GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段，而使其与人类GnRH受体的细胞外结构域结合。例如，可以使用群聚且有规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术将合适的载体嵌入免疫细胞中，而使免疫细胞表达GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段，并使其与在许多组织起源的癌细胞都有表达的人类GnRH受体的细胞外结构域结合。可利用的免疫细胞可以是T细胞或天然杀伤(NK)细胞。

Lee的US9273138公开了人源化GHR106基因的核苷酸序列，并通过重复测序和分子生物学分析验证了序列。现已建立并公开了生产此抗体的稳定细胞系(见图2A-2E)。所建立的稳定细胞系产生的抗体序列与先前用于比较生物等效研究的鼠源化GHR106的序列已被证实是相同的。合成的嵌合抗原受体(CAR)全长被亚克隆到lentio-Puro载体中。这个嵌入片段则是通过Sanger测序被证实。

图2A显示了含有GHR106基因(GHR106-4-1BB-CD3Z-2A-1L7)的CAR慢病毒载体的构建示意图。GHR106抗体的重链和轻链被克隆到专门用于生产稳定细胞系的LakePharma载体中。这质粒DNA被放大转染，并存放在-20℃的DNA库存中；此DNA的一部分会用于稳定细胞系的发育。

根据建立的框架所合成的GHR106 CAR盒构建体全长被亚克隆到lentio-Puro载体中。这个嵌入片段由通过Sanger测序被证实。图2D显示了GHR106 CAR盒构建体(SEQ IDNO.7)的核苷酸序列。

所建立的稳定细胞系产生的抗体序列与先前用于比较生物等效研究的鼠源化和人源化GHR106的序列已被证实是相同的。图2B和2C分别显示了GHR106重链和轻链的蛋白质序列(序列5和6)。图2E显示了GHR106 CAR盒构建体(序列8)的蛋白质序列。

实施例1

从稳定细胞系产生的抗体中推导的hGHR106基因的核苷酸序列

hGHR106基因的核甘酸序列是由稳定细胞系所生产的抗体推导而出。如图1B和1D所示，由CHO稳定细胞系产生的hGHR106基因(U464和Y464)的核苷酸序列与通过瞬时表达产生的scFv链的核苷酸序列是一致的。此scFv链是由U464和Y464单链中的可变结构域透过连接体连接而成。此构建体的构建是通过核酸内切酶消化而验证，并示意在图4中。

hGHR106-4-1BB-CD3Z-2A-1L7(hGHR106BBZ7)是透过Qiagen质粒maxi试剂盒备制的。通过一系列的体外活性测试进行了此CAR构建体的验证，这包括了(1)CAR表达测试，(2)CAR结合测定，(3)利用CAR转染的T细胞而进行的细胞杀伤测定，(4)细胞毒性测定，(5)细胞凋亡测定，(6)脱颗粒测定，(7)细胞因子释放测定和(8)增殖测试。

验证测试结果符合GHR106BBZ7 CAR盒构建体预期的结果。因此，此盒构建体可被用在未来的临床应用上。

实施例2

利用细胞毒性杀伤癌细胞的测定所作的GHR106验证lenti-B1D4G-CAR-IL15

在成功建立GHR106-CAR(称为lenti-B1G4G-CAR-IL15)后，是为慢病毒载体验证所需的慢病毒滴定步骤备制。慢病毒是经由下列步骤构建完成：首先将聚乙烯亚胺和慢病毒载体所需之脱氧核糖核酸充分混合后，再将脱氧核糖核酸/聚乙烯亚胺复合物加入细胞培养皿中。之后分离含有慢病毒颗粒的培养基并保存在-80℃。qPCR标准曲线的高滴度(如图5A和5B所示)显示了lenti-B1G4G-CAR-IL15构建的成功。此慢病毒滴定的结果也总结在表1中。

按照从捐赠人提供的原代T细胞的分离的标准程序，CAR表达的验证是经由制作ALB和LTR的标准曲线来读取拷贝数而确定。结果示于图6A和6B和表2。CAR-T细胞中的平均CAR基因拷贝数测定为3.6/细胞。这些qPCR结果显示，构建的B1G4G-CAR-IL15的基因有成功的转染入T细胞。这些结果验证了CAR的特异性表达。

