CN101912619A - Ing4和il-24双基因共表达载体作为放疗增敏剂的应用 - Google Patents
Ing4和il-24双基因共表达载体作为放疗增敏剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因组学、分子生物学、细胞生物学、基因工程以及临床医学，本发明具体涉及人类ING4IL-24双基因共表达载体作为放疗药物增敏剂的应用，放疗前将人类ING4和IL-24双基因共表达载体导入肿瘤细胞，使人类ING4和IL-24基因在肿瘤细胞中表达，然后进行放疗；本发明所述Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24；可以使大量增殖期肿瘤细胞阻滞于G2/M期，有利于增强照射敏感性，MTT和FCM检测结果进一步表明，Ad-ING4-IL-24联合放疗具有显著性抑制SPC-A1肺腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞及其移植瘤生长和诱导细胞凋亡的作用，优于Ad-ING4-IL-24单纯组和放疗单纯组，呈现明显放疗增敏协同效应；因此，可以应用人类ING4和IL-24双基因共表达载体增强肿瘤细胞对放疗敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及基因组学、分子生物学、细胞生物学、基因工程以及临床医学，本发明具体涉及人类ING4和IL-24双基因共表达载体作为化疗药物增敏剂的应用。
背景技术
放射治疗是肿瘤治疗的常规手段之一，70％～80％的恶性肿瘤患者在治疗过程中需接受放疗。肿瘤对辐射不敏感或对辐射产生抗拒性，是放射治疗难以根治恶性肿瘤的主要原因之一。近年来，随着对肿瘤发病分子机制及细胞生长调控机理研究的深入，肿瘤基因治疗已取得一些令人振奋的成果，但针对单一环节的转基因治疗常常不能达到令人满意的治疗效果。Weichselbaum等于1994年提出肿瘤基因-放射治疗的新思路，其原理是将辐射诱导型基因的调控序列与肿瘤杀伤基因相耦联，转染肿瘤细胞，对肿瘤实施局部照射同时诱导基因表达，通过射线与基因的双重作用杀伤肿瘤，以达到降低照射剂量、缓解正常组织损伤的目的。因此，将放射治疗与基因治疗相结合，事半功倍，已成为肿瘤治疗研究的重要方向之一，目前肿瘤基因联合放射治疗的有关机制主要有如下几种(参见：田玥，苏成海.国际放射医学核医学杂志.2008 32(1))：①免疫基因治疗与放射治疗的联合；②抑癌基因与放射治疗的联合；③自杀基因治疗与放射治疗的联合；④抗血管生成基因治疗与放射治疗的联合；⑤特异性启动子基因治疗与放射治疗的联合；⑥辐射保护性基因治疗与放射治疗的联合。
现有技术中，已知：人ING4基因定位于12p13-31，基因跨距13kb，由8个外显子和7个内含子组成，cDNA全长1380bp，编码蛋白含249个氨基酸，是新近发现的一种细胞内肿瘤生长抑制因子，可与NF-κB蛋白的P65亚基结合抑制NF-κB蛋白的活性，引起对NF-κB敏感的IL-8等基因的表达量减少；可通过调节p53乙酰化状态增强p53的转录活性；可抑制缺氧诱导因子HIF-1的活化等，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞生长；白介素-24(interleukin-24，IL-24)基因原先被命名为黑色素瘤分化相关基因(melanoma differentiation-associated gene-7，mda-7)，由美国哥伦比亚大学的Jiang等人于1995年将增生活跃的人类黑色素瘤细胞HO-1产生的cDNA文库与经人成纤维细胞β干扰素(IFN-β)和mezerein(MEZ)共同处理过的HO-1细胞的cDNA文库进行减数杂交时首次发现(参见：Jiang H，Lin JJ，Su ZZ等人，Oncogene，1995，11(12)：2477-2486.)。这一因子从其结构、染色体定位、碱基序列同源性及细胞因子特性等方面综合考虑，被归入IL-10家族，并命名为IL-24。IL-24为分泌型细胞因子，是一种膜受体介导的肿瘤生长抑制因子。目前的研究显示，IL-24基因是第一个，很可能是唯一既抑制肿瘤细胞生长和血管形成并诱导凋亡，同时又能刺激免疫细胞表达细胞因子的新型抑癌基因，因而能通过抑制肿瘤血管生长，刺激免疫系统应答及诱导肿瘤细胞凋亡三者联合的方式来发挥抗肿瘤效应。
申请号为200910029793.9的中国发明专利申请公开说明书公开了人类ING4基因作为肿瘤放疗增敏剂的用途，可以将ING4基因应用于肿瘤放疗过程，并且明显促进不同肿瘤细胞对放疗的敏感性，有效地抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。
申请号为200810244301.3的中国发明专利申请公开说明书公开了双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24，所述双基因载体将ING4和IL-24基因理想而又成功的组合使两个基因在同一个载体上均能获得成功表达，并且通过双基因表达产物的联合作用，将作用于肿瘤细胞内的ING4与分泌至胞外的IL-24联合作用，进而发挥出抑癌增效和化疗增敏效果，而且其效果相对于单独的ING4或者IL-24的作用更明显。
但是关于人类ING4和IL-24双基因共表达载体作为肿瘤放疗增敏剂的应用却未见报道，而且本领域技术人员公知：化疗增敏药物未必可以作为放疗增敏药物使用；放射增敏作用主要是针对瘤内放射抗拒的那部分乏氧细胞而提出的，指的是某些化学物质能增强射线对肿瘤内乏氧细胞的杀灭作用而对有氧的正常组织损伤较小，这些化学物质称为放疗增敏剂，常用的放疗增敏剂主要有米索硝唑(MISO)、甘氨双唑钠(CMNa)、黄酮乙酸和氧；有些药物既可以作为放疗增敏剂又可以作为化疗增敏剂，比如米索硝唑(MISO)、甘氨双唑钠(CMNa)、CMNa、环磷酰胺、氟尿嘧啶、VP-16、博来霉素、丝裂霉素C、(羟基)喜树碱、紫杉醇、阿霉素、顺(卡)铂等；但是有些药物只能作为化疗增敏药物而不能作为放疗增敏药物，比如磺氨酸、decitabine等可以克服抗药性，使癌症得到更好的治疗。
