CN109706109A

CN109706109A - 一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用

Info

Publication number: CN109706109A
Application number: CN201910089302.3A
Authority: CN
Inventors: 孙义成; 耿艺漫; 严海芹; 任改仙; 郭晓鹏; 钱朝晖; 赵振东; 金奇
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明公布了一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用。所述体内质粒编辑系统包括：HsdR功能缺失且基因组中整合有可诱导表达的λRed重组蛋白基因和可诱导表达的Cas蛋白基因的大肠杆菌工程菌株，插入靶标序列的crRNA表达质粒，以及等位交换底物和靶标质粒。本发明将CRISPR‑Cas系统与重组工程整合使用，建立一种快速且无痕的体内质粒编辑方法，可方便快捷地在大肠杆菌中对质粒进行基因删除、点突变和片段插入，以及建立质粒突变库。

Description

一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及质粒编辑系统，特别涉及一种用于体内改造质粒的CRISPR/Cas和λRed重组系统。

背景技术

重组工程是一种基于核酸同源重组原理的生物技术，利用噬菌体重组蛋白来促进由单链DNA(ssDNA)或线性化双链DNA(dsDNA)介导的体内同源重组。目前，已被广泛应用于多种原核生物的基因组DNA、BAC以及质粒DNA的改造，包括突变、删除或者插入。但是，该技术存在重组效率较低的问题，需要添加筛选标记(如抗生素)来筛选重组子，而后去掉筛选标记则需利用两步法或引入序列特异性重组酶切除抗性标签(抗性基因两边有同向的两个短的DNA序列可以被特定的重组酶识别)，切除后仍会留下一个短的能够被重组酶识别的DNA序列。这使重组操作更复杂且耗时长，很难得到一个真正的无痕突变株。为解决重组效率低以及实现无痕改造细菌基因组DNA，重组工程偶联CRISPR-Cas系统是一种简单有效的方式。

RNA引导的CRISPR-Cas核酸内切酶系统，作为原核生物的一种获得性免疫系统，当前已成为一种高效的基因编辑工具。Cas12a(亦称为Cpf1)，属于II类V型CRISPR系统内切酶，是一种双重核酸酶，可切割RNA使之形成成熟的向导crRNA，亦可识别PAM区(5’-YTN-3’)并在crRNA引导下切割靶向DNA。CRISPR-Cas12a系统被广泛应用于对细菌、植物以及哺乳动物等诸多物种进行基因编辑。我们已利用CRISPR系统偶联λRed重组系统在大肠杆菌、鼠疫杆菌以及分枝杆菌中实现基因编辑操作。

质粒，作为一种非常有用的工具，常用于研究细胞基因组信息以及表达异源基因和信号通路基因。随着分子生物学技术日益发展，已有许多方法可用于体外、体内质粒克隆，甚至大片段克隆也不再是难题。但是，对大质粒进行遗传操作，比如点突变、删除、替换以及插入，仍很困难。基于重组工程的质粒编辑技术可以有效地解决上述问题。该方法可对质粒进行定点精准改造，勿需考虑是否存在限制性内切酶位点。但是，由于重组效率低下，常利用筛选标记或反向筛选元件来筛选重组子。而且，多聚体质粒的形成以及同一细胞内重组质粒和原始质粒的并存问题也限制该方法的应用。

发明内容

针对传统同源重组系统构建质粒过程中存在的上述问题，本发明旨在建立一种高效的体内质粒编辑系统和方法，可方便快捷地实现删除、点突变、替换及片段插入，并能够应用于突变文库的建立。

为实现本发明目的，本发明首先提供一种用于质粒编辑的大肠杆菌工程菌株，所述工程菌株HsdR功能缺失，且在其基因组中整合有可诱导表达的λRed重组蛋白基因和可诱导表达的Cas蛋白基因。

