CN103602625A - 含有重组腺病毒质粒的大肠杆菌及重组腺病毒的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组质粒、重组腺病毒质粒及重组腺病毒的应用。本发明提供了获得的含有双基因共表达同源重组质粒pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN的大肠杆菌(其保藏编号为CCTCC No.M2013212)和重组腺病毒Ad.(RGD)--ING4-PTEN能够用于制备治疗恶性肿瘤和/或白血病的药物或应用于制备化疗增敏剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及含有RGD修饰的双基因共表达重组腺病毒质粒的大肠杆菌及RGD修饰的双基因共表达重组腺病毒的应用。
背景技术
肿瘤已取代心脑血管疾病成为全球头号杀手，据美国癌症协会（ACS）最新发表的全球癌症统计学数据报告显示，2008年全球癌症新发病例约为1270万，癌症死亡例数为760万；其中发展中国家的癌症新发病例和死亡病例分别占到56%和64%。在中国，恶性肿瘤发病率上升尤其迅猛，每年癌症新发病例为220万人，因癌症死亡人数为160万人。预计2020年发病和死亡人数将比2002年上升60%，目前对于肿瘤的常规治疗手段主要为手术、放疗、化疗等。手术是肿瘤最常用治疗手段，也是多数早期肿瘤的首选，虽然手术疗效显著，无生物抗性和敏感性，但风险高，成功率低，创伤大，易产生一系列并发症，常限用于早期肿瘤。放疗虽作用直接、迅速，对敏感度较高的早期癌种效果较好，可治疗手术困难的癌种，但对分化程度高的癌组织不敏感，且副作用大，对正常人体细胞和免疫系统会造成伤害。化疗主要与手术切除和放疗相配合，但其容易产生抗药性，且对肿瘤细胞并无特异性，易引起各种副作用,过度化疗甚至可能缩短患者的存活期，残存的肿瘤干细胞将成为肿瘤复发、转移的根源。综上所述各种肿瘤常规治疗手段均无法达到理想的治疗效果，迫使寻找新的治疗的方式。
近年来，随着人们对肿瘤发生发展机制的深入以及肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程技术的发展，肿瘤的生物治疗发展迅速，成为一种新的肿瘤治疗模式。肿瘤生物治疗通常可概括为：任何生物学物质或生物制剂在肿瘤的治疗中的应用。已有的研究和临床应用已经展示出广阔的应用前景，有望成为常规的抗癌疗法。目前肿瘤的生物治疗研究得较多的技术主要包括细胞因子技术，过继免疫疗法，单克隆抗体及其偶联技术，肿瘤疫苗技术以及基因治疗。
肿瘤是一种多基因疾病。是多种基因在时空上异常的结果。随着对肿瘤分子机制认识的加深及生物技术的发展，基因治疗已成为肿瘤治疗的焦点之一。基因治疗技术可以概括为两大类：一类为替代或添加技术。即将治疗基因用各种方法送入肿瘤或正常细胞。可以是抑癌基因，也可以是各种细胞因子或免疫性基因。如将多种抑癌基因或凋亡诱导基因导入细胞可以抑制肿瘤生长及促进肿瘤细胞凋亡。另一类为基因封闭技术。如反义基因技术、核酶技术、RNA干扰技术等，利用以上技术封闭过度表达的癌基因及其产物、肿瘤耐药基因、细胞周期基因等可以封闭或降解基因或其产物以达到治疗目的。肿瘤基因治疗将成为继手术、化疗、放疗之后令人瞩目的临床肿瘤治疗的第四种模式，将给肿瘤患者带来新的希望。
基因治疗本身的特性以及载体系统转导目的细胞的效率是基因治疗的两个最关键的要素。腺病毒载体作为基因治疗常用的载体系统具有以下优点：1.可以感染增殖和非增殖细胞，2.能够高效制备和纯化高滴度重组病毒，3.它的基因组可以容纳大片段的外源基因，4.腺病毒载体与宿主细胞基因组不整合，属于条件复制缺陷性病毒，不产生具有感染性和致病性的子代病毒，安全性较高等。
腺病毒用于肿瘤基因治疗，感染目的细胞的第一步是其与细胞表面的柯萨斯受体(CAR)相结合，很多肿瘤细胞及白血病淋巴细胞表面CAR的缺失导致腺病毒对其感染效率低下。如何提高感染效率是需要克服的困难之一。
多基因联合治疗在肿瘤基因治疗领域具有重要的价值，通常采用两种办法来达到外源性基因的导入：一是使用多个独立载体分别向靶细胞转导目的基因，二是在一个载体上表达多个目的基因。目前基因治疗的瓶颈是转染和表达效率低下。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种含有RGD修饰的pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN双基因共表达同源重组腺病毒质粒的大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC No.M2013212。本发明采用双启动子（插入polyA+promoter）构建ING4或/和PTEN单、双基 因共表达腺病毒载体，并使用RGD-4C修饰的骨架质粒进行同源重组，以提升腺病毒载体对靶细胞的转染效率和目的基因的表达效率。获得的重组腺病毒Ad.(RGD)-ING4-PTEN能够用于制备治疗恶性肿瘤和/或白血病的药物或应用于制备放疗增敏剂。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
由实验室发明提供了一种双基因共表达转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN。
精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)三肽序列（RGD）存在于多种细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合，能有效地与细胞表面的整合素蛋白相粘附。Dmitriev等成功的将RGD-4C序列插入到腺病毒鞭毛区域的HI茎环上，使得腺病毒可以使用αvβ3整合素作为其粘附受体。这样的改造增加了腺病毒对柯萨斯受体(CAR)表达缺陷细胞的感染能力。
PTEN基因是在1997年由3个不同的研究小组分别用不同的方法获得,分别命名为PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten)、MMAC1(mutated in multiple advanced cancers-1)和TEP-1(TGF-β-regulated and epithelial cell-enriched phosphatase)，它是一种具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,不仅有脂质磷酸酶活性，而且有蛋白磷酸酶活性，定位于人类染色体10q23.3。PTEN蛋白主要呈网格状分布位于细胞胞浆中，近年发现其在核膜、核内都有表达。相比其他磷酸酶,PTEN活性中心有三个碱性氨基酸，如果产生突变失去了脂质磷酸酶活性，失去大多数肿瘤抑制功能，但不影响蛋白质磷酸酶活性。因此肿瘤抑制基因PTEN的抑癌效应主要取决于其脂质磷酸酶活性，但是蛋白质磷酸酶活性仍然可以影响细胞增殖、附着力和细胞迁移。
生长抑制因子蛋白家族（inhibitor of growth family，ING）包括ING1，ING2，ING3，ING4和ING5，是一组重要的肿瘤抑制因子。ING4于2002年从人的脑垂体中被分离出，2003年由Shiseki等鉴定，2004年正式被确定为一种重要的抑癌基因。该基因跨度为13kb，定位于人类染色体12p13.31。研究表明，ING4基因可以通过控制p53乙酰化状态来调节p53的功能，使p53的转录活性增强，肿瘤的发生即被抑制。在体内ING4可抑制由原癌基 因MYC或MYCN过度表达引起的细胞间接触抑制的丧失从而恢复细胞间的接触抑制。过表达ING4基因能够抑制肿瘤细胞的侵袭、转移，通过抑制NF-кB，/IL-6通路影响肿瘤新生血管的形成。低氧时HIF的上调是肿瘤生长过程中重要的促进因素，所以抑制HIF的活性可以抑制肿瘤的生长，提高肿瘤治疗的疗效。研究证实ING4能与缺氧诱导因子（HIF）脯氨酰羟化酶的铁依赖性氧化酶直接发生作用，通过ING4的募集反应来调节HIF的活性。ING4诱导的p2l的上调可以增强细胞周期调节蛋白Bl（cyclin B1）和p2l的结合，启动细胞G2/M周期阻滞，最终抑制细胞的增殖，由此可见，ING4可通过多途径发挥特异性抗肿瘤效应，靶向诱导肿瘤细胞凋亡，是一种潜在的新型抑癌基因。
本发明采用双启动子（插入polyA+promoter）构建ING4或/和PTEN单、双基因共表达腺病毒载体，并使用RGD-4C修饰的骨架质粒进行同源重组，提升腺病毒载体对靶细胞的转染效率和目的基因的表达效率。
本发明还提供了含有RGD修饰的同源重组腺病毒质粒pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN(简称pAd.RGD-ING4-PTEN)的大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC No.M2013212，该同源重组腺病毒质粒pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN是由pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN双基因共表达转移质粒与RGD-4C修饰的骨架质粒pAd.Easy-1(RGD)同源重组获得。
本发明还提供了RGD修饰的重组腺病毒Ad(RGD)-ING4-PTEN的制备方法，由同源重组腺病毒质粒pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN在包装细胞中包装产生。
在本发明的一些实施例中，包装细胞为QBI-293A人胚肾细胞。
本发明还提供了上述重组腺病毒Ad.(RGD)-ING4-PTEN的制备方法获得的重组腺病毒Ad.(RGD)-ING4-PTEN。
本发明还提供了重组腺病毒Ad.(RGD)-ING4-PTEN在制备治疗恶性肿瘤和/或白血病的药物中的应用。
在本发明的一些实施例中，恶性肿瘤选自神经胶质瘤、神经胶质瘤移植 瘤、鼻咽癌或鼻咽癌移植瘤。
作为优选，神经胶质瘤为U87胶质瘤细胞。
作为优选，神经胶质瘤移植瘤为U87胶质瘤细胞移植瘤
作为优选，鼻咽癌为人CNE鼻咽癌细胞
作为优选，鼻咽癌移植瘤为人CNE鼻咽癌细胞移植瘤
作为优选，白血病为MEG01白血病。
本发明还提供了重组腺病毒Ad.(RGD)-ING4-PTEN在制备放疗增敏剂中的应用。
本发明还提供了一种含有RGD修饰的同源重组腺病毒质粒pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN的大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC No.M2013212。本发明采用双启动子（插入polyA+promoter）构建ING4或/和PTEN单、双基因共表达腺病毒载体，并使用RGD-4C修饰的骨架质粒进行同源重组，提升腺病毒载体对靶细胞的转染效率和目的基因的表达效率。
生物保藏说明
大肠杆菌
DH5α/pAdEasy-1(RGD)-pAdtrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN，分类命名：大肠杆菌
DH5α/pAdEasy-1(RGD)-pAdtrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN，拉丁名Escherichia coli DH5α/pAdEasy-1
(RGD)-pAdtrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN，于2013年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏中心地址为武汉市武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No.M2013212。
附图说明
图1示重组转移载体PCR鉴定；其中，A示pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN重组转移载体质粒PCR鉴定（M示DL2000Marker;1示PTEN目的条带）；B示pAdTrack-CMV-polyA-promoter-PTEN重组转移载体质粒PCR鉴定（M:DL2000Marker;2:PTEN目的条带）；
图2示PTEN测序鉴定结果；
图3示同源重组克隆质粒（BJ5183）琼脂糖电泳分子量大小鉴定；其中，
A示pAd.RGD-GFP同源重组：泳道1为转移质粒，泳道2、泳道3、泳道4为同源重组阳性克隆；
B示pAd.RGD-ING4同源重组：泳道4为转移质粒，泳道1、泳道2、泳道3为同源重组阳性克隆；
C示pAd.RGD-PTEN同源重组：泳道4为转移质粒，泳道1、泳道2、泳道3为同源重组阳性克隆；
D示pAd.RGD-ING4-PTEN同源重组：泳道4为转移质粒，泳道1、泳道2、泳道3为同源重组阳性克隆，泳道5为假阳性；
图4示同源重组质粒的pacI酶切鉴定；
其中A中1示pAdTrack-CMV-polyA-promoter，2示pAd.RGD-pAdTrack-CMV-polyA-promote；
图B中1示pAdTrack-CMV-polyA-promoter-PTEN，2示pAd.RGD-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter；
图C中1示pAdTrack-CMV-polyA-promoter-PTEN，2:pAd.RGD-pAdTrack-CMV-polyA-promoter-PTEN；
图D中1示pAdTrack-CMV-polyA-promoter-PTEN，2示pAd.RGD-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN；
图5示重组腺病毒感染QBI-293A光镜和荧光照片；
图6示重组腺病毒介导的ING4和/或PTEN基因在QBI-293A细胞中的转录鉴定；其中，A示QBI-293；B示QBI-293A+Ad.RGD；C示QBI-293A+Ad.RGD-ING4；D示QBI-293A+Ad.RGD-PTEN;E示QBI-293A+Ad.RGD-ING4-PTEN；
图7示荧光显微镜观察腺病毒感染不同细胞系；其中A示Ad-GFP；B示Ad-ING4；C示Ad-PTEN；D示Ad-ING4-PTEN；E示Ad.RGD-GFP；F示Ad.RGD-ING4；G示Ad.RGD-PTEN；H示Ad-RGD-ING4-PTEN；
图8示流式细胞仪检测各感染细胞组GFP阳性细胞率；其中A示Ad-GFP；B示Ad-ING4；C示Ad-PTEN；D示Ad-ING4-PTEN；E示Ad.RGD-GFP；F示Ad.RGD-ING4；G示Ad.RGD-PTEN；H示Ad-RGD-ING4-PTEN；其中，图8（a）示U87，图8（b）示U251，图8（c） 示A549，图8（d）示MCF-7，图8（e）示K562，图8（f）示THP-1，图8（g）示MEG-01；
图9示流式细胞仪检测GFP阳性细胞率；其中，
示AD-GFP，
示AD-ING4，
示AD-PTEN，
示AD-ING4-PTEN，
示AD.RGD-GFP，
示AD.RGD-ING4，示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；其中，图9（a）示U87、U251、A549、MCF-7，图9（b）示K562、THP-1、MEG-01；
图10示ING4和PTEN基因表达的Real-Time PCR鉴定；其中，
示PBS， 
示AD，
示AD.RGD，
示AD.RGD-ING4，
示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；其中，图10（a）ING4基因表达的Real-Time PCR鉴定，图10（b）示PTEN基因表达的Real-Time PCR鉴定；
