CN111440243B - 一种将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法，其特征在于，通过将编码信号肽、化学法切割位点和目的蛋白的基因构建到表达载体中，使得目的蛋白表达后定位到细胞的表面；在收集的细胞中加入含有切割试剂的缓冲液重悬，离心后的上清即为目的蛋白溶液。本申请的蛋白质简易纯化方法利用信号肽的定位功能，使重组蛋白在细胞内表达后分泌并定位到细胞的表面。并利用重组蛋白中间化学剪切位点的优势，只需在用于重悬细胞的缓冲液中加入切割试剂，经过离心就可以非常简便的获取高纯度的目的蛋白。解决了现有技术中纯化蛋白需要裂解细胞以及使用各种性质的层析柱才能获取目的蛋白的繁琐步骤，操作简单，大大节省时间和成本。

Description

一种将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法
技术领域
本申请属于蛋白分离与纯化领域，涉及一种利用将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白的方法。通过将编码信号肽、化学法切割位点和目的蛋白的融合基因构建到表达载体中，使得目的蛋白表达后定位到细胞的外膜。利用这种方法表达的重组蛋白，只需要在收集的细胞中加入含有切割试剂的缓冲液重悬，无需裂解细胞和经过色谱柱纯化，经过离心即可一步获取高纯度、高产量的目的蛋白。
背景技术
重组蛋白的表达系统可分为原核，哺乳动物，酵母和昆虫四类表达系统。重组蛋白在细胞中表达部位可分为细胞质中(胞内)、细胞周质(革兰氏阴性菌，如大肠杆菌)和细胞外。胞内表达是重组蛋白在各种系统中主要的表达形式，已经成功的应用在在工业和科学研究中。要研究某一个具体的蛋白质，首先就需要将这个蛋白从生物体分离纯化出来。但是由于细胞质中蛋白质本底表达较高和种类多，因此要从细胞裂解液的全部组分中分离目标蛋白，同时仍然保留蛋白的生物活性及化学完整性是一项艰巨而繁琐的任务。需要根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法来提高目标蛋白的纯度。
胞内的蛋白质纯化可分为粗分离和精细分离两个阶段。粗分离主要是根据蛋白质间的相似性将蛋白和细胞的非蛋白成分如细胞壁、RNA、DNA等分开。精细纯化阶段的目的是根据蛋白质之间的差异性，把目标蛋白与其他蛋白质分离开，常用的方法有凝胶层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等(
Figure BDA0002435427800000011
S，Nordlund P，Weigelt J，et al.Proteinproduction and purification.Nature Methods，2008，5(2)：135-146.)。由于胞内性质相似的蛋白很多，所以要获取纯度较高的蛋白质往往需要多种纯化方法联用，步骤繁琐，周期较长，成本较高。此外，由于大肠杆菌的细胞质环境呈现还原性，不利于二硫键的形成，导致蛋白不能准确折叠，降低蛋白活性(
Figure BDA0002435427800000012
F J M，Summers D K，Monteiro GA.Recombinant protein secretion in Escherichia coli.Biotechnology Advances，2005，23(3)：177-202.)。细胞质中的蛋白酶活性较高，会降解表达的目标蛋白质(Mergulhao F J M，Monteiro G A，Cabral J M S，et al.Design of bacterial vectorsystems for the production of recombinant proteins in Escherichiacoli.Journal of Microbiology and Biotechnology，2004，14(1)：1-14.)。
一个解决上述问题的办法是将目的蛋白定位于细胞周质或者胞外培养基。与胞内表达相比，这种分泌表达展现出几个优点(Liao Y D，Jeng JC，Wang C F，et al．Removalof N-terminal methionine from recombinant proteins by engineered E．colimethionine aminopeptidase.Protein Science，2004，13(7)：1802-1810；Shokri A，Sandén A，Larsson G Cell and process design for targeting of recombinant proteininto the culture medium of Escherichia coli.Applied Microbiology andBiotechnology，2003，60(6)：654-664；Makrides S C.Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.Microbiol.Mol.Biol.Rev.，1996，60(3)：512-538；
Figure BDA0002435427800000021
F J M，Summers D K，Monteiro G A.Recombinant proteinsecretion in Escherichia coli.Biotechnology Advances，2005，23(3)：177-202)。比如，分泌表达的蛋白质N端不含甲硫氨酸，与天然蛋白的一致，而甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性；革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)的周质中含有一系列的酶比如DsbA/B/C/D，可以提供氧化环境，促进含巯基蛋白的正确折叠，提高活性蛋白的产量；分泌表达还可以提高目标蛋白的溶解度，部分原因可能是周质和细胞外的蛋白含量比细胞质中的少；由于周质空间和胞外培养基中蛋白酶的水平较低，通过分泌表达的蛋白会提供其稳定性；通过分泌表达可以降低宿主细胞中蛋白质的污染，简化下游的分离和纯化步骤。
