CN104163856A - 提高蛋白质可溶性的肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于一种由SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列组成之肽片段。本发明亦关于一种使用由SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列组成之肽以增加目标蛋白质表达量的方法，包含(a)融合该肽与目标蛋白质以形成一重组蛋白；及(b)藉由一表达宿主生产该重组蛋白。

Description

提高蛋白质可溶性的肽及其用途
技术领域
本发明涉及人工肽及其用途。
背景技术
大部份具有潜在临床或工业价值的蛋白质之供给往往受限于其低自然可得性。随着现代基因体学、蛋白质组学和生物信息学的进步，使用重组技术产出的蛋白质似乎可保证无限供应重组蛋白。然而，异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达仍然是蛋白生产的一个严重瓶颈。在大肠杆菌中克隆(clone)基因的过度表达可导致细胞内蛋白质不可溶凝集的形成，其在光学显微镜下清晰可见。一些与宿主细胞、生长条件和该特定蛋白质性质有关的参数都有可能会影响蛋白质的可溶性。因此，能够增强蛋白质表达且同时能简化纯化过程的新技术对于需要大规模产量的蛋白质非常重要。
发明内容
利用亲和性标签与目标蛋白融合可增加蛋白质表达量并提升蛋白质纯化效率，可克服低表达障碍。
本发明设计一肽片段以增加一目标融合蛋白之可溶性。该肽之氨基酸序列实例包括但不限于SEQ ID NO:1。
由台湾三棘鲎(Tachypleus tridentatus)血浆中分离所得之鲎细菌辨识凝集素(bacteria recognizing lectin,BRL)为一种脂多糖结合蛋白质。细菌辨识凝集素之氨基酸序列实例包括但不限于SEQ ID NO:2。
人类嗜酸性白血球核糖核酸酶(human eosinophil ribonuclease)属于核糖核酸酶A超家族，由嗜酸性白血球在发炎期间大量分泌。灵长类动物嗜酸性白血球核糖核酸酶序列系取自NCBI数据库并与人类的嗜酸性白血球核糖核酸酶比对(图4)。人类嗜酸性白血球核糖核酸酶与灵长类动物嗜酸性白血球核糖核酸酶有高度相似(序列相同度高于86％)。人类嗜酸性白血球核糖核酸酶系由133个氨基酸组成，其等电点(isoelectricpoint)为10.8。人类嗜酸性白血球核糖核酸酶之氨基酸序列实例包括但不限于SEQ ID NO:9。
本发明已在大肠杆菌表达系统中创造一种新颖重组蛋白：重组细菌辨识凝集素(rBRL)，其包含氨基端39个氨基酸之肽片段及羟基端128个氨基酸之细菌辨识凝集素，例如SEQ ID NO:3。在SEQ ID NO:3中第1个氨基酸(M)及第41到第42个氨基酸(EF)是从pET23a载体获得之残基且可于使用不同载体时被替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。此外，在SEQ ID NO:3末端的6个残基(HHHHHH)可作用为纯化标签且可以任何具相似功能的其它序列将其替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。根据以上所述，应注意到本发明也提供一种由氨基酸序列SEQ IDNO:4组成之重组细菌辨识凝集素。
本发明也已在大肠杆菌表达系统中创造出一种新颖重组蛋白：重组嗜酸性白血球核糖核酸酶(reRNase)，其包含氨基端39个氨基酸之肽片段及羟基端133个氨基酸之人类嗜酸性白血球核糖核酸酶，例如SEQ ID NO:10。在SEQ ID NO:10中第1个氨基酸(M)及第41到第42个氨基酸(EF)是从pET23a载体中获得之残基且可于使用不同载体时被替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。此外，在SEQ ID NO:10末端6个残基(HHHHHH)可作用为纯化标签且可以任何具相似功能的其它序列将其替换，甚至于本发明之一实施方案中可不存在。根据以上所述，应注意到本发明也提供一种由氨基酸序列SEQ ID NO:11所组成之重组嗜酸性白血球核糖核酸酶。
本领域技术人员将了解到，任何以上氨基酸序列具相似功能的突变体都包含在本发明之范畴中。
添加人工肽SEQ ID NO:1可成功增加细菌辨识凝集素或嗜酸性白血球核糖核酸酶的表达并简化纯化步骤。
除非另外特别加以定义，于此叙述中所用的名词将具有本领域技术人员可了解之普通且常见之含意。
因此，本发明提供一种由SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列组成之肽片段。本发明亦提供一种使用由SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列组成之肽以增加目标蛋白质表达量的方法，包含(a)融合该肽与目标蛋白质以形成一重组蛋白；及(b)藉由一表达宿主生产该重组蛋白。较佳地，该目标蛋白质为糖类结合蛋白；更佳地，该目标蛋白质为脊椎动物血浆凝集素或脊椎动物核糖核酸酶；再更佳地，该目标蛋白质为细菌辨识凝集素或灵长类动物的嗜酸性白血球核糖核酸酶；再更佳地，该目标蛋白质为人类嗜酸性白血球核糖核酸酶。在一实施例中，该表达宿主为细菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳类动物细胞；更佳地，该细菌系大肠杆菌。该方法不仅简化目标蛋白质的纯化步骤，更在融合该肽至目标蛋白质后保留目标蛋白质的生物活性。
附图说明
图1显示重组细菌辨识凝集素(rBRL)纯化及特性判定。
