CN110564700A - 携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。溶瘤痘苗病毒携带鲎凝集素基因，鲎凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示；溶瘤痘苗病毒的构建方法包括两个步骤：(A)将鲎凝集素的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB‑TTL质粒；(B)pCB‑TTL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。本发明的溶瘤痘苗病毒不仅对多种肿瘤细胞具有显著抑制效果，而且能显著抑制肿瘤细胞的抗病毒因子水平和显著提高ERK磷酸化水平，有利于病毒复制；此外，携带TTL基因后溶瘤痘苗病毒的复制水平也显著提高。

Description

携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。
背景技术
溶瘤病毒是指能够选择性感染并损伤肿瘤组织的有治疗价值的病毒。自1991年首次报导胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase,TK)缺失的单纯疱疹病毒(Herpes simplexvirus,HSV)用于治疗鼠胶质母细胞瘤以来，至少已有分属10个病毒家族的溶瘤病毒进入临床试验，包括腺病毒(Adenovirus)、柯萨奇病毒(Coxackie virus)、单纯疱疹病毒、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、细小病毒(Parvovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)与水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)。总体上，溶瘤病毒在临床试验中表现出了可观的安全性和有效性。
痘苗病毒是一种有被膜的双链DNA病毒，因具备全身用药稳定、瘤内快速复制和扩散、外源基因容量大以及多年来用作消除天花的疫苗表现出的安全性，从而成为一种理想的溶瘤病毒载体。进入临床前和临床试验的溶瘤痘苗病毒(oncolytic vaccinia virus,oncoVV)队伍正在日益增长。
目前常见的溶瘤痘苗病毒大都经过减毒改造，包括胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase，TK)基因缺失或TK/痘苗病毒生长因子基因双缺失的病毒株等。TK基因的缺失使痘苗病毒的复制更依赖于细胞内的TK水平，而癌细胞相比于正常细胞往往具有更高水平的TK；另外，痘苗病毒的复制还依赖于表皮生长因子受体EGFR/Ras通路的驱动，从而使其对癌细胞具有很强的选择性。痘苗病毒的几个特征还有助于它们在癌组织间的传播，例如，细胞外痘苗病毒的被膜有助于广泛扩散而且抵御中和抗体的攻击，而细胞内痘苗病毒的肌动蛋白尾巴则可帮助病毒进入邻近的癌细胞。溶瘤痘苗病毒在实验动物和人体上均表现出向癌组织靶向性聚集的能力。
鲎凝集素(Tachypleus tridentatus lectin，TTL)(GenBank:AF264068.1)，是一种来源于鲎血浆的能识别细菌脂多糖LPS的凝集素，在鲎体内执行宿主免疫防御的功能(Chen,S.C.,Yen,C.H.,Yeh,M.S.,Huang,C.J.and Liu,T.Y.2001.Biochemicalproperties and cDNA cloning oftwo new lectins from the plasma ofTachypleustridentatus:Tachypleus plasma lectin 1and 2+.J.Biol.Chem.276(13),9631-9639.)。
目前尚未见将TTL应用于制备抗肿瘤药物的相关研究，也尚未见将鲎凝集素基因与溶瘤痘苗病毒重组协同进行抗肿瘤的研究。
发明内容
本发明是为解决上述技术问题进行的，目的在于提供一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。
本发明的第一方面提供了一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒，该溶瘤痘苗病毒携带鲎凝集素基因，鲎凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示：
atgggaattttcaaagtgtggtttactataatactcgtccacctggtacacgtaacaggagaagataactgcacgtgtgtgacagacaggtctctggaaggaaaactgatgaaacacccttcaacgccagcagtttaccaaattttggatgggtgtcggcgattggtgcccaatccccccacttacaacaacatctacaaaaactgggaatgtattcaatcaaatattttggagaaactcttgtgtaaatgtgattctctttccaacggtgcagaacttatcaagggaagtggagatactgtatatttactaagtaatggcgtcaaaagacctattgctgaccctgaaacttttaatggcttttgtttcgactggaacaaaatcaagacttattcagatattgtcatcaacagtctttctactggacctattataataattaagtaa。
优选的，痘苗病毒为痘苗病毒Western Reserve株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth株、痘苗病毒Copenhagen株、痘苗病毒Lister株或痘苗病毒NYCBH株。
