CN113215145B - 一种不依赖pcr反应的短片段克隆方法 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本申请属于生物工程技术领域，具体涉及一种不依赖PCR反应的短片段快速克隆方法。该方法包括：线性化载体、设计并合成两条部分互补的长链寡核苷酸序列、制备目的序列、同源重组、转化、筛选，获得重组载体等步骤。本申请中，发明人对现有重组反应中目的片段的制备方法进行了进一步改进，利用单链重组方式延长了插入序列的长度，并利用大肠杆菌的天然修复系统完成了双链补全，从而达到短片段快速克隆目的。该发明保留了现有重组方法简单快捷的技术特点，同时兼具了现有连接方法在连接长度方面的技术优势。可为重组质粒改造（例如酶切位点改造、蛋白表达标签的添加等）奠定良好的技术基础。
Description
技术领域
本申请属于生物工程技术领域，具体涉及一种不依赖PCR反应的短片段快速克隆方法。
背景技术
基因克隆是基因研究的主要技术手段，通常需要借助于不同类型载体才能实现目的基因的克隆和表达。实际操作中，载体通常需要经过改造才能满足实验的需要，例如多克隆酶切位点的替换以及表达标签的添加或去除。这些改造往往只需要替换很短的片段就可以完成。
现有技术中，针对短片段（一般指100 bp以下片段）基因克隆时，依据是否依赖PCR反应，可以分为如下两类。
依赖PCR反应的方法：这种方法与长片段克隆的策略一样，首先设计含有酶切位点的引物序列，通过PCR反应扩增目的序列、并纯化回收目的片段，随后，利用T4连接酶或重组酶，将目的片段与预先处理后的线性化载体进行连接。这种方法的主要缺陷在于：操作繁琐、花费时间长：需要模板且PCR扩增后，需要凝胶电泳鉴定、纯化回收等操作。另一方面，由于短片段序列扩增后的回收效率较低，而且PCR反应会产生错配，因此后期需要挑选多个克隆排除突变的克隆，由此导致操作成本较高。
不依赖PCR的方法：又可分为重组和连接两种类型；如果是通过重组的方式，按照现行的技术要求，需要合成两个完全互补且两端含有载体同源臂序列的引物，与线性化载体进行重组反应。这种方法的优点是操作简单，但是主要缺陷是连接片段短。这种方式如果合成两条60 bp的寡核苷酸引物序列，插入长度最长只有30 bp。如果是通过连接的方式，需要设计一对部分重叠的寡核苷酸引物，退火后两端产生酶切位点，通过连接酶连接到载体中。这种方式如果合成两条60 bp的寡核苷酸引物，插入长度可达到56 bp。目前这种方法广泛应用于基因编辑载体sgRNA (small guide RNA) 的克隆和RNA干涉载体shRNA (shorthairpin RNA)的克隆。这种连接方法虽然可以保证连接长度，但是操作复杂费时。其主要原因在于合成的寡核苷酸片段的5’端一般为-OH，因此需要使用T4多聚核苷酸激酶将5’末端磷酸化后才能进行连接反应，另外还需要加热使多聚核苷酸激酶失活和随后的连接反应。
总之，基于实际质粒改造需要，结合短片段特点，有针对性的对相关克隆方法进行进一步改进，对于相关生物技术的发展具有十分重要的技术意义。
发明内容
鉴于长序列（一般值100 bp以上）DNA片段合成时间较长、价格成本较高现状，以及现有短片段克隆方法无法较好兼顾操作的便捷和更长的插入长度的技术局限，针对部分短片段序列克隆需要，在现有不依赖于PCR反应的重组方法基础上，本申请目的在于提供一种改进的不依赖于PCR反应的重组方法，从而为短片段的简单快速克隆、以及重组质粒改造奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法，具体步骤如下：
（一）制备线性化载体
对载体进行单酶切或双酶切，以使载体线性化；并回收、纯化酶切后线性化载体；
实际操作中，对载体优选采用双酶切方式进行线性化处理，以避免线性化后载体的自连；
所述载体例如为载体pTRV2或pRI101-AN；具体双酶切线性化时，采用EcoRI 、XhoI对pTRV2载体进行双酶切，采用NdeI、BamHI对pRI101-AN载体进行双酶切；具体50 μL酶切体系设计如下：
pTRV2载体（或pRI101-AN载体），2000 ng；
内切酶1，2 μL；
内切酶2，2 μL；
10x Cut smart buffer，5 μL；
ddH2O，补足至50 μL。
37℃酶切过夜（大约10h）；
（二）设计并合成两条部分互补的长链寡核苷酸序列
设计并合成两条长链寡核苷酸片段（Oligo F和Oligo R），两条长链寡核苷酸片段的序列的排列方式为：5’－载体同源序列＋酶切位点序列＋目的序列－3’；