图11示ING4和PTEN蛋白表达的Western blot鉴定；其中，泳道A示PBS，泳道B示AD.RGD-PTEN，泳道C示AD.RGD-ING4-PTEN，泳道D示AD.RGD-ING4，泳道E示AD.RGD-GFP，泳道F示AD.RGD；
图12示各组腺病毒对U87细胞增殖的影响；其中，
示PBS，
示AD-GFP，
示AD.RGD-GFP，
示AD.RGD-ING4，
示AD.RGD-PTEN， 
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图13示各组腺病毒对U87细胞的生长抑制率；其中ING4、PTEN单双基因重组腺病毒组分别与Ad-GFP、Ad.RGD-GFP组比较，*P<0.05;Ad.RGD-ING4-PTEN组分别与Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基重组腺病毒组比较，△P<0.05,Q=1.21；其中，
示AD，
示AD.RGD，
示AD.RGD-ING4，
示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图14示各重组腺病毒诱导U87细胞凋亡的流式细胞仪检测；其中，A示PBS；B示Ad-GFP；C示Ad.RGD-GFP；D示Ad.-ING4；E示Ad.RGD-ING4；F示Ad-PTEN；G示Ad.RGD-PTEN；H示Ad-ING4-PTEN；I示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图15示流式细胞术检测U87细胞凋亡率的变化，其中，*Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒组分别与PBS、Ad-GFP、Ad.RGD-GFP组比较，*P<0.05;Ad.RGD-ING4-PTEN组分别与Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基重组腺病毒组比较，P<0.05,Q=1.23；其中，
示PBS，
示Ad-GFP，示Ad.RGD-GFP，示Ad-ING4，
示Ad.RGD-ING4，
示Ad-PTEN，
示Ad.RGD-PTEN，
示Ad-ING4-PTEN，
示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图16示细胞创口划痕；
图17示细胞创口划痕宽度均值统计图；其中，
示PBS，
示Ad，
示Ad.RGD，
示Ad.RGD-ING4，
示Ad.RGD-PTEN，
示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图18示Transwell侵袭小室检测各组穿膜细胞数统计；其中，
示PBS， 
示AD，示AD.RGD，示AD.RGD-ING4，
示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图19示real time PCR检测各组U87细胞分泌基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9；其中，图19（a）示real time PCR检测各组U87细胞分泌基质金属蛋白酶MMP-2，图19（b）示real time PCR检测各组U87细胞分泌基质金属蛋白酶MMP-9；其中，示PBS，
示AD，示AD.RGD，
示AD.RGD-ING4，
示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图20示荧光定量PCR检测U87细胞P21、P53、Bax、Bcl-2、Cyclin-B、Caspase-3和HIF-1α基因转录水平；其中，
示PBS，
示AD，
示AD.RGD， 
示AD.RGD-ING4，
示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图21示移植瘤瘤体图；其中，第一行示PBS，第二行示AD-GFP，第三行示AD.RGD-GFP，第四行示AD.RGD-ING4，第五行示AD.RGD-PTEN，第六行示AD.RGD-ING4-PTEN；
图22示重组腺病毒基因治疗裸鼠人神经胶质细胞移植瘤瘤体的体积-时间变化曲线；其中，
示PBS，
示AD，
示AD.RGD，
示AD.RGD-ING4， 
示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图23示重组腺病毒基因治疗裸鼠人神经胶质细胞移植瘤18天后的瘤体重量；分别与PBS，Ad-GFP，Ad.RGD-GFP组比较，*P＜0.01；分别与Ad.RGD-ING4，Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒组比较，△P＜0.01；其中， 示PBS，
示Ad，
示Ad.RGD，
示Ad.RGD-ING4，
示Ad.RGD-PTEN，
示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图24示重组腺病毒基因治疗裸鼠人神经胶质细胞移植瘤的抑瘤率；分别与Ad.RGD-ING4，Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒组比较，*P＜0.01，Q=1.28；
图25示裸鼠人黑色素瘤移植瘤组织免疫组化检测；
图26示各组冰冻切片免疫组化检测目的基因表达；分别与PBS，Ad组比较，*P＜0.05；分别与Ad-ING4，Ad-IL-24单基因重组腺病毒组比较，△P＜0.05；其中，图26（a）示ING4、PTEN、P53、P21、MMP-2、MMP-9，图26（b）示VEGF、CD34、BCL-2、BAX、HIF-1α；其中，
示PBS，
示AD.GFP，
示AD.RGD-GFP，
示AD.RGD-ING4，
示AD.RGD-PTEN， 
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图27示荧光显微镜观察MEG-01细胞GFP荧光蛋白的表达；
图28示流式细胞仪检测各感染MEG-01细胞组GFP阳性细胞率；其中，A示PBS；B示MEG-01infected with50MOI Ad–GFP；C示MEG-01infected with50MOI Ad.RGD-GFP；D示MEG-01infected with50MOIAd.RGD-ING4；E示MEG-01infected with50MOI Ad.RGD-PTEN；F示MEG-01infected with50MOI Ad.RGD-ING4-PTEN；
图29示流式细胞仪检测各感染组的GFP阳性细胞率；
图30示各组腺病毒感染MEG01细胞的生长曲线；其中，示PBS，示Ad.RGD，示Ad.RGD-ING4，
示Ad.RGD-PTEN，
示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图31示各组腺病毒对MEG01细胞的生长抑制率；其中，
示Ad.RGD， 
示Ad.RGD-ING4，
示Ad.RGD-PTEN，示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图32示流式细胞仪检测MEG01凋亡情况；其中图32（a）示PBS，图32（b）示Ad.RGD，图32（c）示Ad.RGD-ING4，图32（d）示Ad.RGD-PTEN，图32（e）示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图33示重组腺病毒诱导MEG01的凋亡率；其中，示PBS，示AD.RGD，
示AD.RGD-ING4，示AD.RGD-PTEN，
示AD.RGD-ING4-PTEN；
图34示各重组腺病毒感染293A细胞(×100)；其中1示普通光镜；2示 荧光镜；
图35示Ad.RGD-GFP不同剂量感染CNE细胞(×100)；其中，1示普通光镜；2示荧光镜；
图36示50MOI剂量感染CNE细胞时用流式细胞仪检测感染率；
图37示腺病毒介导的ING4或/和PTEN单、双基因在CNE细胞中的转录鉴定(RT-PCR)；其中，泳道1示PBS；泳道2示Ad.RGD-GFP；泳道3示Ad.RGD-ING4；泳道4示Ad.RGD-PTEN；泳道5示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图38示ING4和PTEN基因在CNE中有效表达（Western blot）；其中泳道1示PBS；泳道2示Ad.RGD-GFP；泳道3示Ad.RGD-ING4；泳道4示Ad.RGD-PTEN；泳道5示Ad.RGD-ING4-PTEN；
图39示各组照射对CNE细胞凋亡的影响；
图40示各组对CNE细胞的生长抑制作用（MTT）；Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组分别与PBS，
Ad.RGD-GFP组比较，*P＜0.01；其中Ad.RGD-ING4-PTEN组较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组有显著性差异（P＜0.05），Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组分别与放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组比较，ΔP＜0.05；
其中，图40（a）中示PBS组，
示Ad.RGD组，
示Ad.RGD-ING4组；
图40（b）中示PBS组，示Ad.RGD组，示Ad.RGD-PTEN组；
图40（c）中
示PBS组，
示Ad.RGD组，示Ad.RGD-ING4-PTEN组；
图40（d）中
示PBS组，
示Ad.RGD组，
示放疗组；
图40（e）中
示PBS组，
示Ad.RGD组，
示Ad.RGD-PTEN+放疗组；
图40（f）中示PBS组，
示Ad.RGD组，示Ad.RGD-ING4+放疗组；
图40（g）中
示PBS组，
示Ad.RGD组，
示Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组；
图41示各组CNE细胞生长周期的检测图（PI）；其中图41（a）示PBS组,Ad.RGD-GFP组,Ad.RGD-ING4组；图41（b）示Ad.RGD-PTEN组,Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组；图41（c）示Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组
图42示各组CNE细胞生长周期的检测变化直方图；其中，
示G1期， 
示S期，
示G2期；
图43示各重组腺病毒对CNE细胞凋亡率测定（Annexin-V-PE/7-AAD）；其中图43（a）示PBS组,Ad.RGD-GFP组,Ad.RGD-ING4组；图43（b）示Ad.RGD-PTEN组,Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组；图43（c）示Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组；
图44示流式细胞术检测各组CNE细胞凋亡率的变化；
图45示CNE细胞中相关因子的表达（RT-PCR）；其中，泳道1示PBS；泳道2示Ad.RGD-GFP；泳道3示Ad.RGD-ING4；泳道4示Ad.RGD-PTEN；泳道5:Ad.RGD-ING4-PTEN；泳道6：放疗；泳道7：Ad.RGD-ING4+放疗；泳道8：Ad.RGD-PTEN+放疗；泳道9：Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗；
图46示CNE鼻咽癌细胞中相关因子的表达（RT-PCR）灰度比值直方图；Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组分别与PBS，Ad.RGD-GFP组比较，*P＜0.01；Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组分别与Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组比较，ΔP＜0.05；并且Ad.RGD-ING4-PTEN组较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组有显著性差异,ΔP＜0.05；其中，示PBS组，
示Ad.RGD组，示Ad.RGD-ING4组，示Ad.RGD-PTEN组，
示Ad.RGD-ING4-PTEN组，
示放疗组，示Ad.RGD-ING4+放疗组，
示Ad.RGD-PTEN+放疗组，示Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组；
图47示CNE细胞中Caspase3蛋白的表达（Western-Bolt）；其中，泳道1示PBS；泳道2示Ad.RGD-GFP；泳道3示Ad.RGD-ING4；泳道4示Ad.RGD-PTEN；泳道5示Ad.RGD-ING4-PTEN；泳道6：放疗；泳道7示Ad.RGD-ING4+放疗；泳道8示Ad.RGD-PTEN+放疗；泳道9示Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗；
图48示显微镜下穿透基底膜的CNE细胞(×200)；
图49示CNE细胞侵袭能力(细胞个数/高倍镜)直方图；Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组分别与PBS，Ad.RGD-GFP组比较，*P＜0.01；Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组分别与Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组比较，ΔP＜0.05；
图50示各组瘤体体积-时间变化曲线；分别与PBS组、Ad.RGD-GFP组比较，*P＜0.01；分别与Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组比较，△P＜0.05；
其中，图50（a）中
示PBS组，
示Ad.RGD-GFP组，
示Ad.RGD-ING4组；
图50（b）中
示PBS组，
示Ad.RGD-GFP组，
示Ad.RGD-PTEN组；
图50（c）中
示PBS组，示Ad.RGD-GFP组，
示Ad.RGD-ING4-PTEN组；
图50（d）中示PBS组，
示Ad.RGD-GFP组，
示放疗组；
图50（e）中
示PBS组，
示Ad.RGD-GFP组，
示Ad.RGD-ING4+放疗组；
图50（f）中示PBS组，示Ad.RGD-GFP组，
示Ad.RGD-PTEN+放疗组；
图50（g）中示PBS组，
示Ad.RGD-GFP组，
示Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组；
图51示各组瘤体实物图；
图52示各组瘤体重量直方图；分别与PBS组、Ad.RGD-GFP组比较，*P＜0.01；分别与Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组比较，△P＜0.05；
图53示各组抑瘤率直方图；Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组分别与Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组比较，*P＜0.05；
图54示各组瘤体组织HE染色（×200）；
图55示免疫组化检测裸鼠人鼻咽癌移植瘤组织中Survivin、P21、Bax的表达（×200）；