本发明的第二方面提供了一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的构建方法，该构建方法包括如下两个大步骤：(A)将鲎凝集素的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-TTL质粒；(B)pCB-TTL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。
优选的，步骤(B)中为痘苗病毒Western Reserve株和pCB-TTL质粒的重组，构建获得oncoVV-TTL痘苗病毒。
通过实验验证，相对于不携带鲎凝集素基因的对照痘苗病毒，oncoVV-TTL痘苗病毒在肿瘤细胞内的复制水平以及对肿瘤细胞内的抗病毒因子的抑制效果处于较高水平；相对于携带其它凝集素基因的痘苗病毒和化疗药物顺铂，oncoVV-TTL对荷瘤小鼠的治疗效果更优。
在本发明的构建方法中，步骤(A)和步骤(B)中均可采用常规操作方法进行操作。步骤(B)中，重组时，痘苗病毒Western Reserve(WR)株和pCB-TTL质粒在293A细胞中进行重组，按照细胞转染按照试剂盒(Effectene)说明书进行操作；筛选时，采用黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸作为筛选药物进行重组病毒液的筛查，通过空斑实验分离重组病毒；鉴定时，利用野生型病毒具有完整的TK区而重组病毒却不具有的特征进行PCR鉴定，获得纯化的溶瘤痘苗病毒oncoVV-TTL。
本发明的第三方面提供了携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，抗肿瘤药物为治疗肝癌、结直肠癌或胶质瘤的药物。根据本发明实施例2的记载，通过MTT法检测，溶瘤痘苗病毒oncoVV-TTL对肝癌细胞、结直肠癌细胞以及胶质瘤细胞的体外抑制效果显著，且呈剂量和时间依赖。
优选的，抗肿瘤药物是以携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒作为唯一活性成份或者是包含携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物。
本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。
本发明的第四方面，提供了一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物，其特征在于，还包括医学上可接受的药物载体。
本发明的重组病毒和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双特异性抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
通常情况下，液体制剂可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂。
本发明中重组病毒及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。
本发明的有益保障及效果：
本发明提供了一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用，通过实验验证，本发明的溶瘤痘苗病毒不仅对多种肿瘤细胞具有显著抑制效果，而且能显著抑制肿瘤细胞的抗病毒因子水平和显著提高ERK磷酸化水平，有利于病毒复制；此外，携带TTL基因后溶瘤痘苗病毒的复制水平也显著提高。
就技术而言，本发明的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的构建方法本质上是一种鲎凝集素基因质粒和痘苗病毒在细胞内的重组，具有操作简便、重复性高等特点，大大简化了构建技术路线，生产成本低、纯化周期短，适宜于在生物医药工业化生产中大规模应用。
附图说明
图1为pCB-TTL质粒构建图谱。
图2为MTT方法检测oncoVV-TTL在体外对多种肿瘤细胞的抑制效果，其中A为对肝癌细胞MHCC97-H的体外抑制效果，B为对肝癌细胞BEL-7404的体外抑制效果，C为对结直肠癌细胞HT-29的体外抑制效果，D为胶质瘤细胞U251MG的体外抑制效果。
图3为oncoVV-TTL和对照病毒oncoVV在肿瘤细胞MHCC97-H(A)和BEL-7404(B)里的复制水平比较结果。
图4为用PBS、oncoVV或oncoVV-TTL处理肝癌细胞MHCC97-H(a)和BEL-7404(b)后，Western blot方法检测细胞内Interferon Gamma Inducible Protein 16(IFI16)、Mitochondrial Antiviral Signaling Protein(MAVS)、磷酸化ERK和总ERK的水平的结果图，Actin作为内参。
图5为oncoVV或oncoVV-TTL单独或联合MEK-ERK抑制剂U0126处理肿瘤细胞MHCC97-H(A)和BEL-7404(B)后，各处理方法下病毒的复制水平结果。
图6为oncoVV-TTL、oncoVV-PPA、oncoVV-SpRBL以及顺铂(DDP)对小鼠肝癌移植瘤的疗效比较结果，以PBS作为对照，其中(a)为顺铂(DDP)和oncoVV-TTL对小鼠肝癌移植瘤的疗效比较结果，(b)为oncoVV-PPA和oncoVV-SpRBL对小鼠肝癌移植瘤的疗效比较结果。
图7为利用SWISS-MODEL方法对TTL氨基酸序列进行功能区域分析的结果，其中(a)为模式1功能区域分析的结果，(b)为模式2功能区域分析的结果。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例以痘苗病毒Western Reserve(WR)株与鲎凝集素基因(TTL)基因的重组为例，对溶瘤痘苗病毒的构建及应用进行描述。但本发明的保护范围不限于此，也适用于其他痘苗病毒株与鲎凝集素基因(TTL)基因的重组。
实施例1：溶瘤痘苗病毒oncoVV-TTL的构建和鉴定
1、将鲎凝集素(Tachypleus tridentatus lectin,TTL)的基因序列(SEQ ID NO:1)通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-TTL质粒。