而且目前未见有关人类ING4和IL-24双基因共表达载体及其双基因编码蛋白联合放疗发挥放疗增敏作用的文献报道。
发明内容
本发明目的是提供ING4和IL-24基因共表达载体的新用途，具体涉及人类ING4和IL-24双基因共表达载体作为放疗增敏剂的应用。
本发明的另一目的是提供应用人类ING4和IL-24双基因共表达载体增强肿瘤细胞对放疗敏感性的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：人类ING4和IL-24双基因共表达载体作为放疗增敏剂的应用，所述人类ING4和IL-24双基因共表达载体为双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24(参见：公开号为CN 101591658A的中国发明专利申请公开说明书)。
本发明还提供了一种应用人类ING4和IL-24双基因共表达载体增强肿瘤细胞对放疗敏感性的方法，放疗前将人类ING4和IL-24双基因共表达载体pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24导入肿瘤细胞，使人类ING4和IL-24基因在肿瘤细胞中表达，然后进行放疗。
上述技术方案中，所述将pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24导入肿瘤细胞的方法为质粒转染或腺病毒介导法。
上述技术方案中，所述pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24具有公开号为CN 101591658A中国发明专利申请公开说明书的序列表中SEQID NO.2所述的碱基序列。
下面以腺病毒介导法为例，说明本发明采用的技术方案，包括以下具体步骤：
(1)按照现有技术，用pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24双基因共表达载体质粒构建Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24重组腺病毒病毒子(简称Ad-ING4-IL-24)；
(2)用Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24感染人肿瘤细胞或裸鼠移植瘤，使人ING4和IL-24基因在人的肿瘤细胞中得到表达；
(3)对步骤(2)所述的人的肿瘤细胞进行放疗。
上述技术方案中，所述肿瘤为肺腺癌、乳腺癌。
因此，本发明同时要求保护Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24重组腺病毒子(简称Ad-ING4-IL-24)作为放疗增敏剂的应用。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明所述Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24可以使大量增殖期肿瘤细胞阻滞于G2/M期，有利于增强照射敏感性，MTT和FCM检测结果进一步表明，Ad-ING4-IL-24联合放疗具有显著性抑制SPC-A1肺腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞生长及其诱导细胞凋亡的作用，并优于Ad-ING4-IL-24单纯组和放疗单纯组，呈现明显放疗增敏协同效应(Q值＝1.17)；因此，可以应用人类ING4和IL-24双基因共表达载体增强肿瘤细胞对放疗敏感性。
附图说明
图1为实施例三中腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因在SPC-A1中的转录鉴定(RT-PCR)，其中，1.PBS；2.AdV；3.Ad-IL-24；4.Ad-ING4；5.Ad-ING4-IL-24；
图2为实施例四中IL-24和ING4蛋白表达Western blotting鉴定，其中，1.PBS；2.AdV；3.Ad-IL-24；4.Ad-ING4；5.Ad-ING4-IL-24；
图3A为实施例六中Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞生长的影响，Ad-ING4-IL-24+放疗联合组分别与AdV组，PBS组比较，△P＜0.01；分别与Ad-ING4-IL-24，放疗组比较，＊P＜0.01；
图3B为实施例六中Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞生长的抑制率结果比较，Ad-ING4-IL-24+放疗联合组分别与Ad-ING4-IL-24，放疗组比较，＊P＜0.01，Q＝1.17；
图4A为实施例六中流式细胞仪检测Ad-ING4-hIL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞周期的测定结果；
图4B为实施例六中流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞周期结果的比较，Ad-ING4-IL-24+放疗联合组分别与Ad-ING4-IL-24，单纯放疗组比较，＊P＜0.01；
