TWI531578B - 提高蛋白質可溶性之胜肽及其用途 - Google Patents

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Description

提高蛋白質可溶性之胜肽及其用途
本發明係關於一人工胜肽及其用途。
大部份具有潛在臨床或工業價值的蛋白質之供給往往受限於其低自然可得性。隨著現代基因體學、蛋白質體學和生物資訊學的進步，使用重組技術產出的蛋白質似乎可保證無限供應重組蛋白。然而，異源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表現仍然是蛋白生產的一個嚴重瓶頸。在大腸桿菌中選殖(clone)基因的過度表現可導致細胞內蛋白質不可溶凝集的形成，其在光學顯微鏡下清晰可見。一些與宿主細胞、生長條件和該特定蛋白質性質有關的參數都有可能會影響蛋白質的可溶性。因此，能夠增強蛋白質表現且同時能簡化純化過程的新技術對於需要大規模產量的蛋白質非常重要。
利用親和性標籤與目標蛋白融合可增加蛋白質表現量並提升蛋白質純 化效率，可克服低表現障礙。
本發明設計一胜肽片段以增加一目標融合蛋白之可溶性。該胜肽之胺基酸序列實例包括但不限於SEQ ID NO：1。
由台灣三棘鱟(Tachypleus tridentatus)血漿中分離所得之鱟細菌辨識凝集素(bacteria recognizing lectin,BRL)為一種脂多醣結合蛋白質。細菌辨識凝集素之胺基酸序列實例包括但不限於SEQ ID NO：2。
人類嗜酸性白血球核糖核酸酶(human eosinophil ribonuclease)屬於核糖核酸酶A超家族，由嗜酸性白血球在發炎期間大量分泌。靈長類動物嗜酸性白血球核糖核酸酶序列係取自NCBI資料庫並與人類的嗜酸性白血球核糖核酸酶比對(圖4)。人類嗜酸性白血球核糖核酸酶與靈長類動物嗜酸性白血球核糖核酸酶有高度相似(序列相同度高於86%)。人類嗜酸性白血球核糖核酸酶係由133個胺基酸組成，其等電點(isoelectricpoint)為10.8。人類嗜酸性白血球核糖核酸酶之胺基酸序列實例包括但不限於SEQ ID NO：9。
本發明已在大腸桿菌表現系統中創造一種新穎重組蛋白：重組細菌辨識凝集素(rBRL)，其包含胺基端39個胺基酸之胜肽片段及羥基端128個胺基酸之細菌辨識凝集素，例如SEQ ID NO：3。在SEQ ID NO：3中第1個胺基酸(M)及第41到第42個胺基酸(EF)是從pET23a載體獲得之殘基且可於使用不同載體時被替換，甚至於本發明之一態樣中可不存在。此外，在SEQ ID NO：3末端的6個殘基(HHHHHH)可作用為純化標籤且可以任何具相似功能的其他序列將其替換，甚至於本發明之一態樣中可不存在。根據以 上所述，應注意到本發明也提供一種由胺基酸序列SEQ ID NO：4組成之重組細菌辨識凝集素。
本發明也已在大腸桿菌表現系統中創造出一種新穎重組蛋白：重組嗜酸性白血球核糖核酸酶(reRNase)，其包含胺基端39個胺基酸之胜肽片段及羥基端133個胺基酸之人類嗜酸性白血球核糖核酸酶，例如SEQ ID NO：10。在SEQ ID NO：10中第1個胺基酸(M)及第41到第42個胺基酸(EF)是從pET23a載體中獲得之殘基且可於使用不同載體時被替換，甚至於本發明之一態樣中可不存在。此外，在SEQ ID NO：10末端6個殘基(HHHHHH)可作用為純化標籤且可以任何具相似功能的其他序列將其替換，甚至於本發明之一態樣中可不存在。根據以上所述，應注意到本發明也提供一種由胺基酸序列SEQ ID NO：11所組成之重組嗜酸性白血球核糖核酸酶。
熟諳此技藝者將瞭解到，任何以上胺基酸序列具相似功能的突變體都包含在本發明之範疇中。
添加人工胜肽SEQ ID NO：1可成功增加細菌辨識凝集素或嗜酸性白血球核糖核酸酶的表現並簡化純化步驟。
除非另外特別加以定義，於此敘述中所用的名詞將具有熟知此技藝者可瞭解之普通且常見之含意。
因此，本發明提供一種由SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列組成之胜肽片段。本發明亦提供一種使用由SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列組成之胜肽以增加目標蛋白質表現量的方法，包含(a)融合該胜肽與目標蛋白質以 形成一重組蛋白；及(b)藉由一表現宿主生產該重組蛋白。較佳地，該目標蛋白質為醣類結合蛋白；更佳地，該目標蛋白質為脊椎動物血漿凝集素或脊椎動物核糖核酸酶；再更佳地，該目標蛋白質為細菌辨識凝集素或靈長類動物的嗜酸性白血球核糖核酸酶；再更佳地，該目標蛋白質為人類嗜酸性白血球核糖核酸酶。在一實施例中，該表現宿主為細菌、酵母菌、昆蟲細胞或哺乳類動物細胞；更佳地，該細菌係大腸桿菌。該方法不僅簡化目標蛋白質的純化步驟，更在融合該胜肽至目標蛋白質後保留目標蛋白質的生物活性。
