CN104177499A

CN104177499A - 一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用

Info

Publication number: CN104177499A
Application number: CN201310200787.1A
Authority: CN
Inventors: 张鸿声
Original assignee: 张鸿声
Current assignee: Shanghai Yake Biological Technology Co. Ltd.
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN104177499B

Abstract

本发明公开一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、用于连接单链可变区片段到细胞膜上的CD8α跨膜区、CD3ζ胞内信号区，第一共刺激分子配体和第二共刺激分子配体；所述CD3ζ胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有2A短肽。本发明所提供的嵌合抗原受体通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。

Description

一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体( chimeric antigen receptor，CAR) 由单克隆抗体的单链可变区片段(Single Chain Variable Fragment, ScFv)和T 细胞的信号区连接组成。嵌合抗原受体根据胞内的信号区数量可分为三代。第一代嵌合抗原受体胞内部分只含有一个CD3ζ胞内信号区，因此，所修饰的免疫细胞不能有效激活而且作用时间较短。第二代嵌合抗原受体在CD3ζ胞内信号区前增加了一个共刺激分子受体信号区，如CD28、4-1BB、OX40等，虽然临床表现比第一代嵌合抗原受体无论杀伤活性还是作用时间都有显著的改进，但仍不能满足临床的需要。在此基础上，胞内部分又增加一个共刺激分子信号区，即形成第三代嵌合抗原受体。但第三代嵌合抗原受体由于将三个信号分子线性串联起来，容易被低亲和力的非特异性抗原激活，甚至出现自我激活，从而发生非抗原特异性的激活而导致细胞毒副作用并引起机体的免疫排斥反应。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，旨在解决现有嵌合抗原受体所存在的问题。

本发明的技术方案如下：

一种嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、来源于CD8α的跨膜区、CD3ζ胞内信号区，第一共刺激分子配体(CML-1)和第二共刺激分子配体(CML-2)；所述CD3ζ胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有第一2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有第二2A短肽。

所述的嵌合抗原受体，其中，所述第一和第二共刺激分子配体分别为TNF类配体、Ig超家族分子或者细胞因子中的一种；

所述TNF类配体包括4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHT和CD30L；所述Ig超家族分子为CD80和CD86；所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21或GM-CSF。

所述的嵌合抗原受体，其中，第一共刺激分子配体为CD80，第二共刺激分子配体为4-1BBL。

所述的嵌合抗原受体，其中，所述第一2A短肽的氨基酸序列为EGRGSLLTCGDVEENPGP；第二2A短肽的氨基酸序列为APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。

一种编码基因，其中，所述编码基因用于表达如上所述的嵌合抗原受体。

所述的编码基因，其中，用于编码第一2A短肽的核苷酸序列如SEQ NO.7所示；用于编码第二2A短肽的核苷酸序列如SEQ NO.8所示.

一种如上所述编码基因的应用，其中，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。

一种表达载体，其中，所述表达载体中装载有如上所述的编码基因。

所述的表达载体，其中，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、质粒等表达载体。所述质粒包括普通质粒和微环质粒。

有益效果：本发明所提供的嵌合抗原受体通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。因此，采用此嵌合抗原受体编码基因修饰的免疫细胞，在增强杀伤活性的同时也增强了与靶抗原结合的特异性。采用所述编码基因修饰的免疫细胞可用于肿瘤治疗，也可用于乙肝和其他慢性传染病治疗。

附图说明

图1为本发明实施例2中构建携带有嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的示意图。

图2为本发明实施例2中携带嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的单/双酶切鉴定结果图。

图3为本发明实施例3中瞬时转染慢病毒载体的293T细胞中CD3ζ的表达检测结果图。

图4为本发明实施例4中经嵌合抗原受体基因修饰后的免疫细胞对靶细胞的杀伤活性检测结果图。

具体实施方式

本发明提供一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供的一种嵌合抗原受体，携带有两个共刺激分子配体，并分别通过两个不同的2A短肽将两个共刺激分子配体与所述嵌合抗原受体连接在同一载体上。所述共刺激分子配体可以为4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHT、CD30L、CD80、CD86、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21或GM-CSF等。由于通过采用不同的2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。

本发明中，以CD80和4-1BBL为例，提供一种新型嵌合抗原受体--Super-CAR，其结构为ScFv-CD8α-CD3ζ-2A-CD80-2A-4-1BBL。具体地，所述嵌合抗原受体是由单链可变区片段(Single Chain Variable Fragment, ScFv)，用于连接ScFv到细胞膜上的CD8α跨膜区，CD3ζ胞内信号区，第一共刺激分子配体CD80和第二共刺激分子配体4-1BBL依次串联组成，其中，所述单链可变区片段主要包括V_H和V_L片段。其中，ScFv(CEA)的氨基酸序列依次包括信号前导区、CEA的V_H片段、Linker(GGGGS)3和V_L片段。所述CD3ζ胞内信号区与所述CD80之间串联有第一2A短肽，所述CD80与所述4-1BBL之间串联有第二2A短肽。2A-CD80-2A-4- 1BBL基因的氨基酸序列依次包括T2A片段（即第一2A短肽）、CD80片段、F2A片段（即第二2A短肽）、4-1BBL片段。其氨基酸序列如下表1所示。

