CN101591658A - Ing4和il-24双基因共表达载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双基因重组转移载体：pAdTrack－CMV－ING4－IRES－IL－24和pAdTrack－CMV－ING4－polyA+CMV－IL－24；所述双基因载体将ING4和IL－24基因的理想而又成功的组合使两个基因在同一个载体上均能获得成功表达；并且通过双基因表达产物的联合作用，将作用于肿瘤细胞内的ING4与分泌至胞外的IL－24联合作用，进而发挥出抑癌增效和化疗增敏效果，而且其效果相对于单独的ING4或者IL－24的作用更明显。

Description

ING4和IL-24双基因共表达载体及其用途

技术领域

本发明属于重组载体领域，具体涉及人ING4基因和人IL-24基因的共表达载体的制备及其用途。

背景技术

肿瘤是当今社会影响人类健康的主要疾病之一，肿瘤的发生发展受体内多种基因的调控，肿瘤抑制基因正是参与这一调控的重要分子，很多肿瘤中都有某些肿瘤抑制基因失活，向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因，则可逆转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗目的，例如已经发现的人ING4基因(参见：公开号为CN101058809A的中国专利申请)和人IL-24基因。

人ING4基因定位于12p13-31，基因跨距13kb，由8个外显子和7个内含子组成，cDNA全长1380bp，编码蛋白含249个氨基酸，是新近发现的一种细胞内肿瘤生长抑制因子，可与NF-κB蛋白的P65亚基结合抑制NF-κB蛋白的活性，引起对NF-κB敏感的IL-8等基因的表达量减少；可通过调节p53乙酰化状态增强p53的转录活性；可抑制缺氧诱导因子HIF-1的活化等，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞生长。

白介素-24(interleukin-24，IL-24)基因原先被命名为黑色素瘤分化相关基因(melanomadifferentiation-associated gene-7，mda-7)，由美国哥伦比亚大学的Jiang等人于1995年将增生活跃的人类黑色素瘤细胞HO-1产生的cDNA文库与经人成纤维细胞β干扰素(IFN-β)和mezerein(MEZ)共同处理过的HO-1细胞的cDNA文库进行减数杂交时首次发现(参见：JiangH，Lin JJ，Su ZZ等人，Oncogene，1995，11(12)：2477-2486.)。这一因子从其结构、染色体定位、碱基序列同源性及细胞因子特性等方面综合考虑，被归入IL-10家族，并命名为IL-24。IL-24为分泌型细胞因子，是一种膜受体介导的肿瘤生长抑制因子。目前的研究显示，IL-24基因是第一个，很可能是唯一既抑制肿瘤细胞生长和血管形成并诱导凋亡，同时又能刺激免疫细胞表达细胞因子的新型抑癌基因，因而能通过抑制肿瘤血管生长，刺激免疫系统应答及诱导肿瘤细胞凋亡三者联合的方式来发挥抗肿瘤效应。

近年来肿瘤等疾病多基因治疗倍受关注。于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中具有广泛的应用价值，尤其在针对肿瘤等疾病发生发展的各个环节设计的联合基因治疗方案中。因而构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义。在细胞或整体水平转移外源基因进行遗传学改造、修饰是目前基因治疗的重要方式。肿瘤等疾病的发生和发展是多基因变异的结果，同时转移并表达多个外源基因在基因治疗领域具有重要的应用价值。

目前多基因治疗主要采取两种途径：

一是将多个携带不同基因的独立载体同时转染或感染靶细胞，其优点是可以自由调节各表达载体的比例和时间上协调组合，缺点是其实现多基因共表达的效率太低和工作量大；

二是在同一载体上实现多基因共表达。低效的基因转移过程是基因治疗的瓶颈，与多个携带不同基因的独立载体实现共表达相比，构建多基因共表达载体可提高转移及表达效率。共表达主要应用于：(1)表达异源多聚体蛋白的亚单位，如免疫球蛋白、细胞受体、白细胞介素和转录因子等；(2)同时表达针对同一靶细胞的几种异源蛋白以取得联合或协同的作用，如原癌基因、抗血管生成基因、自杀基因等。尤其是自杀基因及其与免疫活性基因的联合应用已在协同抗肿瘤的研究中取得了重要进展。大量的研究表明，联合应用不同治疗基因可以产生较单基因更有效的作用。现将多基因共表达载体构建策略概括如下：

(1)基因之间以IRES(internal ribosome entry site)(内部核糖体进入位点)序列连接；(2)双启动子表达载体；(3)剪切载体；(4)基因之间以Furin的切割靶点序列连接；(5)基因之间以2A序列连接；(6)表达融合基因。

其中，IRES介导和双启动子介导的双基因共表达模式是目前较常用的两种构建方式，前者为在上游启动子的控制下，该IRES序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一个转录本上翻译出不同的蛋白；后者为带有polyA-promotor(CMV)各自独立启动子的两个表达盒构建于一个载体上，转录出两种不同的mRNA并翻译出不同的蛋白。

本领域技术人员公知：腺病毒载体是一类很有应用前景的基因治疗病毒载体，腺病毒是一种双链DNA病毒，腺病毒载体与其他载体相比有如下许多优点：1.宿主范围广，对人致病性低；2.具有感染率高、对分裂和非分裂细胞都能感染；3.能携带很长的治疗基因和同时表达多个基因；4.不整合到染色体中，无插入致突变性，安全性好；5.能有效进行增殖，滴度高，易加工制备等。采用pAdEasy腺病毒表达系统具有明显优点：1.腺病毒质粒的同源重组可在大肠杆菌BJ5183中高效进行，且细菌繁殖快，同源重组能力强，因而从根本上克服细胞内同源重组率低的缺陷；2.腺病毒中可插入11kb的基因片段或同时插入多个基因片段；3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP报告基因，非常便于监测病毒包装成功与否、检测病毒滴度及感染效率等。所有这些都避免了病毒的空斑克隆纯化过程，大大减少了病毒的制备时间。

构建双基因共表达重组转移载体是作为肿瘤的基因治疗药物的有效途径之一，但到目前为止，国内外没有关于利用IRES策略构建ING4和IL-24双基因载体的报道；另外，利用构建polyA+promoter双启动子策略构建双基因重组转移载体，虽然理论有相关研究，实践中却并没有相关报道，而且该方法存在以下难点：在利用在构建polyA+promoter双启动子策略构建双基因重组转移载体的过程中，发现polyA中有pacI酶切位点，无法采用pacI酶切线性化后在293A细胞中进行腺病毒包装，影响双基因的正常表达。

发明内容

本发明目的是提供人ING4基因和人IL-24基因的双基因重组转移载体及其用途。为达到上述目的，本发明具体技术方案是，双基因重组转移载体，它含有人ING4基因和人IL-24基因，所述双基因重组转移载体选自：pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24或pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24中的一种；所述双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2008年10月12日；保藏编号CCTCC M 208154；分类命名：大肠杆菌DH5α/pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24；Escherichia coli DH5α/pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24；所述双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2008年10月12日；保藏编号CCTCC M 208155；分类命名：大肠杆菌DH5α/pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24；Escherichia coli DH5α/pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24。

上述技术方案中，双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24的制备方法包括以下步骤：(1)在pAdTrack-CMV转移载体SalI、NotI间插入IRES片段构建pAdTrack-CMV-IRES改造转移载体；(2)在pAdTrack-CMV-IRES改造转移空载体XhoI、XbaI间插入IL-24片段，构建pAdTrack-CMV-IRES-IL-24单基因重组转移载体；

(3)在pAdTrack-CMV-IRES-IL-24单基因重组转移载体BglII、SalI间插入ING4片段，构建pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24双基因重组转移载体。

双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24的制备方法包括以下步骤：

(1)构建pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV改造转移载体；

(2)在pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV改造转移空载体XhoI、XbaI间插入IL-24片段，构建pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24单基因重组转移载体；

(3)在pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24单基因重组转移载体BglII、SalI间插入ING4片段，构建pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24双基因重组转移载体。