圖1顯示重組細菌辨識凝集素(rBRL)純化及特性判定。以0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)於16℃培養16小時後，離心收集含有重組細菌辨識凝集素的細菌溶解物上清液，並置於鎳離子固定化親和性層析管柱加以純化。將每一樣品之等分試樣以15%(w/v)之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。M道：分子量標記物；N道：未經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導之大腸桿菌細菌溶解物；I道：經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導之大腸桿菌細菌溶解物；P道：細菌均質化後不可溶之沉澱物；S道：細菌均質化後之上清液；F道：純化後流出之上清液；W1道：含20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、200mM氯化鈉、5mM咪唑清洗管柱之流出夜；W2道：含20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、50mM咪唑清洗管柱之流出液；E道：含20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、300mM咪唑洗提的純化蛋白質；C道：濃縮後的純 化蛋白質。
圖2顯示重組細菌辨識凝集素(N7)及重組細菌辨識凝集素(C7)的少量表現。將0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入培養物並於16℃培養16小時以誘導(A)重組細菌辨識凝集素(N7)及(B)重組細菌辨識凝集素(C7)的表現。以15%(w/v)之SDS-PAGE將每一樣品之等分試樣分離並以考馬思亮藍(Coomassie blue)染色。M道：分子量標記物；N道：未經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導之大腸桿菌細菌溶解物；I道：經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導之大腸桿菌細菌溶解物；P道：細菌均質化後不可溶之沉澱物；S道：細菌均質化後之上清液。
圖3顯示重組人類嗜酸性白血球核醣核酸酶(reRNase)的純化及特性判定。以0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷於16℃培養16小時後，經由離心收集含有重組人類嗜酸性白血球核醣核酸酶的細胞溶解物上清液並置於肝素(Heparin)鍵結層析管柱純化。將每一樣品之等分試樣以15%(w/v)之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加以分析。圖3A中M道：分子量標記物；N道：未經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導之大腸桿菌細菌溶解物；I道：經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導之大腸桿菌細菌溶解物；P道：細菌均質化後不可溶之沉澱物；S道：細菌均質化後之上清液；F道：純化後流出之上清液；W道：含10mM磷酸鈉緩衝液、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)清洗管柱之流出夜；E1~E4道：含10mM磷酸鈉緩衝液、1mM EDTA、0-2M氯化鈉洗提純化蛋白質。圖3B顯示RNase 3少量表現結果。在沒有人工胜肽的情況，重組人類嗜酸性白血球核醣核酸酶經0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳 糖苷於16℃誘導16小時後主要存在於不可溶之沉澱物。
圖4顯示來自不同靈長類六種成熟嗜酸性白血球核糖核酸酶序列的一級序列比對，分別來自智人(Homo spaiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、大猩猩(Gorilla gorilla)、長尾獼猴(Macaca fascicularis)、豬尾獼猴(Macaca nemestrina)及紅毛猩猩(Pongo pygmaeus)。靈長類動物嗜酸性白血球核糖核酸酶序列係取自NCBI資料庫。使用Clustal X2進行序列比對。完全保留胺基酸以星號(*)表示，高度相似胺基酸以冒號(：)表示，低度相似胺基酸則以點(.)表示。eRNase_HUMAN意指人類嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO：9)；eRNase_PANTR意指黑猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO：14)；eRNase_GORGO意指大猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO：15)；eRNase_MACFA意指長尾獼猴嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO：16)；eRNase_MACNE意指豬尾獼猴嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO：17)；eRNase_PONPY則意指紅毛猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO：18)。