其中，两条长链寡核苷酸片段序列的5’末端分别与所用载体存在同源序列，两条长链寡核苷酸片段之间的3’末端存在互补序列；
目的序列的长度L=n1+n2-（a1+b1）-（a2+b2）-c；
其中：n1、a1、b1分别为Oligo F的总长度、Oligo F与载体同源序列的长度、载体一端酶切位点的长度；
n2、a2、b2分别为Oligo R的总长度、Oligo R与载体同源序列的长度、载体另一端酶切位点的长度；
为保证重组效率，a1≥15 nt，a2≥15 nt；
c为Oligo F和Oligo R互补序列长度，为保证重组效率c≥15 nt，且Oligo F和Oligo R 的3’末端互补序列的Tm值应≥40℃；
基于上述原则，在pTRV2中引入SalI酶切位点时，具体序列设计（如SEQ ID No.1~2所示）如下：
Oligo F1：5’ -GTGAGTAAGGTTACCGAATTCACGGTACCCATATGGCTAGCGGATCCGAGCTCCG TCGAC -3’，
Oligo R1：5’- GGGACATGCCCGGGCCTCGAGAGCGGCCGCTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAG CTCGG -3’；
在载体pRI101-AN中添加一个Myc蛋白标签时，具体序列设计（如SEQ ID No.3~4所示）如下：
Oligo F2：5’ -TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATA TGACC -3’，
Oligo R2：5’ -GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGACCGGTCATATTCAGATCCTCTTCTGAG ATGAG -3’；
在pRI101-AN中添加Myc和His两个蛋白标签时，具体序列设计（如SEQ ID No.5~6所示）如下：
Oligo F3：
5’ -TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACC -3’，
Oligo R3：
5’ -GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGATGACCGGTCATATTCAGATC -3’；
（三）制备目的序列
对Oligo F、Oligo R进行退火处理，具体而言：10 μL反应体系设计如下：
Oligo F（10 μM）、1 μL；
Oligo R（10 μM）、1 μL；
ddH2O，8 μL；
反应体系：95℃，2 min（破坏两条长链寡核苷酸序列的二级结构），两条长链寡核苷酸序列的互补区域退火30s（退火温度=两条长链寡核苷酸序列的互补区域的Tm值-5℃），将该反应溶液稀释至10 ng/μL；
（四）同源重组
将步骤（三）中退火后产物进行单链重组，重组反应参考使用南京诺唯赞公司的ClonExpress ® II One Step Cloning Kit产品，具体而言：
10 μL重组反应体系设计如下：
步骤（一）中线性化的载体，（0.01 ×载体碱基对数） ng；
目的序列，1 μL；
5×重组酶缓冲液，2 μL；
重组酶，1 μL；
ddH2O，补足至10 μL
反应条件：37℃，30 min；
（五）转化、筛选，获得重组载体
重组载体两条链均含有缺口，转化大肠杆菌感受态细胞后，通过大肠杆菌体内的复制系统补全缺失碱基；挑选阳性克隆，送测序，验证目的序列是否插入其中。
本申请中，发明人对现有重组反应中目的片段的制备方法进行了进一步改进，利用单链重组方式延长了插入序列的长度，并利用大肠杆菌的天然修复系统完成了双链补全，从而达到短片段快速克隆的技术目的。该发明保留了现有重组方法简单快捷的技术特点，同时兼具了现有连接方法在连接长度方面的技术优势。可为重组质粒改造（例如酶切位点改造、蛋白表达标签的添加等）奠定良好的技术基础，同时也为相关生物技术发展和改良提供了良好借鉴和参考。
附图说明
图1为pTRV2多克隆位点中限制性内切酶位点的替换的流程图和测序结果图；
图2为pRI101-AN多克隆位点区Myc蛋白标签的添加的流程图和测序结果图；
图3为pRI101-AN多克隆位点区Myc和His蛋白标签的添加的流程图和测序结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
病毒载体pTRV2、双元表达载体pRI101-AN，均购自BioVector；
大肠杆菌菌株Trans5α Chemically Competent Cell，购自北京全式金生物；