在构建pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24双基因重组转移载体的过程中，发现polyA中有pacI酶切位点，无法采用pacI酶切线性化后在293A细胞中进行腺病毒包装，为此发明人又将该酶切位点的DNA序列进行了基因点突变：突变之前的polyA具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，其第293位到第300位的碱基序列为ttaattaa，通过突变使之成为ttaaa，突变之后的polyA^Δ296～298具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列，通过这样的突变使pacI酶切位点消失，但仍保持polyA终止基因转录功能，而不影响ING4基因的正常表达，改造了polyA-CMV(尾-启)DNA序列后才能利于腺病毒载体的包装和基因的正常表达。

本发明还涉及同源重组腺病毒载体：pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24和pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24；以及重组腺病毒Ad-ING4-IRES-IL-24和Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24。

同源重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24的构建方法为：

(1)将构建的pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24重组转移质粒用PmeI 37℃单酶切线性化后，与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆抽提质粒，根据琼脂糖电泳分子量大小初步筛选pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24同源重组阳性克隆；

(2)转化DH5α后扩增和抽提质粒进行PCR和PacI单酶切鉴定。

类似的，pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24的构建方法为：

(1)将构建的pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24重组转移质粒用PmeI 37℃单酶切线性化后，与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆抽提质粒，根据琼脂糖电泳分子量大小初步筛选pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24同源重组阳性克隆；

(2)转化DH5α后扩增和抽提质粒进行PCR和PacI单酶切鉴定。

重组腺病毒Ad-ING4-IRES-IL-24的构建方法包括为：

将同源重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24经PacI线性化后胶回收大片段，转染QBI-293A细胞中进行包装产生第一代重组腺病毒；

转染后在荧光显微镜下观察GFP荧光，并于转染10d后收集细胞，细胞沉淀用无菌PBS悬浮后，将细胞悬液在-80℃和37℃间反复冻融3次，2000r/min离心5min，取含有第一代重组腺病毒的上清。

进一步的技术方案中，将第一代重组腺病毒粗提液在QBI-293A细胞中经二轮感染和扩增后获得较高滴度的Ad-ING4-IRES-IL-24第三代重组腺病毒，于-80℃保存待用。

类似地，重组腺病毒Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24的构建方法为：将同源重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24经PacI线性化后胶回收大片段，转染QBI-293A细胞中进行包装产生第一代重组腺病毒；

转染后在荧光显微镜下观察GFP荧光，并于转染10d后收集细胞，细胞沉淀用无菌PBS悬浮后，将细胞悬液在-80℃和37℃间反复冻融3次，2000r/min离心5min，取含有第一代重组腺病毒的上清。

进一步的技术方案中，将第一代重组腺病毒粗提液在QBI-293A细胞中经二轮感染和扩增后获得较高滴度的Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24第三代重组腺病毒，于-80℃保存待用。

本发明还提供了一种肿瘤的基因治疗药物，所述药物包含双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24或pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24中的一种。

本发明还涉及双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24或pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24中的一种用于制备治疗癌症的基因治疗药物的用途，优选的技术方案中，所述癌症包括肝癌、肺癌以及乳腺癌。

本发明还涉及双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24或pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24中的一种用于制备联合顺铂化疗增敏剂的用途，优选的技术方案中，所述癌症包括肝癌、肺癌以及乳腺癌。

本发明的实施例一至四构建了双基因重组转移载体、相应的同源重组腺病毒载体、以及相应的重组腺病毒。

本发明的实施例五至十，对ING4和/或IL-24单、双基因重组腺病毒在人肝癌细胞株进行体内外抗肿瘤实验，发现腺病毒介导的ING4和/或IL-24单、双基因表达具有特异性抑制肝癌细胞生长的作用，而对正常肝细胞几乎无细胞毒作用；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒对SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的细胞毒作用和诱导凋亡的作用较ING4、IL-24单基因重组腺病毒均呈现明显的协同增效作用；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组对SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的细胞毒作用和诱导凋亡的作用均明显优于Ad-ING4-IL-24单纯组和CDDP单纯组均呈现明显的协同化疗增敏效应。

实施例十一至十七通过腺病毒载体导入人肺癌细胞A549中，观察外源性ING4及IL-24对A549细胞生长的影响。发现Ad-ING4-IRES-hIL-24对A549具有高感染效率并且产生明显的细胞毒作用；Ad-ING4-IRES-hIL-24组比单独携带ING4基因或IL-24基因组的抑制作用更强，说明表达在核内的ING4蛋白和分泌到胞外的IL-24蛋白同时从不同靶点起到协同抑癌作用。流式细胞仪检测发现Ad-ING4-IRES-hIL-24作用后，凋亡率明显升高，表明Ad-ING4-IRES-hIL-24能诱导A549细胞凋亡，具有抑癌增效作用，且Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合DDP化疗药物组诱导A549肺癌细胞凋亡的效应明显优于Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒单纯组和DDP化疗药物单纯组，表明Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合DDP化疗药物组诱导A549肺癌细胞凋亡的效应较Ad-ING4-IL-24单纯组和DDP单纯组均具有明显的化疗增敏效应。

实施例十八至二十四将携带ING4/IL-24双基因共表达的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-ING4-polyA-CMV-IL-24，以下简称Ad-ING4-IL-24)感染MDA-MB-231乳腺癌细胞，观察Ad-ING4-IL-24对MDA-MB-231乳腺癌细胞的抑制作用；结果显示ING4/IL-24双基因均能在MDA-MB-231细胞中有效转录；经FCM、MTT等各项指标检测Ad-ING4-IL-24对人MDA-MB-231乳腺癌细胞生长抑制作用和诱导细胞凋亡功能均比Ad-ING4和Ad-IL-24的单基因治疗组明显增强，具有双基因协同增效作用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.将ING4和IL-24基因的理想而又成功的组合使两个基因在同一个载体上均能获得成功表达；

2.通过双基因表达产物的联合作用，将作用于肿瘤细胞内的ING4与分泌至胞外的IL-24联合作用，进而发挥出抑癌增效和化疗增敏效果，而且其效果相对于单独的ING4或者IL-24的作用更明显。

附图说明

图1，实施例中ING4和IL-24双基因共表达模式示意图

图2(A)～(D)为实施例一至三中双基因载体及其同源重组克隆质粒的PCR鉴定

图2(A)pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24质粒鉴定

图中，1.ING4+IRES+IL-24片段；M.DL2000marker；

图2(B)pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24质粒鉴定

图中，1.ING4+polyA^Δ296～298+CMV和IL-24片段；M.DL2000marker；

图2(C)IRES介导pAd-ING4-IRES-IL-24同源重组克隆PCR鉴定

图中1.IRES；2.IL-24；3.ING4；M.DL2000marker；

图2(D)pAd-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24同源重组克隆PCR鉴定

图中1.polyA^Δ296～298+CMV；2.IL-24；3.ING4；M.DL2000marker；

图3(A)～(B)为实施例一中pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24(ING4)DNA测序结果

图3(A)pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24(ING4)测序结果

图3(B)pAdTrack-CMV-IRES-IL-24(IL-24)测序结果

图4(A)～(B)为实施例二中pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24测序结果

图4(A)pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24(IL-24)测序结果

图4(B)pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24(ING4)测序结果

图5为实施例四重组腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因在QBI-293A细胞中转录鉴定

图5(A)IRES介导的各组重组腺病毒的PCR鉴定

图中1.QBI-293A；2.QBI-293A+Ad-IRES；3.QBI-293A+Ad-IRES-IL-24；4.QBI-293A+Ad-ING4-IRES；5.QBI-293A+Ad-ING4-IRES-IL-24；

图5(B)polyA^Δ296～298+CMV介导的各组重组腺病毒的PCR鉴定

图中1.QBI-293A；2.QBI-293A+Ad-polyA^Δ296～298+CMV；3.QBI-293A+Ad-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24；4.QBI-293A+Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV；5.QBI-293A+Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24；