以0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于16℃培养16小时后，离心收集含有重组细菌辨识凝集素的细菌溶解物上清液，并置于镍离子固定化亲和性层析管柱加以纯化。将每一样品之等分试样以15％(w/v)之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
M道：分子量标记物；N道：未经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之大肠杆菌细菌溶解物；I道：经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之大肠杆菌细菌溶解物；P道：细菌均质化后不可溶之沉淀物；S道：细菌均质化后之上清液；F道：纯化后流出之上清液；W1道：含20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、200mM氯化钠、5mM咪唑清洗管柱之流出夜；W2道：含20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、50mM咪唑清洗管柱之流出液；E道：含20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、300mM咪唑洗提的纯化蛋白质；C道：浓缩后的纯化蛋白质。
图2显示重组细菌辨识凝集素(N7)及重组细菌辨识凝集素(C7)的少量表达。
将0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入培养物并于16℃培养16小时以诱导(A)重组细菌辨识凝集素(N7)及(B)重组细菌辨识凝集素(C7)的表达。以15％(w/v)之SDS-PAGE将每一样品之等分试样分离并以考马思亮蓝(Coomassie blue)染色。
M道：分子量标记物；N道：未经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之大肠杆菌细菌溶解物；I道：经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之大肠杆菌细菌溶解物；P道：细菌均质化后不可溶之沉淀物；S道：细菌均质化后之上清液。
图3显示重组人类嗜酸性白血球核糖核酸酶(reRNase)的纯化及特性判定。
以0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于16℃培养16小时后，经由离心收集含有重组人类嗜酸性白血球核糖核酸酶的细胞溶解物上清液并置于肝素(Heparin)结合层析管柱纯化。将每一样品之等分试样以15％(w/v)之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以分析。
图3A中M道：分子量标记物；N道：未经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之大肠杆菌细菌溶解物；I道：经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之大肠杆菌细菌溶解物；P道：细菌均质化后不可溶之沉淀物；S道：细菌均质化后之上清液；F道：纯化后流出之上清液；W道：含10mM磷酸钠缓冲液、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)清洗管柱之流出夜；E1～E4道：含10mM磷酸钠缓冲液、1mM EDTA、0-2M氯化钠洗提纯化蛋白质。
图3B显示RNase3少量表达结果。在没有人工肽的情况，重组人类嗜酸性白血球核糖核酸酶经0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于16℃诱导16小时后主要存在于不可溶之沉淀物。
图4显示来自不同灵长类六种成熟嗜酸性白血球核糖核酸酶序列的一级序列比对，分别来自智人(Homo spaiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、大猩猩(Gorilla gorilla)、长尾猕猴(Macaca fascicularis)、猪尾猕猴(Macacanemestrina)及红毛猩猩(Pongo pygmaeus)。
灵长类动物嗜酸性白血球核糖核酸酶序列系取自NCBI数据库。使用Clustal X2进行序列比对。完全保留氨基酸以星号(*)表示，高度相似氨基酸以冒号(：)表示，低度相似氨基酸则以点(.)表示。eRNase_HUMAN意指人类嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO:9)；eRNase_PANTR意指黑猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO:14)；eRNase_GORGO意指大猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO:15)；eRNase_MACFA意指长尾猕猴嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO:16)；eRNase_MACNE意指猪尾猕猴嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO:17)；eRNase_PONPY则意指红毛猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO:18)。
具体实施方式
本发明可能以不同的形式实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例1：
材料与方法
试剂