相关序列合成及测序工作，由河南尚亚生物技术有限公司提供和完成；
主要试剂：
重组反应的试剂盒ClonExpress ® II One Step Cloning Kit，购自南京诺唯赞公司；
相关限制性内切酶，均为NewEnglandBiolabs（NEB）公司产品。
实施例1
以病毒诱导用基因沉默载体pTRV2中的多克隆位点中的限制性内切酶位点调整为例（具体操作流程可参考图1），本实施例中，引入了SalI酶切位点，并调整了KpnI和BamHI在多克隆位点中的排布顺序。具体实验过程简介如下。
（一）制备线性化载体
采用EcoRI和XhoI将pTRV2载体线性化，并进行纯化回收。具体操作参考如下：
50 μL酶切体系设计如下：
pTRV2载体，2000 ng；
EcoRI，2 μL；
XhoI，2 μL；
10x Cut smart buffer，5 μL；
ddH2O，补足至50 μL。
37℃酶切过夜（大约10h），随后纯化回收酶切后的线性载体产物备用。
（二）设计并合成两条长链寡核苷酸序列
按照目的序列的长度L=n1+n2-（a1+b1）-（a2+b2）-c的原则，设计两条寡核苷酸序列长度n1=60 nt、n2=60 nt，与载体同源的序列长度为a1=15 nt、a2=15 nt，酶切位点长度为b1=6 nt、b2=6 nt，两条寡核苷酸互补的长度为c=15 nt，插入的目的序列大小为L=63 bp（插入目的序列具体为：ACGGTACCCATATGGCTAGCGGATCCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCAGCGGCCGCT）。
具体设计并合成两条长链寡核苷酸序列Oligo F1和Oligo R1序列为；
Oligo F1：5’ -GTGAGTAAGGTTACCGAATTCACGGTACCCATATGGCTAGCGGATCCGAGCTCCG TCGAC -3’，
Oligo R1：5’- GGGACATGCCCGGGCCTCGAGAGCGGCCGCTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAG CTCGG -3’；
（其中双下划线部分“GTGAGTAAGGTTACC”（Oligo F1）、“GGGACATGCCCGGGC”（OligoR1）为载体同源序列，波浪线部分“GAATTC” （Oligo F1）、“CTCGAG”（Oligo R1）为酶切位点，单下划线“CCGAGCTCCGTCGAC”（Oligo F1）、“GTCGACGGAGCTCGG”（Oligo R1）为Oligo互补区域）
（三）制备目的序列
10 μL反应体系设计如下：
Oligo F1（10 μM），1 μL；
Oligo R1（10 μM），1 μL；
ddH2O，8 μL；
经计算，重叠区域的Tm值为58℃，因此，具体反应条件：95℃，2 min；55℃退火30s，降温至常温。反应完成后，将该反应溶液稀释至10 ng/μL。
（四）同源重组
pTRV2载体大约9000 bp，据此，10 μL重组反应体系设计如下：
步骤（一）中线性化载体，90 ng；
目的序列，1 μL；
5×重组酶缓冲液，2 μL；
重组酶，1 μL；
ddH2O，补足至10 μL
反应条件：37℃，30 min；
（五）转化、筛选，获得重组载体
在步骤（四）中重组产物中进一步加入大肠杆菌感受态采用热激法以进行转化，具体操作而言：将混合均匀体系先冰上放置30 min，42℃水浴锅中孵育45 s，再置于冰上5min。
随后，在超净台中加入液体LB培养基，置于37℃、200 rpm摇床培养45 min；之后于超净台中涂布至含有Kana的抗性（浓度30 ug/mL）培养基，倒置培养（37℃、大约14 h）。
挑取平板中的阳性克隆转入液体LB培养基中，37℃、200 rpm的摇床中培养8 h。随后将送菌液交由尚亚公司进行后续的质粒提取和质粒测序（测序验证时，测序引物设计为TRV F，5’ -AATGGTTTGGTGGTCAAGGTACGTA-3’）。
具体测定结果如图1所示。分析后可以看出，目的片段成功插入到pTRV2载体中。（需要解释的是，由于重组反应体系中DNA量很小，电泳跑胶时小片段不容易跑胶区分开，也即，与未重组的无法有效区分，因此，本申请直接采用测序峰图作为鉴定结果）
实施例2
以双元表达载体pRI101-AN为例，本实施例中，在其多克隆位点区添加一个Myc蛋白标签，以使后续转基因植株表达的蛋白C端带有这标签，进而有利于后续蛋白表达水平的检测（具体操作流程可参考图2）。