表1

表2

实施例3

利用CAR-T对靶肿瘤细胞进行裂解

利用子宫颈癌细胞系(ATCC HTB-31)的C33A肿瘤细胞作为靶肿瘤细胞，并在标准细胞培养条件下以三种不同的E/T比与CAR-T细胞一起培养。在共同培养C33A肿瘤细胞和CAR-T细胞8小时后，收集上清液以测定LDH降低的量。此实验重复三次并进行比较(如图7A-C所示)。裂解测定的结果证明CAR-T细胞能够杀死靶肿瘤细胞，而其效果与剂量有很强烈的关联。与转染的T细胞(lenti-B1G4G-CAR-IL15T细胞)相比，未转染的T细胞也显示出低度的溶细胞效应。不受理论的束缚，这种高背景可能是因为测定系统中抗CD3和抗CD28抗体活化了未转染的T细胞。CAR-T细胞所造成的肿瘤细胞裂解明显具有统计学意义(P 0.05-0.001)。

实施例4

与肿瘤细胞共同培养的Car-T细胞释放的细胞因子的证明

在共同培养C33A癌细胞与CAR-T细胞8小时后，不同细胞因子的分泌是通过典型的酶免疫测定法(EIA)来测定且定量，并重复3次。这些细胞因子包括1L2,1L7和IFN-Y。图8A-F显示并比较了细胞因子释放的EIA的结果。细胞因子释放测定结果表明了在与未转染的T细胞相比，与肿瘤细胞共同培养的CAR-T细胞释放出了更多的细胞因子。

从上述这些实施例得出结论：CAR-T细胞(用lenti-B1G4G-CAR-IL15转染的T细胞)可以有效地导致在体外共同培养的肿瘤细胞的细胞毒性杀伤，并最终导致体外或体内显著的抗癌功效。1)慢病毒滴定的结果表明，本发明成功制备了高滴度的慢病毒载体。2)qPCR结果证明慢病毒的基因有转导入T细胞。3)裂解测定结果证明CAR-T细胞能够杀死靶细胞，而其效果与剂量有关联。未转导的T细胞也显示出细胞溶解作用，这可能是由抗CD3和抗CD28的抗体激活未转导的T细胞而产生的。4)细胞因子释放测定结果证明，CAR-T细胞与靶细胞共同培养后所分泌的细胞因子多于未转导的T细胞。

上述参照实施例对该一种人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 李吉祐

<120> 人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用

<150> 62/480229

<151> 2017-03-31

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 471

<212> PRT

<213> GHR106氨基酸序列的重链(Heavy chain for GHR106)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(471)

<400> 1

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly

20 25 30

Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val

35 40 45

Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro

50 55 60

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp

85 90 95

Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala

100 105 110

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Asp Gly Tyr Tyr Ser

115 120 125

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470

<210> 2

<211> 1416

<212> DNA

<213> GHR106核苷酸序列的重链(Heavy chain for GHR106)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(1416)

<400> 2

atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60

ctgagctacg gccaggttca gttgcaagag tctggtcccg gcctggttaa accctctgag 120

actttgagct tgacatgcac cgtaagcggc ttctctctga gccggtactc tgtacactgg 180

attcgacagc ctcctggcaa gggcctggaa tggattggca tgatctgggg cggcggaagt 240

acagattata acccttcctt gaagagccgc gtcaccatct ctaaggacaa cagcaagtcc 300

caggtcttcc tgaagatgtc aagcgtcacc gctgccgaca ccgccatgta ctactgtgca 360

cgggggaatg acggatacta cagtttcgca tattggggcc agggaacact ggttacagtg 420

tctagtgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccctctgg cccccagcag caagagcacc 480

agcggcggaa ccgccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga gcccgtgacc 540

gtgtcctgga acagcggcgc tctgaccagc ggagtgcaca ccttccctgc cgtgctgcag 600

agcagcggcc tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc ccagcagcag cctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720

gagcctaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccctccct gccccgcccc cgagctgctg 780

ggcggaccca gcgtgttcct gttccctccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 840

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcctcg ggaggagcag 960

tacaactcca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgctcccat cgagaagacc 1080

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag cctcaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 1140

gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccacccct 1260

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggatag 1416

<210> 3

<211> 239

<212> PRT

<213> GHR106氨基酸序列的轻链(Light chain for GHR106)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(239)

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 4

<211> 720

<212> DNA

<213> GHR106核苷酸序列的轻链(Light chain for GHR106)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(720)