图5A为实施例六中流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24+放疗联合组对SPC-A1肺腺癌细胞凋亡率测定的结果；
图5B为实施例六中Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1细胞凋亡率的放疗增敏效应，Ad-ING4-IL-24+放疗联合组分别与Ad-ING4-IL-24，单纯放疗组比较，＊P＜0.01，Q＝1.16；
图6为实施例八中各组肺腺癌瘤体体积-时间变化曲线，Ad-ING4-IL-24+放疗联合组分别与PBS组、AdV组比较，＊P＜0.01；分别与Ad-ING4-IL24组、单纯放疗组比较，△P＜0.01；
图7为实施例八中各组肺腺癌瘤体重量直方图，Ad-ING4-IL24+放疗联合组的抑瘤作用优于单纯Ad-ING4-IL24组、单纯放疗组，统计学有显著性差异(P＜0.01)；
图8为实施例八中各组肺腺癌抑瘤率比较直方图Ad-ING4-IL-24+放疗联合组分别与Ad-ING4-IL24组、单纯放疗组比较，＊P＜0.01；Q＝1.20；
图9为实施例八中各组肺腺癌瘤体组织HE染色(×400)；
图10为实施例七中各组对MDA-MB-231乳腺癌细胞的细胞毒作用；
图11为实施例七中FCM检测MDA-MB-231细胞凋亡率；
图12A～C为实施例十一中Ad-ING4-IL-24联合放疗对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤效应结果的比较。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例中所涉及材料和试剂：人肺癌细胞株SPC-A1，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，QBI-293A细胞及携带GFP绿色荧光蛋白的Ad-polyA-promoter腺病毒空载体AdV、Ad-polyA-promoter-IL-24，Ad-ING4-polyA-promoter、Ad-ING4-polyA-promoter-IL-24由苏州大学基础医学系细胞与分子生物学教研室提供；培养基RPMI1640，胎牛血清、DMEM购自Gibcol Brl公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；Annexin-v-PE/7-AAD凋亡试剂盒购于southern biothech公司；PI单染凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。96孔细胞培养板购自CORNING公司，DL2000marker、Taq DNA聚合酶、dNTPmix、Oligo d(T)18、Ribonuclease Inhibitor购自TaKaRa公司；逆转录酶MMLV购自MBI公司；UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、琼脂糖等生化试剂购自上海生工生物技术有限公司。各基因其上、下游引物由上海生工(Sangon)生物技术有限公司合成(如表1)。Western blotting中，IL-24、ING4一抗购自美国abcam公司，其二抗均购于碧云天生物技术研究所，硝酸纤维素膜(NC膜)、Western blotting化学发光试剂盒和暗盒购自上海普利莱基因技术有限公司(苏州金莱生物科技有限公司发货)。3-4周龄、体重约20g/只雄性BALB/c nu/nu裸鼠购自中科院上海斯莱克实验动物中心(许可证号：SCXK(沪)2007-0005)。免疫组化Caspase3、bax、bcl-2、cox-2、Fas-L、Survivin、VEGF一抗购自福州迈新(进口分装)，CD34一抗购自武汉博士德生物有限公司，其所有二抗均购自福州迈新生物技术公司(进口分装)。体外细胞辐照：于苏州大学辐照中心、钴60(γ射线)、剂量率1Gy/min。动物体内放疗：苏大附一院放疗科电子辐照(x射线)，西门子PRIMUS M，5MeV，SSD＝100cm，Dt＝10Gy。
表1PCR扩增所用引物及其序列
| 引物编号和名称 | 引物序列 |
| SEQ ID No.1，P1：ING4上游 | 5’-tagagatctaccatggctgctgggatgtatttgg-3’ |
| SEQ ID No.2，P2：ING4下游 | 5’-accgtcgaccctatttcttcttccgttcttg-3’ |
| SEQ ID No.3，P3：IL-24上游 | 5’-gcactcgagaccatgaattttcaacagaggctgca-3’ |
| SEQ ID No.4，P4：IL-24下游 | 5’-gcttctagatcagagcttgtagaatttctg-3’ |
| SEQ ID No.5，P5：β-actin上游 | 5’-tgcgtgacattaaggagaag-3’ |
| SEQ ID No.6，P6：β-actin下游 | 5’-ctgcatcctgtcggcaatg-3’ |
| SEQ ID No.7，P7：Bax上游 | 5’-GGATGCGTCCACCAAGAA-3’ |
| SEQ ID No.8，P8：Bax下游 | 5’-GCACTCCCGCCACAAAGA-3’ |
| SEQ ID No.9，P9：Bcl-2上游 | 5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’ |
| SEQ ID No.10，P10：Bcl-2上游 | 5’-CTACCCAGCCTCCGTTATCC-3’ |
| SEQ ID No.11，P11：Survivin上游 | 5’-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3’ |