使用大肠杆菌Top10F’(Invitrogen)来建立载体并操作DNA，使用大肠杆菌表达型Rosetta(DE3)(Stratagene)、购于Novagen之pET23a载体表达蛋白质。所有其余缓冲液及试剂均为最高之商业纯度。
蛋白质表达及纯化
用引物5’NdeI-ANP(SEQ ID NO:5)及3’EcoRI-ANP(SEQ ID NO:6)以聚合酶链锁反应(PCR)扩增编码SEQ ID NO:1之DNA片段。编码重组细菌辨识凝集素(SEQ ID NO:2)之DNA片段系用来自三棘鲎RNA所反转录之cDNA以聚合酶链锁反应扩增并使用引物5’EcoRI-BRL(SEQ IDNO:7)及3’NotI-BRL-6His(SEQ ID NO:8)。将两种纯化过之聚合酶链锁反应产物分别以NdeΙ/EcoRI及EcoRI/NotΙ限制酶切，并接上用相同限制酶处理过的pET23a载体。
确定该重组质粒序列后，将其转化至大肠杆菌Top10F’并以含100μg/ml胺苄青霉素(Ampicillin)的琼脂平板筛选。将筛选盘上所挑起的单一菌落置于含有相同浓度抗生素的5毫升LB(Luria-Bertani)培养液(1％胰化蛋白、0.5％酵母菌提取物及0.5％氯化钠)在37℃使其生长一夜以备提取质粒。再将提取出的质粒转化至大肠杆菌表达型Rosetta(DE3)，并以含100μg/ml胺苄青霉素的琼脂平板筛选。将单一菌落挑起并置于1公升之LB培养液中在37℃使其生长直至600nm波长处的吸光值(OD600)达到0.4至0.6。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至最终浓度0.1mM并于16℃培养16小时诱导蛋白质表达。在4℃以4000x g离心10分钟收集细胞，并以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次。接着，使细胞沉淀物悬浮于50mL添加有蛋白酶抑制剂(1mM苯甲基磺酰氟(PMSF))的50mL平衡缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、5mM咪唑、pH值为7.4)并于每平方英寸15000磅之压力下通过细胞均质机(cellhomogenizer)3次使其破碎。在4℃以16000xg离心30分钟使细菌溶解物分成上清液及沉淀物。用Ni SepharoseTM6Fast Flow(GE healthcare)层析管柱将上清液纯化。先用平衡缓冲液将管柱预先平衡并于加载样本，结束时以50mL平衡缓冲液(W1)及50mL清洗缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、50mM咪唑、pH值为7.4)(W2)清洗。用洗提缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、300mM咪唑、pH值为7.4)将管柱上之目标蛋白质洗脱及回收。最后将洗脱之重组细菌辨识凝集素浓缩并将缓冲液换成Tris缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、200mM氯化钠、pH值为7.4)。
结果
重组细菌辨识凝集素的表达与纯化
重组细菌辨识凝集素系由氨基端的人工肽及羟基端的三棘鲎所衍生之鲎细菌辨识凝集素所组成。编码人工肽及细菌辨识凝集素之DNA片段个别连接至pET23a载体且该重组质粒系被转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)以表达蛋白质。自1公升之培养液中，可使用镍离子固定化亲和性层析管柱获得约6mg纯化之重组细菌辨识凝集素，其回收率为80.6％(图1)。已达到产量比嗜甲醇酵母菌所生产之BRL-6His高5倍之重组细菌辨识凝集素，表示融合于细菌辨识凝集素氨基端之肽片段成功促进重组细菌辨识凝集素生产并分离。为了进一步探究该肽在表达细菌辨识凝集素中的重要性，由该肽序列中最前面7个氨基酸组成较短肽及由该肽中最后面7个氨基酸组成较短肽被分别融合在细菌辨识凝集素的氨基端及羟基端(分别为rBRL(N7)及rBRL(C7))。表达状态显示与该2个肽融合之细菌辨识凝集素均被表达于包涵体(inclusion body)部分内，显示全长之该肽片段在表达重组细菌辨识凝集素中扮演重要角色(图2A及图2B，P道)。
实施例2：
材料与方法
试剂
使用大肠杆菌Top10F’(Invitrogen)建立载体并操作DNA，使用大肠杆菌表达型Rosetta(DE3)(Stratagene)、购于Novagen之pET23a载体表达蛋白质。所有其余缓冲液及试剂均为最高之商业纯度。
蛋白质表达及纯化
用引物5’NdeI-ANP(SEQ ID NO:5)及3’EcoRI-ANP(SEQ ID NO:6)以聚合酶链锁反应(PCR)将编码SEQ ID NO:1之DNA片段扩增。编码人类嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO:9)之DNA片段系用来自气喘病患RNA所反转录之cDNA扩增。使用PCR引物5’EcoRI-RNase(SEQ IDNO:12)及3’BamHI-RNase-6His(SEQ ID NO:13)扩增人类嗜酸性白血球核糖核酸酶。将编码SEQ ID NO:1及人类嗜酸性白血球核糖核酸酶之聚合酶链锁反应产物分别用NdeΙ/EcoRI及EcoRI/BamHI限制酶切，并接上用相同限制酶处理过的pET23a。