本發明可能以不同的形式實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
實施例1： 材料與方法 試劑
使用大腸桿菌Top10F’(Invitrogen)來建立載體並操作DNA，使用大腸桿菌表現型Rosetta(DE3)(Stratagene)、購於Novagen之pET23a載體表現蛋白質。所有其餘緩衝液及試劑均為最高之商業純度。
蛋白質表現及純化
用引子5’NdeI-ANP(SEQ ID NO：5)及3’EcoRI-ANP(SEQ ID NO：6)以聚合酶鏈鎖反應(PCR)擴增編碼SEQ ID NO：1之DNA片段。編碼重組細菌辨識凝集素(SEQ ID NO：2)之DNA片段係用來自三棘鱟RNA所反轉錄之cDNA以聚合酶鏈鎖反應擴增並使用引子5’EcoRI-BRL(SEQ ID NO：7)及3’NotI-BRL-6His(SEQ IDNO：8)。將兩種純化過之聚合酶鏈鎖反應產物分別以NdeI/EcoRI及EcoRI/NotI限制酶切，並接上用相同限制酶處理過的pET23a載體。
確定該重組質體序列後，將其轉型至大腸桿菌Top10F’並以含100μg/ml胺苄青黴素(Ampicillin)的瓊脂平板篩選。將篩選盤上所挑起的單一菌落置於含有相同濃度抗生素的5毫升LB(Luria-Bertani)培養液(1%胰化蛋白、0.5%酵母菌萃取物及0.5%氯化鈉)在37℃使其生長一夜以備萃取質體。再將萃取出的質體轉型至大腸桿菌表現型Rosetta(DE3)並以含100μg/ml胺苄青黴素的瓊脂平板篩選。將單一菌落挑起並置於1公升之LB培養液中在37℃使其生長直至600nm波長處的吸光值(OD600)達到0.4至0.6。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至最終濃度0.1mM並於16℃培養16小 時誘導蛋白質表現。在4℃以4000 x g離心10分鐘收集細胞，並以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗一次。接著，使細胞沉澱物懸浮於50mL添加有蛋白酶抑制劑(1mM苯甲基磺醯氟(PMSF))的50mL平衡緩衝液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、5mM咪唑、pH值為7.4)並於每平方英寸15000磅之壓力下通過細胞均質機(cell homogenizer)3次使其破碎。在4℃以16000xg離心30分鐘使細菌溶解物分成上清液及沉澱物。用Ni SepharoseTM 6 Fast Flow(GE healthcare)層析管柱將上清液純化。先用平衡緩衝液將管柱預先平衡並於載入樣本結束時以50mL平衡緩衝液(W1)及50mL清洗緩衝液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、50mM咪唑、pH值為7.4)(W2)清洗。用洗提緩衝液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、300mM咪唑、pH值為7.4)將管柱上之目標蛋白質洗脫及回收。最後將洗脫之重組細菌辨識凝集素濃縮並將緩衝液換成Tris緩衝液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、pH值為7.4)。
結果 重組細菌辨識凝集素的表現與純化
重組細菌辨識凝集素係由胺基端的人工胜肽及羥基端的三棘鱟所衍生之鱟細菌辨識凝集素所組成。編碼人工胜肽及細菌辨識凝集素之DNA片段個別連接至pET23a載體且該重組質體係被轉型至大腸桿菌Rosetta(DE3)以表現蛋白質。自1公升之培養液中，可使用鎳離子固定化親和性層析管 柱獲得約6mg純化之重組細菌辨識凝集素，其回收率為80.6%(圖1)。產量比嗜甲醇酵母菌所生產之BRL-6His高5倍之重組細菌辨識凝集素已達成，表示融合於細菌辨識凝集素胺基端之胜肽片段成功促進重組細菌辨識凝集素生產並分離。為了進一步探究該胜肽在表現細菌辨識凝集素中的重要性，由該胜肽序列中最前面7個胺基酸組成較短胜肽及由該胜肽中最後面7個胺基酸組成較短胜肽被分別融合在細菌辨識凝集素的胺基端及羥基端(分別為rBRL(N7)及rBRL(C7))。表現狀態顯示與該2個胜肽融合之細菌辨識凝集素均被表現於包涵體(inclusion body)部分內，顯示全長之該胜肽片段在表現重組細菌辨識凝集素中扮演重要角色(圖2A及圖2B，P道)。
實施例2： 材料與方法 試劑
使用大腸桿菌Top10F’(Invitrogen)建立載體並操作DNA，使用大腸桿菌表現型Rosetta(DE3)(Stratagene)、購於Novagen之pET23a載體表現蛋白質。所有其餘緩衝液及試劑均為最高之商業純度。