| SEQ ID No.12，P12：Survivin下游 | 5’-GCTCCGGCCAGAGGCTCAA-3’ |
| SEQ ID No.13，P13：GAPDH上游 | 5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3’ |
| SEQ ID No.14，P14：GAPDH下游 | 5’-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3’ |
| SEQ ID No.15，P15：Caspase-3上游 | 5’-CCTAGCGGATGGGTGCTATT-3’ |
| SEQ ID No.16，P16：Caspase-3下游 | 5’-CGAGGTGGCAAAACAAACA-3’ |
实施例一：
(1)根据现有技术，从保藏号为CCTCC M 208155的大肠杆菌中获得pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24(简称pAd-ING4-IL-24)；(所述大肠杆菌保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2008年10月12日；保藏编号CCTCC M 208155；分类命名：大肠杆菌DH5α/pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24；Escherichia coli DH5α/pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24。)；
根据现有技术，采用人ING4和IL-24双基因共表达载体质粒pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24构建腺病毒介导的重组病毒子Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24(简称Ad-ING4-IL-24)；
(2)细胞培养：SPC-A1细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞各自用RPMI1640完全培养基(10％FCS)，在37℃，5％CO2下培养，2～3天传代一次；
(3)AdV、Ad-ING4-IL-24等腺病毒的扩增与效价的测定：
用AdV，Ad-ING4-IL-24，Ad-polyA-promoter-IL-24(简称Ad-IL-24)，Ad-ING4-polyA-promoter(简称Ad-ING4)感染70％贴壁的QBI-293A细胞，48h后收集细胞，将细胞悬液于-80℃及37℃反复冻融4次，取上清，反复扩增，病毒保存于-80℃；
将培养生长状况良好的QBI-293A细胞，用胰酶消化后，细胞计数，稀释细胞浓度为105个/ml后，在96孔板上按每孔100μl接种细胞，培养24h后，将收获的重组病毒子按10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释后，每个稀释度按每孔100μl接种1排，37℃、5％CO2细胞培养箱里培养18h后，荧光显微镜下进行荧光计数。按病毒效价(pfu/m1)＝(荧光数×10)/稀释度计算病毒效价。
结果显示，将腺病毒感染QBI-293A细胞后，次日在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光，48h后细胞变圆，呈葡萄状聚集，脱落，出现明显的细胞病理效应(CPE)，收集细胞，反复冻融。重组病毒子经多轮感染后，检测效价均达到108pfu/ml(乳腺癌那个实施例是109pfu/ml，如果合并实施例，该采用哪个数据？)。
实施例二：Ad-ING4-IL-24重组腺病毒感染SPC-A1细胞
将处于对数生长期的SPC-A1细胞系，经0.25％胰酶消化后，用RPMI1640配成细胞悬液，计数后调整细胞浓度为1×105/ml，每孔100μl接种于96孔培养板，37℃，5％CO2培养过夜。次日AdV空载体腺病毒体外以1、10、25、50、100、200MOI不同剂量感染SPC-A1细胞，以筛选和判定最佳感染剂量并以最佳感染剂量感染SPC-A1细胞，结果为：在普通光镜视野下可见1、10、25、50、100MOI不同剂量AdV空载体腺病毒感染SPC-A1组，细胞均形态正常，生长良好，与未感染腺病毒SPC-A1细胞对照组几乎无差别，而200MOI剂量感染SPC-A1组细胞圆缩、脱落，呈现明显的由腺病毒本身引起细胞毒性；在荧光显微镜下，50、100、200MOI不同剂量AdV感染SPC-A1细胞后可见90％以上细胞呈现GFP表达的绿色荧光，根据AdV对细胞感染效率最高而毒性最低的病毒感染剂量为最佳感染剂量的原则，提示50MOI可作为腺病毒感染SPC-A1细胞的最佳感染剂量。
实施例三：RT-PCR法鉴定不同基因重组腺病毒感染SPC-A1肺腺癌细胞后目的基因转录
将PBS组及用50MOI的AdV，Ad-ING4-IL-24，Ad-IL-24，Ad-ING4分别感染SPC-A1肺癌细胞72h后的各组细胞，1500r/min离心收集细胞，PBS洗涤2-3次，按RNA抽提试剂盒说明书操作提取总RNA，经逆转录获得cDNA第一链。将上述cDNA模板和上下游引物在PCR仪中进行扩增，IL-24、ING4基因上下游引物见表1-1.PCR的条件为94℃4min，94℃30s、55℃45s、72℃1min、30cycle，72℃ 10min。最后分别取10μl产物与DNA Marker一起行琼脂糖凝胶电泳，其产物琼脂糖凝胶电泳后，如图1显示，在621bp位置可检测到一条IL-24特异性条带，750bp位置可检测到一条ING4特异性条带，而PBS，AdV对照组中均未出现预期条带，提示SPC-A1肺癌细胞自身可能失去了IL-24、ING4基因表达能力；RT-PCR鉴定结果表明ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒均能介导外源性ING4和/或IL-24基因在SPC-A1细胞中成功转录。