尽管分泌表达具有许多优势，但是使重组蛋白高效分泌表达还面临许多问题(
Figure BDA0002435427800000022
F J M，Summers D K，Monteiro G A.Recombinant protein secretion inEscherichia coli.Biotechnology Advances，2005，23(3)：177-202；Choi J H，Lee SY.Secretory and extracellular production of recombinant proteins usingEscherichia coli.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64(5)：625-635.)。首先，许多大分子量蛋白和复杂蛋白不能有效的分泌；其次，需要经过反复实验，选择合适的信号肽和宿主细胞才能有效分泌重组蛋白。有时还需要优化培养条件以及共表达跨膜转运蛋白；最后，对于革兰氏阴性菌来说，分泌到周质的重组蛋白还需要定向释放技术，只破坏大肠杆菌的外膜而不破坏内膜。周质中还有一定量的宿主蛋白，后续仍然需要分离纯化。此外，分泌到胞外培养基的蛋白相当于稀释，需要重新浓缩或者分离纯化才能获取目的蛋白。
发明内容
针对现有技术中重组蛋白在细胞中表达后需要复杂的纯化步骤才能获取较纯的蛋白质的缺陷，本申请所要解决的技术问题是提供一种无需裂解细胞和经过色谱柱纯化的快速获取高纯度目的蛋白的方法，该方法是将编码细胞膜锚定蛋白(信号肽)、化学法剪切位点和目的蛋白的基因进行融合表达，使融合蛋白定位到细胞的表面。利用化学剪切方法对收集的细胞进行剪切，经过离心即可一步获取切割下来的目的蛋白，纯度高，产量高，操作简单，成本低。
为解决上述技术问题，本申请采用的技术方案如下：
一种目的蛋白融合表达的方式，在细胞中表达一段编码含有信号肽、化学剪切位点和目的蛋白基因的融合蛋白。本申请利用信号肽分泌的功能，将融合蛋白定位到细胞的表面。将收集的细胞用缓冲液重悬，并加入对应的化学切割试剂，将目的的蛋白从细胞表面切割下来。经过离心即可将切割后的细胞和目的蛋白分离，获取目的蛋白。
本申请所述的细胞包括细菌、哺乳动物细胞、真菌和昆虫细胞等。
本申请所述的信号肽包括PelB、OmpA、OmpF、OmpC、OmpT、Lpp、StII、PhoA、PhoE、MalE、LamB、LTB、FimH、SPA、RsaA、Endoxylanase、Ice nucleation protein、α-Agglutinin和IgA β-domain等的一种或者几种组合而成。
本申请所述的化学切割位点包括溴化氰切割位点(序列为-M-)，Pd2+切割位点(AcHis-X-)，Cu2+切割位点(-SH-和-TH-)，Pt2+切割位点(-M-X-)，(1，4-二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇(β-ME)或半胱氨酸)切割位点，Ni2+切割位点(-XSXHZ-，比如-S/T-XHK，-SRHWAP-，-GSHHW-，-GSHTDLP-和-GSRHW-等)。
所述信号肽为lpp-ompa的融合信号肽；作为优选，其中lpp使用的是N端1-9位氨基酸，序列为MKATKLVLG。OmpA使用的是45-159位氨基酸，序列如SEQ ID NO.5所示。
本申请的化学切割位点为Ni2+切割位点；更优选，切割位点的序列为-GSHHW-。
本申请的编码融合蛋白的基因基因载体可以为任何蛋白表达的通用载体，比如pet21a，pet28a，pet30a等。作为优选，将信号肽和化学剪切位点融合基因构建到pet30a质粒的NdeI和EcoRI位点中，将目的蛋白的基因通过双酶切或者Gibson重组连接到上述质粒中。这些技术均可以通过委托第三方服务公司完成。
上述含有重组蛋白基因的质粒通过热激法转化到大肠杆菌感受态细胞中。37℃扩大培养后，使用IPTG在30℃进行诱导表达5h。离心收集表达目的蛋白后的细菌，用液氮速冻放在零下80℃冰箱备用。
所述用于重悬细胞的缓冲液为正常缓冲液，比如PBS、Tris-HCl、CHES、HEPES、和MOPS等，可以通过商业购买，主要含有一定弱酸/弱碱及其盐，NaCl。作为优选，缓冲液成分为CHES，丙酮肟和NaCl。其中pH范围为8.0-9.0，NaCl浓度为0-1M。
使用上述缓冲液重悬收集的细胞，并加入一定浓度的Ni2+在室温下切割。作为优选Ni2+浓度为0.5-2mM，切割温度为25℃，切割时间为18h。切完后的混合液经过离心，收集上清即可获取高纯度的目的蛋白。
与现有技术相比，本申请的优势在于：
1)本申请将信号肽，化学切割位点和目的蛋白基因融合表达，使融合蛋白能够分泌并定位到细胞表面。将收集的细胞重悬，只需要加入切割试剂(比如溴化氰、Pd2+、Cu2+和Ni2+等)，经过离心即可一步获取高纯度、高产量的目的蛋白。
2)本申请的蛋白质简易纯化方法利用信号肽的定位功能，使重组蛋白在细胞内表达后分泌并定位到细胞的表面。并利用重组蛋白中间化学剪切位点的优势，只需在用于重悬细胞的缓冲液中加入切割试剂，经过离心就可以非常简便的获取高纯度的目的蛋白。解决了现有技术中纯化蛋白需要裂解细胞以及使用各种性质的层析柱才能获取目的蛋白的繁琐步骤，操作简单，大大节省时间和成本。
附图说明
图1是信号肽、化学切割位点和目的蛋白基因的融合方式示意图；
图2是表达重组蛋白Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1和6His-GB1的大肠杆菌细胞膜和细胞质的SDS-PAGE图；