在本发明的一个实施例中，提供了一种上述大肠杆菌工程菌株SY4539，其构建如图1所示，通过同源重组方法将阿拉伯糖启动子及其调控的基因Cas12a整合至大肠杆菌DY331基因组，进一步利用基因敲除方法in-frame删除hsdR。

上述λRed重组蛋白含Gam、Beta和Exo蛋白，这三个蛋白共同介导双链DNA等位交换底物的同源重组，其中Beta蛋白介导单链DNA等位交换底物的同源重组。优选的，上述λRed重组蛋白可由温度敏感启动子驱动表达。

所述Cas蛋白，可为Cas9、Cas12a等，例如在本发明实施例中为Cas12a。优选的，所述Cas蛋白可以在阿拉伯糖启动子的驱动下进行表达。

HsdR的功能缺失导致菌株细胞内的I型限制酶EcoK活性缺失，以利于外源DNA导入及质粒转化。

进一步地，本发明提供一种利用上述菌株快速进行体内质粒无痕编辑的系统，包含pAC-crRNA质粒(crRNA表达质粒)、等位交换底物和靶标质粒。所述pAC-crRNA质粒含有组成型启动子驱动的直接重复序列(Direct Repeats)-间隔序列(Spacers)-直接重复序列(Direct Repeats)单元，其中所述间隔序列包含靶标序列连入位点，所述靶标序列连入位点可以是包含两个或更多个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点。

优选的，当所述Cas蛋白是Cas12a时，所述pAC-crRNA质粒上的直接重复序列如序列表中SEQ ID No：28所示，长36bp，富含回文序列能够形成发卡结构。

本发明实施例中提供的pAC-crRNA质粒在两个直接重复序列(Direct Repeats)之间含有靶标序列连入所需的BpmI和/或BsaI酶切位点的多克隆位点区域(MCS)，以便根据实际应用的需要，在此连入位点通过酶切连接方法连入靶标序列。

优选的，上述pAC-crRNA质粒中由启动子负责驱动直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元。上述pAC-crRNA质粒中还含有选择标记基因，所述选择标记基因可以是抗性基因Cm、Km、Str等，根据实际应用时靶标质粒的抗性特性，选择与之适应的含不同抗性基因的pAC-crRNA质粒，例如在本发明的实施例中使用的是pAC-crRNA-Cm。

进一步的，上述pAC-crRNA质粒还包含复制起点p15A ori。

优选的，所述pAC-crRNA质粒上还含有负选择标记基因，如SacB等。

上述等位交换底物为单链DNA或线性双链DNA。作为等位交换底物的单链DNA可以是针对靶标序列的靶向前导链的单链DNA寡核苷酸，也可以是针对靶标序列的靶向后随链的单链DNA寡核苷酸，突变位点两端有同源序列。作为等位交换底物的线性双链DNA，其上下游具有同源臂片段。

上述靶标质粒为目标改造质粒。

利用本发明的质粒编辑系统在本发明的菌株中进行无痕质粒编辑，具体操作包括以下步骤：

1)构建crRNA表达质粒：在pAC-crRNA质粒的间隔序列中连入靶标序列，所述靶标序列是针对靶标质粒的靶标基因编辑位点的DNA序列；

2)制备针对靶标质粒的靶标基因的等位交换底物；

3)制备所述大肠杆菌工程菌株的感受态细胞，将靶标质粒、crRNA表达质粒和等位交换底物转入感受态细胞中；

4)筛选出重组阳性克隆；

5)通过负筛法使crRNA表达质粒丢失，得到被编辑的靶标质粒最终克隆。

上述步骤1)具体可包括以下步骤：

1-1)针对需要编辑的靶标基因，根据靶标基因内部的PAM区(5’-YTN-3’，其中Y代表C或T，N代表A、C、T、G中的任一种)，选择位于PAM区3’端末尾的18～30bp(优选25bp)作为靶标序列，设计并合成正向和反向的寡核苷酸；