实施例四：Western blotting法鉴定不同基因重组腺病毒感染SPC-A1肺腺癌细胞后目的基因的蛋白表达
用50MOI的AdV，Ad-ING4-IL-24，Ad-IL-24，Ad-ING4分别感染SPC-A1(细胞数为1×105/ml)。感染72h收集细胞按107细胞/ml细胞裂解液的比例加细胞裂解液(含终浓度为1mM PMSF蛋白酶抑制剂)进行裂解，充分裂解后12000r/min离心5min，取总蛋白上清，并以4∶1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，12000r/min离心5min，再用分离胶为12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳(100V，2h)，并300mA，2h将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，NC膜用5％脱脂奶粉37℃封闭1h；分别用鼠抗人IL-24、山羊抗人ING4抗体在37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min；再分别加HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗和HRP标记的驴抗羊IgG二抗，37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min；最后将NC膜与发光工作液(等体积A和B溶液混合)充分接触，室温孵育3min，暗室进行压片曝光、显影和定影。
Western blotting结果如图2所示，Ad-ING4-IL-24感染SPC-A1可产生24kD的与抗人IL-24抗体和29kD的抗人ING4抗体特异性结合的条带；Ad-IL-24组只产生24kD的与抗人IL-24抗体特异性结合的条带，而相应位置未产生29kD的抗人ING4抗体特异性结合的条带；Ad-ING4感染组只产生29kD的抗人ING4抗体特异性结合的条带，而相应位置未产生与抗人IL-24抗体特异性结合的条带；AdV组和PBS组在相应位置均未出现上述条带，说明SPC-A1肺癌细胞自身对IL-24、ING4基因表达能力低下甚至发生了缺失，同时还进一步表明ING4、IL-24单、双基因重组腺病毒均能介导外源性ING4和/或IL-24基因在SPC-A1细胞中成功表达。
实施例五：不同照射剂量对SPC-A1细胞凋亡率的影响
将呈指数生长期，细胞密度为70％SPC-A1细胞分为0、2、4、6、8Gy共5组，室温下采用60Coγ射线照射，吸收剂量率为1Gy/min，由苏州大学放射医学辐照中心照射。37℃5％CO2相同条件下培养72h后收集细胞，PBS清洗2次，用1×binding buffer调节细胞至1×106个/ml，取细胞100μl于流式管中，加10μlAnnexin-V-PE冰上混匀，避光15min。再加1×binding buffer 380μl，再加10μl7-AAD，上流式检测，实验重复三次，旨在筛选出最佳照射剂量以供Ad-ING4-IL-24联合放疗的生物学功能研究时参考。
结果显示各照射剂量组的凋亡率分别为(1.83±0.11)％、(12.51±0.95)％、(24.13±0.60)％、(38.46±2.13)％及(57.75±0.83)％。为了避免高剂量照射的严重副作用和利于观察Ad-ING4-IL-24对中剂量照射的放疗增敏和增效作用，故我们选择常规照射剂量的半数照射剂量(体外实验为4Gy，体内实验为10Gy)作为实施例中体内外放疗增敏实验使用的照射剂量。
实施例六：Ad-ING4-IL-24联合放疗对SPC-A1肺腺癌细胞的影响
(1)MTT法检测Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞生长的影响
1.1实验分组及细胞处理
PBS组：1×105/ml SPC-A1+0.1mol/L PBS；
AdV组：1×105/ml SPC-A1+50MOI AdV；
Ad-ING4-IL-24组(简称双基因组)：1×105/ml SPC-A1+50MOIAd-ING4-IL-24；
放疗组：1×105/ml SPC-A1+48h后辐照(4Gy)；
Ad-ING4-IL-24+放疗联合组(简称双基因联合放疗组)：1×105/ml SPC-A1+50MOI Ad-ING4-IL-24+48h后辐照(4Gy)。
1.2Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞生长的影响
取呈指数生长期，细胞密度为70％SPC-A1细胞，按上述实验分组及细胞处理，每组设3个复孔，37℃，5％CO2孵育，分别于24、48、72、96h每孔加10μl MTT(5mg/ml)，继续孵育4h后加入10％SDS-HCl终止液100μl/孔，置于37℃，至次日待甲臢结晶完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测OD570值，以OD570值为纵坐标，时间(h)为横坐标绘制生长曲线，并计算细胞生长抑制率。
生长抑制率＝[(对照组OD570值-实验组OD570值)/对照组OD570值]×100％