图6为实施例六中RT-PCR鉴定腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因在细胞中的转录

图6(A)腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因在细胞SMMC-7721中的转录

图6(B)腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因在细胞HepG2中的转录

图6(C)腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因在细胞HL-7702中的转录

图中，1.PBS；2.Ad；3.Ad-IL-24；4.Ad-ING4；5.Ad-ING4-IL-24；

图7为实施例六中Western blot法鉴定IL-24和ING4蛋白在细胞中的表达

图中，1.PBS；2.Ad；3.Ad-IL-24；4.Ad-ING4；5.Ad-ING4-IL-24；

图8为实施例七中重组腺病毒对肝癌细胞的细胞毒作用

图8(A)重组腺病毒对肝癌细胞HepG2的细胞毒作用

图8(B)重组腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒作用

图8(c)重组腺病毒对肝癌细胞HL-7702的细胞毒作用

图9为实施例七中Ad-ING4联合CDDP对肝癌细胞的细胞毒作用

图10为实施例七中Ad-ING4-IL-24联合CDDP对肝癌细胞的细胞毒作用

图11为实施例八中重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的效应

图12为实施例八中Ad-ING4联合CDDP诱导肝癌细胞凋亡的效应

图13为实施例八中Ad-ING4-IL-24联合CDDP诱导肝癌细胞凋亡的效应

图14为实施例八中DAPI核荧光染色检测SMMC-7721肝癌细胞凋亡核形态特征

图15为实施例八中DAPI核荧光染色检测HepG2肝癌细胞凋亡核形态特征

图16为实施例九中重组腺病毒及联合CDDP对裸鼠人肝癌移植瘤的抑瘤率

图17为实施例十二中Ad-ING4-hIL-24对A549细胞生长的影响

图18为实施例十三中Ad-ING4-hIL-24联合CDDP对A549细胞作用不同时间的生长抑制曲线

图19为实施例十三Ad-ING4-hIL-24联合CDDP对A549细胞生长作用不同时间的生长抑制率

图20为实施例十四中流式细胞仪检测Ad-ING4-hIL-24等对A549肺癌细胞凋亡率的比较

图21为实施例十五中Ad-ING4-hIL-24对A549细胞凋亡率的化疗增敏效应

图22为实施例十七中细胞凋亡相关分子免疫细胞化学检测

图23为实施例二十中RT-PCR鉴定各组腺病毒在MDA-MB-231乳腺癌细胞中ING4和IL-24基因的转录

图24为实施例二十一中重组腺病毒Ad-ING4-IL-24对MDA-MB-231细胞的细胞毒作用

图25为实施例二十二中流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24对MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡率的比较

图26为实施例二十三中RT-PCR检测MDA-MB-231细胞中相关基因的转录

图中1.PBS组；2.Ad-GFP组；3.ING4基因组；4.IL-24基因组；5.双基因组；

图27为实施例二十四中重组腺病毒作用48h对MDA-MB-231细胞分泌VEGF的影响

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

为了方便说明，将实施例中使用的试剂集中列举如下，

试剂和材料：

BglII、SalI、NotI限制性内切酶、T4DNA连接酶、DL2000marker、Taq DNA聚合酶、dNTPmix、Oligo d(T)₁₈、Ribonuclease Inhibitor购自TaKaRa公司；XhoI和XbaI限制性内切酶、逆转录酶MMLV、Lambda DNA/HindIII marker购自MBI公司；PmeI、PacI购自New England Biolabs公司；日常型小量质粒抽提试剂盒、PCR产物清洁试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司，RPMI-1640、DMEM、α-MEM培养基购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青公司；6孔和96孔细胞培养板购自CORNING公司；、UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉等生化试剂购自上海生工生物技术有限公司；腺病毒扩增细胞GENMED大量腺病毒氯化铯纯化试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；免疫荧光染色试剂盒-抗山羊Cy3和抗小鼠Cy3、PI、DAPI购自碧云天生物技术研究所；硝酸纤维素膜(NC膜)、Western blot化学发光试剂盒和暗盒购自上海普利莱基因技术有限公司；山羊抗人ING4抗体购自Abcam公司；小鼠抗人IL-24抗体购自R&D公司；HRP标记的兔抗山羊IgG和山羊抗小鼠IgG二抗购自武汉博士德生物技术有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自SIGMA公司；顺铂(CDDP)化疗药物由苏州大学附属第二医院段光军博士惠赠，P21、P27、Cox-2、Fas、Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、CD34抗体购自Santa Cruz公司；即用型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTM SP试剂盒购自神州迈新生物技术公司；DAB购自Sigma公司；SMMC-7721肝癌细胞购自上海中科院细胞所；4-6周龄BALB/c雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，人肺癌细胞株A549，细胞凋亡Hoechst33258染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所；免疫细胞化学染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；Survivin基因引物由上海生工生物技术有限公司合成；Annexin-v-PE/7-AAD凋亡试剂盒购于southern biothech公司；VEGF ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

质粒、细菌和细胞：

pGEZ-Term质粒、pORF-mbcl-2α质粒、pAdTrack-CMV-IL-24质粒、pAdTrack-CMV-ING4质粒、大肠杆菌DH5α由本室保存；GFP绿色荧光蛋白标记的pAdTrack-CMV转移质粒、腺病毒骨架质粒pAdEasy-1、大肠杆菌BJ5183、腺病毒包装细胞QBI-293A由复旦大学生命科学学院微生物学教研室钟江教授惠赠。

实施例一至十七中，PCR扩增所用引物及其序列列于表1：

表1PCR扩增所用引物及其序列

实施例十八至实施例二十四中涉及的引物如表2：

表2各引物序列及产物长度

实施例一，IRES介导的各组重组转移载体的构建

1.1pAdTrack-CMV-IRES改造转移空载体的构建

(1)PCR获得IRES目的片段：比对IRES的保守序列，设计引物P1、P2(如表1)，以含有IRES片段的pGEZ-Term质粒为模板PCR扩增IRES目的片段，两端分别引入SalI、NotI酶切位点，获得的IRES PCR产物；

(2)IRES片段亚克隆于pAdTrack-CMV转移质粒：将DNA清洁试剂盒纯化的IRES PCR产物和日常型小量质粒抽提试剂盒提取的转移质粒pAdTrack-CMV分别用SalI、NotI 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆，阳性克隆菌保种备用。

1.2pAdTrack-CMV-IRES-IL-24单基因重组转移载体的构建

(1)设计引物P7、P8(如表1)，以含有IL-24基因片段的pAdTrack-CMV-IL-24质粒为模板PCR扩增IL-24目的片段，其大小与预期扩增的IL-24理论值大小(621bp)相一致，两端分别引入XhoI、XbaI酶切位点，获得IL-24PCR产物。

(2)将纯化的IL-24PCR产物和日常型小量质粒抽提试剂盒抽提的改造空转移质粒pAdTrack-CMV-IRES分别用XhoI、XbaI 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆，阳性克隆菌保种备用。

1.3pAdTrack-CMV-ING4-IRES单基因重组转移载体的构建

(1)将纯化的ING4PCR产物和日常型小量质粒抽提试剂盒抽提的改造转移质粒pAdTrack-CMV-IRES分别用BglII、SalI 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆，阳性克隆菌保种备用。

1.4pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24双基因重组转移载体鉴定

(1)将纯化的ING4PCR产物和日常型小量质粒抽提试剂盒抽提的IL-24单基因转移质粒pAdTrack-CMV-IRES-IL-24分别用BglII、SalI 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆；阳性克隆菌保种备用。

(2)用PCR、双酶切鉴定和DNA序列测定：重组载体pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24经BglII、XbaI双酶切能释放出1952bp大小的ING4+IRES+IL-24片段，参见图2(A)；DNA序列测定参见图3，结果证实成功构建pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24双基因共表达重组转移载体。

实施例二，polyA^Δ296～298+CMV介导的各组重组转移载体的构建

2.1pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV改造转移空载体构建

(1)根据pORF-mbcl-2α质粒的报道序列，设计引物P3、P4、P5、P6(如表1)。以pORF-mbcl-2α质粒为模板，P3、P4；P5、P6为引物PCR分别扩增polyA和CMV目的基因片段(其大小与预期扩增的polyA和CMV理论值大小(333bp；555bp)相一致)；并以polyA和CMV混合PCR产物为模板，P3、P6为引物SOE-PCR扩增polyA+CMV融合片段(约888bp大小的polyA+CMV融合片段；