表1

本发明的技术方案中，通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与CD80、4-1BBL两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。

本发明的技术方案中，用于编码所述嵌合抗原受体的基因序列，其核苷酸序列如SEQ NO.1~10所示。其中包括编码ScFv、CD8α、CD3ζ、2A-CD80-2A-4-1BBL的各片段基因序列。根据需要，还可以在所述嵌合抗原受体的基因序列的两端添加酶切位点，用于连接于表达载体上。

本发明中还提供用于携带有所述嵌合抗原受体基因的表达载体及其构建方法，其构建方法如下：

体外合成ScFv、CD8α、CD3ζ、2A-CD80-2A-4-1BBL的各片段基因序列，利用连接酶将各基因片段依次连接，形成完整的ScFv- CD8α-CD3ζ-2A-CD80-2A-4-1BBL基因片段分子；

将所述ScFv- CD8α-CD3ζ-2A-CD80-2A-4-1BBL基因片段连接到表达载体中，获得携带有Super-CAR基因的慢病毒载体。

本发明中构建的新型嵌合抗原受体Super-CAR的慢病毒载体，将两个共刺激分子配体的基因通过2A短肽的基因片段连接到嵌合抗原受体基因上，使得共刺激分子配体和嵌合抗原受体表达同时表达于免疫细胞表面。而一旦结合到靶细胞上的抗原，形成细胞突触，免疫细胞表面的CD80和4-1BBL共刺激分子配体则迅速迁移到该位点，从而有效的激活免疫细胞。因此，本发明中还提供所述嵌合抗原受体的编码基因的应用，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。经过本发明构建的嵌合抗原受体编码基因修饰的免疫细胞在增强杀伤活性的同时也增强了与靶抗原结合的特异性。采用所述Super-CAR编码基因修饰的免疫细胞可用于肿瘤治疗，也可用于乙肝和其他慢性传染病治疗。

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

以靶向癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA) 为例，通过体外合成、分子克隆方法获得CEA特异性的ScFv(CEA)-CD8α-CD3ζ-2A-CD80-2A- 4-1BBL基因片段。其中，ScFv(CEA)基因的核苷酸序列依次包括信号前导区、CEA的V_H片段、Linker(GGGGS)3和V_L片段，其核苷酸序列如SEQ NO.1~4所示。CD8α跨膜区基因的核苷酸序列如SEQ NO.5所示。CD3ζ信号区基因的核苷酸序列如SEQ NO.6所示。2A-CD80-2A-4-1BBL基因的核苷酸序列依次包括T2A片段、CD80片段、F2A片段、4-1BBL片段，其核苷酸序列如SEQ NO.7~10所示。

实施例2

将所述ScFv（CEA）- CD8α-CD3ζ-2A-CD80-2A-4-1BBL的基因片段导入慢病毒载体pRRL，得到携带Super-CAR基因的慢病毒载体：将所述ScFv- CD8α-CD3ζ-2A-CD80-2A-4-1BBL基因片段和慢病毒载体pRRL使用相同的限制性内切酶进行双酶切，回收DNA片段；将回收的DNA片段通过连接酶进行连接。

同样的，采用相同的方法，构建具有CEA单链抗体基因的第一、二、三代CAR的慢病毒载体，如图1所示，其中，1^st G CAR慢病毒载体为第一代嵌合抗原受体，2^nd G CAR (CD28)为携带CD28共刺激分子的第二代嵌合抗原受体，2^nd G CAR (4-1BB)为携带4-1BB共刺激分子的第二代嵌合抗原受体，3^rd G CAR为第三代嵌合抗原受体，Super-CAR为本发明构建的新型嵌合抗原受体。

将携带有不同嵌合抗原受体基因的慢病毒载体采用单/双酶切鉴定，其结果如图2和表2所示。

表2

	Vector Name	Enzyme	Digestion Products (kb)	Enzyme	Digestion Products (kb)
						1	1^st G CAR	XhoI/SpeI	2.15/6.36	StuI	0.91/1.27/6.33
2	2^nd G CAR (CD28)	XhoI/SpeI	2.27/6.36	StuI	1.27/7.36
						3	2^nd G CAR (4-1BB)	XhoI/SpeI	2.27/6.36	StuI	0.91/1.27/6.45
4	3^rd G CAR	XhoI/SpeI	2.40/6.36	StuI	1.27/1.5/5.98
						5	Super-CAR	XhoI/SpeI	1.50/1.64/6.36	StuI	0.13/0.2/0.68/3.18/5.3