<400> 4

atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60

gatatcgtaa tgactcagtc ccccgatagc ctcgctgtgt cattgggtga acgggcaact 120

attaactgta agtcatcaca aagcctcctt aattctagga ccaggaaaaa ctacctggca 180

tggtatcaac agaagccagg acagtcacca aagctgctga tctactgggc ttctacaaga 240

gagagtggag tgccagaccg cttctccggc tccgggagcg gcactgattt taccctcact 300

atcagctccc ttcaggcaga ggatgtggcc gtgtactatt gcaagcagag ctacaacctc 360

tacaccttcg gccaggggac taaactggaa attaagcgga ccgtggccgc ccccagcgtg 420

ttcatcttcc ctcccagcga cgagcagctg aagtctggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 480

ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 540

agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctacagcctg 600

agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 660

gtgacccacc agggactgtc tagccccgtg accaagagct tcaaccgggg cgagtgctaa 720

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> GHR106重链可变区的氨基酸序列(GHR106 Heavy Chain scFv)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(118)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asn Asp Gly Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> GHR106轻链可变区的氨基酸序列(GHR106 Light Chain scFv)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(112)

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 2079

<212> DNA

<213> GHR106嵌合抗原受体构建体核苷酸序列(GHR106 CAR cassette construct)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(2079)

<400> 7

gaattcgccg ccaccatggc cctccctgtc accgccctgc tgcttccgct ggctcttctg 60

ctccacgccg ctcggcccca ggttcagctg caagagtctg gccctggcct ggtcaagcct 120

agcgaaacac tgagcctgac ctgtaccgtg tccggcttca gcctgagcag atacagcgtg 180

cactggatca gacagcctcc aggcaaaggc ctggaatgga tcggcatgat ttggggcgga 240

ggcagcaccg actacaaccc tagcctgaag tccagagtga ccatcagcaa ggacaacagc 300

aagagccagg tgttcctgaa gatgagcagc gtgacagccg ccgacaccgc catgtactat 360

tgcgccagag gcaacgacgg ctactacagc tttgcctatt ggggccaggg caccctggtc 420

acagttagct ctggaggcgg aggttctggt ggcggaggaa gtggcggcgg aggatctgac 480

atcgtgatga cacagagccc tgatagcctg gccgtgtctc tgggagagag agccaccatc 540

aactgcaaga gcagccagag cctgctgaac agccggacca gaaagaacta cctggcctgg 600

tatcagcaga agcccggaca gtctcccaag ctgctgatct actgggccag caccagagaa 660

agcggcgtgc ccgatagatt ttctggctct ggcagcggca ccgacttcac cctgacaatt 720

tctagcctgc aagccgagga cgtggccgtg tactactgca agcagagcta caacctgtac 780

accttcggcc agggcaccaa gctggaaatc aagaccacta ccccagcacc gaggccaccc 840

accccggctc ctaccatcgc ctcccagcct ctgtccctgc gtccggaggc atgtagaccc 900

gcagctggtg gggccgtgca tacccggggt cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg 960

gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt 1020

aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 1080

actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 1140

gaactgcgcg tgaaattcag ccgcagcgca gatgctccag cctacaagca ggggcagaac 1200

cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg 1260

agaggacggg acccagaaat gggcgggaag ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg 1320

tacaacgagc tccaaaagga taagatggca gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg 1380

gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag 1440

gacacctatg acgctcttca catgcaggcc ctgccgcctc gggagggcag aggcagcctg 1500

ctgacatgtg gcgacgtgga agagaaccct ggccccatgt tccatgtttc ttttaggtat 1560

atctttggac ttcctcccct gatccttgtt ctgttgccag tagcatcatc tgattgtgat 1620

attgaaggta aagatggcaa acaatatgag agtgttctaa tggtcagcat cgatcaatta 1680

ttggacagca tgaaagaaat tggtagcaat tgcctgaata atgaatttaa cttttttaaa 1740

agacatatct gtgatgctaa taaggaaggt atgtttttat tccgtgctgc tcgcaagttg 1800

aggcaatttc ttaaaatgaa tagcactggt gattttgatc tccacttatt aaaagtttca 1860

gaaggcacaa caatactgtt gaactgcact ggccaggtta aaggaagaaa accagctgcc 1920

ctgggtgaag cccaaccaac aaagagtttg gaagaaaata aatctttaaa ggaacagaaa 1980

aaactgaatg acttgtgttt cctaaagaga ctattacaag agataaaaac ttgttggaat 2040

aaaattttga tgggcactaa agaacactaa taatctaga 2079

<210> 8

<211> 687

<212> PRT

<213> GHR106嵌合抗原受体构建体氨基酸序列(GHR106 CAR cassette construct)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(683)