(2)pUcm-T-polyA-CMV质粒的组装：由于pAdTrack-CMV质粒中本身含有多个PacI酶切位点，需采用PacI酶切开polyA-CMV中PacI酶切位点，再用T4DNA聚合酶修平粘性末端的碱基缺失法，但此法不能在pAdTrack-CMV质粒中操作，因此应将polyA-CMV插入到pUcm-T中以便进行PacI酶切位点缺失突变的实验操作。具体方法为先将pUcm-T和polyA+CMV基因片段经SalI、NotI双酶切，用胶回收目的片段，然后再由T4DNA连接酶连接过夜，氯化钙法转化DH5a感受态细胞，挑选pUcm-T-polyA-CMV重组质粒的阳性克隆；

(3)polyA-CMV中的Pac I酶切位点缺失突变：从上述阳性克隆提取的pUcm-T-polyA-CMV重组质粒经Pac I酶切，纯化后，再用T4DNA聚合酶修平粘性末端，然后由T4DNA连接酶连接过夜，氯化钙法转化DH5a感受态细胞，挑选pUcm-T-polyA^Δ296～298-CMV重组质粒的阳性克隆，进行测序鉴定；

(4)pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298-CMV转移空载体质粒的构建：将上述测序正确的pUcm-T-polyA^Δ296～298-CMV和pAdTrack-CMV转移质粒经SalI、NotI双酶切，用胶回收目的片段，再由T4DNA连接酶连接过夜，氯化钙法转化DH5a感受态细胞，筛pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298-CMV(即pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV)重组质粒的阳性克隆，并用PCR、双酶切鉴定，将鉴定正确的细胞-80℃保存。

2.2pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24单基因重组转移载体

(1)将纯化的IL-24PCR产物和日常型小量质粒抽提试剂盒抽提的改造转移质粒pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV分别用XhoI、XbaI 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆，阳性克隆菌保种备用。

2.3pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV单基因重组转移载体

(1)将纯化的ING4PCR产物和日常型小量质粒抽提试剂盒抽提的改造转移质粒pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV分别用BglII、SalI 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆，阳性克隆菌保种备用。

2.4pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24双基因重组转移载体的构建和鉴定

(1)将纯化的ING4PCR产物和日常型小量质粒抽提试剂盒抽提的IL-24单基因转移质粒pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24分别用BglII、SalI 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆；

(2)用PCR、双酶切鉴定和DNA序列测定：重组载体pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24经BglII、EcoRV双酶切能释放出预期大小的ING4+polyA^Δ296～298+CMV和IL-24片段，参见图2(B)；DNA序列测定结果参见图4(A)～(B)，结果进一步证实成功构建了pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24双基因共表达重组转移载体。阳性克隆菌保种备用。

实施例一和二中ING4和IL-24双基因共表达模式示意图如图一所以，其中promoter采用的是CMV启动子。

实施例三，同源重组腺病毒载体的构建和鉴定

将上述pAdTrack-CMV-IRES、pAdTrack-CMV-IRES-IL-24、pAdTrack-CMV-ING4-IRES和pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24；pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV、pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24、pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV和pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24重组转移质粒用PmeI 37℃单酶切2h线性化后，分别与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆抽提质粒，根据琼脂糖电泳分子量大小初步筛选pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-IRES(简称为pAd-IRES)、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-IRES-IL-24(简称为pAd-IRES-IL-24)、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES(简称为pAd-ING4-IRES)和pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24(简称为pAd-ING4-IRES-IL-24)；pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV(简称为pAd-polyA^Δ296～298+CMV)、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24(简称为pAd-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24)、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV(简称为pAd-ING4-polyA^Δ296～298+CMV)和pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24(简称为pAd-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24)同源重组克隆；

分别选择上述各组初步确定的任意一个同源重组阳性克隆转化DH5α后再抽提质粒进行PCR鉴定(图2(C)、图2(D))，均可见预期大小的PCR产物；PacI酶切鉴定同源重组克隆，均可获得30kb大小的腺病毒基因组片段和独特的4.5kb大小的ori及卡那霉素抗性编码基因片段。

实施例四：重组腺病毒的包装和扩增以及鉴定

(1)重组腺病毒的包装

将构建的pAd-IRES、pAd-IRES-IL-24、pAd-ING4-IRES和pAd-ING4-IRES-IL-24；pAd-polyA^Δ296～298+CMV、pAd-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24、pAd-ING4-polyA^Δ296～298+CMV和pAd-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24同源重组腺病毒质粒经PacI线性化后胶回收大片段，按Lipofectamine^TM2000操作说明分别转染QBI-293A细胞中进行包装产生第一代重组腺病毒。转染后在荧光显微镜下观察GFP荧光，荧光显微镜下可见GFP的表达，且荧光强度随转染后时间延长逐渐增强。

于转染10d后收集细胞，细胞沉淀用无菌PBS悬浮后，将细胞悬液在-80℃和37℃间反复冻融3次，2000r/min离心5min，取含有第一代重组腺病毒的上清。

将第一代重组腺病毒粗提液在QBI-293A细胞中经2轮感染和扩增后获得较高滴度的Ad-IRES、Ad-IRES-IL-24、Ad-ING4-IRES和Ad-ING4-IRES-IL-24；Ad-polyA^Δ296～298+CMV、Ad-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24、Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV和Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24第三代重组腺病毒于-80℃保存待用。

2次感染QBI-293A细胞后，在倒置荧光显微镜下可观察到荧光，并出现CPE，结果表明各组重组腺病毒在QBI-293A细胞中包装成功。

(2)重组腺病毒的RT-PCR鉴定

将Ad-IRES、Ad-IRES-IL-24、Ad-ING4-IRES  和Ad-ING4-IRES-IL-24；Ad-polyA^Δ296～298+CMV、Ad-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24、Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV和Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24腺病毒分别感染QBI-293A细胞48h后，1000r/min离心5min收集上述病毒感染细胞和未感染病毒的QBI-293A细胞对照，PBS洗涤2次，按UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书操作提取各组QBI-293A细胞总RNA，用上述引物P1、P2；P3、P6；P7、P8；P9、P10；P11、P12为引物进行RT-PCR，分别鉴定IRES、polyA^Δ296～298+CMV、IL-24、ING4、内参照β-actin基因在QBI-293A细胞中的转录。

由图5可见，RT-PCR鉴定结果初步表明成功构建了由IRES介导和polyA^Δ296～298+CMV介导的两套ING4和IL-24双基因共表达重组腺病毒表达载体。

实施例五

(1)重组腺病毒的大量扩增和纯化

将实施例四构建获得的Ad-IRES或Ad-polyA+CMV(以下简称为Ad)、Ad-IRES-IL-24或Ad-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24(以下简称为Ad-IL-24)、Ad-ING4-IRES  或Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV(以下简称为Ad-ING4)和Ad-ING4-IRES-IL-24或Ad-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24(以下简称为Ad-ING4-IL-24)第三代腺病毒粗提液再分别多轮感染QBI-293A细胞中进行大量繁殖，并进一步用氯化铯密度梯度离心纯化，以制备高纯度和高滴度的重组腺病毒。氯化铯密度梯度离心纯化根据GENMED大量腺病毒氯化铯纯化试剂盒说明书进行，属于本领域技术人员公知的技术。

(2)重组腺病毒的效价检测

将对数生长期的QBI-293A细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，在96孔板上按每孔100μl接种细胞，培养24h后，将上述氯化铯密度梯度离心纯化获得的Ad、Ad-IL-24、Ad-IRES和Ad-ING4-IL-24重组腺病毒作10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释后，每个稀释度按每孔100μl接种3孔，37℃，5％CO2细胞培养箱里培养18h后，荧光显微镜下，进行荧光计数，按病毒效价(pfu/ml)＝(每孔荧光平均数×10)/稀释度公式计算腺病毒效价，其效价分别为：3.5×10¹⁰；4×10¹⁰；3.2×10¹⁰；5×10¹⁰(pfu/ml)。