蛋白質表現及純化
用引子5’NdeI-ANP(SEQ ID NO：5)及3’EcoRI-ANP(SEQ ID NO：6)以聚合酶鏈鎖反應(PCR)將編碼SEQ ID NO：1之DNA片段擴增。編碼人類嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO：9)之DNA片段係用來自氣喘病 患RNA所反轉錄之cDNA擴增。使用PCR引子5’EcoRI-RNase(SEQ ID NO：12)及3’BamHI-RNase-6His(SEQ ID NO：13)擴增人類嗜酸性白血球核糖核酸酶。將編碼SEQ ID NO：1及人類嗜酸性白血球核糖核酸酶之聚合酶鏈鎖反應產物分別用NdeI/EcoRI及EcoRI/BamHI限制酶切，並接上用相同限制酶處理過的pET23a。
以定序法確定該重組質體，接著將其轉型至大腸桿菌Top10F’並以含100μg/ml胺苄青黴素(Ampicillin)的瓊脂平板篩選。將篩選盤上所挑起的單一菌落置於含有相同濃度抗生素的5毫升LB(Luria-Bertani)培養液(1%胰化蛋白、0.5%酵母菌萃取物及0.5%氯化鈉)中在37℃使其生長一夜以備萃取質體。再將萃取出的質體轉型至大腸桿菌表現型Rosetta(DE3)並以含100μg/ml胺苄青黴素的瓊脂平板篩選。將單一菌落挑起並置於1公升之LB培養液中在37℃使其生長直到600nm波長處的吸光值(OD600)達到0.4至0.6。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其最終濃度為0.1mM並於16℃培養16小時誘導蛋白質表現。在4℃以4000xg離心10分鐘以收集細胞，並以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗一次。接著，使細胞沉澱物懸浮於添加有蛋白酶抑制劑(1mM苯甲基磺醯氟(PMSF))的緩衝液A(10mM磷酸鈉緩衝液、1mM EDTA、pH值為7.0)並於每平方英寸15000磅之壓力下通過細胞均質機5次以將其破碎。均質後，將該細菌溶解物在4℃以16000xg離心30分鐘移除細胞碎片。將上清液中的蛋白以每分鐘2mL的流速裝載入FPLC系統(GE Health)中5mL HiTrap Heparin HP管柱。以緩衝液A清洗直到在280nm波長處的吸光值(OD280)達到基線。接著將蛋白質以線性NaCl濃度梯 度(0-2M NaCl)洗提。將每一樣品以15%(w/v)之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加以分析。
結果 重組嗜酸性白血球核糖核酸酶的表現與純化
重組嗜酸性白血球核糖核酸酶係由胺基端人工胜肽及羥基端人類嗜酸性白血球核糖核酸酶所組成。編碼人工胜肽及人類嗜酸性白血球核糖核酸酶之DNA片段個別連接至pET23a載體且該重組質體係被轉型至大腸桿菌Rosetta(DE3)中表現蛋白質。結果顯示預期分子量為20.5kDa的重組嗜酸性白血球核糖核酸酶成功於大腸桿菌BL21 Rosetta(DE3)表現，且大部分目標蛋白質係存在於上清液分層中(圖3A，S道)。接著將上清液分層中可溶性重組嗜酸性白血球核糖核酸酶以FPLC系統的HiTrap Heparin HP管柱純化。圖3A(E1道及E2道)顯示重組嗜酸性白血球核糖核酸酶可以透過NaCl梯度成功洗脫。另一方面，未融合胜肽片段的人類嗜酸性白血球核糖核酸酶的表現(圖3B)主要存在於包涵體(沉澱部分)內，如同前案中所述。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之胜肽、重組蛋白、其製造程序與方法及其用途乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠 製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
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<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 5
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子3' EcoRI-ANP。
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(27)
<400> 6
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子5' EcoRI-BRL。
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(29)
<400> 7
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子3' NotI-BRL-6His。
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 8
