CN101481689A - 新序列人胰岛素样生长因子-ⅰ基因的克隆及其高效表达 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和生物制药领域；在GenBank已收录的A29117的IGF－I基因序列基础上，根据同义突变的原理，利用拼接PCR的方法克隆出大肠杆菌密码子偏爱性的新序列人胰岛素样生长因子－I基因，通过融合表达、亲和层析纯化、酶切获得具有代替牛血清促进CHO细胞生长的活性的人胰岛素样生长因子－I多肽，其优点为新序列的IGF－I在大肠杆菌内的表达量高，可达35－40％，拼接PCR的方法比人工合成全基因的成本明显降低，同时原核表达代替真核表达缩短了培养周期也降低了成本，为人胰岛素样生长因子－I的深入研究及应用打下良好的基础。

Description

新序列人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆及其高效表达

技术领域：

本发明涉及基因工程和生物制药领域，具体而言，特指用拼接PCR的方法克隆了新序列的人胰岛素样生长因子-I(简称IGF-I)基因，经原核系统高效表达出IGF-I多肽，具有促进CHO细胞生长的活性。

背景技术：

胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factors，IGFs)是一类非常重要的生长因子，其化学结构与胰岛素原类似，包括IGF-I和IGF-II两种相关多肽。大量研究证实，二者在组织细胞的增殖、分化、凋亡、机体的生长发育及肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。特别是IGF-I可以促进细胞的生长、与许多疾病相关，如与心血管疾病、代谢综合症、糖尿病、胰岛素拮抗症等的发生都有着密切的关系。

但是由于IGF-I在原核系统中表达量一直较少，甚至不表达，而在真核系统表达时，往往在N端发生不正确的加工，也不适于应用；另外，IGF-I在真核系统中表达的成本高、周期长，因此使它的广泛应用受到了严重的限制。

能够大幅度提高IGF-I在原核系统中的表达量对于IGF-I的深入研究及大量生产有着非常重要的理论价值及实践意义。

发明创造内容：

本发明的目的是根据已知序列克隆IGF-I基因，并根据同义突变的原理，利用大肠杆菌密码子偏爱性和密码子兼并性的原理，对IGF-I进行人工改造以提高其表达量。

本发明的目的是这样实现的：

在分析了该基因的大肠杆菌稀有密码子以后，运用大肠杆菌密码子使用频率表和密码子兼并性的原理，在不更改氨基酸的基础上，对克隆到的IGF-I基因序列进行同义突变，将该基因更改为大肠杆菌偏嗜性的基因，利用人工合成的方法，以最低的成本合成了三条单链DNA，采用拼接PCR的方法获得该基因的全长；新序列人胰岛素样生长因子-I基因包括该人胰岛素样生长因子-I氨基酸序列：Gly Pro Glu Thr Leu Trp Gly Ala Glu Leu Val AspAla Leu Gln Phe Val Trp Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser SerSer Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Trp Trp Phe Arg Ser Trp Asp Leu Arg ArgLeu Glu Met Tyr Trp Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala，其核苷酸序列为：GGC CCGGAA ACC CTG TGG GGC GCA GAA CTG GTG GAT GCA CTG CAG TTT GTG TGG GGCGAT CGC GGC TTT TAT TTC AAC AAA CCG ACC GGC TAT GGC TCC AGC AGT CGCCGC GCG CCG CAG ACC GGC ATT GTG GAT GAA TGG TGG TTT CGC AGC TGG GATCTG CGC CGC CTG GAA ATG TAT TGG GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAG TCA GCATAG。

本方案所述的新序列人胰岛素样生长因子-I基因的高效表达方法为，将改造后的基因克隆到融合表达载体pET32a(+)上，并导入到E.coli BL21中，采用IPTG诱导的方法诱导该基因的大量表达多肽，表达量可达到35-40％。该多肽进行组氨酸亲和层析纯化、酶切后，通过培养CHO细胞检测IGF-1多肽的生物活性，证明其具有促进细胞生长的功能。

本发明提供的是人源的IGF-I基因，以NCBI上登录的A29117基因为依据，设计特异引物将其克隆，并在此基础上对其序列进行改造，成为新序列的人胰岛素样生长因子-I基因，其核苷酸序列与A29117基因的序列同源性为80.75％，氨基酸序列未改变。