图3是表达重组蛋白Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP和6His-SFGFP的大肠杆菌细胞膜和细胞质的SDS-PAGE图；
图4是本申请实施例Ni2+纯化表达重组蛋白Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1大肠杆菌的SDS-PAGE图；
图5是本申请实施例Ni2+纯化表达重组蛋白6His-GB1大肠杆菌(对照组)的SDS-PAGE图；
图6是使用本申请的方法纯化GB1和使用镍亲和柱纯化6His-GB1对比的SDS-PAGE图；
图7是本申请实施例中纯化得到GB1的MALDI-TOF-MS图；
图8是本申请实施例中镍亲和柱纯化得到6His-GB1的MALDI-TOF-MS图；
图9是本申请实施例中纯化得到的GB1中Ni2+处理前后的含量对比结果图；
图10是本申请实施例Ni2+纯化表达重组蛋白Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP大肠杆菌的SDS-PAGE图；
图11是本申请实施例Ni2+纯化表达重组蛋白6His-SFGFP大肠杆菌(对照组)的SDS-PAGE图；
图12是使用本申请的方法纯化SFGFP和使用镍亲和柱纯化6His-SFGFP对比的SDS-PAGE图；
图13是本申请实施例中纯化得到SFGFP的MALDI-TOF-MS图；
图14是本申请实施例中镍亲和柱纯化得到6His-SFGFP的MALDI-TOF-MS图；
图15是表达重组蛋白的大肠杆菌在切割前后溶液颜色的对比图；
图16是表达重组蛋白的大肠杆菌在切割前后共聚焦显微镜图；
图17是本申请方法纯化得到的SFGFP和镍柱纯化得到的6His-SFGFP三维荧光光谱对比图；
图18是本申请方法纯化得到的SFGFP和镍柱纯化得到的6His-SFGFP量子产率对比结果图；
图19是本申请方法纯化得到的SFGFP和镍柱纯化得到的6His-SFGFP荧光寿命对比结果图；
图20是本申请实施例中在不同pH条件下纯化表达Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1的SDS-PAGE图；
图21是本申请实施例中在不同盐离子浓度和不同切割试剂浓度条件下纯化表达Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1的SDS-PAGE图；
图22是本申请实施例中分别在还原剂、4度和不同缓冲液中纯化表达Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1的SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例阐述本申请中的将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法。通过使用本方法在革兰氏阴性菌大肠杆菌中纯化GB1和SFGFP来说明本申请的可行性，所给出的实例只用于说明目的，并不能限制本申请的范围。
实施例1：Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1融合蛋白和Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP融合蛋白的构建和表达
本实施例所用的融合蛋白的方式如图1所示，将通过基因全合成(生工生物工程股份有限公司)获得的编码Lpp(1-9)-OmpA(45-159)-(SNAC-tag)-GB1(序列如SEQ ID NO.1所示)的pet30a质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，使用0.5mM IPTG在30℃下诱导表达5h，使用高速离心机收菌。并储存在-80℃待用。通过基因全合成(生工生物工程股份有限公司)获得编码Lpp(1-9)-OmpA(45-159)-(SNAC-tag)-SFGFP(序列如SEQ ID NO.2所示)的pet30a质粒采用同样方式表达，收菌。
实施例2：6His-GB1融合蛋白和6His-SFGFP融合蛋白的构建、表达和纯化
将通过基因全合成(生工生物工程股份有限公司)获得的编码6His-GB1(序列如SEQ ID NO.3所示)的pet28a质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，使用0.5mM IPTG在30℃下诱导表达5h，使用高速离心机收菌。并储存在-80℃待用。通过基因全合成(生工生物工程股份有限公司)获得编码6His-SFGFP(序列如SEQ ID NO.4所示)的pet28a质粒采用同样方式获取并表达，收菌。
实施例3：表达融合蛋白细菌的细胞膜和细胞质成分鉴定
为了表征信号肽是否能把目的蛋白定位到细胞膜上，需要对表达重组蛋白细菌的细胞膜和细胞质成分通过SDS-PAGE胶鉴定。使用10mM PBS(pH 7.4)重悬细菌，然后使用超声裂解细菌。12000转高速离心分离上清和沉淀，沉淀使用TDSET缓冲液(1％Triton X-100，0.2％sodium deoxycholate，0.1％SDS，10mM tetrasodium EDTA，and 10mM Tris/HCl)洗脱两次。使用SDS-PAGE对沉淀和上清进行鉴定。图2中的第2泳道为表达Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1细菌的上清，第3泳道为Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1细菌的细胞膜成分，第4泳道为表达6His-GB1细菌的上清，第5泳道为表达6His-GB1细菌的细胞膜成分。