图56示免疫组化裸鼠人鼻咽癌移植瘤中Caspase-3、COX-2、Bcl-2的表达（×200）；
图57示免疫组化检测裸鼠人鼻咽癌移植瘤中CD34、VEGF的表达（×200）；
图58示各组鼻咽癌移植瘤的相关因子蛋白表达的比较
分别与PBS组、Ad.RGD-GFP组比较，*P＜0.01；分别与Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组比较，△P＜0.01；
其中图58（a）示Survivin、P21、Bax、Caspase-3表达的比较；图58（b）示COX-2、Bcl-2、CD34、VEGF表达的比较；其中，
示PBS组，
示Ad.RGD-GFP组，示Ad.RGD-ING4组，
示Ad.RGD-ING4组，
示Ad.RGD-ING4-PTEN组，
示放疗组，
示Ad.RGD-ING4+放疗组，
示Ad.RGD-PTEN+放疗组，
示Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组；
图59示腺病毒表达载体构建流程图；
图60示ING4和PTEN双基因共表达模式示意图；
图61示PTEN基单因表达模式示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种RGD修饰的基因重组双基因共表达转移质粒、同源 重组腺病毒质粒及重组腺病毒的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的含有RGD修饰的同源重组腺病毒质粒的大肠杆菌及重组腺病毒的应用中所用试剂或原料均可由市场购得。其中，人鼻咽癌细胞CNE购于南京凯基生物有限公司，细胞培养血清为10%小牛血清的RPMI-1640购自GIBGO公司。MTT购自Sigma公司；细胞凋亡PI染色试剂盒，AnnexinV-PE/7-AAD检测凋亡试剂盒购于南京凯基生物有限公司；细胞裂解液Trizol试剂购自Invitrogen公司；MMLV逆转录酶、Taq酶购自Fermentas公司；各上下游引物由上海生工生物技术有限公司合成，见表1；小鼠抗人ING4抗体购自santacruz公司,抗人pten抗体购自celling signaling公司，小鼠抗人Caspase-3抗体购自abcam公司；HRP标记的兔抗小鼠IsG二抗购自abcam公司；PVDF膜购买于苏州阿尔法生物技术有限公司、Western blot化学发光试剂盒和暗盒购自上海普利莱基因技术有限公司；Matrigel基质胶购自BD公司；Transwell小室购自Corning公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1转移载体的构建
材料：
NotI、XbaI、XhoI、PmeI、PacI限制性内切酶、T4DNA连接酶、DL2000marker、DreamTaqTM Green PCR Master Mix、RevertAidTM sFirst Strand cDNASynthesis Kit购自Fermentas公司；日常型小量质粒抽提试剂盒、PCR产物清洁试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；pAdTrack-CMV-PTEN、pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter、pAdTrack-CMV-PolyA-promoter为本实验室之前构建[张海峰，杨吉成等腺病毒介导的PTEN对A549肺癌细胞体内外生长的影响。中国肿瘤生物治疗 杂志，2007，14（2），173-178;盛伟华杨吉成等Ad-ING4-PolyA-Promoter-IL-24双基因共表达载体构建及表达,中华微生物学和免疫学杂志，30（8）：695-703]；pAd-Easy-1骨架质粒、QBI-293A包装细胞、BJ5183细菌为本实验室保存；pAd(RGD)骨架质粒由加拿大Sidney Kimmel肿瘤中心ALBERTDEISSEROTH教授惠赠；引物：ING4、PTEN、GAPDH基因引物均由上海Sangon合成；RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自加拿大Wisent公司。
pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN转移载体的构建：
比对PTEN的保守序列，设计引物P1、P2，两端分别引入NotI、XhoI酶切位点；以含有PTEN片段本实验室之前构建的pAdTrack-CMV-PTEN质粒为模板，PCR扩增获得PTEN目的片段，PCR产物经琼脂糖电泳鉴定。PCR条件为：94℃预变性2min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后72℃延伸10min。
将由DNA清洁试剂盒纯化的PTEN基因PCR产物和小量质粒抽提试剂盒提取本实验室之前构建的转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter、pAdTrack-CMV-PolyA-promoterr分别用NotI、XhoI37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，用T4DNA连接酶连接,将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在含Kana(50μg/ml)抗性平板中挑选阳性单克隆，经PCR、双酶切鉴定和DNA序列测序鉴定后，阳性克隆菌-20℃保种备用。
鉴定构建的重组转移质粒：
分别以重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN、 pAdTrack-CMV-poly-A-promoter-PTEN质粒为模板，P1、P2为引物PCR能扩增出PTEN目的基因片段，其大小与预期扩增的PTEN理论值大小（1209bp）相一致（图1）。
pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN重组转移载体质粒的PTEN基因测序：
PTEN基因测序结果（见图2），结果表明PTEN目的基因已经成功亚克隆于pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN、pAdTrack-CMV-polyA-promoter-PTEN质粒中。并将其进行-20℃保种备用。
实施例2同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定
ING4或/和PTEN单基因、双基因共表达同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定：
将本实验室之前构建的pAdTrack-CMV-PolyA-promoter、pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter及上述构建的pAdTrack-CMV-PolyA-promoter-PTEN、pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter-PTEN重组转移质粒用Pme I在37℃单酶切2h线性化后，分别与RGD-4C修饰的pAdEasy-1(RGD)腺病毒骨架质粒进行同源重组,采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，Kana(50μg/ml)抗性筛选同源重组质粒，挑取阳性克隆后抽提质粒，进行琼脂糖凝胶电泳，根据分子量大小分别初步筛选出pAdEasy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-polyA-promoter(简称pAd.RGD-GFP)、pAdEasy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter(简称pAd.RGD-ING4)、pAdEasy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-polyA-promoter-PTEN(简称pAd.RGD-PTEN)、pAdEasy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN(简称pAd.RGD-ING4-PTEN)同源重组质粒，其pAdEasy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN(简称pAd.RGD-ING4-PTEN)同源重组质粒转化DH5α后大量扩增，提质粒行PacI单酶切鉴定，琼脂糖电泳鉴定结果如图3，同源重组质粒分子量明显大于未同源重组的转移质粒。
选择经初步确定的同源重组阳性克隆，转化DH5α后（保藏编号为 CCTCC NO：M2013212）再抽提质粒进行PacI酶切鉴定（图4），可获得约30kb大小的腺病毒基因片段和独特的4.5kb大小的卡那霉素抗性编码基因片段，结果表明各转移质粒分别与RGD-4C修饰的pAdEasy-1(RGD)腺病毒骨架质粒同源重组成功。为重组腺病毒的包装创造了条件。
实施例3同源重组腺病毒的包装和扩增
将构建的pAd.RGD-GFP、pAd.RGD-ING4、pAd.RGD-PTEN、pAd.RGD-ING4-PTEN同源重组腺病毒质粒经PacI酶切线性化后，进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收大片段，按LipofectaminTM2000脂质体操作说明分别转染QBI-293A人胚肾细胞中进行包装。转染后在荧光显微镜下观察GFP荧光,12小时后荧光显微镜下可见GFP的表达，且荧光强度随转染后时间延长逐渐增强。转染10d后分别收集Ad.RGD、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-ING4-PTEN第一代重组腺病毒粗提液。二次感染QBI-293A包装细胞后，在倒置荧光显微镜下可观察到荧光，并出现CPE，结果表明各组重组腺病毒在QBI-293A细胞中包装成功。反复冻融获得第二代重组腺病毒粗提液再感染QBI-293A包装细胞，经三轮扩增可获得高滴度的重组腺病毒子，于-80℃保存备用。Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN，各组重组腺病毒感染QBI-293A细胞光镜CPE和荧光照片如图5。
实施例4重组腺病毒鉴定
将Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒分别感染QBI-293A细胞，收集上述病毒感染细胞和未感染病毒的QBI-293A空白对照，抽提各组QBI-293A细胞总RNA，并逆转成cDNA，分别以P1、P2；P3、P4；P5、P6为引物进行RT-PCR，鉴定PTEN、ING4及内参GAPDH基因在各组细胞中的转录。
。由图6可见，Ad.RGD-ING4-PTEN感染组可产生预期大小的750bp的ING4和1209bp的PTEN PCR产物；Ad.RGD-ING4感染组可产生预期大小 的750bp的ING4PCR产物，而相应位置未产生1209bp的PTEN PCR产物；Ad.RGD-PTEN感染组可产生预期大小的1209bp的PTEN PCR产物，而相应位置未产生750bp ING4PCR产物；Ad.RGD-GFP感染组和未感染病毒的QBI-293A细胞对照组在相应位置均未产生750bp的ING4和1209bp的PTENPCR产物。RT-PCR鉴定结果表明成功构建了由腺病毒介导的ING4或/和PTEN双基因共表达重组腺病毒表达载体,各组转录成功。
实施例5重组腺病毒效价测定及其对不同细胞感染效率的检测
Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒由本发明成功构建；Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒载体为本实验室之前构建；人白血病细胞系K562、Thp-1、MEG-01，人脑胶质瘤细胞系U251、U87，人结肠癌细胞系HT29、人肺腺癌细胞系A549、人乳腺癌上皮细胞系MCF-7和人胚肺正常二倍体细胞系WI-38购自中科院上海细胞库；腺病毒扩增细胞QBI-293A由复旦大学生命科学学院微生物学教研室钟江教授惠赠；RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青公司；胎牛血清购自加拿大WISENT公司；6孔细胞培养板、96孔细胞培养板购自美国CORNING公司。
重组腺病毒的大量扩增：
将本发明成功构建获得的Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN及本实验室之前构建的Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒分别多轮感染QBI-293A细胞进行大量扩增，待出现细胞病变效应明显，荧光显著增强时，收集细胞并反复冻融3次，2000r／min离心5min，取病毒上清，于-80℃保存。
重组腺病毒的效价检测：
将对数生长期的QBI-293A细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105个/mL，在96孔板上按每孔100μL接种细胞，培养24h后，将上述各组重组腺病毒作10-6、10-7、10-8、10-9稀释后，每个稀释度按每孔100μL接种3 孔，37℃，5%CO2细胞培养箱里培养18h后，荧光显微镜下，进行荧光计数，按病毒效价(pfu/mL)=（每孔荧光平均数×10）/稀释度公式计算腺病毒效价。Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒效价分别约为：5×109、3×109、5×109、2×109、2×1010、1×1010、2×1010、6×109（pfu/mL）。RGD-4C修饰的腺病毒载体效价分别比未经修饰的腺病毒效价高3-4倍，其RGD明显提高了腺病毒的效价。
RGD修饰的腺病毒对细胞感染效率的比较：
荧光显微镜观察细胞GFP荧光蛋白的表达：
将处于对数生长期分散的K562、THP-1、MEG-01白血病细胞和经0.5%胰酶消化分散的U251、U87、HT29、A549、MCF-7和WI-38细胞系，分别用含10%FCS的1640完全培养基悬浮，计数后调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔2mL接种于6孔培养板，37℃，5%CO2培养过夜。次日将Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒以1、50、100MOI不同剂量感染U87、U251、WI-38、MCF-7、A549、HT29、K562、MEG-01和THP-1细胞。24h后在荧光显微镜下观察细胞中GFP绿色荧光表达情况。荧光显微镜下观察结果,48h后，在荧光显微镜下观察不同剂量病毒对细胞的感染情况。结果显示（见图7）在50MOI时，非RGD修饰的各组腺病毒均能成功感染U87、U251、WI-38、MCF-7、A549、HT29细胞，但THP-1、MEG-01和K562细胞中GFP荧光蛋白表达阳性细胞极少；而经RGD修饰的腺病毒感染的各组细胞均能较高的表达GFP荧光蛋白。结果表明在50MOI时，RGD修饰的腺病毒载体比未经修饰的腺病毒载体有更高的感染效率，尤其是对THP-1、K562、MEG-01淋巴细胞感染效率的差异最为明显。
流式细胞仪检测GFP荧光阳性细胞比例：