1-2)将合成的正向和反向的寡核苷酸磷酸化后退火，得到退火产物；

1-3)将退火产物连入酶切后的pAC-crRNA载体中，并转化宿主菌，经PCR和测序验证后得到crRNA表达质粒。

上述步骤2)中所述等位交换底物可以是ssDNA，也可以dsDNA。

对于ssDNA介导的重组实验，设计寡链核苷酸含突变位点和两端同源序列，文献表明靶向后随链的ssDNA重组效率更高，本发明中前导链、后随链略有差异，统计学分析差异不显著。

对于dsDNA介导的重组实验，将目的片段插入载体，需在目的片段上下游添加同源臂(长度30～300bp或≥30bp均可)。同源臂长度为30～50bp时，可通过设计在片段引物5’端直接合成，PCR扩增获得dsDNA；同源臂长度＞50bp时，可通过Gibson cloning构建含目的片段及两端同源臂的中间质粒，再以其为模板PCR扩增获得dsDNA。

上述步骤3)可以通过电转化法或化学转化法将靶标质粒、crRNA表达质粒和等位交换底物导入工程菌株中。

上述步骤4)根据靶标基因的不同采用不同的筛选方法。

优选的，上述步骤5)采用SacB负筛法。

本发明进一步提供一种建立质粒突变库的方法，基于目的片段设计随机引物，采用该方法进行质粒编辑，得到质粒突变库。

本发明将CRISPR-Cas系统与重组工程整合使用，建立一种快速且无痕的体内质粒编辑方法。该方法可方便快捷地在大肠杆菌中对质粒进行基因删除、点突变和片段插入，可建立质粒突变库。用于同源重组的等位交换底物可以是单链DNA，也可以是线性双链DNA。其最大优点在于：可将此方法应用于质粒编辑，不受酶切位点限制，不存在多聚体质粒以及原始质粒和重组质粒并存的问题，时间周期短。化学转化的可行性则进一步降低了成本，同时扩大了该方法的使用范围。

附图说明

图1.大肠杆菌工程菌株SY4539的构建示意图。

图2.本发明提供的体内质粒编辑方法的实施流程图。

图3.本发明实施例1～3对质粒进行编辑的转化效率和重组效率结果，其等位交换底物为ssDNA，其转化方式为电转化法，其中：A为实施例1的实验结果，B为实施例2的实验结果，C为实施例3的实验结果。

图4.本发明实施例5对质粒pUC19进行插入编辑的转化效率和重组效率结果，其等位交换底物为dsDNA。

图5.本发明实施例2中对质粒pJV53-GFPm1进行GFP回复编辑的转化效率和重组效率结果，其转化方式为化学转化法。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议条件。

一、体内质粒编辑系统的构建方法

1.大肠杆菌工程菌株SY4539的构建

具体步骤如下：

1)整合Cas12a至大肠杆菌DY331(来自Donald L.Court’s lab的馈赠)基因组：参见图1中A，将AroA编码序列及其上下游200bp左右(上游195bp，下游197bp)从基因组克隆至质粒pUC57-hyg，随后将阿拉伯糖启动子及Cas12a的编码序列反向无缝克隆至上述质粒，构建质粒为pUC57-hyg-Cas12a。以质粒pUC57-hyg-Cas12a为模板，PCR获得阿拉伯糖启动子、Cas12a编码序列和两端含500bp左右同源臂(上游是590bp，下游是530bp)的同源片段。同时构建靶向aroA的crRNA质粒。将所述同源片段和crRNA质粒转入含pKD46-Cpf1-Amp质粒的感受态细胞中，筛选重组子。利用SacB负筛法丢质粒后得到整合有阿拉伯糖启动子和Cas12a的菌株SY4172。

2)构建hsdR的突变株：如图1中B所示，在菌株SY4172中，利用其自身携带的λRed重组蛋白，转入oligo(寡核苷酸，79bp)，筛选出阳性重组子(成功删除hsdR编码区域840bp)，丢质粒后得到菌株SY4539。