可以看出Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1在细胞膜的成分中，而6His-GB1在上清中。同样的道理，图3中第2泳道为表达Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP细菌的上清，第3泳道为Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP细菌的细胞膜成分，第4泳道为表达6His-SFGFP细菌的上清，第5泳道为表达6His-SFGFP细菌的细胞膜成分。可以看出Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP在细胞膜的成分中，而6His-SFGFP在上清中。说明信号肽可以把重组蛋白定位到细菌细胞膜上。
实施例4：使用本申请的方法纯化GB1和使用纯化仪利用Ni-NTA层析柱纯化6His-GB1
1.使用50mL缓冲液重悬0.1L菌液收集的菌(实施例1表达的Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-GB1)(缓冲液为：100mM CHES，pH 8.6，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl)，加入Ni2+(终浓度为1mM)后。于混匀仪上在室温下切割18h，然后使用离心机6000rpm离心5分钟，收取上清即为目的蛋白GB1。如图4所示，第2泳道为切割之前的全菌液，第3泳道为切割18h后的全菌液，第4泳道为切割后的沉淀，第5泳道为切割后的上清，纯度为95％以上。采用上述同样的方法对表达6His-GB1细菌进行纯化，结果如图5中所示。第2泳道为切割之前的全菌液，第3泳道为切割18h后的全菌液，第4泳道为切割后的沉淀，第5泳道为切割后的上清，可以看出没有GB1蛋白被切割下来。这说明6His-GB1因为缺少信号肽，所以只能在细胞质中，无法被切割。而将GB1定位到细菌表明以后，使用本申请的方法，利用Ni2+可以把GB1切割下来。
2.使用30mL缓冲液重悬并超声裂解1L菌液收集的菌(实施例2表达6His-GB1)(缓冲液为10mM Tris-HCl，pH 7.4，100mM NaCl，0.1mM PMSF，10％glycerol)，使用高速离心机12000转离心裂解液，使用0.45μm的滤膜过滤上清，然后上样到5mL的镍柱上，10％缓冲液B平衡后，使用10％-100％缓冲液B洗脱5个柱体积。收集洗脱下来的样品即为6His-GB1。这里使用的缓冲液A为：10mM Tris-HCl，100mM NaCl，缓冲液B为：缓冲液A+500mM imidazole。图6中显示了利用本申请的方法纯化的GB1和利用Ni柱纯化的6His-GB1纯度对比，可以看出本申请的方法纯化得到的GB1纯度大于95％，与Ni柱纯化的6His-GB1纯度相当。
使用MALDI-TOF mass对纯化的GB1和6His-GB1分子量进行测定(图7和图8)，测定的蛋白分子量均与理论预测一致。使用Bradford方法对两种纯化方法获取的蛋白量进行测定，本申请的方法获取的GB1总量为99mg/L，而使用Ni柱纯化获取的6His-GB1只有14.28mg/L，说明本申请的方法获取的目的蛋白的量要远远大于使用层析柱获取的蛋白质量。此外，与生物酶切不同的是，本申请的方法不需要后续除去切割的试剂。如有特殊需要，图9中显示可以使用反复浓缩稀释或者脱盐柱将98％以上Ni2+除去。
实施例5：使用本申请的方法纯化SFGFP和使用纯化仪利用Ni-NTA层析柱纯化6His-SFGFP
1.使用50mL缓冲液重悬0.1L菌液收集的菌(实施例1表达Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP)(缓冲液为：100mM CHES，pH8.6，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl)，加入Ni2+(终浓度为1mM)后。于混匀仪上在室温下切割18h，然后使用离心机6000rpm离心5分钟，收取上清即为目的蛋白SFGFP。如图10所示，第2泳道为切割之前的全菌液，第3泳道为切割18h后的全菌液，第4泳道为切割后的沉淀，第5泳道为切割后的上清，纯度为95％以上。采用上述同样的方法对表达6His-SFGFP细菌进行纯化，结果如图11中所示。第2泳道为切割之前的全菌液，第3泳道为切割18h后的全菌液，第4泳道为切割后的沉淀，第5泳道为切割后的上清，可以看出没有SFGFP蛋白被切割下来。这说明6His-SFGFP因为缺少信号肽，所以只能在细胞质中，无法被切割。而将SFGFP定位到细菌表明以后，使用本申请的方法，利用Ni2+可以把SFGFP切割下来。
2.使用30mL缓冲液重悬并超声裂解1升菌液收集的菌(实施例2表达6His-SFGFP)(缓冲液为10mM Tris-HCl，pH 7.4，100mM NaCl，0.1mM PMSF，10％glycerol)，使用高速离心机12000转离心裂解液，使用0.45μm的滤膜过滤上清，然后上样到5mL的镍柱上，10％缓冲液B平衡后，使用10％-100％缓冲液B洗脱5个柱体积。收集洗脱下来的样品即为6His-GB1。这里使用的缓冲液A为：10mM Tris-HCl，100mM NaCl，缓冲液B为：缓冲液A+500mMimidazole。图12中显示了利用本申请的方法纯化的SFGFP和利用Ni柱纯化的6His-SFGFP纯度对比，可以看出本申请的方法纯化得到的SFGFP纯度大于95％，比Ni柱纯化得到的6His-SFGFP纯度相当。