实施例3

将上述构建的携带不同CAR基因的慢病毒载体瞬时转染293T细胞，48 h后，裂解细胞，采用Western blot方法检测CD3ζ胞内信号区的表达，结果如图3所示。其中，1：转染空载体的293T细胞；2：转染1^stG CAR载体的细胞；3：转染2^nd G CAR (CD28)载体的细胞；4：转染2^nd G CAR (4-1BB)载体的细胞；5：转染3^rd G CAR载体的细胞；6：转染Super-CAR载体的细胞。293T细胞本身不表达CD3ζ，转染后，可检测到符合预期大小的CD3ζ胞内信号区，大小正确，说明转染后的重组慢病毒载体在人源细胞中正确表达。

实施例4

将转染重组慢病毒载体的免疫细胞与CEA阳性的肺癌细胞共培养，检测其杀伤活性。发现Super-CAR修饰的免疫细胞对靶肿瘤细胞的杀伤率明显高于其它类型的受体修饰的免疫细胞，具体结果如图4所示。其中，1^st G CAR: 表达第一代嵌合抗原受体的免疫细胞；2^nd G CAR (CD28): 表达携带有CD28共刺激分子的第二代嵌合抗原受体的免疫细胞；2^nd G CAR (4-1BB):表达携带有4-1BB共刺激分子的第二代嵌合抗原受体的免疫细胞；3^rd G CAR：表达第三代嵌合抗原受体的免疫细胞；CD80-CAR：表达携带有CD80共刺激分子配体的嵌合抗原受体的免疫细胞；4-1BBL-CAR：表达携带有4-1BBL共刺激分子配体的嵌合抗原受体的免疫细胞；Super CAR：表达本发明构建的新型嵌合抗原受体的免疫细胞。

综上所述，本发明所构建的Super-CAR，将嵌合抗原受体通过2A短肽连接CD80和4-1BBL两个共刺激分子配体，从而使其修饰的免疫细胞不但具有较高的杀伤活性，也具有较高的抗原特异性。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

<110> 上海雅科生物科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用

<160> 10

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码信号前导区的基因序列

<400> 1

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 2

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码V_H片段的基因序列

<400> 2

gaggtccaac tggtggagag cggtggaggt gttgtgcaac ctggccggtc cctgcgcctg 60

tcctgctccg catctggctt cgatttcacc acatattgga tgagttgggt gagacaggca 120

cctggaaaag gtcttgagtg gattggagaa attcatccag atagcagtac gattaactat 180

gcgccgtctc taaaggatag atttacaata tcgcgagaca acgccaagaa cacattgttc 240

ctgcaaatgg acagcctgag acccgaagac accggggtct atttttgtgc aagcctttac 300

ttcggcttcc cctggtttgc ttattggggc caagggaccc cggtcaccgt ctcctca 357

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> linker（GGGGS）3片段的基因序列

<400> 3

ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatct 45

<210> 4

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码V_L片段的基因序列

<400> 4

gacatccagc tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60

atcacctgta aggccagtca ggatgtgggt acttctgtag cttggtacca gcagaagcca 120

ggtaaggctc caaagctgct gatctactgg acatccaccc ggcacactgg tgtgccaagc 180

agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca 240

gaggacatcg ccacctacta ctgccagcaa tatagcctct atcggtcgtt cggccaaggg 300

accaaggtgg aaatcaaa 318

<210> 5

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CD8α的跨膜区基因序列

<400> 5

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca accccggcgc ccacgatcgc gtcgcagccc 60

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 120

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 180

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaccac 216

<210> 6

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CD3ζ的胞内信号区基因序列

<400> 6

atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60

gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120

atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 180

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 360

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 420

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 480

ccccctcgct aa 492

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码T2A的基因序列

<400> 7

gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码F2A的基因序列

<400> 8

gcacctgtga aacagacttt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc 60

aacccagggc cc 72

<210> 9

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CD80的基因序列

<400> 9

atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60

cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120

gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180

caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240

atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300

attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360

tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420

gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480

atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540

gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600

agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660

ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720

gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780

tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840

agaagggaaa gtgtacgccc tgtataa 867

<210> 10

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码4-1BBL的基因序列

<400> 10

atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60

gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120

ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180

tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240

cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300

ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360

acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420

tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480

gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540

ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600

ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660

agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720

acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、CD8α跨膜区、CD3ζ胞内信号区，第一共刺激分子配体和第二共刺激分子配体；所述CD3ζ胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有第一2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有第二2A短肽。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一和第二共刺激分子配体分别为TNF类配体、Ig超家族分子或者细胞因子中的一种；所述TNF类配体包括4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHT和CD30L；所述Ig超家族分子为CD80和CD86；所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21或GM-CSF。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，第一共刺激分子配体为CD80，第二共刺激分子配体为4-1BBL。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一2A短肽的氨基酸序列为EGRGSLLTCGDVEENPGP；第二2A短肽的氨基酸序列为APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。

5.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因用于表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

6.根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，用于编码第一2A短肽的核苷酸序列如SEQ NO.7所示；用于编码第二2A短肽的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。

7.一种如权利要求5所述编码基因的应用，其特征在于，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中装载有如权利要求5所述的编码基因。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒。