CN111850022A - 一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，包括引物设计、目的基因和蛋白标签片段的扩增、表达载体双酶切及重组酶处理、转化、阳性转化子检测及测序比对。本发明在目的基因和蛋白标签的序列片段上，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中F1与R2要分别和表达载体插入位置要有至少15bp的同源臂，R1与F2之间也要有至少15bp的同源臂。目的基因片段、蛋白标签和载体片段在重组酶反应后，利用大肠杆菌转化体系就可以得到同时含有目的基因和添加蛋白标签的环状质粒，该方法适用于构建各种多标签表达载体，具有简单、快速和高效等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法。
背景技术
蛋白标签(protein tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种蛋白或多肽，主要用于目的蛋白的表达、纯化、检测和示踪等。随着功能基因组学和蛋白质组学的快速发展，越来越多的蛋白标签系统不断被发现，这也极大地丰富了蛋白标签的功能。根据试验的不同目的可以选择不同功能的蛋白标签，常用的蛋白标签有Flag、Myc、6×His、HA、GST和GFP/YFP/mCherry等。根据蛋白标签分子量的大小被分成两大类：大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段。前者主要有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)和GFP(绿色荧光蛋白)等，它们在使用过程中会增加目的蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中必须去除标签；后者主要有Flag(用于蛋白纯化和检测设计的多肽)、Myc(来源于人c-myc基因的表位标签)、6×His(六聚组氨酸)和HA(流感病毒血凝素表位)等，多数情况下多肽标签分子量相对较小，对融合蛋白的结构影响较小，不需要从融合蛋白中切除，所以多肽标签更为常用[1]。
不同的融合标签系统有其相同点，但各自也有其不同的优势和缺点。融合标签系统受到很多因素制约，例如融合标签系统的纯化条件、融合目的蛋白自身的性质(如等电点和细胞定位等)、纯化的基质及实验材料成本和融合标签的可去除性等[2]。综上所述，没有任何单一标签可以满足所有试验研究的需要。因而，开发两种甚至多种不同功能蛋白标签的组合使用，现已成为融合标签技术以后发展趋势。但传统的构建添加或替换目的基因的蛋白标签的方法存在试验环节较多，即需要多次构建并转化，测序验证目的基因和蛋白标签是否连接到表达载体上，操作繁杂且重复，往往还导致转化效率偏低等问题。针对这些问题，本研究基于重组酶反应，利用大肠杆菌转化体系可将一个蛋白标签与目的基因同时进行连接从而一步获得试验所需的重组表达载体，同时还可以一步添加多个蛋白标签或替换原有载体上的蛋白标签。该方法具有简单、快速和高效等特点，为进一步研究目的蛋白的功能提供了一定的技术基础。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的不足，提供一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明设计了一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，该方法包括如下步骤：
(1)引物设计：为目的基因和待添加或替换的新蛋白标签分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2之间要有15bp同源臂，F1和R2分别与被限制性内切酶双酶切之后的线性表达载体的两端要有15bp同源臂；
(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增：以含有目的基因的载体为模板，以F1、R1为引物对其进行PCR扩增；同样以含有待添加或替换的新蛋白标签的载体为模板，以F2、R2为引物对其进行PCR扩增，分别扩增出目的基因片段和待添加或替换的新蛋白标签片段；
(3)表达载体双酶切及重组酶处理：将表达载体用限制性内切酶双酶切得到线性表达载体，将步骤(2)获得的目的基因片段、待添加或替换的新蛋白标签片段和线性表达载体在重组酶反应体系下进行重组酶处理快速添加或替换目的基因的蛋白标签获得重组表达载体；
快速添加目的基因的蛋白标签时，线性表达载体保留表达载体的原有蛋白标签且添加新的蛋白标签；
快速替换目的基因的蛋白标签时，线性表达载体酶切去除表达载体的原有蛋白标签替换为新的蛋白标签；
(4)转化：将步骤(3)获得的重组表达载体转化大肠杆菌T1感受态并进行平板筛选获得阳性转化子；
(5)阳性转化子检测：挑取阳性转化子单克隆菌落进行扩大培养后，以引物F1、R2为引物对进行菌落PCR，将PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后获得的目的条带进行测序；
(6)测序比对：完成目的条带测序后进行测序结果比对，若序列正确即可得到重组菌株，或者从重组菌株中提取质粒进行下一步其它试验。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中的目的基因为S7-RNase蛋白基因(切除信号肽，如SEQ ID No.1所示)，含有目的基因的载体为载体pCold-TF-S7-RNase(切除信号肽)；含有待添加的新蛋白标签的载体为载体p1300-35S-GFP(购自TAKAR)；步骤(3)中表达载体为载体pCold-TF，用NdeI和XhoI双酶切得到线性载体pCold-TF；步骤(1)中所设计的引物序列为：
S7+GFP-F1：GGTATCGAAGGTAGGCATATGATGTACGATTATTTTCAATTTACGCAGC
S7+GFP-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC
S7+GFP-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG
S7+GFP-R2：CTTGAATTCGGATCCCTCGAGGTACAGCTCGTCCATGCCG。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中的目的基因为S7-RNase蛋白基因(SEQ ID NO:2)，分别以砀山酥梨花柱cDNA和含有待替换的新蛋白标签(mCherry)的载体(pROK2-35S-mCherry，购自TAKAR)为模板；步骤(3)中表达载体为载体p1300-35S-GFP，用XbaⅠ和BglⅡ双酶切将p1300-35S-GFP蛋白标签酶切下来得到线性表达载体；步骤(1)中所设计的引物序列为：
S7+mCherry-F1：gagaacacgggggactctagaATGGGGATTACGGGGATGATATA
S7+mCherry-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC
S7+mCherry-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG
S7+mCherry-R2：cgagctctcaacataagatctTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC。
作为一种优选技术方案，在步骤(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增中的PCR反应体系为50μL，质粒模板为1μL、dNTP为1μL、Phanta Max高保真DNA聚合酶为1μL、正向引物和反向引物各为2μL、2×Phanta Max buffer为25μL以及加无菌ddH2O补至50μL。
进一步优选的，所述正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
作为一种优选技术方案，步骤(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增中的反应条件具体为95℃预变性3min，然后95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小和特异性，并用DNA凝胶回收试剂盒按说明书回收。
作为一种优选技术方案，步骤(3)中重组酶处理时，重组酶反应体系为20μL，具体包括目的基因片段为xμL、待添加或替换的新蛋白标签片段为yμL、线性表达载体为zμL、5×重组酶酶反应buffer为4μL、重组酶为2μL以及用无菌ddH2O补至20μL，其中x＝[0.04×目的基因片段碱基对数]/目的基因片段的浓度，y＝[0.04×新蛋白标签片段碱基对数]/新蛋白标签片段的浓度，z＝[0.02×线性表达载体载体碱基对数]/线性表达载体的浓度。
作为一种优选技术方案，在进行步骤(5)阳性转化子检测时，PCR反应条件具体为98℃预变性3min，然后95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min，取10μl菌落PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
本发明提出的一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法，有益效果在于：
该方法构建目的基因的蛋白标签能够实现快速的添加或替换，将目的基因和蛋白标签作为2个片段，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2之间要有至少15bp的同源臂，F1与R2要分别和表达载体插入位置要有至少15bp的同源臂，基因片段、蛋白标签片段和载体片段在重组酶反应后，利用大肠杆菌转化系统就可以得到含有2个蛋白标签的环状质粒，该方法同样适用于多个蛋白标签的添加及替换。
附图说明
图1为快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法的流程图；
其中，A为快速添加目的基因的蛋白标签的流程图；B为快速替换目的基因的蛋白标签的流程图。
图2为快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法的引物设计图。
图3为pCold-TF在大肠杆菌DE3中的表达情况；
其中，1为pCold-TF空载质粒菌液表达图；2为pCold-TF-S7-RNase质粒菌液表达图；3为pCold-TF-S7-RNase-GFP质粒菌液表达图。
图4是重组梨S7-RNase蛋白的诱导表达后SDS-PAGE示图；
其中，M为蛋白质标准分子量；1为IPTG诱导后His的菌体总蛋白；2为IPTG诱导后S7-RNase-His的菌体总蛋白；3为IPTG诱导后S7-RNase-GFP-His的菌体总蛋白。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1一种快速添加目的基因的蛋白标签的新方法
如图1和2，实验材料的准备：大肠杆菌T1(DH5α)感受态、大肠杆菌Rosetta(DE3)、融合目的基因的质粒载体pCold-TF-S7-RNase(切除信号肽)[3]、空载体pCold-TF和空载体p1300-35S-GFP、限制性内切酶NdeI和XhoI、Phanta Max高保真DNA聚合酶、金牌MIX、重组酶ExnaseⅡ等，同时试验使用引物(下划线为酶切位点)包括：
S7+GFP-F1：GGTATCGAAGGTAGGCATATGATGTACGATTATTTTCAATTTACGCAGC
S7+GFP-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC
S7+GFP-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG
S7+GFP-R2：CTTGAATTCGGATCCCTCGAGGTACAGCTCGTCCATGCCG
(1)引物设计：将目的基因和GFP蛋白标签作为2个片段，分别设计两对引物S7+GFP-F1、S7+GFP-R1和S7+GFP-F2、S7+GFP-R2，在各个引物中引入一个酶切位点，同时S7+GFP-R1与S7+GFP-F2至少有15bp同源臂，S7+GFP-F1和S7+GFP-R2分别与载体pCold-TF被NdeI和XhoI双酶切之后的两端有15bp同源臂；
(2)目的基因和蛋白标签片段扩增：目的基因为S7-RNase蛋白基因(切除信号肽，如SEQ ID No.1所示)，分别以含有目的基因的载体pCold-TF-S7-RNase(切除信号肽)和载体p1300-35S-GFP为模板，以S7+GFP-F1、S7+GFP-R1和S7+GFP-F2、S7+GFP-R2为引物对进行PCR扩增，分别扩增出目的基因和GFP蛋白标签两个片段，分别命名为片段1以及片段2；
PCR扩增反应体系为50μL，质粒模板为1μL、dNTP为1μL、Phanta Max高保真DNA聚合酶为1μL、正向引物和反向引物各为2μL、2×Phanta Max buffer为25μL以及加无菌ddH2O补至50μL。所述正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
PCR扩增反应条件具体为95℃预变性3min，然后95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小和特异性。
(3)表达载体双酶切及重组酶处理：pCold-TF空载体用NdeI和XhoI进行双酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对片段1、2和载体pCold-TF(NdeI和XhoI双酶切)进行胶回收，再将片段1、2和载体pCold-TF(NdeI和XhoI双酶切)在重组酶反应体系下37℃，30min，然后将样品置于冰上终止反应，重组酶反应体系为20μL，具体包括目的基因片段为xμL、待添加的新蛋白标签片段为yμL、线性表达载体为zμL、5×重组酶酶反应buffer为4μL、重组酶为2μL以及用无菌ddH2O补至20μL，其中x＝[0.04×目的基因片段碱基对数]/目的基因片段的浓度，y＝[0.04×新蛋白标签片段碱基对数]/新蛋白标签片段的浓度，z＝[0.02×线性表达载体载体碱基对数]/线性表达载体的浓度；实验过程中具体得出的X＝0.5，Y＝0.5，Z＝1。
(4)转化：重组酶反应终止后，立即进行载体转化，从反应体系中取10μL样品在冰上与100μL大肠杆菌T1感受态混合，并冰浴30min，然后在42℃水浴锅中热激45s，立即放入冰上，3min后在体系中加入700μL无抗LB培养基溶液，在37℃摇床中孵育1h后，将样品涂布于100μg/mL抗性氨苄青霉素(Amp)固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h；
(5)阳性转化子检测：在完成步骤(4)后，从上述的转化平板中挑取10个单克隆菌落分别放于装有200μL Amp的液体LB培养基的2mL的离心管中，在37℃摇床中摇菌6h。取其中1μL菌液为PCR模板，以引物S7+GFP-F1和S7+GFP-R2为引物对，进行菌落PCR。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，如有目的条带，选取3个单克隆菌液(每个100μL菌液)送公司测序。
(6)测序比对：在完成(5)步骤后进行测序结果比对，若序列正确即可得到重组菌株，也可以提取重组表达载体质粒pCold-TF-S7-RNase-GFP进行下一步其它试验。
实施例2：pCold-TF-S7-RNase-GFP在大肠杆菌中的表达
(1)将实施例1中获得的测序结果比对正确的菌液进行摇菌，用康为世纪公司的QuickPure Plasmid Mini kit快速质粒小提试剂盒提取质粒。取1ng重组表达载体质粒pCold-TF-S7-RNase-GFP、pCold-TF-S7-RNase和pCold-TF转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布于含100μg/mL的Amp固体平板上，培养温度为37℃，培养时间为过夜培养，即获得目的基因的工程菌，随机选取1个单菌落进行划线培养，取少量长出的划线培养菌接种于1ml LB(含100μg/mL Amp)液体培养基中，37℃/220rpm振荡培养过夜，然后按700μl菌液加入300μL灭菌30％甘油，混匀后用液氮速冻贮存于-80℃冰箱，即得到表达pCold-TF-S7-RNase-GFP重组表达菌株。
(2)pCold-TF-S7-RNase-GFP重组蛋白的表达
将上述得到的重组表达菌株按1:50接种10ml LB(含100μg/mL Amp)液体培养基中，37℃/220rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。将活化的重组表达菌株再按1:50转至200ml LB培养基(含Amp 100μg/mL)中培养，培养条件为37℃/220rpm，振荡培养至OD600为0.5时加入15℃摇床中静置40min，最后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，诱导表达24h。表达完成后取10ml菌液离心，收集菌体沉淀并发现菌液明显变绿(结果如图3)。沉淀中加入200μl 10％SDS，混匀后100℃沸水水浴5分钟，置于冰中冷却2min，之后于4℃下12000rpm离心10min，各取上清50μl，加入10μl 5×蛋白上样缓冲液后取10μl进行12％常规SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后检测重组蛋白表达情况，结果如图4。
实施例3一种快速替换目的基因的蛋白标签的新方法
实验材料的准备：大肠杆菌T1(DH5α)感受态、砀山酥梨花柱cDNA、空载体p1300-35S-GFP和含有待替换的新蛋白标签(mCherry)的载体(pROK2-35S-mCherry，购自TAKAR)、限制性内切酶XbaⅠ和BglⅡ、Phanta Max高保真DNA聚合酶、金牌MIX、重组酶ExnaseⅡ等，同时试验使用引物(下划线为酶切位点)包括：
S7+mCherry-F1：gagaacacgggggactctagaATGGGGATTACGGGGATGATATA
S7+mCherry-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC
S7+mCherry-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG
S7+mCherry-R2：cgagctctcaacataagatctTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC。
(1)引物设计：将目的基因S7-RNase和mCherry蛋白标签作为2个片段，分别设计两对引物S7+mCherry-F1、S7+mCherry-R1和S7+mCherry-F2、S7+mCherry-R2，在各个引物中引入一个酶切位点，同时S7+mCherry-R1与S7+mCherry-F2至少有15bp同源臂，F1和R2分别与载体p1300-35S-GFP被XbaⅠ和BglⅡ双酶切之后两端有15bp同源臂；
(2)目的基因和蛋白标签片段扩增：分别以砀山酥梨花柱cDNA和含有待替换的新蛋白标签(mCherry)的载体质粒为模板，以S7+mCherry-F1、S7+mCherry-R1和S7+mCherry-F2、S7+mCherry-R2为引物对进行PCR扩增，分别扩增出目的基因和mCherry蛋白标签两个片段，分别命名为片段1以及片段2；
PCR扩增反应体系为50μL，质粒模板为1μL、dNTP为1μL、Phanta Max高保真DNA聚合酶为1μL、正向引物和反向引物各为2μL、2×Phanta Max buffer为25μL以及加无菌ddH2O补至50μL。所述正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
PCR扩增反应条件具体为95℃预变性3min，然后95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小和特异性。
(3)表达载体双酶切及重组酶处理：p1300-35S-GFP空载体用XbaⅠ和BglⅡ进行双酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对片段1、2和载体p1300-35S-GFP(XbaⅠ和BglⅡ双酶切)进行胶回收，再将片段1、2和载体p1300-35S-GFP(XbaⅠ和BglⅡ双酶切)在重组酶反应体系下37℃，30min，然后将样品置于冰上终止反应，重组酶反应体系为20μL，具体包括目的基因片段为xμL、待替换的新蛋白标签片段为yμL、线性表达载体为zμL、5×重组酶酶反应buffer为4μL、重组酶为2μL以及用无菌ddH2O补至20μL，其中x＝[0.04×目的基因片段碱基对数]/目的基因片段的浓度，y＝[0.04×新蛋白标签片段碱基对数]/新蛋白标签片段的浓度，z＝[0.02×线性表达载体载体碱基对数]/线性表达载体的浓度；实验过程中具体得出的X＝0.5，Y＝0.5，Z＝1。
(4)转化：重组酶反应终止后，立即进行载体转化，从反应体系中取10μL样品在冰上与100μL大肠杆菌T1感受态混合，并冰浴30min，然后在42℃水浴锅中热激45s，立即放入冰上，3min后在体系中加入700μL无抗LB培养基溶液，在37℃摇床中孵育1h后，将样品涂布于100μg/mL卡那霉素抗性(Kan)固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h；
(5)阳性转化子检测：在完成步骤(4)后，从上述的转化平板中挑取10个单克隆菌落分别放于装有200μL Kan的液体LB培养基的2mL的离心管中，在37℃摇床中摇菌6h。取其中1μL菌液为PCR模板，以引物S7+mCherry-F1、S7+mCherry-R2为引物对，进行菌落PCR。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，如有目的条带，选取3个单克隆菌液(每个100μL菌液)送公司测序。
(7)测序比对：在完成(5)步骤后进行测序结果比对，若序列正确即可得到重组菌株，也可以提取重组表达载体质粒p1300-35S-S7-RNase-mCherry进行下一步其它试验。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
参考文献
[1]王娅宁,李淑娟.融合标签技术及其应用[J].科技经济市场,2009(6):39-40.
[2]李永进,陈媛媛,毕利军.融合标签技术及其应用[J].生物工程学报,2006,22(4):6-10.
[3]张绍铃,汤超,吴巨友,王鹏,施冬青,一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法,中国,CN108165539A,2018-06-15。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtacgatt attttcaatt tacgcagcaa tatcagccag ctgtctgcaa ctccaaacct 60
actccttgta aggatcctcc tgacaagttg ttcacggttc acggtttgtg gccttcaaac 120
ttgaatggac ctcacccaga aaattgcact aatgcaaccg tgaatcctca caggataaaa 180
aatatccaag cccagttgaa aattatttgg ccgaatgtac tcgatcgaac caatcatgta 240
ggcttctgga ataaacagtg gataaaacat ggcagctgtg ggtatcccgc aataatgaac 300
gacacgcatt actttcaaac agtaatcaac atgtacataa cccagaaaca aaacgtctct 360
gaaatactct caaaggcgaa gattgaaccg ttgggaatac aaaggccact ggtgcatatt 420
gaaaatgcca tacggaatag taccaacaat aagaaaccaa aattcaagtg ccaaaagaat 480
tctggggtga ctgaattagt tgaggtcggt ctttgcagcg atggcagctt aacgcagttc 540
agaaattgcc cccacccacc accaggatca ccatatctct gcccggccga tgttaagtat 600
taa 603
<210> 2
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggggatta cggggatgat atatatagtt acgatggtat tttcattaat tgtattgata 60
ttgtcttcct ctacggtggg atacgattat tttcaattta cgcagcaata tcagccagct 120
gtctgcaact ccaaacctac tccttgtaag gatcctcctg acaagttgtt cacggttcac 180
ggtttgtggc cttcaaactt gaatggacct cacccagaaa attgcactaa tgcaaccgtg 240
aatcctcaca ggataaaaaa tatccaagcc cagttgaaaa ttatttggcc gaatgtactc 300
gatcgaacca atcatgtagg cttctggaat aaacagtgga taaaacatgg cagctgtggg 360
tatcccgcaa taatgaacga cacgcattac tttcaaacag taatcaacat gtacataacc 420
cagaaacaaa acgtctctga aatactctca aaggcgaaga ttgaaccgtt gggaatacaa 480
aggccactgg tgcatattga aaatgccata cggaatagta ccaacaataa gaaaccaaaa 540
ttcaagtgcc aaaagaattc tggggtgact gaattagttg aggtcggtct ttgcagcgat 600
ggcagcttaa cgcagttcag aaattgcccc cacccaccac caggatcacc atatctctgc 660
ccggccgatg ttaagtatta a 681
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtatcgaag gtaggcatat gatgtacgat tattttcaat ttacgcagc 49
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcccttgctc accatggatc catacttaac atcggccggg c 41
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgatgtta agtatggatc catggtgagc aagggcgag 39
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttgaattcg gatccctcga ggtacagctc gtccatgccg 40
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagaacacgg gggactctag aatggggatt acggggatga tata 44
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcccttgctc accatggatc catacttaac atcggccggg c 41
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gccgatgtta agtatggatc catggtgagc aagggcgag 39
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgagctctca acataagatc tttacttgta cagctcgtcc atgc 44
Claims (8)
1.一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)引物设计：为目的基因和待添加或替换的新蛋白标签分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2之间要有15bp同源臂，F1和R2分别与被限制性内切酶双酶切之后的线性表达载体的两端要有15bp同源臂；
(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增：以含有目的基因的载体为模板，以F1、R1为引物对其进行PCR扩增；同样以含有待添加或替换的新蛋白标签的载体为模板，以F2、R2为引物对其进行PCR扩增，分别扩增出目的基因片段和待添加或替换的新蛋白标签片段；
(3)表达载体双酶切及重组酶处理：将表达载体用限制性内切酶双酶切得到线性表达载体，将步骤(2)获得的目的基因片段、待添加或替换的新蛋白标签片段和线性表达载体在重组酶反应体系下进行重组酶处理快速添加或替换目的基因的蛋白标签获得重组表达载体；
快速添加目的基因的蛋白标签时，线性表达载体保留表达载体的原有蛋白标签且添加新的蛋白标签；
快速替换目的基因的蛋白标签时，线性表达载体酶切去除表达载体的原有蛋白标签替换为新的蛋白标签；
(4)转化：将步骤(3)获得的重组表达载体转化大肠杆菌T1感受态并进行平板筛选获得阳性转化子；
(5)阳性转化子检测：挑取阳性转化子单克隆菌落进行扩大培养后，以引物F1、R2为引物对进行菌落PCR，将PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后获得的目的条带进行测序；
(6)测序比对：完成目的条带测序后进行测序结果比对，若序列正确即可得到重组菌株，或者从重组菌株中提取质粒进行下一步其它试验。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的目的基因为如SEQ ID NO:1所示的切除信号肽的S7-RNase蛋白基因，含有目的基因的载体为载体pCold-TF-S7-RNase；含有待添加的新蛋白标签的载体为载体p1300-35S-GFP；步骤(3)中表达载体为载体pCold-TF，用NdeI和XhoI双酶切得到线性载体pCold-TF；步骤(1)中所设计的引物序列为：
S7+GFP-F1：GGTATCGAAGGTAGGCATATGATGTACGATTATTTTCAATTTACGCAGC