收集以50MOI的Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病 毒分别感染的U87、U251、WI-38、MCF-7、K562、A549、HT29、MEG-01和THP-1细胞，制作单细胞悬液，以未感染腺病毒的细胞作为空白对照消除背景影响，用流式细胞仪检测各组细胞中GFP荧光阳性细胞比例。
结果显示，带有RGD的腺病毒感染的各组细胞GFP绿色荧光表达阳性细胞比例较未经RGD修饰的腺病毒载体更高(见图8，9)，特别是对K562、MEG-01及THP-1白血病淋巴细胞的感染效率提升最为明显。使经RGD修饰的腺病毒载体被用于白血病细胞的肿瘤基因治疗成为可能。
上述实验通过将改造后带有RGD修饰的腺病毒载体与未经RGD修饰的腺病毒载体进行对比，以同样的感染复数条件感染人白血病细胞系K562、Thp-1、MEG-01，人脑胶质瘤细胞系U251、U87，人结肠癌细胞系HT29、人肺腺癌细胞系A549、人乳腺癌上皮细胞系MCF-7和人胚肺正常二倍体细胞系WI-38后，检测显示，在CAR未缺失的肿瘤细胞U251、U87、HT29、A549、MCF-7和人胚肺正常细胞系WI-38中，RGD修饰的腺病毒明显具有更高的感染效率。这也就意味着将RGD修饰的腺病毒用于肿瘤基因治疗，能以更低的感染复数更有效的表达目的基因，降低腺病毒的毒性，提高表达效率。
而对于CAR缺失的淋巴细胞系MEG-01、K562、THP-1，由于CAR的缺失，未经RGD改造的腺病毒载体几乎无法感染，而经RGD修饰的腺病毒载体感染效率大大提升，这形成了鲜明的对比。GFP绿色荧光的检测证实经RGD修饰的腺病毒携带的外源性基因能够在淋巴细胞中高效表达。这也就意味着将经RGD修饰的腺病毒载体用于白血病、淋巴瘤的基因治疗研究成为可能。为今后进一步进行白血病、淋巴瘤的基因治疗的实验研究打下基础。
实施例6Ad.RGD-ING4-PTEN对U87神经胶质瘤细胞生长抑制效应的体外实验研究
Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒由实验室之前构建保存，U87神经胶质瘤细胞(简称U87细胞)购自中科院上海细胞库,Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒为本发明成功构建，MTT试剂购自美国Sigma公司，24孔Transwell 小室、6孔细胞培养板、96孔细胞培养板购自美国Corning公司，荧光定量试剂盒SsoFast EvaGreen Supermix购自美国Bio-rad公司，细胞凋亡Annexin-V-PE/7-AAD双染试剂盒购自南京凯基公司，ING4抗体购自美国Santa Cruz公司，PTEN抗体购自美国Cell Signaling公司，β-actin抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，Page Ruler Prestained Protein Ladder购自美国Fermentas公司，Dylight800-Labeled Antibody荧光二抗购自美国KPL公司。
表1文中PCR扩增所用引物及其序列
Real-Time PCR鉴定ING4和/或PTEN基因在U87细胞中的转录：
以50MOI感染剂量的Ad-GFP、Ad.RGD-GFP、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN感染U87细胞，设空白对照组加PBS做对照。培养48h后收集细胞用Trizol法分别抽提总RNA，并使用RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit逆转录成cDNA，以P1、P2、P3、P4、P5、P6为引物进行RealTime PCR检测腺病毒介导的外源性ING4、PTEN在U87细胞中的转录。按照公式：ΔCt=Cq(目的基因)-Cq(GAPDH)，目的基因初始含量=2-ΔΔCt计算ING4和/或PTEN在各组细胞中的转录含量。
PCR反应条件为：
ING4/GAPDH：94℃预变性2min，94℃变性50s，61℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后72℃后延伸10min。
PTEN/GAPDH：94℃预变性2min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后72℃后延伸10min。
PCR反应体系如下：
结果显示，如图（10），ING4基因在Ad.RGD-ING4、Ad-ING4-PTEN重组腺病毒组均能高效转录，而在其他组未能检测出。PTEN基因在Ad.RGD-PTEN、Ad-ING4-PTEN重组腺病毒组均能高效转录，而在其他组转录水平较低。Real-Time PCR鉴定结果表明腺病毒转染的目的基因ING4和/或PTEN能在U87人神经胶质瘤细胞中高效转录。
Western blot法检测外源性ING4和/或PTEN基因的表达：
将腺病毒以50MOI的感染剂量感染U87细胞（细胞数约为4×106），实验分为6组：细胞对照组、Ad-GFP空载体组、Ad.RGD-GFP空载体组、Ad.RGD-ING4单基因组、Ad.RGD-PTEN单基因组和Ad.RGD-ING4-PTEN双基因组。感染48h后1000r/min离心5min收集细胞,PBS洗涤2～3次,按照107细胞/mL细胞裂解液的比例加细胞裂解液（含终浓度为1mM PMSF蛋白酶抑制剂）进行裂解，充分裂解后12000r/min离心5min，取总蛋白上清，并以4:1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，用分离胶为10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳（浓缩胶100V，分离胶120V），并以200mA，2h将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，然后将PVDF膜用5％脱脂奶粉37℃脱色摇床上封闭1h或4℃封闭过夜；分别用小鼠抗人ING4(1∶1000)和小鼠抗人PTEN抗体(1∶1000)在4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5min；再分别加Dylight-800标记的荧光二抗，37℃避光作用1h，TBST避光洗涤3次，每次5min；最后在荧光成像仪上进行拍照。
Western blot结果(如图11)显示，Ad..RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒感染U87组可产生与抗人ING4抗体和抗人PTEN抗体特异性结合的条带；Ad-ING4单基因重组腺病毒感染组只产生与抗人ING4抗体特异性结合的条带；Ad-PTEN单基因重组腺病毒感染组只产生与抗人PTEN抗体特异性结合的条带；Ad-GFP、Ad.RGD-GFP空病毒感染组和PBS细胞对照组均未出现上述条带。Western blot鉴定结果进一步表明重组腺病毒介导的外源性ING4和/或PTEN基因在U87细胞中成功表达目的蛋白。
MTT法检测Ad.RGD-ING4和/或PTEN单、双基因表达对U87细胞生长的影响：
将对数生长期的U87细胞,按5×103个/孔接种于96孔板，37℃，5%CO2培养24h后，空病毒阴性对照组和实验组分别加50MOI感染剂量的Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN病毒液，细胞对照组加RPMI1640，每组设5个复孔，37℃、5%CO2条件下孵 育。随后分别于1d、2d、3d、4d、5d加MTT(5mg/mL)10μL/孔，继续孵育4-6h后加入溶解剂[10%SDS+1%HCl(1mol/L)]100μL/孔,至次日待甲臢结晶完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测OD570值,绘制U87细胞生长曲线。并按U87细胞生长抑制率(%)＝（对照组OD570值－实验组OD570值）/对照组OD570值计算细胞生长抑制率。。由图12、图13可见Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒和Ad.RGD-IMG4-PTEN双基因重组腺病毒对U87细胞均有不同程度的生长抑制作用，并且第五天生长抑制率各组分别可达66.5%、63.0%和83.1%左右，与Ad-GFP空载体组和细胞对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；而且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒对U87细胞的抑制作用明显优于Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Ad-GFP空载体比较，Ad.RGD-GFP空载体腺病毒对U87细胞也有一定的生长抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒对U87人神经胶质瘤细胞的生长抑制作用强于Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒，且腺病毒本身RGD的表达对U87细胞也有一定程度的生长抑制作用。RGD肽、ING4和PTEN三者的联合表达对U87细胞具有生长抑制协同作用（Q=1.21）。
Annexin-V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测Ad.RGD-ING4和/或PTEN单、双基因表达对U87细胞凋亡的影响：
采用PE-AnnexinV/7-AAD双荧光标记法，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡的变化。具体方法如下：将腺病毒以50MOI感染剂量分别感染处于对数生长期的U87细胞，分为6组：细胞对照组、Ad-GFP、Ad.RGD-GFP空载体腺病毒组、Ad-ING4、Ad-PTEN单基因重组腺病毒组、Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组。腺病毒感染细胞后37℃5%CO2培养48h，收集细胞制成单细胞悬液，加入100μL的1×Binding Buffer悬浮细胞后加入1μLAnnexin V-PE混匀，37℃避光水浴15min，然后加入5μL7-AAD染液混匀，37℃避光水浴10min，然后加入400μL的1×Binding Buffer，1h内流式细胞仪检测。
FCM检测细胞凋亡率结果如图14可见Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒和Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒均能诱导U87细胞凋亡，凋亡率分别为28.9%、27.6%和40.7%，与空载体腺病毒组和细胞对照组比较具有统计学意义（P＜0.05）；并且Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组诱导U87细胞凋亡的作用明显强于单基因腺病毒Ad-ING4组和Ad-PTEN组，差异具有统计学意义（P＜0.05）(如图15)；并且经RGD修饰的腺病毒感染组的细胞凋亡率高于未经RGD修饰的普通腺病毒感染组，差异具有统计学意义(P<0.05)。
体外划痕实验检测细胞迁移能力：
将U87细胞株于对数生长期接种于6孔板中培养。待细胞基本长满后将Ad-GFP、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒以50MOI的剂量分别感染U87细胞，以未感染腺病毒的U87细胞作为空白对照。用无菌200μl枪头于细胞层中横向划线，形成宽度均匀一致的划痕，造成培养细胞划痕伤口模型，此时倒置显微镜下观察拍照，测定宽度，作为划痕后0时。
具体方法为：位于划痕缘间隔0.5mm标定1个测量点，每条划痕取3个测量点。测量每一个点垂直于划痕方向的宽度，计算3点的均值作为实验的初始划痕宽度值，以后每隔24小时测定1次。
如（图16）所示。PBS组、Ad-GFP细胞随着时间的延长，划痕伤口的宽度由于细胞的迁移而逐渐变窄，划痕伤口由于细胞的迁移逐渐融合，Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒感染组细胞迁移受到抑制，培养第5天时仍可见明显的划痕伤口。结果统计如图17所示，Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒双基因重组腺病毒均能抑制U87细胞的迁移，与Ad-GFP空载体腺病毒组和细胞对照组比较具有统计学意义（P＜0.05）；并且Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒抑制细胞的迁移作用明显强于Ad.RGD-GFP组、Ad.RGD-ING4组和Ad.RGD-PTEN组，差异具有统计学意义（P＜0.05），结果见表2。
表2抑制U87细胞的迁移效果
Transwell穿膜侵袭实验：
将冻存于－80℃冰箱的BD matrigel4℃过夜，变成液态；取300ul无血清培养基，加入60ul Matrigel，冰浴混匀，加入上室各100ul；放入37℃培养箱中，孵育5h，直至出现“白色层”变为固态；将Ad-GFP、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒以50MOI的剂量分别感染U87细胞，以未感染腺病毒的U87细胞作为空白对照。24h后收集各组细胞用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×105/ml；用无血清培养基洗Matrigel1次；每孔加入100ul细胞悬液；下腔室中加入500ul含有20％FBS条件培养基，37℃培养箱中，孵育24h。取出transwell小室用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；用棉球擦去上表面细胞，加入0.1%结晶紫染色10min，室温0.5h，PBS洗2遍，显微镜下观察并拍照。
由图18可见，Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒感染后，U87神经胶质瘤细胞体外穿膜侵袭能力均有下降，穿膜细胞数与Ad-GFP、Ad.RGD-GFP空载体腺病毒组和细胞对照组比较均呈显 著性差异（P＜0.05）；且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒抑制U87细胞穿膜侵袭的效应强于Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒（P＜0.05）。
Real-Time荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-9基因的转录情况：
将Ad-GFP、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒以50MOI的剂量分别感染U87细胞，以未感染腺病毒的U87细胞作为空白对照（细胞数约为4×106）。24h后收集细胞并提取总RNA，逆转录得cDNA后，以GAPDH为内参，以表1中P5，P6；P21，P22；P23，P24为引物，进行Real-Time PCR分别检测MMP-2、MMP-9基因在各组U87细胞中mRNA的转录，以检验U87细胞是否具有侵袭能力。MMP-2和MMP-9退火温度分别为58℃和61℃。
由图19可见，Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒感染后，U87细胞MMP-2和MMP-9的表达均明显下调，与空载体腺病毒组和细胞对照组比较均呈显著性差异（P＜0.05）。
Real-Time荧光定量PCR法检测细胞凋亡及周期调控相关基因的转录：
以50MOI感染复数的Ad-GFP、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad-ING4-PTEN感染U87细胞，设空白对照组加PBS做对照。48h后分别收集经腺病毒感染和未感染病毒的U287细胞,提取其总RNA，逆转录成cDNA，以表（1）中P5、P6；P7，P8；P9，P10；P11，P12；P13，P14；P15，P16；P17，P18；P19，P20为引物进行Real-Time荧光定量PCR，按照公式：ΔCt=Cq(目的基因)-Cq(GAPDH)，目的基因初始含量=2-ΔΔCt检测计算P21、P53、Bax、Bcl-2、Cyclin-B、Caspase-3和HIF-1α基因在U87细胞中的转录水平。
由图20可见，与PBS组和Ad-GFP组相比，Ad.RGD-GFP组能明显下调HIF-1α基因转录水平（*P<0.05)；Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组和Ad.RGD-ING4-PTEN组均能明显上调促细胞凋亡相关因子p53、p21、bax、Caspase-3基因转录水平（*P<0.05)，下调Bcl-2、Cyclin-B、HIF-1α凋亡抑制因子基因转录水平（*P<0.05)；并且Ad.RGD-ING4-PTEN组上调细胞凋亡相 关因子P53、P21、Bax，以及下调Bcl-2、Cyclin-B、HIF-1α凋亡抑制因子基因转录水平的能力均强于Ad.RGD-ING4组和Ad.RGD-PTEN组（△P<0.05)。结果表明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒能通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生长等途径抑制U87神经胶质瘤细胞的生长。
综上所述，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达重组腺病毒载体，体外对U87神经胶质瘤细胞具有明显的抑瘤增效作用，其调控细胞周期、迁移、侵袭和凋亡相关基因表达的更为显著的效应可能是重要机制之一。本文将Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达重组腺病毒载体用于体外对U87神经胶质瘤细胞生长抑制、促进凋亡和抑制侵袭、迁移效应的研究，为进一步的体内实验提供了依据。
实施例7Ad.RGD-ING4-PTEN对裸鼠人神经胶质瘤移植瘤生长抑制效应的体内实验研究
Ad-GFP腺病毒由实验室之前构建保存，Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒为上述成功构建，，ING4、CD34抗体购自美国Santa Cruz公司，PTEN抗体购自美国Cell Signaling公司，β-actin抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，P53、P21、MMP-2、MMP-9、VEGF、CD34、BCL-2、BAX、HIF-1α抗体、两步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒、防脱落载玻片购自于购自武汉Boster公司，OCT冰冻切片包埋剂购自日本樱花公司，U87人神经胶质瘤细胞株购自中科院上海细胞库，RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司；福尔马林溶液购自上海化学试剂公司；BALB/c裸鼠,雌性,3-4周龄,18-22g购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
U87人神经胶质瘤裸鼠移植瘤模型的建立：
用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基在37℃，5%CO2细胞培养箱内培养U87细胞。对数生长期的U87细胞经胰酶消化后，PBS洗3次，1500r/min离心5min，PBS重悬制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×107个/mL，将U87细胞约5×106个，皮内注射于28只裸鼠的左前腋下，无特定病原体 (specific-pathogen free,SPF)环境下饲养，无菌复合维生素B标准饲料饲养，室温稳定于23℃～28℃，相对湿度为40%～60%。隔日更换垫料、饮用水。垫料及其它与裸鼠接触的物品均经过高压或辐射灭菌处理。每日定时观察移植瘤瘤体生长情况，其中动物饲养和实验严格按照中华人民共和国《动物实验管理条例》要求进行。
U87人神经胶质瘤裸鼠模型的建立及成功率：
裸鼠皮下接种U87人神经胶质瘤细胞，3天内可见接种部位皮丘逐渐减小，5天后慢慢转变为实性结节并渐渐长大，8天左右直径约1cm，裸鼠成瘤率达100%（25/25）
U87鼠移植瘤实验分组及抗肿瘤治疗：
将上述28只荷瘤裸鼠随机分为6组，空白对照组及Ad-GFP对照组，Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN组,每组5只。待肿瘤长出能触及的皮下瘤块（直径约1cm），按照上述筛选的腺病毒最佳感染剂量用于以下实验，实验组用Ad.RGD-ING4（109pfu/mL）、Ad.RGD-PTEN（109pfu/mL）、Ad.RGD-ING4-PTEN（109pfu/mL）、对照组用Ad-GFP（109pfu/mL）、Ad.RGD-GFP（109pfu/mL）、细胞对照组用PBS各100μL于瘤体内多点注射，隔日一次，共注射5次。
肿瘤瘤体体积、瘤重、抑瘤率以及标本的免疫组织化学的检测：
皮下移植10天后每2天一次使用游标卡尺测量移植瘤，按公式体积=（长径x短径2)/2计算瘤体体积，持续到实验结束。治疗结束后持续观察7天后处死裸鼠，摘除瘤体称瘤重（W），计算各组抑瘤率，抑瘤率(%)=[1－实验组平均瘤重/对照组平均瘤重]×100%，肿瘤组织标本福尔马林溶液固定过夜，30%蔗糖溶液脱水48小时，用于进行免疫组织化学检测。
组织于蔗糖溶液脱水48小时后取出修整使切面平整，然后使用OCT包埋剂包埋后，冰冻切片机切片。
冰冻切片用免疫组织化学法染色后检测ING4、PTEN、P53、P21、MMP-2、MMP-9、VEGF、CD34、BCL-2、BAX、HIF-1α等因子的表达，以细胞质或 细胞核内出现散在或弥漫状分布的黄色颗粒为阳性细胞。冰冻切片免疫组化染色步骤按免疫组化试剂盒说明书进行。大致如下：
①冰冻切片于65℃烘片2小时，PBS（PH7.4）冲洗三次，每次5分钟。
②切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。
③自然冷却后PBS（PH7.4）洗3次，每次5min。切片放入3%H2O2中室温孵育10分钟，PBS（PH7.4）洗3次，每次5分钟，甩干后5%BSA（牛血清白蛋白）封闭20分钟（封闭电荷）。
④甩去BSA液，每张切片加入约50μL稀释后的相应一抗孵育60min或4℃冰箱孵育过夜。
⑤PBS冲洗三次，每次5分钟。甩去PBS后，滴加二抗A液，室温下孵育45min～60min。
⑥PBS（PH7.4）洗3次，每次5min。
⑦甩去PBS液，每张切片加50-100μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察显色。
⑧显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化（1s），自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
⑨切片经过梯度酒精（70-100%）10分钟一个梯度，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化结果判断：
免疫组化的冰冻切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片的累积光密度值（IOD值）。IOD值越大，阳性表达越强。每组所有照片的平均IOD值代表该组的IOD值用Mean±SD表示。
数据处理：
（1）采用SPSS12.0统计软件包进行单因素方差分析，所有数据用
表示，P＜0.05视为差异有统计学意义。
（2）Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组的联合效应增敏结果判断用 金正均法[8]（计算Q值），Q值=E（A＋B）/(EA＋EB－EA·EB)，式中EA、EB分别为A、B单用之效应，分子E（A＋B）代表实测合并效应，分母是期望合并效应。当Q值=1±0.15时，两作用因素被认为有相加作用，Q值＞1.15时，两作用因素被认为有协同作用，当Q＜0.85时,两作用因素有拮抗作用。
结果：
各重组腺病毒对裸鼠U87人神经胶质瘤移植瘤生长的影响：
移植瘤模型在移植10天左右，将28只荷瘤裸鼠模型随机分为6组，分组后完全随机资料方差分析结果显示，各组平均数之间无显著性差异。分组完成后用不同病毒(Ad-GFP，Ad.RGD-GFP，Ad.RGD-ING4，Ad.RGD-PTEN，Ad.RGD-ING4-PTEN和PBS)进行肿瘤内注射治疗，病毒剂量1×109pfu/100μL；隔日一次，共注射5次。
裸鼠体内药物实验安全性观察：
以上各组实验期间无动物死亡及感染，状态良好，治疗前后动物的粪便色泽和形态、食欲以及行为无明显变化。处死后，肉眼观察各内脏无明显增大；组织切片显微镜下观察均无实质性改变。
各重组腺病毒对裸鼠人神经胶质瘤移植瘤的体内抗肿瘤效应观察：
用Ad-GFP，Ad.RGD-GFP，Ad.RGD-ING4，Ad.RGD-PTEN，Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒进行瘤体内注射基因治疗U87裸鼠人神经胶质细胞皮下移植瘤，治疗后2天一次进行瘤体长、短径测量和计算瘤体体积（cm3），观察肿瘤生长变化(如图21所示)。由图（22）可见，Ad.RGD-ING4，Ad.RGD-PTEN，Ad.RGD-ING4-PTEN单、双基因重组腺病毒对U87裸鼠人神经胶质细胞移植瘤均有不同程度的抑制作用，与Ad-GFP,Ad.RGD-GFP空载体腺病毒组和PBS组比较均呈显著性差异（P＜0.05）；Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒对裸鼠人神经胶质细胞移植瘤的体内抗肿瘤效应优于Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒（P＜0.05）。治疗18天后，裸鼠处死，取瘤体标本称重（图23），Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和 Ad.RGD-ING4-PTEN单、双基因重组腺病毒治疗组瘤重（g）分别为2.37±0.34，2.66±0.51，1.84±0.23，与Ad-GFP组（4.95±0.85）Ad.RGD-GFP组（4.67±1.12）和PBS组（6.28±1.05）比较均呈显著性差异（P＜0.01）。Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN单、双基因重组腺病毒治疗组抑瘤率比较如图（24）。结果表明，Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN单、双基因重组腺病毒体内对裸鼠人神经胶质细胞移植瘤均具有明显的抑瘤效应，且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒的体内抑瘤效应较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒呈现明显的抑瘤增效的协同效应（Q=1.28）。
免疫组化检测重组腺病毒的裸鼠体内抗神经胶质瘤效应分子机制：
将各组U87裸鼠人神经胶质瘤移植瘤肿瘤组织切片进行免疫组化检测，研究裸鼠体内抗癌效应潜在的分子机制（图25）。免疫组化检测的指标包括转染目的基因ING4和PTEN，细胞周期和细胞凋亡相关因子P53、P21、Bcl-2、Bax，肿瘤侵袭相关分子基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9，以及肿瘤血管形成相关因子VEGF和CD34，缺氧诱导因子HIF-1α。由图25和图26可见，Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-ING4-PTEN治疗组癌细胞呈ING4阳性表达,而Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN治疗组癌细胞呈PTEN阳性表达。PBS组及空载体腺病毒组未见-ING4/PTEN明显表达。与PBS组和空载体组比较，Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒和Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒均能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21、P53、Bax的表达和下调Bcl-2的表达，下调肿瘤血管形成相关的因子VEGF、CD34的表达，下调肿瘤侵袭相关分子基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达，下调缺氧诱导因子HIF-1α的表达；，且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒更为显著(MMP-9除外)。此外，与Ad-GFP组相比，Ad.RGD-GFP组下调MMP-2、MMP-9的表达及明显下调HIF-1α的表达。结果表明ING4、PTEN单、双基因重组腺病毒能通过阻滞肿瘤细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生长和抑制肿瘤迁移及侵袭等多途径抑制U87裸鼠人神经胶质细胞移植瘤的生 长，且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒所具有的更为显著的抑瘤效应,上述分子可能参与其对体内裸鼠人神经胶质细胞移植瘤的协同抑瘤增效作用(如图25和图26)。
裸鼠人神经胶质瘤移植瘤动物试验基因治疗结果表明：Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN单、双基因重组腺病毒体内对裸鼠人神经胶质瘤移植瘤均具有明显的抗肿瘤效应，且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒的体内抗肿瘤效应均明显优于Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒，并呈现明显的抑瘤增效的协同效应。
RGD竞争性结合αvβ3后可以抑制FAK信号通路，引起RhoB表达下调，继而引起下游靶基因HIF-1α的下调；ING4同样可以抑制HIF-1α的表达，引起其下游靶基因IL-8，OPN（血管生成因子）的下调，从而抑制肿瘤血管的生成；PTEN的表达可以抑制PI3K/AKT信号通路的转导，从而使得Forkheadtranscription factors(FOXO)家族去磷酸化，抑制HIF-1α的表达。RGD、ING4和PTEN从三条不同的信号通路可以同时抑制HIF-1α的表达，从而抑制肿瘤血管的生成，这可能是Ad.RGD-ING4-IL-24重组腺病毒对U87人神经胶质瘤移植瘤体内生长抑制具有协同抑瘤增效作用的另一重要机制。