MTT法检测结果显示(如图3A和图3B)，Ad-ING4-IL-24组+放疗联合组与PBS组和AdV组比较均具有明显的生长抑制作用(P＜0.01)，Ad-ING4-IL-24联合放疗组对SPC-A1肺癌细胞的生长抑制作用明显优于单纯Ad-ING4-IL-24组和单纯放疗组(P＜0.01)，且对肺癌细胞的细胞毒作用较Ad-ING4-IL-24双基因组和放疗单纯组呈现明放疗增敏协同效应(Q＝1.17)。
(2)FCM检测Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞周期的影响
取呈指数生长期，细胞密度为70％SPC-A1细胞，按实施例六分组及细胞处理，于37℃，5％CO2条件下培养72h后，分别收集各组细胞，所收集细胞用PBS1.0ml混匀，2000r/min离心5min，弃上清，重复上述步骤一次后，70％冷乙醇4℃下固定24h以上，进行PI染色流式检测细胞周期。实验重复三次。
PI染色法的FCM检测的结果显示(如图4A和图4B)：Ad-ING4-IL-24联合放疗组作用72h的SPC-A1细胞出现G2/M期阻滞(71.47±1.54)％高于单纯Ad-ING4-IL-24(39.3±1.01)％和单纯放疗组(24.98±2.31)％(P＜0.01)；Ad-ING4-IL-24联合放疗组的G1期细胞比率为(10.72±2.24)％，与单纯Ad-ING4-IL-24及单纯放疗组G1期细胞比率(分别为40.70±2.31％、37.81±1.77％)比较均明显减少(P＜0.05)。
(3)Annexin-V-P/7-AAD双染法流式检测Ad-ING4-IL-24+放疗对SPC-A1肺腺癌细胞凋亡的影响
按实施例六分组和上述FCM检测方法收集细胞，PBS清洗2次，用1×binding buffer调节细胞至1×106个/ml，取细胞100μl于流式管中，加10μl Annexin-V-PE冰上混匀，避光15min。再加1×binding buffer 380μl，再加10μl 7-AAD，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复三次。
结果如图5A、5B所示：Ad-ING4-IL-24联合放疗组(4Gy)诱导SPC-A1肺癌细胞凋亡率为(56.10±1.24)％，不仅可达到如前8Gy照射剂量诱导肺癌细胞凋亡(凋亡率为57.25±0.83％)的放疗效果，而且还优于单纯Ad-ING4-IL-24(31.60±2.55)％和单纯放疗组(24.27±2.02)％，(P＜0.01，)，提示在肺癌细胞中Ad-ING4-IL-24联合放疗组对SPC-A1肺癌细胞的诱导细胞凋亡作用与Ad-ING4-hIL-24单纯组和放疗单纯组比较具有放疗增敏的协同效应(Q＝1.16)。
实施例七：参照实施例六的方法，观察Ad-ING4-IL-24联合放疗对MDA-MB-231乳腺癌生长的影响。
(1)MTT法检测Ad-ING4-IL-24联合放疗组对MDA-MB-231细胞生长的抑制作用，结果如图10所示，单纯放疗组至第四天γ-射线可轻度抑制细胞存活率(21.7％)。当Ad-ING4-IL-24和6Gyγ-射线共同处理细胞后的Ad-ING4-IL-24联合放疗组，细胞存活率进一步下降，Ad-ING4-IL-24联合放疗组第四天的细胞生长抑制率达83.9％，明显高于Ad-ING4-IL-24(62.1％)和单纯放疗组(21.7％)，呈现放疗增敏的协同效应(P＜0.05，Q＝1.19)；注：Ad-ING4-IL-24联合放疗组分别与PBS，AdV空载体腺病毒组比较，＊P＜0.05；分别与单纯放疗组、Ad-NG4-IL-24双基因重组腺病毒组比较，△P＜0.05，Q＝1.19。
(2)Annexin-V-PE/7-AAD双染FCM检测Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒联合放疗对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，结果如图11所示，Ad-ING4-IL-24、单纯放疗及Ad-ING4-IL-24联合放疗组均能诱导MDA-MB-231细胞凋亡，其中早期凋亡率分别可达(39.18±5.08)％、(13.87±4.14)％和(56.63±5.95)％，与AdV组和PBS细胞对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。尤其Ad-ING4-IL-24联合放疗组处理细胞后72h，细胞凋亡的发生率明显高于Ad-ING4-IL-24组及单纯放疗组(P＜0.05)。实验结果表明Ad-ING4-IL-24可以增加乳腺癌细胞对γ-射线诱发凋亡的敏感性，具有诱导细胞凋亡的协同增效功能(Q＝1.21)；注：Ad-ING4-IL-24联合放疗组分别与PBS，AdV组比较，＊P＜0.05；分别与单纯放疗组、Ad-NG4-IL-24双基因组比较，△P＜0.05，Q＝1.21。
(3)PI染色的FCM检测细胞周期，结果显示，Ad-ING4-IL-24组作用72hMDA-MB-231细胞在G2/M期出现明显阻滞，可达(32.36±3.62)％。单纯放疗处理后，MDA-MB-231细胞出现G2/M期阻滞，达(47.39±4.24)％，Ad-ING4-IL-24联合放疗组出现G2/M期阻滞达(59.26±4.56)％，显著高于AdV组的G2/M期(13.52±1.35)％和PBS组的G2/M期(11.61±1.26)％(均P＜0.05)。
实施例八：Ad-ING4-IL-24联合放疗对裸鼠SPC-A1肺腺癌移植瘤的影响