2.crRNA质粒的构建

i.根据靶标质粒的编辑位点的DNA序列5’-YTN-N₂₅-3’(其中Y代表C或T，N代表A、C、T、G中的任一种)，其中N₂₅为靶标序列，设计并合成针对上述位点的crRNA，其序列为正向oligo 5’-T-N₂₅-GT-3’，反向oligo 5’-N₂₅-ATC-3’。

ii.将合成的上述正、反向oligo磷酸化后退火(95℃保持5min后以5min/℃缓慢降温至25℃)，将得到的退火产物用ddH₂O稀释10倍待用。

iii.将上述稀释后的退火产物与BpmI酶切后的载体pAC-crRNA-Cm(或pAC-crRNA-Km等系列抗性质粒，均来自本实验室构建，参见Yan,M.Y.,Yan,H.Q.,Ren,G.X.,Zhao,J.P.,Guo,X.P.and Sun,Y.C.(2017)CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering inBacteria.Appl Environ Microbiol,83.DOI:10.1128/AEM.00947-17)按一定比例(50:1的摩尔比)混合，加入T4连接酶，25℃5min。

iv.将上述连接产物转化至DH5α感受态细胞中，PCR和测序验证后得到crRNA表达质粒。

3.等位交换底物的设计

等位交换底物可以是ssDNA，也可以dsDNA。

i.ssDNA介导的重组实验中，设计寡链核苷酸含突变位点和两端同源序列。文献表明靶向后随链的ssDNA重组效率更高，本发明中前导链、后随链略有差异，统计学分析差异不显著。

ii.dsDNA介导的重组实验中，将目的片段插入载体，需在目的片段上下游添加同源臂(长度30～300bp)。同源臂长度为30～50bp时，可通过设计在目的片段引物5’端直接合成，PCR扩增获得dsDNA；同源臂长度＞50bp时，可通过Gibson cloning构建含目的片段及两端同源臂的中间质粒，再以其为模板PCR扩增获得dsDNA。

4.感受态细胞的制备

i.电转感受态的制备：挑选单克隆于4mL培养基中，30℃，培养16-18h。1:25转接饱和菌液，OD为0.2时加入诱导剂20％阿拉伯糖。继续培养至0.4-0.5之间，42℃水浴摇床热激15min，立即放置冰上静置10～15min。6500g，4℃离心7min，收集菌体。随后预冷ddH₂O洗涤菌体两次，最终1/100初始培养体积的预冷10％水甘油重悬菌体后分装50μL/EP管待用。

ii.化转感受态的制备：常规CaCl₂法制备感受态。

5.转化及重组子的筛选

50ng靶标质粒、200ng crRNA表达质粒和1μg ssDNA(或700ng dsDNA)混匀后冰置，随后转入50μL感受态细胞中。电转条件为：1.8kV,200Ohm,25μF。随后立即加入1mL LB30℃复苏2h。化转条件为42℃热激30s，冰置5min后加入1mL LB 30℃复苏2h。而后将100μL复苏原液和梯度稀释液分别涂布在含相应抗生素和0.2％阿拉伯糖的LB平板上，30℃培养22-24h后经PCR筛选出阳性克隆。

对于重组效率较低的构建，可采取预筛选方式提高其重组效率。复苏的1mL菌液扩大培养转接至4mL含相应抗生素和0.2％阿拉伯糖的LB中，待生长至饱和状态，原液和梯度稀释液分别涂布在含相应抗生素和0.2％阿拉伯糖的LB平板上，30℃培养22-24h后经PCR筛选出阳性克隆。

6.crRNA表达质粒的丢失

利用SacB负筛法，将重组单克隆放入1mL无抗LB中吹匀涂布7％蔗糖板，30℃24h，单克隆划线于无抗平板和氯霉素抗性板，仅在无抗板生长的克隆即为最终克隆。

二、利用本发明的体内质粒编辑系统对靶标质粒进行片段替换、突变、删除和插入

实施例1.质粒pJV53-GFP的片段替换

1)寻找质粒pJV53-GFP上GFP编码基因的crRNA作用位点，序列为T1、T2、T3；针对每一个位点，合成正、反向oligo，其序列见表1中SEQ ID No：1和2，4和5，7和8。正、反向oligo利用T4多核苷酸激酶(NEB)磷酸化(37℃，30min)后退火(95℃，5min后以5min/℃缓慢降温至25℃)，连入BpmI酶切后的pAC-crRNA载体，构建相应的crRNA表达质粒。