实施例六，ING4和/或IL-24重组腺病毒感染SMMC-7721、HepG2、HL-7702细胞

(1)最佳感染剂量的确定

将处于对数生长期的SMMC-7721、HepG2肝癌细胞株和HL-7702正常肝细胞系，经0.25％胰酶消化后，分别用10％FCS DMEM(SMMC-7721、HL-7702)、10％FCSα-MEM(HepG2)完全培养基悬浮，计数后调整细胞浓度为1×10⁵/ml，每孔100μl接种于96孔培养板，37℃，5％CO2培养过夜。次日Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒和Ad空载体腺病毒体外分别以1、10、25、50、100、200MOI不同剂量感染SMMC-7721、HepG2和HL-7702细胞，各分为5组：细胞对照组、Ad空载体组、Ad-IL-24单基因组、Ad-ING4单基因组和Ad-ING4-IL-24双基因组。感染48h后分别在普通光镜视野下观察SMMC-7721、HepG2和HL-7702细胞生长形态和荧光视野下观察GFP绿色荧光表达情况。

结果表明：50、100MOI不同剂量空载体病毒感染SMMC-7721细胞48h对细胞几乎无毒性，而且呈很高的感染效率，其可达90％以上，根据以感染效率最高所需剂量最低为原则，提示50MOI作为腺病毒感染SMMC-7721细胞最佳感染剂量；

25、50、100MOI不同剂量的空载体病毒感染HepG2和HL-7702细胞对细胞几乎无毒性，而且呈很高的感染效率，其可达90％以上，提示25MOI作为腺病毒感染HepG2和HL-7702细胞最佳感染剂量。

(2)RT-PCR法鉴定ING4和/或IL-24基因在细胞中的转录

分别收集经Ad空载体腺病毒、Ad-IL-24、Ad-ING4单基因重组腺病毒和Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒感染的SMMC-7721、HepG2、HL-7702细胞和未感染病毒的细胞，提取其总RNA进行RT-PCR，鉴于polyA^Δ296～298+CMV只负责基因的终止和启动，本身无mRNA转录产物，为此只能以制备的3×4组cDNA为模板，P1、P2；P7、P8；P9、P10；P11、P12为引物分别鉴定IRES、IL-24、ING4、内参照β-actin基因在SMMC-7721、HepG2、HL-7702中的转录。

由图6可见，RT-PCR鉴定结果表明IRES介导的ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒均能介导外源性ING4和/或IL-24基因在SMMC-7721、HepG2、HL-7702细胞中成功转录。

(3)间接免疫荧光检测ING4和/或IL-24蛋白在细胞中的表达

将Ad空载体腺病毒、Ad-IL-24、Ad-ING4单基因重组腺病毒和Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒分别感染6孔板中爬片的SMMC-7721(50MOI剂量)、HepG2(25MOI剂量)、HL-7702细胞(25MOI剂量)。感染48h后，收集细胞，利用免疫荧光染色试剂盒-抗山羊Cy3和抗小鼠Cy3进行间接免疫荧光分别检测腺病毒介导的外源性ING4和/或IL-24基因在SMMC-7721、HepG2、HL-7702细胞中的表达。

间接免疫荧光检测结果表明，IRES介导的ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒均能介导外源性ING4和/或IL-24基因在SMMC-7721、HepG2、HL-7702细胞中成功表达。

(4)Western blot鉴定ING4和/或IL-24基因在细胞中的表达

分别收集经Ad空载体腺病毒、Ad-IL-24、Ad-ING4单基因重组腺病毒和Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒感染的SMMC-7721、HepG2、HL-7702细胞和未感染病毒的细胞，并用细胞裂解液裂解细胞提取其总蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blot，以鉴定腺病毒介导的外源性IL-24和ING4基因在SMMC-7721、HepG2、HL-7702中的表达。

Western blot结果(图7)显示，Western blot鉴定结果进一步表明IRES介导的ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒均能介导外源性ING4和/或IL-24基因在SMMC-7721、HepG2、HL-7702细胞中成功表达。

实施例七，重组腺病毒及联合CDDP对肝癌细胞的体外生长抑制

(1)重组腺病毒对肝癌细胞的体外生长抑制作用

肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和正常肝细胞HL-7702分别用50、25、25MOI最佳感染剂量Ad-IL-24、Ad-ING4、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒和Ad空载体腺病毒感染，MTT检测0-5d的细胞生长活力，并绘制细胞生长曲线。

结果由图8表明，腺病毒介导的ING4和/或IL-24单、双基因表达均具有特异性抑制肝癌细胞生长的作用，而对正常肝细胞几乎无细胞毒作用；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒对SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的细胞毒作用显著优于ING4、IL-24单基因重组腺病毒均呈现明显的协同增强效应。

(2)Ad-ING4联合CDDP对肝癌细胞的体外生长抑制作用

肝癌细胞SMMC-7721、HepG2分别用50、25MOI最佳感染剂量Ad-ING4单基因重组腺病毒感染和联合2μg/ml CDDP化疗药物作用，MTT检测0-5d的细胞生长活力，并绘制细胞生长曲线。

如图9可见，结果表明，Ad-ING4单基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组对SMMC-7721肝癌细胞的细胞毒作用较Ad-ING4单纯组和CDDP单纯组呈现明显的协同效应；Ad-ING4单基因重组腺病毒可作为化疗药物CDDP治疗肝癌的增敏剂。

(3)Ad-ING4-IL-24联合CDDP对肝癌细胞的体外生长抑制作用

肝癌细胞SMMC-7721、HepG2分别用50、25MOI最佳感染剂量Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒感染和联合CDDP化疗药物作用，MTT检测0-5d的细胞生长活力，并绘制细胞生长曲线。

由图10可见，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组对SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的细胞毒作用均明显优于Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒单纯组和单一CDDP化疗药物组(P＜0.01)。

结果表明，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组对SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的细胞毒作用较Ad-ING4-IL-24单纯组和CDDP单纯组均呈现明显的协同增敏效应；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒可作为化疗药物CDDP治疗肝癌的增敏剂，且优于Ad-ING4单基因重组腺病毒。

实施例八，重组腺病毒及联合CDDP诱导肝癌细胞凋亡的效应

(1)重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的效应

肝癌细胞SMMC-7721、HepG2分别用50、25MOI最佳感染剂量Ad-IL-24、Ad-ING4、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒和Ad空载体腺病毒感染，72h流式细胞仪检测细胞凋亡峰。

观察图11可知，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒诱导SMMC-7721、HepG2肝癌细胞凋亡的效应明显高于ING4、IL-24单基因重组腺病毒，具有明显的协同增效作用；ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的效应强于HepG2肝癌细胞，但CDDP化疗药物诱导HepG2细胞凋亡的效应强于SMMC-7721。

(2)Ad-ING4单基因重组腺病毒联合CDDP诱导肝癌细胞凋亡的效应

肝癌细胞SMMC-7721、HepG2分别用50、25MOI最佳感染剂量Ad-ING4单基因重组腺病毒感染和联合CDDP化疗药物作用，72h流式细胞仪检测细胞凋亡峰。

由图12可知：Ad-ING4单基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的效应明显高于Ad-ING4单纯组和CDDP单纯组具有明显的协同增敏效应；Ad-ING4重组腺病毒可作为化疗药物治疗肝癌的增敏剂。

(3)Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP诱导肝癌细胞凋亡的效应

肝癌细胞SMMC-7721、HepG2分别用50、25MOI最佳感染剂量Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒感染和联合CDDP化疗药物作用，72h流式细胞仪检测细胞凋亡峰。

由图13可见，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组诱导SMMC-7721、HepG2肝癌细胞凋亡的效应明显优于Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒单纯组和CDDP化疗药物单纯组。

结果表明，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组诱导SMMC-7721、HepG2肝癌细胞凋亡的效应较Ad-ING4-IL-24单纯组和CDDP单纯组均具有明显的协同增效作用；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒可作为化疗药物治疗肝癌的增敏剂，且优于Ad-ING4单基因重组腺病毒。