本发明中IGF-I基因转化的宿主菌是大肠杆菌。由于IGF-I在真核系统表达时，往往在N端发生不正确的加工，从而影响了重组的人胰岛素样生长因子-I于血液中的IGF结合蛋白的结合，降低了其在体内的半衰期，不适于应用。由于大肠杆菌表达系统的研究最早，图谱研究最为明确，容易培养且费用低，对很多蛋白质有很强的耐受力，能高水平地表达外源蛋白质和多肽，同时还具有生产周期短和表达量高等优点，故本发明采用了大肠杆菌作为IGF-I的表达系统。

本发明使用的表达载体为市售的pET系列载体中的pET-32a(+)，该载体为融合表达载体。由于IGF-I成熟多肽的片段较小，是一个只有70个氨基酸的小分子碱性多肽，分子质量只有7648.7Da，在表达过程中极易被蛋白酶所降解，导致表达失败，所以对于这种小分子多肽的表达，最好的选择是融合表达。且pET-32a(+)载体相较于其他该系列的载体而言，融合的蛋白较大，有16KD左右，可以和目的基因共表达，从而隐藏目的多肽的活性位点，免受蛋白酶的降解。比较适宜像IGF-I这种小肽的表达。最后pET-32a(+)载体上有一段连续的6个组氨酸能够与亲和层析柱亲和，从而便于融合蛋白的纯化。

本发明对IGF-I基因进行了大肠杆菌稀有密码子的分析，发现共有7个稀有密码子，它们分别是：编码精氨酸的稀有密码子AGG，共有四个，分别位于21，37，55，56位，在大肠杆菌中的偏嗜性最低，为1.8；编码脯氨酸的稀有密码子CCC，有两个，分别位于28，63位，在大肠杆菌中的偏嗜性最低，为5.6；编码亮氨酸的稀有密码子CTA，有一个，位于54位，在大肠杆菌中的偏嗜性最低，为3.9。如此多的稀有密码子，严重影响了IGF-I基因的表达。故需要在此基础上对该基因进行改造。

本发明对IGF-I进行改造的原则是同义突变，即在不改变其氨基酸序列的基础上，利用密码子的兼并性原理，参照大肠杆菌密码子使用频率表，将IGF-I基因更改为在大肠杆菌中极易表达的基因。所得的核苷酸序列为一个全新的序列，并且还不改变该基因的氨基酸组成，不会影响该多肽的功能。

本发明的多肽表达纯化工艺有效的获得了大量的、高纯度的目的序列多肽，利于后续研究的开展。发酵所使用的培养基是LB+M9，有利于大肠杆菌的高密度发酵，获得大量基因工程菌。利用IPTG诱导表达，获得高效表达的IGF-I多肽，表达量可达35-40％。

本发明中用于检测IGF-I多肽活性的真核细胞系为中国仓鼠卵巢细胞，即CHO细胞系，在无血清培养基中IGF-I多肽可促进其生长，可检测新序列IGF-I基因的生物活性。

综上所述，本发明的优点在于：

1.密码子修改后的新序列的IGF-I在大肠杆菌内的表达量高。对IGF-I进行稀有密码子分析后，利用大肠杆菌密码子使用频率表，以同义突变为原则修改的IGF-I基因在大肠杆菌内的表达量明显升高，可达35-40％。

2.使用拼接PCR的方法明显降低了人工合成基因的成本并且不影响基因序列的准确性。利用生物分析软件Primer5.0等，合成三段互相有重叠的长的单链DNA分子，价钱与合成引物差不多，在每个碱基3.5元左右，再利用拼接PCR的方法获得全长的双链DNA，而单纯的双链DNA的全基因合成价钱为每对碱基12元。二者比较，本发明所采用的方法，成本明显降低。

3.新序列的IGF-I基因在原核系统中高效表达，代替真核系统，不仅缩短了细胞培养周期，同时也降低了成本。

4.新序列的IGF-I基因表达的多肽具有代替牛血清促进CHO细胞生长的活性。

附图说明：

图1：健康人胎盘组织总RNA分离图谱及RNA浓度计算

浓度＝OD₂₆₀×40×稀释倍数＝0.5909×40×100＝2.3636μg/μl

图2：IGF-I基因的RT-PCR图谱

Lane1：Maker DL2000

Lane2-3：IGF-I基因的RT-PCR产物

图3：重组表达载体pET-32a-IGF-I的构建示意图

图4：修改后的IGF-I基因的PCR拼接示意图

图5：修改后的IGF-I基因在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE检测图谱

Lane1：低分子量蛋白质Maker

Lane2：未诱导样品

Lane3-6：不同单菌落的诱导表达

图6：融合蛋白纯化过程中各阶段产物的SDS-PAGE

Lane1：破菌后上清  Lane2：包涵体一次洗涤  Lane3：包涵体二次洗涤

Lane4：抽提液     Lane5：低分子量蛋白质Maker  Lane6：复性液

Lane7：Ni柱后峰尖 Lane8：穿过

图7：目的蛋白纯化图

M：低分子量蛋白质Maker

Lane1：未切割前的融合蛋白

Lane2：切割后的目的蛋白IGF-I图8：DMEM+50μg/ml IGF-1培养的CHO细胞

具体实施方式：

下面结合附图举实例对本发明作进一步阐述，并不限制本发明范围。

实验材料及来源：

实验所用健康人胎盘组织：哈尔滨市红十字中心医院提供。

菌种：菌株E.col iJM109、E.coli BL21，购自大连宝生物工程有限公司。

质粒：pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；pET-32a(+)，购自Novagen公司。

细胞：CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞系，由哈药集团生物工程有限公司提供。

实验步骤：

1.胎盘组织获得

取新出生婴儿的胎盘组织，去除表面血液，迅速分割后，置于液氮中快速冷冻，以防止RNA被降解，保证RNA的完整性。

2.总RNA的分离

取出适量大小的冷冻的胎盘组织，迅速置于预冷的装满液氮的研钵中，迅速研磨，以免RNA在空气中被RNA酶降解。加入适量Trizol后，匀浆破碎，抽提的到总RNA，使用DEPC处理过的无RNase的水溶解RNA沉淀，1％琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的纯度及完整性，利用紫外分光光度计测定其浓度。

3.cDNA第一链的获得

以分离到的总RNA为模版，利用反转录试剂盒，以Oligo(dT)为引物获得cDNA第一链全长。

4.IGF-I基因的PCR扩增

根据GenBank上所收录的人胰岛素样生长因子，搜寻到登陆号为A29117的胰岛素样生长因子-I基因序列，设计特异引物：

P1：CCATGG GGACCGGAGACGCTCTGCGGGGCTG 为正向引物

P2：CTCGAG CTAAGCTGACTTGGCAGGCTTGAGG 为反向引物

PCR反应条件为95℃预变性3min，随之以95℃变性30s、60℃复性30s和72℃延伸30s进行30个循环，最后72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为227bp。按照常规方法对PCR扩增产物进行克隆，筛选，测序鉴定，序列比对同源性为99％，将其初步命名为pMD18-T-IGF-I。

5.IGF-I基因的诱导表达及序列分析

将保存好的测序正确的菌种划线复苏，挑取4个单菌落，接种到3ml的LB培养基中，小量诱导表达，未发现目的条带，该基因没有表达。

通过稀有密码子在线分析发现，在该序列中存在大量稀有密码子，严重影响了该基因的表达。

6.大肠杆菌偏爱性人IGF-I基因的基因改造、PCR扩增以及克隆

通过稀有碱基和密码子偏爱性的分析，分别设计合成三条DNA单链，分别命名为：IGFa、IGFb、IGFc，以及两条PCR引物(Pup、Plow)。利用拼接PCR的方法获得基因全长，将重组质粒命名为rIGF-I。

IGFa：5’-GGCCCG GAAACCCTGTGCGGCGCAGAACTGGTGGATGCACTGCAGTTTGTGTGCGGCGATCGCGGCTTTTATTTCAACAAACC-3’；

IGFb：5’-AGCTGCGAAAGCAGCATTCATCCACAATGCCGGTCTGCGGCGCGCGGCGACTGCTGGAGCCATAGCCGGTCGGTTTGTTGAAAT-3；

IGFc：5’-AATGCTGCTTTCGCAGCTGTGATCTGCGCCGCCTGGAAATGTATTGCGCGCCGCTGAAACCGGCGAAGTCAGCA-3’；

Pup：CCATGGGCCCGGAAACCCTGTGCGGCGCAG；

Plow：CTCGAGCTATGCTGACTTCGCCGGTTTCAGC。

用无菌纯水溶解合成的基因片段，进行PCR反应。PCR反应分两步，第一步：分别取2μl的IGFa、IGFb和IGFc，加入0.8μldNTP、1μl10×ExBuffer和0.2μlExTaq，用水补足至10μl。按照95℃预变性3min，随之以95℃变性30s、65℃复性30s和72℃延伸30s进行15个循环，最后72℃延伸10min，再以该产物为模版，以Pup、Plow为引物进行二次PCR。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为227bp。