具体实验过程简介如下。
（一）制备线性化载体
采用NdeI和BamHI将pRI101-AN载体线性化，并进行纯化回收。具体操作参考如下：
50 μL酶切体系如下：
pRI101-AN载体，2000 ng；
NdeI，2 μL；
BamHI，2 μL；
10x Cut smart buffer，5 μL；
ddH2O，补足至50 μL
37℃酶切过夜（大约10h），随后纯化回收酶切后的线性载体产物备用。
（二）设计并合成两条长链寡核苷酸序列
按照目的序列的长度L=n1+n2-（a1+b1）-（a2+b2）-c的原则，设计两条寡核苷酸序列长度为n1=60 nt、n2=60 nt，与载体同源的序列长度为a1=15 nt、a2=15 nt，酶切位点长度为b1=6 nt、b2=6 nt，两条寡核苷酸互补的长度为c=30 nt，插入的目的序列大小为L=48bp（插入目的序列具体为：GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACCGGTCATTGA）。
具体设计并合成两条长链寡核苷酸序列Oligo F2、Oligo R2序列如下：
Oligo F2：5’ -TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATA TGACC -3’，
Oligo R2：5’ -GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGACCGGTCATATTCAGATCCTCTTCTGAG ATGAG -3’；
（其中双下划线部分“TCTTCACTGTTGATA”（Oligo F2）、“GTTGATTCAGAATTC”（OligoR2）为载体同源序列，波浪线部分“CATATG” （Oligo F2）、“GGATCC”（Oligo R2）为酶切位点，单下划线“CTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACC”（Oligo F2）、“GGTCATATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG”（Oligo R2）为Oligo互补区域）
（三）制备目的序列
10 μL反应体系设计如下：
Oligo F2（10 μM），1 μL；
Oligo R2（10 μM），1 μL；
ddH2O，8 μL；
计算重叠区域的Tm值（为便于操作的统一性，实际反应时依然采用了55℃反应）；据此设计反应条件为：95℃，2 min；55℃退火30s，降温至常温。最后，将反应结束后反应溶液稀释至10 ng/μL。
（四）同源重组
pRI101-AN载体大约10000 bp，据此，10 μL重组反应体系设计如下：
步骤（一）中线性化载体，100 ng；
目的序列，1 μL；
5×重组酶缓冲液，2 μL；
重组酶，1 μL；
ddH2O，补足至10 μL
反应条件：37℃，30 min；
（五）转化、筛选，获得重组载体
参考实施例1操作，将步骤（四）中重组产物中采用热激法进行转化，并进行进一步筛选。最后将送菌液交由尚亚公司进行后续的质粒提取和质粒测序（测序验证时，测序引物设计为M13R：5’-CACACAGGAAACAGCTATGAC-3’）。
具体测定结果如图2所示。分析后可以看出，目的片段成功插入到pRI101-AN载体。
实施例3
以双元表达载体pRI101-AN为例，本实施例中，在其多克隆位点区添加Myc和His两个蛋白标签，以使后续转基因植株表达的蛋白C端带有这标签，进而有利于后续蛋白表达水平的检测（具体操作流程可参考图3）。
（一）制备线性化载体
采用NdeI和BamHI将pRI101-AN载体线性化，并进行纯化回收。具体操作参考如下：
50 μL酶切体系如下：
pRI101-AN载体，2000 ng；
NdeI，2 μL；
BamHI，2 μL；
10x Cut smart buffer，5 μL；
ddH2O，补足至50 μL；
37℃酶切过夜（大约10h），随后纯化回收酶切后的线性载体产物备用。
（二）设计并合成两条长链寡核苷酸序列
按照目的序列的长度L=n1+n2-（a1+b1）-（a2+b2）-c的原则，设计两条寡核苷酸序列长度为n1=60 nt、n2=60 nt，与载体同源的序列长度为a1=15 nt、a2=15 nt，酶切位点长度为b1=6 nt、b2=6 nt，两条寡核苷酸互补的长度为c=15 nt，插入的目的序列大小为L=63bp（插入目的序列具体为：
GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACCGGTCATCATCACCATCACCATTGA）。
具体设计并合成两条长链寡核苷酸序列Oligo F3、Oligo R3序列如下：
Oligo F3：
5’ -TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACC -3’，
Oligo R3：
5’ -GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGATGACCGGTCATATTCAGATC -3’；
（其中双下划线部分“TCTTCACTGTTGATA”（Oligo F3）、“GTTGATTCAGAATTC”（OligoR3）为载体同源序列，波浪线部分“CATATG” （Oligo F3）、“GGATCC”（Oligo R3）为酶切位点，单下划线“GATCTGAATATGACC”（Oligo F3）、“GGTCATATTCAGATC”（Oligo R3）为Oligo互补区域）
（三）制备目的序列
10 μL反应体系设计如下：
Oligo F3（10 μM），1 μL；
Oligo R3（10 μM），1 μL；
ddH2O，8 μL；
经计算，重叠区域的Tm值为40℃，据此设计反应条件为：95℃，2 min；35℃退火30s，降温至常温。最后，将反应结束后反应溶液稀释至10 ng/μL。
（四）同源重组
pRI101-AN载体大约10000 bp，据此，10 μL重组反应体系设计如下：
步骤（一）中线性化载体，100 ng；
目的序列，1 μL；
5×重组酶缓冲液，2 μL；
重组酶，1 μL；
ddH2O，补足至10 μL
反应条件：37℃，30 min；
（五）转化、筛选，获得重组载体
参考实施例1操作，将步骤（四）中重组产物中采用热激法进行转化，并进行进一步筛选。最后将送菌液交由尚亚公司进行后续的质粒提取和质粒测序（测序验证时，测序引物设计为M13R：5’-CACACAGGAAACAGCTATGAC-3’）。
具体测定结果如图3所示。分析后可以看出，目的片段成功插入到pRI101-AN载体。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法
<130> none
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
gtgagtaagg ttaccgaatt cacggtaccc atatggctag cggatccgag ctccgtcgac 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
gggacatgcc cgggcctcga gagcggccgc tgcggccgca agcttgtcga cggagctcgg 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 3
tcttcactgt tgatacatat ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatatgacc 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 4
gttgattcag aattcggatc ctcaatgacc ggtcatattc agatcctctt ctgagatgag 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 5
tcttcactgt tgatacatat ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatatgacc 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 6
gttgattcag aattcggatc ctcaatggtg atggtgatga tgaccggtca tattcagatc 60
Claims (5)
1.一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，具体步骤如下：
（一）制备线性化载体
对载体进行单酶切或双酶切，以使载体线性化；并回收、纯化酶切后的线性化载体；
所述载体为pTRV2或pRI101-AN；
具体双酶切线性化时，采用EcoRI 、XhoI对pTRV2载体进行双酶切，采用NdeI、BamHI对pRI101-AN载体进行双酶切；