结果表明RGD修饰的ING4、PTEN单、双基因重组腺病毒可能通过阻滞肿瘤细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生长和抑制肿瘤迁移及侵袭等多途径联合抑制U87裸鼠人神经胶质细胞移植瘤的生长，且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒所具有的更为显著的效应可能参与其对体内裸鼠人神经胶质细胞移植瘤的协同抑瘤增效作用。
实施例8RGD修饰的ING4和PTEN双基因腺病毒载体用于MEG01白血病细胞肿瘤基因治疗
荧光显微镜观察MEG01细胞GFP荧光蛋白的表达
将处于对数生长期分散的MEG01白血病细胞用含10%FCS的1640完全培养基悬浮，计数后调整细胞浓度为1×105/mL，以每孔2mL接种于6孔 培养板，37℃，5%CO2培养过夜。次日分别将Ad-GFP、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒以1、50、100MOI不同剂量感染MEG01细胞,空白对照组以相同量的PBS代替病毒。48h后在荧光显微镜下观察细胞中GFP绿色荧光表达情况。结果显示（见图27）在50MOI时，Ad-GFP感染的MEG01细胞中GFP荧光蛋白表达阳性细胞几乎没有；而Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN感染的MEG01细胞均能较高的表达GFP荧光蛋白。结果表明在50MOI时，经RGD修饰的腺病毒比没有RGD修饰的腺病毒对白血病MEG01细胞的感染效率有明显差异。
流式细胞仪检测GFP荧光阳性细胞比例：
将处于对数生长期分散的MEG01白血病细胞分别以50MOI Ad-GFP、Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN腺病毒感染MEG01细胞，制作单细胞悬液，以加入相同量PBS的MEG01细胞作为空白对照，培养48h后收集MEG01细胞，用流式细胞仪检测各组细胞中GFP荧光阳性细胞比例。结果显示，以50MOI经RGD修饰的腺病毒感染的各组细胞较50MOI无RGD修饰的腺病毒感染的各组细胞，GFP绿色荧光表达阳性细胞比例显著提高(见图28，图29)。而使得腺病毒载体被用于白血病治疗的研究成为可能。
CCK8法检测AAd.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-ING4-PTEN单、双基因重组腺病毒对MEG01细胞生长的影响：
将对数生长期的MEG01细胞,按5×103个/孔接种于96孔板，37℃，5%CO2培养24h后，空病毒对照组和实验组分别加50MOI感染剂量的Ad.RGD-GFP和Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒的病毒液，细胞对照组加RPMI1640，每组设5个复孔，37℃、5%CO2条件下孵育。随后分别于培养0d、1d、2d、3d、4d、5d加cck8试剂，10μL/孔，继续孵育4h，在酶联免疫检测仪上测OD450值,绘制细胞生长曲线，并按抑制率(%)＝（对照组OD450值－实验组OD450值）/对照组OD450值计算细胞生长抑制率。由图30、图31可见Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN 单基因重组腺病毒和Ad.RGD-IMG4-PTEN双基因重组腺病毒对MEG01细胞均有不同程度的生长抑制作用，并且第五天抑制率各组分别可达35%、28%、56%左右，与Ad.RGD-GFP空载体组和细胞对照组比较差异有统计学意义；而且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒对MEG01细胞的抑制作用明显优于Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒。说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒对MEG01细胞的生长抑制作用强于Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒。ING4和PTEN两者的联合表达对MEG01细胞具有生长抑制协同作用。
Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测MEG01细胞凋亡：
采用Annexin V-PE/7-AAD双荧光标记，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡的变化。具体方法如下：将腺病毒以50MOI感染剂量分别感染处于对数生长期的MEG01细胞，分为6组：PBS对照组、Ad.RGD-GFP空载体腺病毒组、Ad-ING4单基因重组腺病毒组、Ad-PTEN单基因重组腺病毒组、Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组。腺病毒感染细胞后37℃5%CO2培养48h，收集细胞制成单细胞悬液，加入100μL的1×Binding Buffer悬浮细胞后加入1μL Annexin V-PE混匀，37℃避光水浴15min，然后加入5μL7-AAD染液混匀，37℃避光水浴10min，然后加入400μL的1×Binding Buffer，1h内用流式细胞仪检测。结果如图32、图33可见Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒和Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒均能诱导MEG01细胞凋亡，凋亡率分别为22%、20%、30%，；Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组诱导MEG01细胞凋亡的作用明显强于单基因腺病毒Ad-ING4组和Ad-PTEN组。
实施例9Ad.RGD-ING4-PTEN联合放疗对人鼻咽癌CNE细胞生长抑制效应的体外实验研究
RGD修饰的ING4和PTEN双基因腺病毒载体(简称Ad.RGD-ING4-PTEN)由本发明成功构建；人鼻咽癌细胞CNE(简称CNE细胞)购于南京凯基生物有限公司，细胞培养血清为10%小牛血清的RPMI-1640 购自GIBGO公司。MTT购自Sigma公司；细胞凋亡PI染色试剂盒，AnnexinV-PE/7-AAD检测凋亡试剂盒购于南京凯基生物有限公司；细胞裂解液Trizol试剂购自Invitrogen公司；MMLV逆转录酶、Taq酶购自Fermentas公司；各上下游引物由上海生工生物技术有限公司合成，见表1；小鼠抗人ING4抗体购自santacruz公司,抗人pten抗体购自celling signaling公司，小鼠抗人Caspase-3抗体购自abcam公司；HRP标记的兔抗小鼠IsG二抗购自abcam公司；PVDF膜购买于苏州阿尔法生物技术有限公司、Western blot化学发光试剂盒和暗盒购自上海普利莱基因技术有限公司；Matrigel基质胶购自BD公司；Transwell小室购自Corning公司。
重组腺病毒的扩增、纯化和效价测定如上述,各重组腺病毒（图34）， 其效价可达1010（pfu/ml）。
测定重组腺病毒对CNE细胞的最佳感染复数（MOI）：
将对数生长期的CNE细胞制备成浓度为105/ml的细胞悬液，按104/100μl·孔接种于96孔板上，继续培养。24h后将Ad.RGD-GFP空病毒以1、10、25、50、100、200的不同剂量感染CNE细胞。每组各设5个复孔，继续培养。72h后进行细胞观察，以荧光强度达80%以上，细胞形态正常的最低感染剂量组为最佳MOI。Ad.RGD-GFP组中，1、10、25、50、100、MOI不同剂量所感染后的CNE细胞其形态均正常，生长良好，与PBS组比较无明显差异(图34)，而200MOI剂量组出现CNE细胞圆缩、脱落，呈现腺病毒细胞毒性作用，并呈现强荧光；50、100MOI剂量组均有90%以上的CNE细胞表达GFP荧光蛋白，并未见细胞毒性(图35)，提示50MOI剂量组为腺病毒感染CNE细胞的最佳MOI。以50MOI剂量组Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN分别感染CNE细胞后，均能表达GFP并未呈现明显的细胞毒性特征,通过流式细胞仪检测其感染率，感染率均在95%以上，见图36。
RT-PCR鉴定ING4或/和PTEN基因转录：
按上述筛选的腺病毒最佳感染剂量Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4-PTEN、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN感染CNE细胞。感染72h收集细胞用Trizol法分别抽提总RNA用P13、P14、P15、P16引物进行RT-PCR.其产物琼脂糖凝胶电泳后显示，Ad.RGD-ING4-PTEN、Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-PTEN分别在各自相应位置可产生特异性条带，在750bp位置可检测到一条ING4特异性条带，在1209bp位置可检测到一条PTEN特异性条带，而PBS，Ad.RGD-GFP对照组中均未出现预期条带，提示CNE细胞自身可能失去了ING4、PTEN基因表达能力；RT-PCR鉴定结果表明Ad.RGD-ING4-PTEN、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、能在CNE细胞中成功转录ING4、PTEN基因，见图37。
Western blot鉴定ING4或/和PTEN基因在CNE细胞中的表达：
以最佳感染剂量的重组腺病毒分别感染CNE细胞。培养72h后收集各组细胞，加入细胞裂解液（按107细胞：1ml细胞裂解液的比例），取总蛋白上清；蛋白上清以4:1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE电泳（分离胶、浓缩胶浓度分别为12%、5%），转膜将蛋白由凝胶转移至PVDF膜上；PVDF膜以5％脱脂奶粉封闭后，分别用鼠抗人ING4、鼠抗人PTEN和鼠抗人β-actin抗体稀释液作用后，PBS洗膜3次，再分别加入相应二抗稀释液使其作用；最后将PVDF膜与发光工作液充分接触，室温孵育，暗室中压片曝光、显影和定影。结果显示：Ad.RGD-ING4-PTEN、Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-PTEN分别在各自相应位置可产生与抗ING4抗体和抗PTEN抗体结合的特异性条带，而PBS组和Ad.RGD-GFP组均未见相应上述条带，见图38。
不同照射剂量对CNE-2Z细胞凋亡率的影响：
将呈指数生长期，细胞密度为70％CNE细胞分为0、2、4、6、8、10Gy共6组，室温下采用60Coγ射线照射，吸收剂量率为1Gy／min，由苏州大学放疗医学放疗中心照射。37℃5%CO2相同条件下培养72h后收集细胞，PBS清洗2次，收集1×105细胞。加入100μl的binding buffer于样本中，混匀后加入1μl Annexin-V-PE混匀，室温避光反应15min。再加1×binding buffer400μl,再加5μl7-AAD混匀，室温避光反应15min,上流式检测，实验重复三次，各照射剂量组的凋亡率结果见图39。为了避免高剂量照射的严重副作用，故我们选择本实验的半数照射剂量（体外实验为6Gy，体内实验为10Gy）作为本实验体内外放疗增敏的照射剂量。
ING4或/和PTEN单、双基因表达对CNE细胞的体外抑癌增效和放疗增敏作用：
实验分组及细胞处理：
PBS组（正常细胞对照组）：1×105/ml CNE细胞+0.1mol/L PBS；
Ad.RGD-GFP组（空病毒载体对照组）：1×105/ml CNE细胞+50MOIAd.RGD-GFP；
Ad.RGD-ING4组（ING4单基因治疗实验组）：1×105/ml CNE细胞+50MOI Ad.RGD-ING4
Ad.RGD-PTEN组（PTEN单基因治疗实验组）：1×105/ml CNE细胞+50MOI Ad.RGD-PTEN
Ad.RGD-ING4-PTEN组（ING4、PTEN双基因治疗实验组）：1×105/ml CNE细胞+50MOI Ad.RGD-ING4-PTEN
放疗组（单纯放疗阳性对照组）：1×105/ml CNE细胞+放疗（6Gy）；
Ad.RGD-ING4+放疗组（ING4联合放疗实验组）：1×105/ml CNE细胞+50MOI Ad.RGD-ING4+放疗（6Gy）
Ad.RGD-PTEN+放疗组（PTEN联合放疗实验组）：1×105/ml CNE细胞+50MOI Ad.RGD-PTEN+放疗（6Gy）
Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组（ING4、PTEN双基因联合放疗实验组）：1×105/ml CNE细胞+50MOI Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗（6Gy）。
MTT法检测CNE细胞的生长情况：
将对数生长期的CNE细胞制备成浓度为105/ml的细胞悬液，按细胞104/100μl·孔接种于96孔板上，每组各设3个复孔。培养24h后弃上清，将各组细胞按照上述1.2.6分组处理，随后分别继续培养，于24h、48h、72h、96h加MTT(5mg/ml)10μl/孔，继续培养4h后加入溶解剂[10%SDS+1%HCl(1mol/L)]100μl/孔，次日测OD570值，绘制其生长曲线（图40）并按公式计算细胞生长抑制率(E)，生长抑制率＝[(对照组OD570值－实验组OD570值)/对照组OD570值]×100％。结果表明，与PBS组和Ad.RGD-GFP对照组比较，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组生长抑制率（65.43±2.81）%明显高于Ad.RGD-ING4(42.41±2.32）%、Ad.RGD-PTEN单基因治疗组（42.41±2.32）%（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有更为明显的抑癌增效作用；联合放疗与单纯放疗组（38.78±2.56）%生长抑制率的比较的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组（83.58±4.01）%的生长抑制率、Ad.RGD-ING4+放疗组的生长抑制率（68.47±3.96）%和Ad.RGD-PTEN+放疗组的生长抑制率（66.79±3.33）%明显高于单纯放疗组 （P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN的单、双基因表达对CNE细胞具有放疗增敏作用。Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组（83.58±4.01）%明显高于Ad.RGD-ING4+放疗组（68.47±3.96）%和Ad.RGD-PTEN+放疗（66.79±3.33）%的单基因治疗组（P<0.01）、说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有更为显著的放疗增敏作用。
PI染色的FCM检测细胞周期：