<400> 8

Ala Ala Thr Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly

20 25 30

Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val

35 40 45

Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro

50 55 60

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp

85 90 95

Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala

100 105 110

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Asp Gly Tyr Tyr Ser

115 120 125

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala

165 170 175

Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg

180 185 190

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn

245 250 255

Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

275 280 285

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

290 295 300

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

305 310 315 320

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

325 330 335

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

340 345 350

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

355 360 365

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly

485 490 495

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Phe

500 505 510

His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val

515 520 525

Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly

530 535 540

Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp

545 550 555 560

Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe

565 570 575

Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe

580 585 590

Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly

595 600 605

Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu

610 615 620

Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly

625 630 635 640

Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu

645 650 655

Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu

660 665 670

Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

675 680 685

<210> 9

<211> 73

<212> DNA

<213> 信号结构域的核苷酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(73)

<400> 9

gccgccacca tggccctccc tgtcaccgcc ctgctgcttc cgctggctct tctgctccac 60

gccgctcggc ccc 73

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 信号结构域的氨基酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(24)

<400> 10

Ala Ala Thr Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 11

<211> 134

<212> DNA

<213> 铰炼和跨膜结构域的核苷酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(134)

<400> 11

ggcatgtaga cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg ggtcttgact tcgcctgcga 60

tatctacatt tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc ctgctgcttt cactcgtgat 120

cactctttac tgta 134

<210> 12

<211> 69

<212> PRT

<213> 铰炼和跨膜结构域的氨基酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(69)

<400> 12

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 13

<211> 123

<212> DNA

<213> 共刺激结构域的核苷酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(123)

<400> 13

agcgcggtcg gaagaagctg ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga 60

ctactcaaga ggaggacggc tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg 120

aac 123

<210> 14

<211> 41

<212> PRT

<213> 共刺激结构域的氨基酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(41)

<400> 14

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

35 40

<210> 15

<211> 339

<212> DNA

<213> 信号结构域的核苷酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(339)

<400> 15

tgcgcgtgaa attcagccgc agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc 60

tctacaacga actcaatctt ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag 120

gacgggaccc agaaatgggc gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca 180

acgagctcca aaaggataag atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac 240

gcagaagagg caaaggccac gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca 300

cctatgacgc tcttcacatg caggccctgc cgcctcggg 339

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> 信号结构域的氨基酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(113)

<400> 16

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 自切割肽的核苷酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(54)

<400> 17

agggcagagg cagcctgctg acatgtggcg acgtggaaga gaaccctggc ccca 54

<210> 18

<211> 18

<212> PRT

<213> 自切割肽的氨基酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(18)

<400> 18

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 19

<211> 536

<212> DNA

<213> 细胞因子结构域的核苷酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(536)

<400> 19

tgttccatgt ttcttttagg tatatctttg gacttcctcc cctgatcctt gttctgttgc 60

cagtagcatc atctgattgt gatattgaag gtaaagatgg caaacaatat gagagtgttc 120

taatggtcag catcgatcaa ttattggaca gcatgaaaga aattggtagc aattgcctga 180

ataatgaatt taactttttt aaaagacata tctgtgatgc taataaggaa ggtatgtttt 240

tattccgtgc tgctcgcaag ttgaggcaat ttcttaaaat gaatagcact ggtgattttg 300

atctccactt attaaaagtt tcagaaggca caacaatact gttgaactgc actggccagg 360

ttaaaggaag aaaaccagct gccctgggtg aagcccaacc aacaaagagt ttggaagaaa 420

ataaatcttt aaaggaacag aaaaaactga atgacttgtg tttcctaaag agactattac 480

aagagataaa aacttgttgg aataaaattt tgatgggcac taaagaacac taataa 536

<210> 20

<211> 177

<212> PRT

<213> 细胞因子结构域的氨基酸序列(Synthetic Construct)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(177)

<400> 20

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His

Claims

1.一种人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体，其特征在于：为Signalpeptide–GHR106 scFv–CD8-4-1BB-cD3Z-2A-IL7，具有序列表8所示氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的人源化GHR106单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体，其特征在于：具有序列表7所示核苷酸序列。

3.权利要求1所述构建体包含人源化GHR106单克隆抗体或其中片段的核苷酸序列，用于在体外或体内转染和表达的人源化GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段。

4.一种被分离的核酸分子，其特征在于：包含权利要求1所述构建体。

5.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：所述人源化GHR106单克隆抗体或其中片段具有序列表1所示氨基酸序列的重链。

6.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：所述人源化GHR106单克隆抗体或其片段的重链是由序列表2所示核苷酸序列编码而成。