pCB-TTL质粒图谱如图1所示。其中，vTK-L与vTK-R通过与野生型病毒的胸腺嘧啶激酶TK区同源重组，将外源基因插入TK区，同时造成TK缺失。此外，该质粒还带有黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(xanthine-guanine phoshporibosyl transferase，gpt)基因作为筛选基因，gpt基因来自大肠埃希菌，病毒或细胞在霉酚酸(MPA)存在的情况下，由于MPA可以阻断鸟嘌呤合成，使病毒或细胞核酸合成不能正常进行而死亡。而在gpt基因存在下，细胞或病毒可以利用次黄嘌呤(hypoxanthine)和黄嘌呤(xanthine)通过替代途径合成鸟嘌呤，使核酸合成不受限制。
2、Western Reserve(WR)株痘苗病毒和pCB-TTL质粒的重组，过程如下：
(1)在面积6cm2的培养皿内接种适当数量的293A细胞，使之能于次日长至80-90％成片。
(2)弃去培养液，沿侧壁轻轻加入1mL病毒液(0.05～0.1MOI，用含2％血清的培养基稀释病毒液)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养2～4小时，其间大约每15min摇匀一次，以防细胞局部干死。
(3)细胞转染按照试剂盒(Effectene)说明书进行操作，步骤如下：
将1μg的pCB-TTL补加buffer EC至150μL，再分别加8μL Enhance buffer，振荡1s，室温静置5min。在上述三份混合物中分别加入25μL的Effectene buffer，颠倒混匀5次，振荡10s，室温静置5～10min，然后向上述混合物中分别加入1mL的新鲜培养液(可含血清和抗生素)，上下颠倒两次。
与此同时，将步骤2中的病毒液弃去，加入4mL 10％FBS的新鲜培养液，并将混合好的转染液分别加入其中，然后将培养皿置于37℃，5％CO2培养箱中培养6～18个小时后吸弃培养液，PBS洗一次，加入5mL的新鲜培养液继续培养。
(4)细胞完全病变后，在生物安全柜中收集病毒液，分装到离心管中，标记好，将离心管置-80℃和37℃反复冻融三次，彻底裂解细胞释放病毒，2000rmp离心5min收集上清，放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
3、重组病毒的筛选，步骤如下：
(1)将生长状态良好的293A细胞接种于培养皿中，次日细胞密度可达约80％-90％。
(2)准备三种筛选药物：黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸。
(3)向(1)中每个培养皿沿侧壁小心加入500μL之前包装出来的病毒液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养2-4h；约2～4h后，吸弃悬浮的病毒液，加入3mL新鲜培养液，其中含7.5μL的(1×)霉酚酸、75μL的(1×)黄嘌呤与7.5μL的(1×)次黄嘌呤。
(4)每天观察细胞病变情况，大约两三天后在生物安全柜中收集全部病变的细胞液，反复冻融三次，放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
(5)每次收集的病毒液按照以上方法重复筛选3～4次。
4、病毒挑空斑及鉴定
(1)5％低溶点胶的配制：称取0.25g的低熔点胶溶于5mL的PBS中，将其121℃高压灭菌20min，然后放4℃冰箱保存备用。
(2)将状态良好的293A细胞接种于六孔板中，次日，待细胞密度达到90％左右时，将病毒液按照10-4～10-6梯度进行系列稀释，之后弃去六孔板中旧的培养液，向每孔加入1mL稀释好的病毒液使病毒吸附，置于培养箱中培养2～4h后将已煮沸的低熔点胶放置40℃水浴锅中保温；然后放入超净台，加入三倍体积的DMEM培养液使其最终浓度为1.25％，用吸管快速混匀并迅速用移液枪将板中的悬浮病毒液吸弃，而后用吸管沿侧壁小心加入2mL含1.25％低熔点胶的培液，注意不要将细胞吹起，然后将其置于37℃、5％CO2的细胞培养箱培养。
(3)每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况，如果有孤立的病毒空斑出现，将其挑取置于提前铺好293A细胞的12孔板中，标记好，将其置于37℃，5％CO2的细胞培养箱培养，待其充分病变后，在安全柜收集病毒液于1.5mL离心管，置于-80℃超低温冰箱保存，以备下一步鉴定。
(4)利用野生型病毒具有完整的TK区而重组病毒却不具有的特征进行PCR鉴定(自己鉴定)，获得纯化的溶瘤痘苗病毒oncoVV-TTL。
实施例2：MTT法检测oncoVV-TTL对多种肿瘤细胞的体外抑制效果
本实验选用肝癌细胞BEL-7404和MHCC97-H、结直肠癌细胞HT-29和胶质瘤细胞U251MG，分别按5×103/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入90μL细胞培养液培养过夜，分别加入2MOI或10MOI oncoVV-TTL病毒，设置6个重复孔，实验对照组为不加病毒的细胞，空白组为不含细胞的培液。
37℃，5％CO2培养，设置24h、48h、72h三个时间梯度，到相应的时间点时避光每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)。培养箱静置4h，吸去每组的培液后，每孔加入150μL二甲基亚砜，放在摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解。置酶联检测仪上测定OD值，检测波长490nm。
根据所测OD值计算细胞存活率，公式为：细胞存活率＝(处理组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100％。
分析结果如图2所示，oncoVV-TTL在体外显著抑制多种肿瘤细胞的增殖，且呈剂量和时间依赖。
实施例3：溶瘤痘苗病毒oncoVV-TTL在肿瘤细胞内的复制水平显著高于对照病毒oncoVV