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(133)
<400> 9
<210> 10
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一種新穎重組蛋白reRNase，包含胺基端39個胺基酸之胜肽及羥基端133個胺基酸之人類嗜酸性白血球核醣核酸酶。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(181)
<400> 10
<210> 11
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 另一種reRNase。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(172)
<400> 11
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子5' EcoRI-Rnase。
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(27)
<400> 12
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子3' BamHI-RNase-6His。
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 13
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> 黑猩猩(Pan troglodytes)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(133)
<400> 14
<210> 15
<211> 133
<212> PRT
<213> 大猩猩(Gorilla gorilla)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(133)
<400> 15
<210> 16
<211> 133
<212> PRT
<213> 長尾獼猴(Macaca fascicularis)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(133)
<400> 16
<210> 17
<211> 133
<212> PRT
<213> 豬尾獼猴(Macaca nemestrina)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(133)
<400> 17
<210> 18
<211> 133
<212> PRT
<213> 紅毛猩猩(Pongo pygmaeus)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..(133)
<400> 18

Claims (10)

  1. 一種由SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列組成之胜肽片段。
  2. 一種使用如申請專利範圍第1項所述之胜肽以增加目標蛋白質可溶性的方法，包含(a)融合一編碼該胜肽之核酸與一編碼一目標蛋白質之核酸以形成一重組核酸；(b)將該重組核酸轉型(transform)至一表現宿主細胞中；及(c)於該表現宿主細胞中表現該重組核酸以形成一目標融合蛋白，其中該目標蛋白質的表現量會增加。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該目標蛋白質係醣類結合蛋白。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該目標蛋白質係脊椎動物血漿凝集素或脊椎動物核糖核酸酶。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該目標蛋白質係細菌辨識凝集素或靈長類動物嗜酸性白血球核糖核酸酶。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該目標蛋白質係人類嗜酸性白血球核糖核酸酶。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該表現宿主細胞為細菌、酵母菌、昆蟲細胞或哺乳類動物細胞。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該細菌係大腸桿菌。
  9. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其進一步簡化了目標蛋白質的純化步驟。
  10. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其在融合該胜肽至目標蛋白質後保留目標蛋白質的活性。
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