实施例九，重组腺病毒及联合CDDP诱导SMMC-7721、HepG2肝癌细胞凋亡的核形态改变

肝癌细胞SMMC-7721、HepG2分别用50、25MOI最佳感染剂量Ad-IL-24、Ad-ING4、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒和Ad空载体腺病毒感染及Ad-ING4联合CDDP和Ad-ING4-IL-24联合CDDP作用，72h用DAPI核荧光染色和荧光显微镜检测细胞凋亡的核形态变化。

由图14、15可见，Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒组及Ad-ING4联合CDDP组和Ad-ING4-IL-24联合CDDP组SMMC-7721、HepG2肝癌细胞核均出现深染、固缩，甚至断裂，呈现明显的细胞凋亡核形态特征，而PBS、Ad空载体腺病毒处理的SMMC-7721、HepG2细胞核形态正常，未出现上述细胞凋亡的特征。

DAPI核荧光染色结果进一步表明，ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒及Ad-ING4联合CDDP和Ad-ING4-IL-24联合CDDP均具有诱导SMMC-7721、HepG2肝癌细胞凋亡的效应。

实施例九，裸鼠人肝癌移植瘤的建立以及治疗

(1)SMMC-7721人肝癌荷瘤裸鼠模型的建立

SMMC-7721人肝癌细胞用含10％小牛血清的DMEM完全培养基于5％CO2，37℃常规培养。将处于对数生长期的SMMC-7721肝癌细胞用PBS洗涤后经0.25％胰酶消化，并用无血清培养液中止后以1000r/min的转速离心5min收获细胞，并细胞计数后调整细胞浓度制备4×10⁷/ml的细胞悬液。取4-6周龄BALB/c雌性裸鼠60只，用安尔碘在其右前肢腋下消毒，然后皮下注射上述制备的SMMC-7721肝癌细胞悬液50μl(细胞数为2×10⁶)/只，观察SMMC-7721人肝癌细胞在裸鼠体内的生长和成瘤情况：裸鼠皮下接种SMMC-7721人肝癌细胞2天内，接种部位皮丘逐渐缩小，4天后慢慢转变为实性结节并渐渐长大，2周左右直径约5mm，裸鼠成瘤率达80％以上(50/60)。

(2)重组腺病毒对裸鼠人肝癌移植瘤的体内抗肿瘤效应

用Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒进行瘤体内注射治疗SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤，治疗前和治疗后1、2、3周分别进行瘤体长、短径测量和计算体积，观察肿瘤生长变化。

结果表明：Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒对SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤均有不同程度的抑制作用，与Ad空载体腺病毒组和PBS组比较呈显著性差异(P＜0.01)；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒对裸鼠人肝癌移植瘤的体内抗肿瘤效应明显优于Ad-ING4、Ad-IL-24单基因重组腺病毒(P＜0.01)。治疗3周后，裸鼠处死，取瘤体标本称重，Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒治疗组瘤重分别为0.57，0.66，0.44g，与Ad组(0.95g)和PBS组(0.98g)比较有显著性差异(P＜0.01)。Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒治疗组抑瘤率比较如图16(A)。

结果表明，Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24单、双基因重组腺病毒对裸鼠人肝癌移植瘤具有明显的抗肿瘤效应，且Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒的体内抗肿瘤效应较ING4、IL-24单基因重组腺病毒呈现明显的协同效应。

(3)Ad-ING4联合CDDP对裸鼠人肝癌移植瘤的体内抗肿瘤效应

用Ad-ING4单基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物进行瘤体内注射治疗SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤，同样治疗前和治疗后1、2、3周分别进行瘤体长、短径测量和计算体积，观察肿瘤生长变化。

结果显示：Ad-ING4单基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组对SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤的体内抗肿瘤效应明显优于Ad-ING4单基因重组腺病毒单纯组和CDDP化疗药物单纯组(P＜0.01)。治疗3周后，裸鼠处死，取瘤体标本称重，Ad-ING4联合CDDP治疗组瘤重为0.34g，与Ad-ING4组(0.57g)和CDDP组(0.47g)比较有显著性差异(P＜0.01)。Ad-ING4、CDDP、Ad-ING4联合CDDP治疗组抑瘤率比较如图16(B)。

结果表明，Ad-ING4单基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组的体内抗肿瘤效应较Ad-ING4单纯组和CDDP单纯组呈现明显的协同效应；Ad-ING4重组腺病毒可作为化疗药物治疗肝癌的增敏剂。

(4)Ad-ING4-IL-24联合CDDP对裸鼠人肝癌移植瘤的体内抗肿瘤效应

用Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物进行瘤体内注射治疗SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤，同样治疗前和治疗后1、2、3周分别进行瘤体长、短径测量和计算体积，观察肿瘤生长变化。

结果表明：Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组对裸鼠SMMC-7721人肝癌移植瘤的体内抗肿瘤效应明显优于Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒单纯组和CDDP化疗药物单纯组(P＜0.01)。治疗3周后，裸鼠处死，取瘤体标本称重，Ad-ING4-IL-24联合CDDP治疗组瘤重为0.29g，与Ad-ING4-IL-24组(0.44g)和CDDP组(0.47g)比较有显著性差异(P＜0.01)。Ad-ING4-IL-24、CDDP、Ad-ING4-IL-24联合CDDP治疗组抑瘤率比较如图16(C)。

结果表明，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组的体内抗肿瘤效应较Ad-ING4-IL-24单纯组和CDDP单纯组呈现明显的协同效应；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒可作为化疗药物治疗肝癌的增敏剂，且优于Ad-ING4单基因重组腺病毒。

实施例十，免疫组化检测重组腺病毒及联合CDDP的裸鼠体内抗肝癌效应分子机制

将各组治疗组SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤肿瘤组织切片进行免疫组化检测研究裸鼠体内抗肝癌效应潜在的分子机制。免疫组化检测的指标包括与细胞周期和细胞凋亡相关因子P21，P27，Cox-2，Fas，Bcl-2，Bax和Caspase-3及与肿瘤血管形成相关因子VEGF和CD34。

(1)ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒的裸鼠体内抗肝癌效应分子机制

与PBS组和Ad相比，Ad-ING4单基因重组腺病毒能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21，Cox-2，Fas，Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达，而对P27的表达无影响，并下调肿瘤血管形成相关的因子VEGF和CD34的表达；Ad-IL-24单基因重组腺病毒能明显上调P21，P27，Cox-2，Fas，Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达，及下调肿瘤血管形成相关的因子VEGF和CD34的表达；Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒同样能明显上调P21，P27，Cox-2，Fas，Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达，及下调肿瘤血管形成相关的因子VEGF和CD34的表达，且较Ad-ING4和Ad-IL-24单基因重组腺病毒组呈现明显的协同效应。

结果表明ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒能通过阻滞肿瘤细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生长等多途径抑制SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤的生长。

(2)Ad-ING4联合CDDP的裸鼠体内抗肝癌效应分子机制

Ad-ING4单基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21，P27，Cox-2，Fas，Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达，并下调肿瘤血管形成相关的因子VEGF和CD34的表达，且较Ad-ING4单纯组和CDDP单纯组呈现明显的协同效应。

(3)Ad-ING4-IL-24联合CDDP的裸鼠体内抗肝癌效应分子机制

Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合CDDP化疗药物组能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21，P27，Cox-2，Fas，Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达，并下调肿瘤血管形成相关的因子VEGF和CD34的表达，且较Ad-ING4-IL-24单纯组和CDDP单纯组呈现明显的协同效应。

实施例十一，Ad-ING4-hIL-24等对人肺癌细胞株A549毒作用

经0.1mol/L PBS，50MOI Ad，Ad-ING4-hIL-24，Ad-ING4，Ad-hIL-24，25ug/ml DDP处理的A549细胞72h后在倒置显微镜及荧光倒置显微镜下观察细胞形态及GFP(绿色荧光蛋白)表达。用50MOI剂量的病毒感染A549细胞，75％的细胞都表达GFP，呈现高感染效率，并且Ad-ING4-hIL-24，Ad-ING4，Ad-hIL-24作用的A549细胞出现变圆，脱落，皱缩等病变，Ad作用的A549细胞有轻度变圆，无脱落，皱缩等病变，PBS组细胞贴壁生长状态良好，数量多，形态正常，DDP作用后的细胞圆缩脱落，细胞贴壁数量减少，但无细胞裂解病变。