（二）设计并合成两条部分互补的长链寡核苷酸序列
设计并合成两条长链寡核苷酸片段Oligo F和Oligo R，两条长链寡核苷酸片段的序列的排列方式为：5’－载体同源序列＋酶切位点序列＋目的序列－3’；
其中，两条长链寡核苷酸片段序列的5’末端分别与所用线性化载体两端存在同源序列，两条长链寡核苷酸片段之间的3’末端目的序列存在部分互补序列；
目的序列的长度L=n1+n2-（a1+b1）-（a2+b2）-c；
其中：n1、a1、b1分别为Oligo F的总长度、Oligo F与载体同源序列的长度、载体一端酶切位点的长度；
n2、a2、b2分别为Oligo R的总长度、Oligo R与载体同源序列的长度、载体另一端酶切位点的长度；
同时，a1≥15 nt，a2≥15 nt；
c为Oligo F和Oligo R互补序列长度，c≥15 nt，且Oligo F和Oligo R 的3’末端互补序列的Tm值应≥40℃；
（三）制备目的序列
对Oligo F、Oligo R进行退火处理；
（四）同源重组
将步骤（三）中退火后产物与步骤（一）中线性化载体进行单链重组；
（五）转化、筛选，获得重组载体
将步骤（四）中单链重组后产物进一步转化大肠杆菌并进一步进行筛选验证。
2.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，具体50 μL酶切体系及反应条件设计如下：
pTRV2载体或pRI101-AN载体，2000 ng；
内切酶1，2 μL；
内切酶2，2 μL；
10x Cut smart buffer，5 μL；
ddH2O，补足至50 μL；
37℃酶切过夜。
3.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，步骤（二）中，
在pTRV2中引入SalI酶切位点时，序列设计如SEQ ID No.1~2所示，具体如下：
Oligo F1：5’ -GTGAGTAAGGTTACCGAATTCACGGTACCCATATGGCTAGCGGATCCGAGCTCCGTCGAC-3’，
Oligo R1：5’- GGGACATGCCCGGGCCTCGAGAGCGGCCGCTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGG-3’；
在载体pRI101-AN中添加一个Myc蛋白标签时，序列设计如SEQ ID No.3~4所示，具体如下：
Oligo F2：5’ -TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACC-3’，
Oligo R2：5’ -GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGACCGGTCATATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG-3’；
在pRI101-AN中添加Myc和His两个蛋白标签时，序列设计如SEQ ID No.5~6所示，具体如下：
Oligo F3：
5’ -TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACC -3’，
Oligo R3：
5’ -GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGATGACCGGTCATATTCAGATC -3’。
4.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，步骤（三）中，
10 μL反应体系设计如下：
Oligo F，10 μM、1 μL；
Oligo R，10 μM、1 μL；
ddH2O，8 μL；
反应条件：95℃，2 min；两条长链寡核苷酸序列的互补区域退火30 s，退火温度=两条长链寡核苷酸序列的互补区域的Tm值-5℃。
5.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，步骤（四）中，
10 μL重组反应体系设计如下：
步骤（一）中线性化的载体，添加量为0.01 ×载体碱基对数，ng；
步骤（三）中退火产物，1 μL；
5×重组酶缓冲液，2 μL；
重组酶，1 μL；
ddH2O，补足至10 μL
反应条件：37℃，30 min。
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