以测序法确定该重组质粒，接着将其转化至大肠杆菌Top10F’并以含100μg/ml胺苄青霉素(Ampicillin)的琼脂平板筛选。将筛选盘上所挑起的单一菌落置于含有相同浓度抗生素的5毫升LB(Luria-Bertani)培养液(1％胰化蛋白、0.5％酵母菌提取物及0.5％氯化钠)中在37℃使其生长一夜以备提取质粒。再将提取出的质粒转化至大肠杆菌表达型Rosetta(DE3)并以含100μg/ml胺苄青霉素的琼脂平板筛选。将单一菌落挑起并置于1公升之LB培养液中在37℃使其生长直到600nm波长处的吸光值(OD600)达到0.4至0.6。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其最终浓度为0.1mM并于16℃培养16小时诱导蛋白质表达。在4℃以4000xg离心10分钟以收集细胞，并以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次。接着，使细胞沉淀物悬浮于添加有蛋白酶抑制剂(1mM苯甲基磺酰氟(PMSF))的缓冲液A(10mM磷酸钠缓冲液、1mM EDTA、pH值为7.0)并于每平方英寸15000磅之压力下通过细胞均质机5次以将其破碎。均质后，将该细菌溶解物在4℃以16000xg离心30分钟移除细胞碎片。将上清液中的蛋白以每分钟2mL的流速装载入FPLC系统(GE Health)中5mL HiTrap Heparin HP管柱。以缓冲液A清洗直到在280nm波长处的吸光值(OD280)达到基线。接着将蛋白质以线性NaCl浓度梯度(0–2M NaCl)洗提。将每一样品以15％(w/v)之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以分析。
结果
重组嗜酸性白血球核糖核酸酶的表达与纯化
重组嗜酸性白血球核糖核酸酶系由氨基端人工肽及羟基端人类嗜酸性白血球核糖核酸酶所组成。编码人工肽及人类嗜酸性白血球核糖核酸酶之DNA片段个别连接至pET23a载体且该重组质粒系被转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达蛋白质。结果显示预期分子量为20.5kDa的重组嗜酸性白血球核糖核酸酶成功于大肠杆菌BL21Rosetta(DE3)表达，且大部分目标蛋白质系存在于上清液分层中(图3A，S道)。接着将上清液分层中可溶性重组嗜酸性白血球核糖核酸酶以FPLC系统的HiTrap Heparin HP管柱纯化。图3A(E1道及E2道)显示重组嗜酸性白血球核糖核酸酶可以透过NaCl梯度成功洗脱。另一方面，未融合肽片段的人类嗜酸性白血球核糖核酸酶的表达(图3B)主要存在于包涵体(沉淀部分)内，如同前案中所述。
本领域技术人员能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到之结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中之肽、重组蛋白、其制造程序与方法及其用途乃较佳实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。本领域技术人员将会想到其中可修改之处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在申请专利范围中界定。
本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何熟习此技艺者能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明之精神及范围。
说明书中提及之所有专利及出版品，都以和发明有关领域之一般技艺为准。所有专利和出版品都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出纳入参考。
在此所适当地举例说明之发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书之描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明之特点或其部份之名词及表达，但需认清的是，在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明之申请专利范围内。

Claims (10)

1.一种由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的肽片段。
2.一种使用如权利要求1所述的肽以增加目标蛋白质表达量的方法，包含(a)融合所述肽与目标蛋白质以形成重组蛋白；及(b)通过表达宿主生产所述重组蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述目标蛋白质为糖类结合蛋白。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述目标蛋白质为脊椎动物血浆凝集素或脊椎动物核糖核酸酶。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述目标蛋白质为细菌辨识凝集素或灵长类动物嗜酸性白血球核糖核酸酶。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述目标蛋白质为人类嗜酸性白血球核糖核酸酶。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述表达宿主为细菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳类动物细胞。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌。
9.如权利要求2所述的方法，其进一步简化所述目标蛋白质的纯化步骤。
10.如权利要求2项所述的方法，其在融合所述肽至所述目标蛋白质后保留所述目标蛋白质的活性。
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