将肿瘤细胞BEL-7404或MHCC97-H按5×103/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入90μL细胞培养液培养过夜，分别加入5MOI oncoVV-TTL病毒或对照病毒oncoVV，每个时间梯度设置3个以上重复孔。将细胞和培液一起收集，利用TCID50法(半数组织培养感染量)对oncoVV-TTL和对照病毒oncoVV在肿瘤细胞内的复制效率进行了检测。
检测结果如图3所示：与对照组对比，实验组oncoVV-TTL病毒在肿瘤细胞MHCC97-H和BEL-7404中的复制效率显著高于对照病毒oncoVV。
实施例4：oncoVV-TTL显著抑制肿瘤细胞内的抗病毒因子并激活细胞外调节蛋白激酶ERK
将3×105个肿瘤细胞BEL-7404或MHCC97-H铺于6孔板中培养过夜，每孔分别加入5MOI的oncoVV-TTL或对照病毒oncoVV，加等体积PBS的孔作对照，48h后裂解细胞收集蛋白。利用Western blot方法检测细胞内抗病毒因子Interferon Gamma Inducible Protein 16(IFI16)、MitochondrialAntiviral Signaling Protein(MAVS)、磷酸化ERK和总ERK的水平。
oncoVV和oncoVV-TTL单独使用或分别和MEK-ERK抑制剂U0126联用，测量病毒在肿瘤细胞MHCC97-H与BEL-7404内的复制情况。
如图4所示，对照病毒oncoVV显著诱导IFI16和MAVS的表达，而oncoVV-TTL则彻底抑制IFI16和MAVS的水平。此外，oncoVV-TTL显著提高ERK的磷酸化水平。
另外，如图5所示，U0126没有抑制oncoVV的复制，却显著抑制oncoVV-TTL的复制。
综上，oncoVV-TTL的高复制水平是由于其抑制肿瘤细胞内的抗病毒因子并激活ERK活性所致。
实施例5：oncoVV-TTL显著抑制小鼠皮下肿瘤移植瘤的生长
选取4周龄雌性BALB/c裸鼠，在其前肢腋端皮下注射2.5×106个/100μL的MHCC97-H肝癌细胞，待肿瘤体积大小在120mm3左右时，将其按照体积大小均匀的分组：PBS组，顺铂(DDP)组，oncoVV-TTL组，每组各8只裸鼠。分完组之后，oncoVV-TTL组裸鼠瘤内注射1×107PFU病毒，DDP组瘤内注射5mg/kg顺铂，空白对照组瘤内注射100μLPBS。定期测量肿瘤的体积，计算方式：肿瘤体积(mm3)＝(长×宽2)/2。
在另一个实验中，以携带掌叶半夏凝集素PPA与紫海胆凝集素SpRBL的溶瘤痘苗病毒为研究对象，给荷瘤小鼠注射与上述实验等量的PBS、oncoVV-PPA或oncoVV-SpRBL，其余方法类似。
如图6所示：相比于PBS对照，oncoVV-TTL治疗显著抑制肿瘤生长，且优于顺铂化疗。但oncoVV-PPA和oncoVV-SpRBL却未能起到抑瘤作用，而且oncoVV-SpRBL表现出明显的毒性，荷瘤小鼠在第30天就开始出现死亡。
实施例6：TTL的功能区域分析
利用SWISS-MODEL方法对TTL的氨基酸序列进行分析，如图7所示：TTL存在JumonjiC(Jmj C)家族组蛋白去甲基化酶结构域(氨基酸序列对应H39到S105区域，包含以下保守片段：HPSTPAVYQ、RRLVPN、YMNIYKNWECIQSNITL、KCDS、AELIK、TVYL)和保守的膜蛋白结构域(氨基酸序列对应G90到I145区域，包含以下保守片段：GAELIK、GDTVYLL、VKRPI、PETFNGP、KIKT、DIVINS、STGP)。
以上已对本发明的实例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州世耀生物科技有限公司
<120> 携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用
<130> 权利要求书 说明书
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
atgggaattt tcaaagtgtg gtttactata atactcgtcc acctggtaca cgtaacagga 60
gaagataact gcacgtgtgt gacagacagg tctctggaag gaaaactgat gaaacaccct 120
tcaacgccag cagtttacca aattttggat gggtgtcggc gattggtgcc caatcccccc 180
acttacaaca acatctacaa aaactgggaa tgtattcaat caaatatttt ggagaaactc 240
ttgtgtaaat gtgattctct ttccaacggt gcagaactta tcaagggaag tggagatact 300
gtatatttac taagtaatgg cgtcaaaaga cctattgctg accctgaaac ttttaatggc 360
ttttgtttcg actggaacaa aatcaagact tattcagata ttgtcatcaa cagtctttct 420
actggaccta ttataataat taagtaa 447

Claims (9)

1.一种携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述的溶瘤痘苗病毒携带鲎凝集素基因，所述鲎凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒，其特征在于：
其中，所述的痘苗病毒为痘苗病毒Western Reserve株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth株、痘苗病毒Copenhagen株、痘苗病毒Lister株或痘苗病毒NYCBH株。
3.权利要求1或2所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)将鲎凝集素的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-TTL质粒；