2)设计用于同源重组实现替换的等位交换底物oligo 1、2、3，其序列见表1中SEQID No：3、6、9。

3)制备SY4539电转感受态细胞。

4)将上述crRNA表达质粒、原始靶标质粒pJV53-GFP和等位交换底物oligo转入步骤3)制备的感受态细胞，加入20％阿拉伯糖诱导Cas12a的表达从而进行筛选，并进一步分析转化子。

5)对筛选出的白色转化子进行PCR测序验证。

等位交换底物内含终止密码子，替换原始靶标质粒上GFP的相应氨基酸编码序列，含编辑成功的重组质粒的宿主菌呈白色，只含原始靶标质粒的宿主菌为绿色。对比无CRISPR-Cas筛选压力的0.20％重组率，筛选后重组效率可大幅度提升至90％左右(见图3中A)。每组随机选20个白色转化子进行测序，结果表明在T1位点成功替换的有17个，在T2位点成功替换的有19个，在T3位点成功替换的有18个，将这些成功替换的质粒命名为pJV53-GFPm。因该原始质粒为多拷贝质粒，故白色转化子中会存在原始质粒和重组质粒并存的现象。可通过CRISPR-Cas预筛选处理去除上述假阳性转化子。

实施例2.质粒pJV53-GFPm回复突变的片段替换

1)针对上述经验证替换成功的质粒pJV53-GFPm(三个位点分别对应质粒pJV53-GFPm1、pJV53-GFPm2和pJV53-GFPm3)，寻找crRNA作用位点，序列为RT1、RT2、RT3；合成对应每个位点的正、反向oligo，其序列见表1中SEQ ID No：10和11，13和14，16和17。正、反向oligo利用T4多核苷酸激酶(NEB)磷酸化(37℃，30min)后退火(95℃，5min后以5min/℃缓慢降温至25℃)，连入BpmI酶切后的pAC-crRNA载体，构建相应的crRNA表达质粒。

2)设计用于同源重组实现替换的等位交换底物oligo R1、R2、R3，序列见表1中SEQID No：12、15、18。

3)制备SY4539电转感受态细胞。

4)将上述crRNA表达质粒、原始靶标质粒pJV53-GFPm和等位交换底物oligo转入上述感受态细胞，加入20％阿拉伯糖诱导Cas12a的表达从而进行筛选，并进一步分析转化子，其中实现回复突变的转化子为绿色转化子。

对比无CRISPR-Cas筛选压力的重组率，筛选后重组效率相应从3.65％，0.85％和2.00％分别提升至94.00％，84.00％和90.00％(见图3中B)。每组随机选20个绿色转化子进行测序，结果表明在三个位点均实现成功替换。

进一步地，选择pJV53-GFPm1进行GFP回复编辑，采取化学转化法。将靶标质粒pJV53-GFPm1转入SY4539后，制备化转感受态。将上述crRNA表达质粒和等位交换底物oligoR1转入上述感受态细胞，加入20％阿拉伯糖诱导Cas12a的表达从而进行筛选。转化效率需进一步改善，重组效率可达73.00％，预筛选处理后可高达90.00％(见图5)。

实施例3.质粒pJV53-GFP的突变

1)选取靶标质粒pJV53-GFP上GFP编码基因的crRNA作用位点(序列为T3)的crRNA表达质粒；

2)设计用于同源重组实现琥珀突变的等位交换底物oligo M1、M3、M5和M10，序列见表1中SEQ ID No：19-22，分别突变1bp，3bp，5bp和10bp。