建立动物模型：SPC-A1肺腺癌细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基于5％CO2、37℃常规培养。将处于对数生长期的SPC-A1肺腺癌细胞先用PBS洗涤，经0.25％胰酶消化，并用无血清培养液中止后以1000r/min的转速离心5min，收获细胞，用PBS调整细胞浓度制备3.0×107/ml的细胞悬液。取4周龄SPF级BALB/c雄性裸鼠25只，安尔碘于裸鼠右前腋下常规消毒后，每只裸鼠皮下注射细胞悬液3.0×106/100μl，并观察SPC-A1肺腺癌细胞在裸鼠皮下的生长成瘤情况。裸鼠皮下接种SPC-A1肺腺癌细胞2～3天后，局部皮丘逐渐缩小、变实，随后瘤体体积不断增殖，10d后其瘤体直径约5mm。本实施例中SPC-A1肺腺癌细胞接种裸鼠的成瘤率为100％(25/25)。
实验分组及各组处理
待上述皮下接种2周左右肿瘤直径长至5mm左右时，将其随机分成5组，每组5只：
PBS组：50μl PBS/只，使用瘤体内注射干预用药，隔日一次，共注射6次；
AdV组：1×108pfu AdV/50μl PBS/只，治疗方法同PBS组；
Ad-ING4-IL-24组：1×108pfu Ad-ING4-IL-24/50μl PBS/只，治疗方法同PBS组；
Ad-ING4-IL-24+放疗联合组：1×108pfu Ad-ING4-IL-24/50μl PBS/只，治疗方法同PBS组，治疗2次后于肿瘤局部单次照射10Gy/只；
放疗组：抗肿瘤实验开始后的第5d，荷瘤裸鼠肿瘤处局部单次照射10Gy/只。
本实施例中照射治疗方法为：先将需要照射的裸鼠麻醉，10％水合氯醛按200mg/kg体重腹腔注射待裸鼠麻醉后固定在特制装置上，以铅板屏蔽除局部肿块以外的部位，采用西门子PRIMUS M对瘤体进行电子辐照(x射线)，5MeV，SSD＝100cm，Dt＝10Gy。
(1)瘤体体积观察
第一次治疗前及开始治疗后隔日用游标卡尺测量各组瘤体的长径(a)、短径(b)，计算瘤体体积(V＝a×b2/2)，绘制瘤体体积-时间变化曲线，得图6，结果表明，治疗15d后，Ad-ING4-IL-24组、单纯放疗组、Ad-ING4-IL-24+放疗联合组对裸鼠SPC-A1肺腺癌移植瘤均有不同程度的抑瘤作用，与PBS组、AdV组比较有显著性差异(P＜0.01)，且Ad-ING4-IL-24+放疗联合组的抑瘤作用优于单纯Ad-ING4-IL-24组和单纯放疗组，统计学有显著性差异(P＜0.01)。
(2)瘤体重量观察
治疗15d后，将裸鼠脱颈处死，肿瘤局部皮肤用安尔碘常规消毒，切开皮肤摘取瘤体，电子天平称肿瘤湿重，根据电子天平称瘤体重量(g)，并绘制瘤体重量直方图(图7)，Ad-ING4-IL-24组、单纯放疗组、Ad-ING4-IL-24+放疗联合组的平均瘤体重量
分别为0.963±0.059，1.232±0.042，0.386±0.038，与PBS组(1.907±0.103)、AdV组(1.882±0.129)比较有显著性差异(P＜0.01)，Ad-ING4-IL24+放疗联合组的抑瘤作用优于单纯Ad-ING4-IL24组、单纯放疗组，统计学有显著性差异(P＜0.01)。
(3)抑瘤率观察
根据瘤重计算抑瘤率(E)，抑制率(％)＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％；绘制瘤体抑瘤率直方图，得图8，结果表明，Ad-ING4-IL-24组、单纯放疗组、Ad-ING4-IL-24+放疗联合组对裸鼠SPC-A1肺腺癌移植瘤均有明显的抑瘤作用，抑瘤率分别为48.86％、34.54％、79.52％；其中Ad-ING4-IL-24+放疗联合组较单纯Ad-ING4-IL-24组和单纯放疗组有显著性差异(P＜0.01)，并呈现放疗增敏的协同作用(Q＝1.20)。
(4)免疫组化检测
将各组瘤体组织以10％中性福尔马林固定，常规石蜡包埋并组织切片，进行HE染色和免疫组化染色。
上述瘤体组织HE常规染色，光镜下(×400)观察各肿瘤组织细胞的形态变化，如图9所示：单纯Ad-ING4-IL-24组和放疗组及Ad-ING4-IL-24+放疗联合组表现为大量细胞呈细胞核固缩、裂解或溶解，细胞质浓缩，细胞膜不完整，组织间有大量空泡形成。
上述5组瘤体均制成组织切片，用特异抗体的免疫组化常规染色法检测SPC-A1肺腺癌移植瘤生长相关因子的表达：(1)Bax、Caspase3、FasL等促凋亡因子；(2)Bcl-2、Cox-2、Survivin等凋亡抑制因子；(3)VEGF等肿瘤血管形成相关因子。将每张切片于400倍光镜下观察，共记数10个视野下的阳性细胞数(以细胞质内和/或细胞浆内出现散在或弥漫状分布的棕黄色颗粒为阳性细胞)数据进行统计分析，结果见表2、表3，结果表明，各实验组Fas-L、Bax、Caspase-3阳性细胞数显著高于PBS组和AdV组(P＜0.01)，且Ad-ING4-IL-24+放疗联合组较单纯Ad-ING4-IL-24组、单纯放疗组有显著性差异(P＜0.01)；各实验组Cox-2、Bcl-2、VEGF、Survivin及CD34(MVD)阳性细胞数(除VEGF阳性细胞计数中单纯放疗组与PBS组差异不显著外)均显著低于PBS组和AdV组(P＜0.01)，且Ad-ING4-IL-24+放疗联合组较Ad-ING4-IL-24组、单纯放疗组有显著性差异(P＜0.01)。
表2：各治疗组肿瘤组织中相关因子的表达(个/HP)
＊为各治疗组分别与PBS，AdV组比较＊P＜0.05；△为分别与Ad-ING4-IL-24，单纯放疗组比较△P＜0.05。
表3：各治疗组肿瘤组织中相关因子的表达(个/HP)
＊为各治疗组分别与PBS，AdV组比较＊P＜0.05；△为分别与Ad-ING4-IL-24，单纯放疗组比较△P＜0.05。
(5)腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因表达对放疗敏感性比较