按照上述分组处理CNE细胞于37℃，5%CO2条件下培养72h后收获细胞悬液，用PBS洗涤2次,收集5×105细胞，70%冷乙醇4℃固定12h以上,再用PBS洗涤细胞两次，每个样本加入缓冲液500μl、PI25μl、RNA酶10μl，37℃水浴避光染色30min,上流式细胞仪检测细胞周期,实验重复3次。FCMPI单染检测细胞周期的结果显示（如图41、图42）,与PBS组和Ad.RGD-GFP对照组比较，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组在G2/M期出现明显阻滞,可达(38.77±3.73）%,明显高于Ad.RGD-ING4组(24.00±2.62）%、Ad.RGD-PTEN组(22.90±2.55）%（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达对CNE细胞具有更为显著的阻滞G2/M期的作用；联合放疗的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗组(56.23±4.25)%对CNE细胞的周期阻滞作用明显高于Ad.RGD-ING4+放疗（43.83±3.62）%和Ad.RGD-PTEN+放疗（41.87±3.09）的单基因治疗组、说明Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗具有放疗增敏作用。与单纯放疗组(20.87±2.11）%的比较，Ad.RGD-ING4+放疗组的G2/M期周期阻滞（43.83±3.62）%和Ad.RGD-PTEN+放疗组的G2/M期周期阻滞（41.87±3.09）明显高于单纯放疗组（P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN的单基因表达对CNE细胞的G2/M期阻滞也具有放疗增敏作用。
Annexin-V-PE/7-AAD染色检测CNE-2Z细胞凋亡率的变化：
按照上述分组处理处于对数生长期的CNE细胞，37℃5%CO2相同条件下培养72h后收集细胞，PBS清洗2次，收集1×105细胞。加入100μl的binding buffer于样本中，混匀后加入1μl Annexin-V-PE混匀，室温避光反应15min。 再加1×binding buffer400μl,再加5μl7-AAD混匀，室温避光反应15min,上流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复三次。FCM检测结果表明(图43、44)，与PBS组(2.27±0.75)%和Ad.RGD-GFP(3.57±1.06)%对照组比较，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组诱导细胞的凋亡率(42.53±2.77）%明显高于Ad.RGD-ING4(23.90±2.35）%和Ad.RGD-PTEN单基因治疗组(22.73±2.11）%（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有明显的抑癌增效作用；联合放疗组与单纯放疗组（21.90±2.36）%诱导细胞的凋亡率的比较，结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗组（61.07±5.05）%、Ad.RGD-ING4+放疗组（46.10±3.27）%和Ad.RGD-PTEN+放疗组（44.90±3.04）%的诱导细胞的凋亡率明显高于单纯放疗组（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因、Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-PTEN的单基因表达对CNE细胞具有放疗增敏作用。Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗组对CNE细胞的诱导细胞凋亡作用明显高于Ad.RGD-ING4+放疗（46.10±3.27）%和Ad.RGD-PTEN+放疗（44.90±3.04）%的单基因治疗组（P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗与单基因治疗比较，具有更为显著的放疗增敏作用。
RT-PCR检测CNE细胞中相关因子的表达：
按照上述分组处理CNE细胞，培养72h后收集各组细胞，提取总RNA，经逆转录后获得cDNA；以各cDNA为模板，以各上、下游引物（如表1）P1、P2，P3、P4，P5、P6，P9,P10,P11,P12进行PCR检测P21、CyclinB、Survivin、Bcl-2、Bax因子的表达。RT-PCR检测结果表明（图45、46），与PBS组和Ad.RGD-GFP对照组比较，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN单基因组能明显上调P21、P53等促凋亡因子的表达，明显下调Bcl-2、Survivin等凋亡抑制因子的表达（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因表达具有更为显著的上调P21、P53和下调Bcl-2、Survivin作用；联合放疗的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组较Ad.RGD-ING4+放疗、Ad.RGD-PTEN+放疗的单基因治疗组，能明显上调P21、P53等促凋亡因子 的表达，而明显下调Bcl-2、Survivin等凋亡抑制因子的表达（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗具有更为显著的放疗增敏作用。与单纯放疗组比较，Ad.RGD-ING4+放疗组和Ad.RGD-PTEN+放疗组上调P21、P53等促凋亡因子的表达，而下调Bcl-2、Survivin等凋亡抑制因子的表达明显高于单纯放疗组（P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN的单基因表达对CNE细胞上调P21、P53和下调Bcl-2、Survivin基因的表达也具有放疗增敏作用。
Western blot鉴定Caspase3蛋白在CNE细胞中的表达：
按照上述分组处理CNE细胞，培养72h后收集各组细胞，加入细胞裂解液（按107细胞：1ml细胞裂解液的比例），取总蛋白上清；蛋白上清以4:1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE电泳（分离胶、浓缩胶浓度分别为12%、5%），转膜将蛋白由凝胶转移至PVDF膜上；PVDF膜以5％脱脂奶粉封闭后，分别用鼠抗人Caspase3、Cleaved-Caspase3,和鼠抗人β-actin抗体稀释液作用后，PBS洗膜3次，再分别加入相应二抗稀释液使其作用；最后将PVDF膜与发光工作液充分接触，室温孵育，暗室中压片曝光、显影和定影。结果表明（图47），与PBS组和Ad.RGD-GFP对照组比较,Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因组能更为显著的上调Caspase3蛋白的表达（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有更为显著的明显上调Caspase3蛋白表达的抑癌增效作用；联合放疗的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组较Ad.RGD-ING4+放疗、Ad.RGD-PTEN+放疗的单基因治疗组，明显上调Caspase3蛋白的表达（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗对上调Caspase3蛋白的表达具有更为显著的放疗增敏作用。与单纯放疗组比较，Ad.RGD-ING4+放疗组和Ad.RGD-PTEN+放疗组明显上调Caspase3蛋白的表达（P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN的单基因表达对CNE细胞上调Caspase3蛋白的表达也具有放疗增敏作用。
Transwell侵袭实验检测ING4或/和PTEN单、双基因表达对CNE细胞 侵袭能力的影响：
基质胶的准备：
Matrigel4℃过夜，取60μl Matrigel+300μl无血清培养基，冰浴混匀，加入Transwell小室的上室各100μl,放入37℃培养箱中，孵育5h，直至出现“白色层”变成固态。用无血清培养基洗Matrigel一次。
细胞的处理：
按照上述分组处理CNE细胞于37℃，5%CO2条件下培养72h后收获细胞悬液，用PBS洗涤2次,收集5×105细胞，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×105/ml，每个小室加100μl。下室中加入500μl含20%FBS条件培养基，37℃5%CO2孵育24小时，取出小室，PBS清洗2遍，5%戊二醛固定，4℃1h;用棉球擦去小室表面细胞，加入0.1%结晶紫染色10min，室温0.5h，PBS清洗2遍，显微镜下观察并拍照。
结果表明（图48、49），与PBS组和Ad.RGD-GFP对照组比较，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因组能更为显著的降低CNE细胞的侵袭能力（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有更为显著的抑制细胞侵袭的能力；联合放疗的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组较Ad.RGD-ING4+放疗、Ad.RGD-PTEN+放疗的单基因治疗组，能更为显著的降低CNE细胞的侵袭能力（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗具有更为显著的放疗增敏作用。与单纯放疗组比较，Ad.RGD-ING4+放疗组和Ad.RGD-PTEN+放疗组能明显降低CNE细胞的侵袭能力（P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN的单基因表达对CNE细胞的侵袭能力也具有放疗增敏作用。
实施例10Ad.RGD-ING4-PTEN联合放疗对人鼻咽癌CNE细胞裸鼠移植瘤的体内抑癌实验
Ad-GFP腺病毒由实验室之前构建保存，Ad.RGD-GFP、Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-ING4-PTEN重组腺病毒为本发明成功构建，，ING4、CD34抗体购自美国Santa Cruz公司，PTEN抗体购自美国Cell Signaling公 司，β-actin抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，BALB/c裸鼠,雌性,3～4周龄,18～22g购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；P21、Cox-2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin、VEGF抗体购自ABCAM公司；即用型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTM SP试剂盒（鼠/兔）购自武汉谷歌生物技术公司；DAB购自Sigma公司；盖玻片和载玻片购自上海生工生物技术服务有限公司；10%福尔马林购自上海化学试剂公司。
人鼻咽癌细胞CNE裸鼠移植瘤模型的建立：
CNE细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养基于5%CO2、37℃常规培养。将处于对数生长期的CNE细胞先用PBS洗涤，经0.25%胰酶消化，并用无血清培养液中止后以1000r/min的转速离心5min，收获细胞，用PBS调整细胞浓度制备5.0×107/ml的细胞悬液。取4周龄SPF(specific-pathogen free,SPF)级BALB/c雄性裸鼠45只，安尔碘于裸鼠右前腋下常规消毒后，每只裸鼠皮下注射细胞悬液5.0×106/100μl，并观察CNE细胞在裸鼠皮下的生长成瘤情况。裸鼠在无特定病原体SPF环境下饲养，无菌复合维生素B标准饲料饲养，并予以自然昼夜光线照射。每日紫外线照射4h，室温稳定于23℃～28℃，相对湿度为40%～60%。隔日更换垫料、饮用水。垫料及其它与裸鼠接触的物品均经过高压或辐射灭菌处理。每日定时观察移植瘤瘤体生长情况。
照射治疗方法：
先将需要照射的裸鼠麻醉，10%水合氯醛按200mg/kg体重腹腔注射待裸鼠麻醉后固定在特制装置上，以铅板屏蔽除局部肿块以外的部位，采用西门子PRIMUS M对瘤体进行电子辐照（x射线），5MeV，SSD＝100cm，Dt＝10Gy。
实验分组及各组处理：
皮下接种2周左右肿瘤直径长至200mm3左右时，计为第0d，将其随机分成9组，每组5只：
PBS组：100μl PBS/只，使用瘤体内注射干预用药，隔日一次，共注射6次；
Ad.RGD-GFP组：1×109pfu Ad.RGD-GFP/100μl/只，治疗方法同PBS组；
Ad.RGD-ING4组：1×109pfu Ad.RGD-ING4/100μl/只，治疗方法同PBS组；
Ad.RGD-PTEN组：1×109pfu Ad.RGD-PTEN/100μl/只，治疗方法同PBS组；
Ad.RGD-ING4-PTEN组：1×109pfu Ad.RGD-ING4-PTEN双基因/100μl/只，治疗方法同PBS组；
放疗组：抗肿瘤基因治疗实验开始治疗2次后(第5d)，荷瘤裸鼠肿瘤处局部单次照射10Gy/只；
Ad.RGD-ING4+放疗组：1×109pfu Ad.RGD-ING4/100μl/只，治疗方法同PBS组，治疗2次后于肿瘤局部单次照射10Gy/只；
Ad.RGD-PTEN+放疗组：1×109pfu Ad.RGD-PTEN/100μl/只，治疗方法同PBS组，治疗2次后于肿瘤局部单次照射10Gy/只；
Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组：1×109pfu Ad.RGD-ING4-PTEN双基因/100μl/只，治疗方法同PBS组，治疗2次后于肿瘤局部单次照射10Gy/只。
瘤体体积观察：
第一次治疗前及开始治疗后隔日用游标卡尺测量各组瘤体的长径(a)、短径(b)，计算瘤体体积(V=a*b2/2)，绘制瘤体体积-时间变化曲线，并进一步分析Ad.RGD-ING4-PTEN基因治疗和联合放疗对裸鼠CNE移植瘤的抑瘤作用。
瘤体重量观察：
治疗15d后，将裸鼠脱颈处死，肿瘤局部皮肤用安尔碘常规消毒，切开皮肤摘取瘤体，电子天平称肿瘤湿重，并进一步分析Ad.RGD-ING4-PTEN和联合放疗对裸鼠CNE移植瘤的抑瘤作用。
抑瘤率观察：
根据瘤重计算抑瘤率（E），抑制率(%)=（1－实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%；进一步分析Ad.RGD-ING4-PTEN基因治疗和联合放疗对裸鼠CNE移植瘤的抑瘤作用。
免疫组化检测：
将各组瘤体组织以10％中性福尔马林固定，常规石蜡包埋并组织切片，进行HE染色和免疫组化染色。HE染色用以观察各肿瘤组织细胞的形态变化，如细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞核固缩、碎裂、溶解，组织间有大量空泡形成，初步判断CNE细胞的凋亡情况。用特异抗体的免疫组化常规染色法检测CNE鼻咽癌移植瘤生长相关因子的表达：（1）P21、Bax、Caspase3、等促凋亡因子；（2）Bcl-2、Cox-2、Survivin等凋亡抑制因子(3)CD34、VEGF等影响肿瘤血管生成的因子。
方法：每组内每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片的累积光密度值（IOD值）。IOD值越大，阳性表达越强。每组所有照片的平均IOD值代表该组的IOD值用Mean±SD表示。应用SPSS16.0进行显著性检验。进一步探讨Ad.RGD-ING4-PTEN基因治疗和联合放疗对裸鼠CNE移植瘤抑瘤作用的分子机制。
统计学处理：
所有数据用
表示，用SPSS13.0统计学软件包进行单因素方差分析，P＜0.05视为统计学有差异，P＜0.01视为统计学有显著性差异。