3)制备SY4539电转感受态细胞。

4)将上述crRNA表达质粒、原始靶标质粒pJV53-GFP和等位交换底物oligo转入上述感受态细胞，加入20％阿拉伯糖诱导Cas12a的表达从而进行筛选，并进一步分析转化子。

5)对白色转化子进行PCR测序验证。

如图3中C所示，90％以上为白色转化子，进一步测序结果表明重组效率为89％(25of 28,1bp突变),91％(32of 35,3bp突变),95％(34of 36,5bp突变)和92％(26of 28,10bp突变)。

实施例4.质粒pJV53-GFP的删除

2)设计用于同源重组实现删除的等位交换底物oligo D102、D600、D801，序列见表1中SEQ ID No：25-27，分别删除102bp、600bp、801bp。该等位交换底物全长79bp，含上游同源臂(40bp)和下游同源臂(39bp)。

3)制备SY4539电转感受态细胞，

4)将上述crRNA表达质粒、质粒pJV53-GFP和等位交换底物oligo转入上述感受态细胞，加入20％阿拉伯糖诱导Cas12a的表达从而进行筛选，并进一步分析转化子。

6)对白色转化子进行PCR测序验证。

结果显示几乎全部转化子均为白色转化子，但再次培养则绝大多数不能生长，删除102bp、600bp、801bp的重组效率依次为4.35％、5.66％和1.89％，预筛选处理后可高达98.3％,98.0％和79.3％。

实施例5.质粒pUC19的片段插入

1)寻找质粒pUC19上crRNA作用位点，序列为5’-actggccgtcgttttacaacgtcgt-3’；合成对应位点的正、反向oligo crRNA for pUC19，其序列见表1中SEQ ID No：23和24。正、反向oligo利用T4polynucleotide kinase(NEB)磷酸化(37℃，30min)后退火(95℃，5min后以5min/℃缓慢降温至25℃)，连入BpmI酶切后的pAC-crRNA载体，构建相应的crRNA表达质粒。

2)设计用于同源重组实现替换的等位交换底物(目的片段为GFP编码基因)，构建同源臂长度为200bp。通过Gibson cloning构建含目的片段及两端同源臂(长度为200bp)的中间质粒，再以其为模板PCR扩增获得dsDNA。

3)制备SY4539电转感受态细胞。

4)将上述crRNA表达质粒、原始靶标质粒pUC19和等位交换底物(含有不同长度同源臂的PCR产物)转入上述感受态细胞，加入20％阿拉伯糖诱导Cas12a的表达从而进行筛选，并进一步分析转化子，其中实现GFP插入的转化子为绿色转化子。

在无CRISPR-Cas筛选、CRISPR-Cas筛选和预筛选处理三种情况下，dsDNA介导的重组效率分别为1.15％，5.10％和92.55％(见图4和表2)。

进一步地，以上述阳性重组子为模板，设计含不同同源臂长度(20bp，30bp，40bp,100bp,500bp)的一系列引物，PCR扩增获得ds20、ds30、ds40、ds100和ds500，随后进行上述转化实验。ds 20组未获得阳性重组子，其余各组重组效率经预筛选处理，其重组效率由0.50％,1.55％,3.88％和9.15％提高至75％～95％(见表2)。

表1.本发明涉及的寡核苷酸序列

表2.含不同长度同源臂的片段利用本发明系统进行质粒编辑

注：Insert，插入片段；CFU，转化子数；RE1，未经预筛选的重组效率；RE1，预筛选处理后的重组效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用

<130> WX2019-90-001

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<170> PatentIn version 3.3

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ttccgtctcc ggcgagggtg agggcggt 28

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cgccctcacc ctcgccggag acggaatc 28

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agggtcagct tgccgtaggt ggcgtcgccc gtcgcagtcg gaaccgccta gaacttgtgg 60

ccgttgacgt caccgtcca 79

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tttcaagtcc gccatgccgg agggttgt 28