参照以上步骤，比较腺病毒介导的ING4和/或IL-24基因对SPC-A1肺癌细胞及其裸鼠移植瘤放疗敏感性，包括Ad-ING4+放疗组、Ad-IL-24+放疗组和Ad-ING4-IL-24+放疗组对SPC-A1细胞生长抑制率、对SPC-A1细胞G2/M期阻滞率、对SPC-A1细胞的细胞凋亡率、对移植瘤的瘤体重量、对移植瘤生长的抑瘤率的影响，结果见下表：
结果表明：在同一放疗剂量(4Gy)下，Ad-ING4-IL-24双基因+放疗联合组体外对SPC-A1肺癌细胞96h的生长抑制率，72h细胞生长的G2/M期阻滞率和诱导细胞的细胞凋亡率均明显高于单基因表达的Ad-ING4+放疗组和Ad-IL-24+放疗组(P＜0.05)。
在同一放疗剂量(10Gy)下，Ad-ING4-IL-24双基因+放疗联合组体内对SPC-A1肺癌细胞裸鼠移植瘤的瘤体重量(g)的下降和瘤重抑瘤率的升高均明显优于单基因表达的Ad-ING4+放疗组和Ad-IL-24+放疗组(P＜0.05)。
综上所述，Ad-ING4-IL-24联合放疗对SPC-A1肺腺癌细胞及其裸鼠移植瘤的放疗增敏协同作用，其机制可能与明显上调Bax、Caspase-3和FasL等促凋亡因子的表达和下调Bcl-2、COX-2、Survivin凋亡抑制因子的表达以及下调VEGF肿瘤血管形成相关因子的表达有关。
实施例九：参照实施例八的方法，建立人乳腺癌动物模型，研究Ad-ING4-IL-24对乳腺癌移植瘤的放疗增敏效果。
取指数生长期的MDA-MB-231乳腺癌细胞经胰酶消化分散后，PBS洗涤2次，2000r/min离5min，重悬于PBS中，调整细胞浓度为2×107/ml，取100μl(2×106个细胞/只)分别接种于25只裸鼠右侧腹股沟皮下，SPF环境下饲养。
2周后待移植瘤长至60-80mm3左右时，计为第0d。将其随机分成5组，即PBS组、AdV组、Ad-ING4-IL-24组、单纯放疗组、Ad-ING4-IL-24联合放疗组，每组5只，给药方式及剂量同第二部分。单纯放疗组于第0天、Ad-ING4-IL-24+放疗的联合放疗组于病毒治疗第二次后，以200mg/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛麻醉小鼠，仰卧固定于自制解剖板上，充分暴露局部肿块，射野充分包括肿瘤。定位后体表标记，精确摆位后开始放疗，肿瘤局部接受单次5MeV电子线6Gy照射，源瘤距100cm，剂量率为2Gy/min。小鼠腹股沟局部照射时选用3mm厚的铅板屏蔽身体其他部位。
(1)PBS细胞对照组：第0天瘤体内注射PBS 100μl，隔日1次，连续治疗5次；
(2)AdV组：第0天瘤体内注射AdV(108pfu/次)100μl，隔日1次，连续治疗5次；
(3)Ad-ING4-IL-24组：第0天瘤体内注射Ad-ING4-IL-24(108pfu/次)100μl，隔日1次，连续治疗5次；
(4)单纯放疗组：第0天肿瘤局部接受单次5MeV电子线6Gy照射；
(5)Ad-ING4-IL-24联合放疗组：第0天瘤体内注射Ad-ING4-IL-24(108pfu/次)100μl，隔日1次，连续治疗5次，注射Ad-ING4-IL-24二次后结合放疗，肿瘤局部接受单次5MeV电子线6Gy照射；
然后观察以下结果：
(1)肿瘤体积、瘤重、抑瘤率及标本免疫组织化学的检测
结果见图图12，其中，A为不同治疗组移植瘤体积的大小；
B为重组腺病毒治疗裸鼠人乳腺癌移植瘤瘤体体积-时间变化曲线：Ad-ING4-IL-24联合放疗组分别与PBS、AdV组比较，＊P＜0.05；分别与单纯放疗组、Ad-NG4-IL-24双基因重组腺病毒组比较，ΔP＜0.05；
C为重组腺病毒治疗裸鼠人乳腺癌移植瘤14d后瘤体重量：Ad-ING4-IL-24联合放疗组分别与PBS，AdV组比较，＊P＜0.05；分别与单纯放疗组、Ad-NG4-IL-24双基因重组腺病毒组比较，ΔP＜0.05，Q＝1.18。
瘤体重量研究结果(图12C)显示：与PBS对照组相比，治疗2w后Ad-ING4-IL-24组和单独放疗组的瘤体重量抑瘤率分别为67.7％和29.1％，而Ad-ING4-IL-24联合放疗组的抑瘤率高达88.1％，后者明显高于前两者(P＜0.05)。而PBS对照组和空载体对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。在饲养治疗期间未发现裸鼠死亡及其它躯体的毒性反应。结果显示，Ad-ING4-IL-24双基因重组腺病毒治疗和放疗结合，可产生放疗增敏协同效果(Q＝1.18)。
综上所述，Ad-ING4-IL-24与放射治疗结合可提高乳腺癌细胞的放射治疗敏感性，可产生放疗增敏协同疗效。
注，统计学处理：所有数据用
表示，用SPSS16.0统计学软件包进行单因素方差分析，P＜0.05视为统计学有差异，P＜0.01视为统计学有显著性差异。
Ad-ING4-IL-24+放疗联合组放疗增敏作用的判断用金正均法(计算Q值)，Q值＝E(A+B)/(EA+EB-EA·EB)，式中EA、EB分别为A、B单用之效应，分子E(A+B)代表实测合并效应，分母是期望合并效应。当Q值＝1±0.15时，两药间被认为有相加作用，Q值＞1.15时，两药间被认为有协同作用，当Q值＜0.85时，两药间有拮抗作用。
Claims (2)
1.人类ING4和IL-24基因共表达载体作为放疗增敏剂的应用，所述人类ING4和IL-24双基因共表达载体为双基因重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24。
2.腺病毒介导的重组病毒子Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24作为放疗增敏剂的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101215 |