实施例十二，MTT法观察Ad-ING4-hIL-24对A549细胞生长的抑制

以50MOI的Ad，Ad-ING4-hIL-24，Ad-hIL-24，Ad-ING4，25ug/ml DDP及0.1mol/L PBS作用于A549细胞，分时段进行MTT检测，并绘制生长曲线，50MOI的Ad-ING4，Ad-hIL-24，Ad-ING4-hIL-24对A549细胞的增殖有明显的抑制作用并呈时间依赖性(图17)，其中以Ad-ING4-hIL-24的生长抑制作用最强，明显优于Ad-ING4，Ad-hIL-24单基因实验组(p＜0.05)，但仍低于DDP化疗药物组(p＜0.01)。

实施例十三，MTT法检测Ad-ING4-hIL-24联合DDP化疗药物对A549细胞生长的抑制作用

A549肺癌细胞分别用50MOI Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒和联合DDP化疗药物的共同作用，MTT法检测细胞生长活力，并绘制细胞生长曲线(图18)，其生长抑制率(图19)，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合DDP化疗药物组对A549肺癌细胞的生长抑制作用明显优于Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒单纯组和DDP化疗药物单纯组(P＜0.05)。

结果表明，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合DDP化疗药物组对A549肺癌细胞的细胞毒作用较Ad-ING4-IL-24单纯组和DDP单纯组均呈现明显的增敏效应。

实施例十四，流式细胞术检测Ad-ING4-hIL-24等对A549肺癌细胞凋亡的影响

用50MOI Ad，Ad-ING4-hIL-24，Ad-hIL-24，Ad-ING4作用于A549细胞，72h后收集细胞并将其PBS阴性对照组细胞及DDP阳性对照组细胞同时进行流式细胞术检测(图20)，Ad-ING4-hIL-24及Ad作用后，A549细胞凋亡率分别为19.4％和2.2％，PBS组及DDP组的凋亡率分别为0.2％和22.5％，Ad-ING4-hIL-24组与Ad组及PBS组相比凋亡率明显升高，Ad-ING4-hIL-24双基因组凋亡率明显高于Ad-hIL-24(12.4％)，Ad-ING4(13.3％)单基因组，但仍低于DDP化疗药物组。

实施例十五，流式细胞术检测Ad-ING4-hIL-24联合DDP对A549肺癌细胞凋亡的增敏作用

A549肺癌细胞分别用50MOI最佳感染剂量Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒感染和联合DDP化疗药物作用，72h流式细胞仪检测细胞凋亡峰。Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合DDP化疗药物组诱导A549肺癌细胞凋亡率(28.5％)明显优于Ad-ING4-IL-24双基因组(19.4％)和DDP化疗药物组(22.5％)，在肺癌细胞中Ad-ING4-IL-24对DDP具有明显的化疗增敏效应。(图21)

实施例十六，激光共聚焦显微镜观察Ad-ING4-hIL-24及其联合DDP诱导A549肺癌细胞凋亡的细胞核形态改变

肺癌细胞A549分别用50MOI最佳感染剂量Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒和Ad空载体腺病毒感染及Ad-ING4-IL-24联合DDP作用，72h用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡的核形态变化。Ad-ING4-IL-24作用的A549细胞很多出现胞体固缩，核断裂，形成大小不等的块状或颗粒状的荧光碎片，即典型的凋亡小体，DDP及Ad-ING4-IL-24联合DDP组的A549肺癌细胞核均出现深染、固缩，甚至断裂，呈现明显的细胞凋亡小体的核形态特征，而PBS、Ad空载体腺病毒处理的细胞核形态正常，未出现上述细胞凋亡的特征。

实施例十七，免疫细胞化学分析感染Ad-ING4-hIL-24对活化Caspase3，Bax，Bcl-2的影响

经免疫细胞化学试剂盒检测，空白对照组(PBS组)的bcl-2和bax阳性细胞百分率分别为(78.4±2.1)％和(24.6±1.7)％，活化Caspase3阳性细胞百分率为(13.8±3.7)％，阴性对照组(Ad组)的bcl-2和bax阳性细胞百分率分别为(75.3±3.4)％和(25.8±2.9)％，活化Caspase3阳性细胞百分率为(18.1±2.6)％，实验组(Ad-ING4-hIL-24组)的bcl-2和bax阳性细胞百分率分别为(63.3±4.2)％和(34.1±3.2)％，活化Caspase3阳性细胞百分率为(32.4±2.7)％，空白对照组和阴性对照组相比p＞0.05，实验组和阴性对照组相比p＜0.05(参见图22)。

实施例十八，基因重组腺病毒的扩增及其效价的测定

将构建的基因重组复制缺陷型腺病毒Ad，Ad-hIL-24，Ad-ING4，Ad-ING4-hIL-24分别感染70％贴壁的QBI-293A细胞，次日在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光，48h后普通光镜下可见细胞变圆，呈葡萄状聚集、脱落，出现明显的细胞病理效应(CPE)，收集细胞，将细胞悬液于-80℃及37℃充分冻融3次，取上清，反复扩增后，病毒保存于-80℃。

病毒效价测定时，将生长良好的QBI-293A细胞经胰酶消化后计数，稀释细胞浓度为10⁵个/ml，然后以100μl/孔接种于96孔板上。培养24h后，将收获的重组病毒子按10^-6、10^-7、10^-8、10^-9稀释，每个稀释度设3个复孔并按100μl/孔接种，37℃、5％CO₂培养18h后，荧光显微镜下计数，按公式：病毒效价(pfu/ml)＝(平均荧光数×10)/相应稀释度，计算病毒效价，检测病毒效价均达到10⁹pfu/ml。

实施例十九，重组腺病毒对MDA-MB-231细胞的感染效率测定

Ad按25、50、100、200不同感染复数(MOI)分别感染细胞后，感染率分别为50％、75％、95％、100％。将感染复数为200的Ad转染MDA-MB-231细胞后，对细胞增殖抑制率为15.1％，与空白对照组比较有显著差异(P＜0.05)，而感染复数为100的Ad对细胞增殖抑制率为7.2％，与空白对照组比较没有显著差异(P＞0.05)，因此确定MOI＝100为最适感染值。

实施例二十，RT-PCR检测Ad-ING4和/或IL-24基因的转录

按100MOI的Ad、Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24感染MDA-MB-231细胞(细胞数为1×10⁶)。感染48h收集细胞用Trizol法分别抽提总RNA，用ING4引物P9、P10，IL-24引物P11、P12进行RT-PCR，经琼脂糖凝胶电泳后显示，Ad-ING4组的ING4、GAPDH；Ad-IL-24组的IL-24、GAPDH；Ad-ING4-IL-24组的ING4、IL-24和GAPDH均出现阳性条带；Ad和PBS组均只有GAPDH出现阳性条带；说明Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24中的目的基因ING4和IL-24均能在MDA-MB-231乳腺癌细胞中有效转录(参见图23)。

实施例二十一，MTT法检测Ad-ING4和/或IL-24单、双基因表达对MDA-MB-231细胞生长的影响

收取指数生长期的MDA-MB-231细胞，按1×10⁵/ml的细胞浓度，于96孔培养板每孔加100μl，37℃，5％CO₂条件下培养过夜后，弃上清，加5μl 0.1mol/L PBS为阴性对照组，实验组分别加100MOI Ad、Ad-ING4、Ad-hIL-24、Ad-ING4-IL-24病毒液，每组设3个复孔，37℃，5％CO₂孵育24、48、72、96h，每孔加10μl MTT(5mg/ml)，继续孵育4h后加入10％SDS-HCl终止液100μl/孔，置于37℃，至次日待甲臢结晶完全溶解后，在酶标仪上测OD570值，以OD570值为纵坐标，时间(h)为横坐标绘制生长曲线，并计算细胞生长抑制率。