结果：
人鼻咽癌CNE细胞裸鼠模型的建立及成功率：
裸鼠皮下接种人鼻咽癌CNE细胞，3天内可见接种部位皮丘逐渐减小，5天后慢慢转变为实性结节并渐渐长大，8天左右直径约1cm，裸鼠成瘤率达100%（45/45）。
裸鼠体内药物实验安全性观察：
以上各组实验期间无动物死亡及感染，状态良好，治疗前后动物的粪便色泽和形态、食欲以及行为无明显变化。处死后，肉眼观察各内脏无明显增大；组织切片显微镜下观察均无实质性改变。
Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达对CNE细胞裸鼠移植瘤的抑癌增效和放疗增敏作用：
瘤体体积变化：
根据公式计算瘤体体积，并绘制瘤体体积-时间变化曲线（图50）。结果表明，治疗15d后，Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN双基因组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗组对裸鼠CNE细胞移植瘤均有不同程度的抑瘤作用，与PBS组、Ad.RGD-GFP组比较有显著性差异（P＜0.01），Ad.RGD-ING4-PTEN双基因组与Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因治疗组比较有显著性差异（P＜0.05）。联合放疗的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗联合组的抑瘤作用优于Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组，统计学有差异（P＜0.05）。
瘤体重量变化：
治疗15d后处死裸鼠，摘取瘤体组织（图51），电子天平称瘤体重量（g）并绘制瘤体重量直方图（图52）。Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因治疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组的平均瘤体重量
分别为0.932±0.036g，0.960±0.029g，0.584±0.024g，0.911±0.031g，0.601±0.042g，0.624±0.041g，0.387±0.026g与PBS组（1.939±0.184）、Ad.RGD-GFP组（1.921±0.206）比较有显著性差异（P＜0.01），Ad.RGD-ING4-PTEN双基因（0.584±0.024g）组抑瘤作用优于Ad.RGD-ING （0.932±0.036g）和Ad.RGD-PTEN组（0.960±0.029g））,具有明显的抑癌增效作用。联合放疗组瘤体重量与单纯放疗组瘤体重量（0.911±0.031g）Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗组（0.387±0.026g）抑瘤作用Ad.RGD-ING4+放疗组（0.601±0.042g）和Ad.RGD-PTEN+放疗组（0.624±0.041g）抑瘤作用明显高于单纯放疗组（P<0.01）说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN的单、双基因表达对CNE细胞裸鼠移植瘤具有放疗增敏作用。并且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗组瘤体重量（0.387±0.026g）明显低于Ad.RGD-ING4+放疗组（0.601±0.042g）和Ad.RGD-PTEN+放疗组（0.624±0.041g）单基因+放疗组（P＜0.05）,说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有更为显著的放疗增敏作用。
裸鼠移植瘤的抑瘤率变化：
根据公式计算抑瘤率，并绘制瘤体抑瘤率直方图（图53）。结果表明与PBS组和Ad.RGD-GFP对照组比较，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗组对裸鼠CNE细胞移植瘤抑瘤率（69.88±4.87）%明显高于Ad.RGD-ING4组(51.93±3.65）%、Ad.RGD-PTEN组（50.49±4.09）%（P＜0.05），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有明显的抑瘤增效作用；联合放疗与单纯放疗组（49.92±3.95）%生长抑制率的比较的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组的抑瘤率（80.00±5.76）%、Ad.RGD-ING4+放疗组的抑瘤率（69.00±4.61）%和Ad.RGD-PTEN+放疗组的抑瘤率（67.82±5.01）%明显高于单纯放疗组（P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN和Ad.RGD-ING4-PTEN的单、双基因表达对CNE细胞具有放疗增敏作用。Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组（80.00±5.76）%的抑瘤率明显高于Ad.RGD-ING4+放疗组（69.00±4.61）%和Ad.RGD-PTEN+放疗（67.82±5.01）%的单基因治疗组（P＜0.05）、说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达具有更为显著的放疗增敏作用。
HE染色观察瘤体组织细胞的形态学变化：
上述瘤体组织HE常规染色，光镜下（×200）观察：Ad.RGD-ING4组、 Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组均表现为较多细胞呈细胞核固缩、裂解或溶解，细胞质浓缩，细胞膜不完整，组织间有大量空泡形成，并且Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组的表现较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组明显（图54）。
免疫组化检测瘤体组织中相关因子的表达：
上述9组瘤体均制成组织切片，用特异抗体进行免疫组化染色分别检测不同因子的表达，结果表明（表2、表3、表4和图55、图56、图57、图58）Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组P21、Bax、Caspase-3阳性细胞数、累积光密度值显著高于PBS组和Ad.RGD-GFP组（P＜0.01），Cox-2、Bcl-2、Survivin、CD34、VEGF阳性细胞数、累积光密度值均显著低于PBS组和Ad.RGD-GFP组（P＜0.01）。
与PBS组和Ad.RGD-GFP对照组比较，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因治疗较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组能更为显著的上调P21、Bax、Caspase-3的基因表达表达，更为显著的下调Cox-2、Bcl-2、Survivin、CD34、VEGF的表达（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因表达抑癌增效作用机制可能通过阻滞肿瘤细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成等多途径联合抑制鼻咽癌细胞生长。联合放疗的实验结果表明：Ad.RGD-ING4-PTEN双基因+放疗组较Ad.RGD-ING4+放疗、Ad.RGD-PTEN+放疗的单基因治疗组，更能明显上调P21、Bax、Caspase-3的基因表达和下调Cox-2、Bcl-2、Survivin、CD34、VEGF基因的表达（P<0.01），说明Ad.RGD-ING4-PTEN双基因的放疗增敏作用机制可能与对CNE细胞更能明显上调P21、Bax、Caspase-3的基因表达和下调Cox-2、Bcl-2、Survivin、CD34、VEGF基因的表达有关。与单纯放疗组比较，Ad.RGD-ING4+放疗组和Ad.RGD-PTEN+放疗组也能明显上调P21、Bax、Caspase-3的基因表达和下调Cox-2、Bcl-2、Survivin、CD34、VEGF基因的表达,并且明显高于单纯 放疗组（P<0.01）,说明Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN的单基因表达对CNE细胞上调P21、Bax、Caspase-3的基因表达和下调Cox-2、Bcl-2、Survivin、CD34、VEGF基因的表达也具有放疗增敏作用。
表3各组肿瘤组织中相关因子的表达（累积光密度值IOD）
表4各组肿瘤组织中相关因子的表达（累积光密度值IOD）
表5各组肿瘤组织中相关因子的表达（累积光密度值IOD）
本发明在载体成功构建的基础上，进一步研究Ad.RGD-ING4-PTEN联合低剂量放疗抑制鼻咽癌细胞生长和诱导细胞凋亡的效应及其潜在的分子机制。MTT和流式细胞仪检测结果表明，腺病毒介导的ING4和/或PTEN单、双基因表达均具有特异性抑制鼻咽癌细胞CNE生长的作用，而且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒联合低剂量放疗对CNE细胞的细胞毒作用和诱导凋亡的作用较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组相比较有显著性差异。
而通过RT-PCR检测结果表明，与PBS组和Ad.RGD-GFP组相比，Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组和Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组均能明显上调P53、p21、bax、基因转录水平，下调Bcl-2、Survivin基因转录水平；并且Ad.RGD-ING4-PTEN组上调细胞凋亡相关因子P53、P21、Bax，以及下调Bcl-2、Survivin基因转录水平的能力均强于Ad.RGD-ING4组和Ad.RGD-PTEN组。而且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒联合低剂量放疗组较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组相比较有显著性差异。
通过Western Blot检测结果表明，与PBS组和Ad.RGD-GFP组相比，Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组和Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组均能明显上调Caspase3蛋白的表达水平；并且Ad.RGD-ING4-PTEN组上调Caspase3蛋白的表达水平均强于Ad.RGD-ING4组和Ad.RGD-PTEN组。而且Ad.RGD-ING4-PTEN双基 因重组腺病毒联合低剂量放疗组较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组相比较有显著性差异。
在Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达重组腺病毒联合低剂量放疗体外可明显抑制鼻咽癌细胞的生长和诱导细胞凋亡的基础上，我们进一步建立裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型，观察Ad.RGD-ING4-PTEN联合低剂量放疗体内对人鼻咽癌移植瘤生长的影响，并通过免疫组化法检测P21、VEGF、CD34、BCL-2、BAX、Survivin、Caspase3等因子的表达，初步研究Ad.RGD-ING4-PTEN联合低剂量放疗对裸鼠人鼻咽癌移植瘤的生长抑制作用的潜在分子机制。
免疫组化分子机制检测结果表明：ING4、PTEN单、双基因重组腺病毒、Ad.RGD-ING4+放疗、Ad.RGD-PTEN+放疗、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21、、Bax、Caspase3的表达和下调Bcl-2、Survivin的表达，下调肿瘤血管形成相关的因子VEGF和CD34的表达，且其效应Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒联合低剂量放疗较Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN单基因重组腺病毒、双基因重组腺病毒、Ad.RGD-ING4+放疗、Ad.RGD-PTEN+放疗更为显著。
裸鼠人鼻咽癌移植瘤动物试验基因治疗结果表明：与PBS组和Ad.RGD-GFP组相比，Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组、Ad.RGD-ING4-PTEN+放疗组对裸鼠人鼻咽癌移植瘤均具有明显的抗肿瘤效应；并且Ad.RGD-ING4-PTEN组对裸鼠人鼻咽癌移植瘤抗肿瘤作用均强于Ad.RGD-ING4组和Ad.RGD-PTEN组。而且Ad.RGD-ING4-PTEN双基因重组腺病毒联合低剂量放疗组较Ad.RGD-ING4组、Ad.RGD-PTEN组、Ad.RGD-ING4-PTEN组、放疗组、Ad.RGD-ING4+放疗组、Ad.RGD-PTEN+放疗组相比较有显著性差异，呈现明显的放疗增敏作用。
综上所述，Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达重组腺病毒载体联合低剂量放疗，体内、外对鼻咽癌细胞CNE具有明显的抑瘤增效和放疗增敏作用，其机制可能通过阻滞肿瘤细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭 等多途径联合抑制鼻咽癌细胞生长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种含有RGD修饰的pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN双基因共表达同源重组腺病毒质粒的大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC No.M2013212。
2.重组腺病毒Ad(RGD)-ING4-PTEN的制备方法，其特征在于，由如权利要求1所述的pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN双基因共表达同源重组腺病毒质粒在包装细胞中包装产生。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述包装细胞为QBI-293A人胚肾细胞。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法获得的重组腺病毒Ad(RGD)-ING4-PTEN。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒Ad(RGD)-ING4-PTEN在制备治疗恶性肿瘤和/或白血病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤选自神经胶质瘤、神经胶质瘤移植瘤、鼻咽癌或鼻咽癌移植瘤。
7.根据权利要求5所述的重组腺病毒Ad.(RGD)-ING4-PTEN在制备放疗增敏剂中的应用。
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