使用MALDI-TOF mass对纯化的SFGFP和6His-SFGFP分子量进行测定(图13和图14)，SFGFP测定的蛋白分子量均与理论预测一致，6His-SFGFP在表达时N端的甲硫氨酸被切除，所以测定的分子量比预测的少一个甲硫氨酸。使用Bradford方法对两种纯化方法获取的蛋白量进行测定，本申请的方法获取的SFGFP总量为225mg/L，而使用Ni柱纯化获取的6His-SFGFP为96.96mg/L，说明本申请的方法获取的目的蛋白的量要远远大于使用层析柱获取的蛋白质量。
实施例6：证明重组蛋白是从细菌表面被切割
1.因为SFGFP会发出绿色的荧光，所以可以非常直观的观察它是否被切除。参照实施例5中的方法，在同样条件下分别对表达Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP的细菌(图15a)和表达6His-SFGFP的细菌(图15b)切割。图15a中左边比色皿为Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP的细菌切割之前的全菌液，中间比色皿为切割之后的沉淀，右边比色皿为切割之后的上清。可以非常清晰看出切割之后细菌绿色基本消失，上清呈现非常明显的绿色。作为对比，图15b中的表达6His-SFGFP细菌在切割之后上清几乎透明，没有绿色。这个实验非常直观的说明将重组蛋白定位到细菌表面之后可以被化学法切割。
2.为了进一步证明重组蛋白是在细菌表面被切割，使用共聚焦显微镜对切割前后的菌液进行观察。图16a为Lpp-OmpA-(SNAC-tag)-SFGFP的细菌切割之前的全菌液，16b为其切割后的全菌液，可以看出切割后细菌表面的绿色几乎消失，而溶液颜色为绿色。而对照组6His-SFGFP的细菌切割前后绿色在细菌中的分布没有发生变化(图16c和16d)。
实施例7：本申请的方法纯化的蛋白与层析柱纯化的蛋白性质对比
分别对实施例5中两种方法纯化得到的SFGFP和6His-SFGFP的荧光性质进行测定。两个蛋白的三维荧光光谱非常相似(图17)；SFGFP的绝对量子产率为28.45％，与6His-SFGFP的量子产率(29.48％)非常接近(图18)；SFGFP的荧光寿命为3.0ns，6His-SFGFP的荧光寿命为2.92ns(图19)。以上的结果说明本申请纯化蛋白的方式与使用层析柱纯化获取的蛋白性质几乎一致，但是层析柱纯化十分复杂，还需要借助昂贵的蛋白纯化仪，本申请纯化蛋白的方法十分简单，成本较低。
实施例8：使用本申请的方法在不同的条件下纯化蛋白
不同的条件下纯化蛋白的效率可能会有所不同，所以本申请研究了不同pH、不同盐离子浓度、不同切割试剂浓度、不同温度和不同缓冲液对纯化GB1效率的影响。以下实验除了特殊强调外，均在25度下切割，且切割时间为18h。
图20中的切割条件为100mM CHES，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl，1mM Ni2+。pH变化范围从6.0-10.0，可以看出只有pH在8.0-9.0之间才可以将GB1切割下来。当pH提高到10.0时，可能有部分细菌的细胞膜破裂，导致部分来源于细胞质中的宿主蛋白释放到上清中，影响目的蛋白的纯化。图21中第3-8泳道的切割条件为100mM CHES，pH 8.6，0.1Macetone oxime，1mM Ni2+，NaCl浓度分别为0、300和500mM，可以看出对于纯化效率没有影响。
图21中第9-10泳道切割条件为100mM CHES，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl，0.5mM Ni2+；11-12泳道切割条件为100mM CHES，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl，2mM Ni2 +。与实施例4中1mM Ni2+切割条件对比，可以看出Ni2+的浓度在0.5-2mM之间纯化效果类似。
有些蛋白在纯化时需要维持还原的条件，图22中第3-4泳道为在100mM CHES，0.1Macetone oxime，0.1M NaCl，1mM Ni2+，0.5mM TCEP条件下纯化，可以看出添加还原剂会微弱的降低纯化效率，但是不会影响蛋白的纯度。而在降低温度到4度时，切割效率会大幅度降低。因此最适宜的温度是在室温下切割，这样既可以维持蛋白的稳定性，又可以保证纯化的效率。图22中第7-8泳道的缓冲液为100mM PBS，pH8.0，0.1M acetone oxime，1mM Ni2+；第9-10泳道的切割条件为100mM Hepes，pH 8.2，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl，1mM Ni2+；第11-12泳道的切割条件为100mM Tris-HCL，pH 8.6，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl，1mMNi2+。切割效率均没有实施例4中的缓冲液高(100mM CHES，pH 8.6，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl，1mM Ni2+)，Tris-HCl和Hepes缓冲液中虽然切割效率低，但是可以把部分GB1从细菌表面切割下来，但是PBS几乎不能切割目的蛋白。
因此，当使用的Ni2+切割位点时(-GSHHW-)，最适宜的切割条件为100mM CHES，pH8.6，0.1M acetone oxime，0.1M NaCl，1mM Ni2+，切割温度为25℃，切割时间为18h。
序列表
<110> 黄善青
<120> 一种将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法
<130> 100
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> Lpp(1-9)-OmpA(45-159)-(SNAC-tag)-GB1序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Asn Asn Asn Gly Pro Thr His