按照常规方法对PCR扩增产物进行克隆、筛选、测序鉴定，与A29117序列进行比对，同源性为80.75％，与将重组质粒命名为pMD18-T-rIGF-I。

新序列人胰岛素样生长因子-I基因的核苷酸：

GGC CCG GAA ACC CTG TGG GGC GCA GAA CTG GTG GAT GCA CTG CAG TTT GTG

TGG GGC GAT CGC GGC TTT TAT TTC AAC AAA CCG ACC GGC TAT GGC TCC AGC

AGT CGC CGC GCG CCG CAG ACC GGC ATT GTG GAT GAA TGG TGG TTT CGC AGC

TGG GAT CTG CGC CGC CTG GAA ATG TAT TGG GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAG

TCA GCA TAG

新序列人胰岛素样生长因子-I基因的氨基酸：

Gly Pro Glu Thr Leu Trp Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Trp Gly Asp Arg Gly

Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp

Glu Trp Trp Phe Arg Ser Trp Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Trp Ala Pro Leu Lys Pro Ala

Lys Ser Ala

7.大肠杆菌偏爱性人IGF-I基因的表达载体的构建、扩增及鉴定

分别用Nco I和Xho I对构建好的重组质粒pMD18-T-rIGF-I进行双酶切，回收227bp左右的目的条带，同时使用这两个酶对表达载体pET-32a(+)进行双酶切，回收大片段，使用T₄DNA连接酶将这两个带有相同粘性末端的片段连接起来，将连接产物转化进入大肠杆菌JM109中，利用抗生素进行筛选，挑取单菌落，分别用Nco I和Xho I进行双酶切鉴定。

8.大肠杆菌偏爱性人IGF-I基因在大肠杆菌中的高效表达

挑取四个单菌落，以相同浓度的IPTG(100μg/μl)、相同的诱导时间(3.5小时)、相同的诱导温度(37℃)进行诱导表达，从中筛选高表达菌株，确定了高效表达菌株后，大量发酵，使用发酵培养基LB+M9。用12％分离胶对样品进行SDS-PAGE分析，结果发现目的条带的分子量约25KD，如图5所示。该条带与预期融合蛋白大小相符，且表达量均很高，说明该多肽基因修改成功，大大提高了IGF-I的表达量。

9.大肠杆菌偏爱性人IGF-I多肽的纯化及活性检测将目的多肽进行组氨酸亲和层析柱纯化、酶切(见图6，7)，通过培养CHO细胞检测IGF-I多肽的生物活性，在DMEM+50μg/mlIGF-1的条件下，培养的细胞状态较好，边界清楚，大小均一，分散较好(见图8)，证明该浓度是CHO细胞的生长较佳浓度，且不会造成细胞聚集。验证了IGF-1具有代替牛血清促进细胞生长的功能。

序列表

<110>哈尔滨师范大学

<120>新序列人胰岛素样生长因子-I基因的克隆及其高效表达

<140>2008100648150

<141>2008-06-26

<160>2

<210>1

<211>213

<212>DNA

<213>人种(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>70

<212>PRT

<213>人种(Homo sapiens)

<400>2

Claims (3)

1.一种新序列人胰岛素样生长因子-I基因，包括该人胰岛素样生长因子-I氨基酸序列：GlyPro Glu Thr Leu Trp Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Trp Gly Asp Arg Gly PheTyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp GluTrp Trp Phe Arg Ser Trp Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Trp Ala Pro Leu Lys Pro Ala LysSer Ala，其特征在于新序列人胰岛素样生长因子-I基因的核苷酸为：GGC CCG GAAACCCTG TGG GGC GCA GAA CTG GTG GAT GCA CTG CAG TTT GTG TGG GGC GAT CGCGGC TTT TAT TTC AAC AAA CCG ACC GGCTAT GGC TCC AGC AGT CGC CGC GCGCCG CAG ACC GGC ATT GTG GAT GAA TGG TGG TTT CGC AGC TGG GAT CTG CGCCGC CTG GAAATG TATTGG GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAG TCA GCATAG。

2.一种如权利要求1所述的新序列入胰岛素样生长因子-I基因的克隆，其特征在于在分析了该基因的大肠杆菌稀有密码子以后，运用大肠杆菌密码子使用频率表和密码子的兼并性，在不更改氨基酸的基础上，对克隆到的IGF-1基因序列进行同义突变，将基因更改为大肠杆菌偏嗜性的基因，利用人工合成的方法，以最低的成本合成了三条单链DNA，采用拼接PCR的方法获得该基因的全长。

3.根据权利要求1所述的新序列人胰岛素样生长因子-I基因，其特征在于该序列的高效表达方法为，将改造后的基因克隆到融合表达载体pET32a(+)上，并导入到E.coli BL21中，采用IPTG诱导的方法诱导该基因的大量表达，表达量可达到35-40％。

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