生长抑制率＝[(对照组OD570值-实验组OD570值)/对照组OD570值]×100％

由图24可见Ad-ING4、Ad-IL-24、和Ad-ING4-IL-24对MDA-MB-231细胞不仅均有不同程度的生长抑制作用，其中第四天抑制率各组分别可达45％、45％和68％左右，与Ad组和细胞对照组比较呈显著性差异(P＜0.05)；而且双基因腺病毒Ad-ING4-IL-24对MDA-MB-231的抑制作用明显优于单基因腺病毒Ad-ING4和Ad-IL-24(P＜0.05)，但空病毒Ad对MDA-MB-231细胞几乎无毒性作用。

说明双基因腺病毒Ad-ING4-IL-24对MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长抑制作用明显强于Ad-ING4、Ad-IL-24单基因腺病毒，有明显的生长抑制增效功能。

实施例二十二，Annexin-V-PE/7-AAD双染的FCM检测细胞凋亡

同上分别感染处于对数生长期的MDA-MB-231细胞。37℃、5％CO₂培养72h后收集细胞，PBS洗涤2次，用结合缓冲液调节细胞至10⁶～10⁷个/ml，取细胞100μl于流式管中，加10μl Annexin-V-PE冰上混匀，避光15min，再加结合缓冲液380μl，再加10μl 7-AAD，上流式细胞仪(FCM)检测。

如图25，可见Ad-ING4、Ad-IL-24和Ad-ING4-IL-24均能不同程度诱导MDA-MB-231细胞凋亡，其中凋亡率分别可达22.63％、15.8％和39.18％，与Ad组和细胞对照组比较呈显著性差异(P＜0.05)；尤以双基因腺病毒Ad-ING4-IL-24组对诱导MDA-MB-231细胞凋亡的作用明显强于单基因腺病毒Ad-ING4组和Ad-IL-24组(P＜0.05)。

说明Ad-ING4-IL-24双基因表达对乳腺癌肿瘤细胞也具有诱导细胞凋亡的协同增效功能。

实施例二十三，RT-PCR分析Bax、Bcl-2、Survivin细胞凋亡相关基因的表达

按上述各组将重组腺病毒分别感染MDA-MB-231细胞(细胞数为1×10⁶)48h，收集细胞并提取总RNA，分别取2μL模板样品，以GAPDH为内参照进行RT-PCR检测Bax、Bcl-2、和Survivin基因在MDA-MB-231细胞中mRNA的转录。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像仪分析(参见图26)。

琼脂糖凝胶电泳条带，通过BandScan4.0软件对条带进行灰度扫描分析，结果如表3，由表3可见，与PBS组和Ad组相比，感染100MOI的Ad-ING4-IL-24、Ad-ING4的MDA-MB-231细胞中的Bax基因表达明显上调，而Bcl-2和Survivin基因表达明显下调，Bax/Bcl-2比值明显上调，导致细胞凋亡；Ad-IL-24组MDA-MB-231细胞中的Bax基因表达明显上调，而Survivin基因表达则明显下凋，尽管Bcl-2基因表达下调不明显，但也可以引起Bax/Bcl-2比值上调，同样也会导致细胞凋亡。

表3细胞凋亡相关基因的半定量分析结果(目的条带/GAPDH灰度比值)

实施例二十四，VEGF浓度的ELISA测定

用100MOI的Ad、Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24分别感染MDA-MB-231细胞48h后，1000r/min离心收集细胞培养上清，同时设不加病毒的细胞对照组(PBS组)。按ELISA试剂盒说明书测定各组细胞培养上清中VEGF的浓度。经ELISA检测结果显示，Ad-ING4、Ad-IL-24和Ad-ING4-IL-24组培养上清中的VEGF水平与PBS组及Ad组比较均显著减少(P＜0.05)。PBS组及Ad组比较VEGF表达水平差异不明显(如图27)。

SEQUENCE LISTING

<110>苏州大学

<120>ING4和IL-24双基因共表达载体及其用途

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2803

<212>DNA

<213>大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)

<220>

<221>gene

<222>(2801)..(2803)

<223>n is a，c，g，or t

<400>1

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<210>2

<211>3102

<212>DNA

<213>大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)

<220>

<221>gene

<222>(3100)..(3102)

<223>n is a，c，g，or t

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agggaaaaac tcagatgaag aagcccccaa gactgcccag aagaagttaa aacttgtgcg    1080

cacaagtcct gagtatggga tgccctcagt gacatttggc agtgtccacc cctctgatgt    1140

gttggatatg cctgtggatc ccaacgaacc cacatattgc ctttgtcacc aggtctccta    1200

tggagagatg attggctgtg acaacccgga ttgttccatc gagtggttcc acttcgcctg    1260

tgtggggctg acaaccaaac ctcgagggaa atggttttgc ccacgctgct cccaagaacg    1320

gaagaagaaa tagggtcgac aaacctgccc caaacaaata tgctagctcg acatgataag    1380

atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg    1440

tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta    1500

accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag    1560

gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaga    1620

tccatttaaa tgttaaaaaa cccgcttcgg cgggtttttt tatggatctg cgatcgctcc    1680

ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg    1740

gtcggcaatt gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc    1800

gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc    1860

gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacagctggt gggtagggat    1920

gagggaggga ggggcattgt gatgtacagg gctgctctgt gagatcaagg gtctcttaag    1980

ggtgggagct ggggcaggga ctacgagagc agccagatgg gctgaaagtg gaactcaagg    2040

ggtttctggc acctacctac ctgcttcccg ctggggggtg gggagttggc ccagagtctt    2100

aagattgggg cagggtggag aggtgggctc ttcctgcttc ccactcatct tatagctttc    2160

tttccccaga tccgaattcg agatccaaac caaggaggaa aggatatcac agaggagagc    2220

ggccgctcga gaccatgaat tttcaacaga ggctgcaaag cctgtggact ttagccagac    2280

ccttctgccc tcctttgctg gcgacagcct ctcaaatgca gatggttgtg ctcccttgcc    2340

tgggttttac cctgcttctc tggagccagg tatcaggggc ccagggccaa gaattccact    2400

ttgggccctg ccaagtgaag ggggttgttc cccagaaact gtgggaagcc ttctgggctg    2460

tgaaagacac tatgcaagct caggataaca tcacgagtgc ccggctgctg cagcaggagg    2520

ttctgcagaa cgtctcggat gctgagagct gttaccttgt ccacaccctg ctggagttct    2580

acttgaaaac tgttttcaaa aactaccaca atagaacagt tgaagtcagg actctgaagt    2640

cattctctac tctggccaac aactttgttc tcatcgtgtc acaactgcaa cccagtcaag    2700

aaaatgagat gttttccatc agagacagtg cacacaggcg gtttctgcta ttccggagag    2760

cattcaaaca gttggacgta gaagcagctc tgaccaaagc ccttggggaa gtggacattc    2820

ttctgacctg gatgcagaaa ttctacaagc tctgatctag ataactgatc ataatcagcc    2880

ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc    2940

tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt    3000

acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta    3060

gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttaacgcgn nn                       3102

<210>3

<211>326

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aaacctgccc caaacaaata tgctagctcg acatgataag atacattgat gagtttggac    60

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg    120

ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa    180

acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga    240

ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaga tccatttaaa tgttaattaa    300

aaacccgctt cggcgggttt  ttttat                                        326

<210>4

<211>323

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aaacctgccc caaacaaata tgctagctcg acatgataag atacattgat gagtttggac    60

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg    120

ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa    180

acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga    240

ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaga tccatttaaa tgttaaaaaa    300

cccgcttcgg cgggtttttt tat                                            323

Claims (8)

1.一种DNA序列，它具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。

2.一种重组载体pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24，它含有权利要求1所述的DNA序列，其保藏号为：CCTCC NO：M208154。

3.一种DNA序列，它具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列。

4.一种重组载体pAdTrack-CMV-ING4-polyA^Δ296～298+CMV-IL-24，它含有权利要求3所述的DNA序列，其保藏号为：CCTCC NO：M208155。

5.一种肿瘤的基因治疗药物，其特征在于含有权利要求2或权利要求4所述的重组载体。

6.一种联合顺铂化疗增敏剂，其特征在于含有权利要求2或权利要求4所述的重组载体。

7.权利要求2或权利要求4所述的重组载体用于制备癌症的基因治疗药物的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述癌症为肝癌、肺癌或乳腺癌。

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