7.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：所述人源化GHR106单克隆抗体或其片段具有序列表3所示氨基酸序列的轻链。

8.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：所述人源化GHR106单克隆抗体或其片段的轻链是由序列表4所示核苷酸序列编码而成。

9.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：所述人源化GHR106的重链可变区为序列表5所示氨基酸序列。

10.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：所述人源化GHR106的轻链可变区为序列表6所示氨基酸序列。

11.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：具有序列表9所示序列，所述信号结构域包含白介素2信号传导氨基酸序列，具有序列表10所示序列。

12.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：包含铰炼和跨膜结构域的核苷酸序列，具有序列表11所示序列，所述铰炼和跨膜结构域是用于连接细胞外人源化的GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段和细胞内共刺激结构域和信号结构域，所述铰炼和跨膜结构域包含来自CD8的铰炼和跨膜结构域，具有序列表12所示氨基酸序列。

13.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：包含共刺激结构域的核苷酸序列，具有序列表13所示序列，所述共刺激结构域共同刺激T细胞以改善体内CAR构建体的持续性，所述共刺激结构域可包含4-1BB共刺激结构域，具有序列表14所示氨基酸序列。

14.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：包含用于在T细胞内信号传导的信号结构域的核苷酸序列，具有序列表15所示序列，所述信号结构域包含CD3(TCR)分子的ζ亚基，具有序列表16所示氨基酸序列。

15.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：包含自切割肽的核苷酸序列，具有序列表17所示序列，所述自切割肽包含2A自切割肽，具有序列表18所示氨基酸序列。

16.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：包含细胞因子结构域的核苷酸序列，具有序列表19所示序列，所述细胞因子结构域可包含IL7结构域，具有序列表20所示氨基酸序列。

17.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于：具有由序列7的核苷酸序列所表达的蛋白质的氨基酸序列所编码而成的多肽，所述多肽具有：

信号结构域；

跨膜结构域；

CD3-zeta信号结构域；与

细胞因子结构域；

其中所述多肽从N末端至C末端包含

所述细胞因子结构域可包含IL-7或其片段。

18.一种用于在免疫细胞中转染和表达人源化GHR106单克隆抗体或其片段的载体，其特征在于：包含任一项前述核酸分子。

19.一种适于转染到T细胞或NK细胞的慢病毒载体，其特征在于：具有任一项前述核酸分子。

20.一种免疫细胞，其特征在于：包括T细胞或天然杀伤细胞，具有如前述任一项要求中的核酸分子，载体或慢病毒载体。

21.根据权利要求20所述的免疫细胞，其特征在于：包括T细胞或天然杀伤细胞，利用CAR-T免疫疗法或群聚且有规律间隔的短回文重复序列基因编辑技术嵌入核酸分子于T或NK免疫细胞中。

22.权利要求20所述免疫细胞在制备癌症治疗药物方面的应用。

23.根据权利要求22所述的免疫细胞的应用，其特征在于：所述癌症的癌细胞表面拥有GHR106癌性免疫球蛋白的高表达。

24.权利要求20所述免疫细胞在制备涉及高表面表达GnRH受体的疾病治疗药物方面的应用。

25.根据权利要求24所述的免疫细胞的应用，其特征在于：所述药物的治疗作用是利用被核酸分子、载体、或慢病毒载体转染的免疫细胞，该转染促使免疫细胞在体外或体内都能够表达人源化GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段在表面上。

26.根据权利要求24所述的免疫细胞的应用，其特征在于：所述药物的治疗作用是人源化GHR106单克隆抗体或其抗原结合片段在免疫细胞表面上的表达会导致对癌细胞的选择性杀伤，而此选择性杀伤可包含诱导癌细胞凋亡或引起细胞毒性进而杀死癌细胞。

27.根据权利要求22所述的免疫细胞的应用，其特征在于：所述癌症包括卵巢癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，胰腺癌，食管癌，结肠癌，肺癌或肾癌。

28.根据权利要求22所述的免疫细胞的应用，其特征在于：转染细胞作为癌症治疗药物重新导入患者体内。

29.根据权利要求28所述的免疫细胞的应用，其特征在于：所述转染细胞为T细胞或NK细胞，是哺乳动物细胞或人类细胞。

30.根据权利要求24所述的免疫细胞的应用，其特征在于：所述方法为：

修饰T细胞以表达CAR，其中CAR包括

信号结构域；

跨膜结构域；

CD3-zeta信号结构域；与

抗原结合结构域，此抗原结合结构域包含

以此修饰过的人类T细胞用予人类。