(B)pCB-TTL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得所述携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。
4.根据权利要求3所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：
其中，步骤B为痘苗病毒Western Reserve株和pCB-TTL质粒的重组，构建获得oncoVV-TTL痘苗病毒。
5.权利要求1或2所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：
其中，所述的肿瘤为肝癌、结直肠癌或胶质瘤。
7.根据权利要求5所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：
其中，所述抗肿瘤药物是以携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒作为唯一活性成份或者是包含携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物。
8.含有如权利要求1或2所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物，以携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒作为活性成份，还包括医学上可接受的药物载体。
9.含有如权利要求8所述的携带鲎凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物的药物制剂，所述制剂为混悬剂、水针剂、冻干剂。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755455A (zh) * 2020-06-05 2021-12-07 杭州功楚生物科技有限公司 携带sike基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100129326A1 (en) * 2007-05-14 2010-05-27 Rene Djurup Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
EP1180157B1 (en) * 1999-05-28 2012-11-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector
CN104163856A (zh) * 2013-05-15 2014-11-26 张大慈 提高蛋白质可溶性的肽及其用途
CN105535993A (zh) * 2015-12-25 2016-05-04 浙江省人民医院 重组溶瘤痘苗病毒在治疗胃癌中的用途
CN106591361A (zh) * 2015-10-20 2017-04-26 钱文斌 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1180157B1 (en) * 1999-05-28 2012-11-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector
US20100129326A1 (en) * 2007-05-14 2010-05-27 Rene Djurup Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
CN104163856A (zh) * 2013-05-15 2014-11-26 张大慈 提高蛋白质可溶性的肽及其用途
CN106591361A (zh) * 2015-10-20 2017-04-26 钱文斌 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用
CN105535993A (zh) * 2015-12-25 2016-05-04 浙江省人民医院 重组溶瘤痘苗病毒在治疗胃癌中的用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN,S.C. ET AL.: "ACCESSION NO：AF264068，Tachypleus tridentatus LPS-binding protein mRNA, complete cds", 《GENBANK》 *
GONGCHU LI ET AL.: "Haliotis discus discus Sialic Acid-Binding Lectin Reduces the Oncolytic Vaccinia Virus Induced Toxicity in a Glioblastoma Mouse Model", 《MARINE DRUGS》 *
吴冰冰: "携带凝集素基因的重组腺病毒和痘苗病毒对肝癌细胞的作用机制研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
段雪梅: "溶瘤痘苗病毒携带 SPL/PPA 凝集素基因的抗癌研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755455A (zh) * 2020-06-05 2021-12-07 杭州功楚生物科技有限公司 携带sike基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用
CN113755455B (zh) * 2020-06-05 2023-09-12 杭州功楚生物科技有限公司 携带sike基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用

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