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ttaggcggtt ccgactgcga cgggcggt 28

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgacgaacag gggccacaag ctggaggt 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctccagcttg tggcccctgt tcgtcatc 28

<210> 18

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gagttgtagt tgtactccag cttgtggccc aggatgttac cgtcctcctt gaagtcgatg 60

cccttcagct cgatgcggt 79

<210> 19

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc ggactagaag aagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 20

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc ggacttgacc tagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 21

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc ggactttgcc tagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 22

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcgctcctgg acgtaaccct ccggcatggc gctcgctgcc tagtcgtggc gcttcatgtg 60

gtccgggtag cgggagaag 79

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tactggccgt cgttttacaa cgtcgtgt 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtatc 28

<210> 25

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggtgtcgccc tcgaacttga cctcggcacg cgtcttgtag aagcactgga cgccgtaggt 60

cagggtggtg accagggtc 79

<210> 26

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cagctcgtcc atgccgtggg tgatgccggc ggcggtgacg ttgacgtcac cgtccagctc 60

gaccaggatc gggacgacg 79

<210> 27

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttc gtgctcattt cgggcggcga 60

atctctcggc gtcgaaatg 79

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtctaagaac tttaaataat ttctactgtt gtagat 36

Claims

1.一种体内质粒编辑系统，对靶标质粒进行体内基因编辑，其包括大肠杆菌工程菌株、pAC-crRNA质粒、等位交换底物和靶标质粒，其中：所述大肠杆菌工程菌株HsdR功能缺失，且在其基因组中整合有可诱导表达的λRed重组蛋白基因和可诱导表达的Cas蛋白基因；所述pAC-crRNA质粒含有组成型启动子驱动的直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元，其中所述间隔序列包含靶标序列连入位点；所述等位交换底物为单链DNA或线性双链DNA。

2.如权利要求1所述的体内质粒编辑系统，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株的基因组中整合的Cas蛋白基因是Cas9或Cas12a的基因，由阿拉伯糖启动子驱动表达；所述λRed重组蛋白基因由温度敏感启动子驱动表达。

3.如权利要求1所述的体内质粒编辑系统，其特征在于，所述pAC-crRNA质粒上的间隔序列包含靶标序列连入位点，所述靶标序列连入位点是包含两个或更多个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点。

4.如权利要求1所述的体内质粒编辑系统，其特征在于，所述Cas蛋白基因为Cas12a的基因，所述pAC-crRNA质粒上的直接重复序列如序列表中SEQ ID No：28所示。

5.如权利要求1所述的体内质粒编辑系统，其特征在于，所述pAC-crRNA质粒含有与靶标质粒上的选择标记基因不同的选择标记基因。

6.如权利要求1所述的体内质粒编辑系统，其特征在于，所述pAC-crRNA质粒上含有负选择标记基因。

7.如权利要求1所述的体内质粒编辑系统，其特征在于，作为等位交换底物的单链DNA是针对靶标序列的靶向前导链的单链DNA寡核苷酸，或者是针对靶标序列的靶向后随链的单链DNA寡核苷酸；作为等位交换底物的线性双链DNA，其上下游具有同源臂片段，所述同源臂片段≥30bp。

8.利用权利要求1～7任一所述的体内质粒编辑系统在菌株中进行质粒编辑的方法，包括以下步骤：

2)制备针对靶标质粒的靶标基因的等位交换底物；

4)筛选出重组阳性克隆；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)具体包括：

1-1)针对需要编辑的靶标基因，根据靶标基因内部的PAM区选择位于PAM区3’端末尾的18～30bp作为靶标序列，设计并合成正向和反向的寡核苷酸；

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3)通过电转化法或化学转化法将靶标质粒、crRNA表达质粒和等位交换底物导入大肠杆菌工程菌株中；步骤5)采用SacB负筛法。

11.一种建立质粒突变库的方法，基于目的片段设计随机引物，根据权利要求1～8所述的方法进行质粒编辑，得到质粒突变库。