S7+GFP-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC
S7+GFP-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG
S7+GFP-R2：CTTGAATTCGGATCCCTCGAGGTACAGCTCGTCCATGCCG。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的目的基因为如SEQ ID NO:2所示的S7-RNase蛋白基因，分别以砀山酥梨花柱cDNA和含有待替换的新蛋白标签mCherry的载体为模板；步骤(3)中表达载体为载体p1300-35S-GFP，用XbaⅠ和BglⅡ双酶切将p1300-35S-GFP蛋白标签酶切下来得到线性表达载体；步骤(1)中所设计的引物序列为：
S7+mCherry-F1：gagaacacgggggactctagaATGGGGATTACGGGGATGATATA
S7+mCherry-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC
S7+mCherry-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG
S7+mCherry-R2：cgagctctcaacataagatctTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增中的反应体系为50μL，质粒模板为1μL、dNTP为1μL、Phanta Max高保真DNA聚合酶为1μL、正向引物和反向引物各为2μL、2×Phanta Max buffer为25μL以及加无菌ddH2O补至50μL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的浓度均为10μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增中的反应条件具体为95℃预变性3min，然后95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小和特异性，并用DNA凝胶回收试剂盒按说明书回收。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中重组酶处理时，重组酶反应体系为20μL，具体包括目的基因片段为xμL、待添加或替换的新蛋白标签片段为yμL、线性表达载体为zμL、5×重组酶酶反应buffer为4μL、重组酶为2μL以及用无菌ddH2O补至20μL，其中x＝[0.04×目的基因片段碱基对数]/目的基因片段的浓度，y＝[0.04×新蛋白标签片段碱基对数]/新蛋白标签片段的浓度，z＝[0.02×线性表达载体载体碱基对数]/线性表达载体的浓度。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行步骤(5)阳性转化子检测时，PCR反应条件具体为98℃预变性3min，然后95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min，取10μl菌落PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113215145A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-08-06 | 河南大学 | 一种不依赖pcr反应的短片段克隆方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102443596A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-05-09 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的dna的方法 |
| CN102634534A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-08-15 | 深圳市中联生物科技开发有限公司 | 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 |
| CN105087517A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-11-25 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法 |
| CN108165539A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-06-15 | 南京农业大学 | 一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法 |
| CN110592129A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-20 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法 |
| CN111349638A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-06-30 | 深圳市泽龙生物技术有限公司 | 构建包含大片段反向互补序列载体的方法 |
-
2020
- 2020-07-02 CN CN202010628191.1A patent/CN111850022A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102443596A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-05-09 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的dna的方法 |
| CN102634534A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-08-15 | 深圳市中联生物科技开发有限公司 | 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 |
| CN105087517A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-11-25 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法 |
| CN108165539A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-06-15 | 南京农业大学 | 一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法 |
| CN110592129A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-20 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法 |
| CN111349638A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-06-30 | 深圳市泽龙生物技术有限公司 | 构建包含大片段反向互补序列载体的方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113215145A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-08-06 | 河南大学 | 一种不依赖pcr反应的短片段克隆方法 |
| CN113215145B (zh) * | 2021-05-08 | 2022-07-08 | 河南大学 | 一种不依赖pcr反应的短片段克隆方法 |
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