1 5 10 15
Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro
20 25 30
Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Pro Tyr
35 40 45
Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu
50 55 60
Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr
65 70 75 80
Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys Ser Asn Val Tyr
85 90 95
Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val
100 105 110
Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Gly Ser His His Trp
115 120 125
Met Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
130 135 140
Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln
145 150 155 160
Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala
165 170 175
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
180
<210> 2
<211> 366
<212> PRT
<213> LPP(1-9)-OMPA(45-159)-(SNAC-TAG)-SFGFP序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Asn Asn Asn Gly Pro Thr His
1 5 10 15
Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro
20 25 30
Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Pro Tyr
35 40 45
Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu
50 55 60
Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr
65 70 75 80
Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys Ser Asn Val Tyr
85 90 95
Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val
100 105 110
Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Gly Ser His His Trp
115 120 125
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
130 135 140
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
145 150 155 160
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
165 170 175
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
180 185 190
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg
195 200 205
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
210 215 220
Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
225 230 235 240
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
245 250 255
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
260 265 270
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
275 280 285
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val
290 295 300
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
305 310 315 320
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser
325 330 335
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
340 345 350
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
355 360 365
<210> 3
<211> 78
<212> PRT
<213> 6His-GB1序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Glu Val
1 5 10 15
Leu Phe Gln Gly Pro His Met Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys
20 25 30
Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala
35 40 45
Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu
50 55 60
Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
65 70 75
<210> 4
<211> 260
<212> PRT
<213> 6His-SFGFP序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Glu Val
1 5 10 15
Leu Phe Gln Gly Pro His Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
20 25 30
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys
35 40 45
Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu
50 55 60
Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro
65 70 75 80
Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr
85 90 95
Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu
100 105 110
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg
130 135 140
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly
145 150 155 160
His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala
165 170 175
Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
180 185 190
Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr
195 200 205
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
210 215 220
Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
225 230 235 240
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp
245 250 255
Glu Leu Tyr Lys
260
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> OmpA的45-159位氨基酸序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asn Asn Asn Gly Pro Thr His Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe
1 5 10 15
Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp
20 25 30
Trp Leu Gly Arg Met Pro Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr
35 40 45
Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr
50 55 60
Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala
65 70 75 80
Asp Thr Lys Ser Asn Val Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala
100 105 110
Thr Arg

Claims (2)

1.一种将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法，其特征在于，通过将编码信号肽、化学法切割位点和目的蛋白的基因构建到表达载体中，使得目的蛋白表达后定位到细胞的表面；在收集的细胞中加入含有切割试剂的缓冲液重悬，离心后的上清即为目的蛋白溶液；
其中，信号肽为使用N端1-9位氨基酸MKATKLVLG的lpp与SEQ ID NO.5所示的OmpA融合而成的lpp-ompA；
目的蛋白为以-GSHHW-为Ni2+切割位点的SFGFP和GBI两种融合蛋白，序列如SEQ IDNO.1和2所示；
所述细胞为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的将重组蛋白定位到细胞表面的简便纯化蛋白方法，其特征在于，使用切割试剂对表达重组蛋白的细胞切割后，只需一步离心就可以获取目的蛋白。
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