CN110628761A - 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 - Google Patents

Abstract

细菌是代谢工程中的主要宿主，基因组编辑是细菌工程改造的主要途径，而现有的针对细菌的基因组编辑方法都需要过表达外源的同源重组系统或非同源末端连接系统。本发明公开了一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法。本发明所提供的基因组编辑方法是按照包括以下步骤进行：构建一个双质粒基因组编辑系统，通过转化将该系统导入待编辑的菌株。将含有基因组编辑系统的菌株在液体培养基中培养使其进行繁殖，待细胞数目足够时加入诱导剂诱导CRISPR/Cas9系统表达，随后发生DNA双链切割和修复，实现基因组编辑。本发明先通过细胞繁殖增加细胞的数量和活性再启动基因组编辑，显著提高了基因组编辑效率，并成功在大肠杆菌中实现了基因敲除和大片段删除。

Description

一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法

技术领域

本发明涉及一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

合成生物学是21世纪最重要的生物技术平台，合成生物学在生物能源、生物材料、生物医药、生物修复等领域具有广泛的应用。基因组编辑技术与DNA组装技术、定向进化技术一起组成合成生物学的三大前沿技术。

细菌是合成生物学中的主要宿主生物，对微生物的代谢工程改造是合成生物学中必不可少的环节，而基因组编辑又是细菌代谢工程改造的主要手段。

CRISPR/Cas9技术已经被广泛应用于细菌的基因组编辑，多种基于CRISPR/Cas9技术的细菌基因组编辑方法已被报道。这些方法的原理可以简单概括为：Cas9-sgRNA复合体特异性识别目标DNA并切割产生DNA双链断裂，随后断裂的DNA被修复系统所修复，在修复的过程中完成基因组编辑。然而，这些针对细菌的基因组编辑方法都依赖外源的同源重组系统或非同源末端连接系统来修复被Cas9蛋白切割的基因组DNA，这个限制到目前为止尚未被打破。产生这种依赖的原因是，大部分细菌內源的同源重组系统和非同源末端连接系统在修复DNA双链断裂时活性很弱，这一点与酵母等真核生物不同。

为了打破细菌基因组编辑所受到的这种限制，本发明提出了一种新的方法。使用严谨性强的诱导型启动子控制Cas9和sgRNA的表达，这样一来，只有当加入诱导剂时，CRISPR/Cas9系统才会启动，在此之前，细胞能够正常生长，而不会因为Cas9的切割而死亡。在诱导Cas9和sgRNA表达之前，通过一段时间的液体培养让细胞增殖，在这个过程中，细胞的数量和活性增加。加入诱导剂之后，CRISPR/Cas9系统启动并产生DNA双链断裂，随后细胞內源的DNA修复系统将断裂的DNA修复，实现基因组编辑。绝大部分的细胞因为DNA修复失败而死亡，但由于细胞的基数足够大，仍有大量的修复成功的细胞存活下来。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单高效的细菌基因组编辑方法，解除已有方法对外源修复系统的依赖，加快细菌代谢工程改造的进程。

按照本发明提供的技术方案，一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，采用以下方法步骤：

1.构建一个以质粒为载体的基因组编辑系统，该系统由Cas9编码基因和sgRNA编码基因组成，Cas9编码基因和sgRNA编码基因由诱导型启动子控制。

2.将负载了基因组编辑系统的质粒转化至待编辑的宿主菌株中，得到的转化子在液体培养基中培养使细胞增殖。

3.待细胞增殖至指数期，加入诱导剂诱导Cas9蛋白和sgRNA表达。

4.诱导2–3小时后，将菌液以不同的稀释度涂在含有诱导剂的平板上。

5.从步骤4中的平板上挑取单菌落做PCR验证，获得正确的编辑菌株。

附图说明

图1为针对大肠杆菌构建的双质粒基因组编辑系统。(a)质粒p15A-P_BAD-Cas9的图谱。该质粒用于表达Cas9蛋白。(b,c)质粒pSC101-P_BAD-sgRNA的图谱。该质粒用于表达sgRNA，分为只表达一种sgRNA的pSC101-P_BAD-sgRNA质粒(如图1b)和同时表达两种sgRNA的pSC101-P_BAD-sgRNA质粒(如图1c)。

图2为pSC101-P_BAD-sgRNA质粒的构建流程图

图3为在大肠杆菌中进行基因敲除的流程图

图4为在大肠杆菌中进行基因组大片段敲除的流程图

图5为基因敲除和大片段删除的结果图。(a,b,c)敲除lacZ基因。(d,e)删除81kb基因组片段。

序列表

序列1为质粒pSC101-P_BAD-sgRNA-T1

序列2为质粒pSC101-P_BAD-sgRNA-T2

序列3为质粒pSC101-P_BAD-sgRNA-T3

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。

以下实例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施实例1：在大肠杆菌MG1655菌株中敲除lacZ基因

构建质粒p15A-P_BAD-Cas9，如图1a。该质粒以p15A为复制子，以卡那霉素抗性基因为筛选标记，质粒上带有P_BAD启动子控制的Cas9编码基因。该质粒只需要构建一次，进行其他的基因敲除时无需重复构建。

构建表达一种sgRNA的质粒pSC101-P_BAD-sgRNA，如图1b。该质粒以pSC101为复制子，以氨苄青霉素抗性基因为筛选标记，质粒上带有一个P_BAD启动子控制的sgRNA编码基因。该质粒专门用于敲除lacZ基因，其表达的sgRNA特异性靶向lacZ基因的开放阅读框。若要敲除其他基因，则需重新构建表达其他sgRNA的pSC101-P_BAD-sgRNA质粒。

构建pSC101-P_BAD-sgRNA质粒之前，需要先选择合适的靶向位点，靶向位点必须位于待敲除基因的开放阅读框内，靶向位点的选择原则为(1)效率高(2)脱靶率低。选择靶向位点可借助专门的网站或软件等工具，这里利用的是网站https:// chopchop.cbu.uib.no/#。选择的靶向位点序列为5’-cagtatccccgtttacagggcgg-3’，由protospacer(20bp)和PAM(3bp)组成。在pSC101-P_BAD-sgRNA质粒中，spacer序列为靶向位点中的protospacer序列，即cagtatccccgtttacaggg。

构建pSC101-P_BAD-sgRNA质粒时，如图2a所示，以质粒pSC101-P_BAD-sgRNA-T1为模版，以F1和R1为引物，通过PCR扩增得到含有spacer序列的DNA片段。PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix(2×)25μL，引物1(10μM)1μL，引物2(10μM)1μL，模板10ng/μL 1μL，蒸馏水22μL。PCR程序为：98度变性10秒、56度退火10秒、72度延伸1分20秒(35个循环)；72度延伸2分钟。PCR产物通过胶回收的方式纯化(赛默飞GENEJET RNA PURIFICATION KIT EA)，随后用Dpn1酶(赛默飞FastDigest Dpn1)37度消化40分钟除去纯化产物中残留的模板质粒。利用Gibson组装将DNA片段自连，获得带有spacer序列的pSC101-P_BAD-sgRNA质粒。Gibson组装体系为：1.33×Master Mix 7.5μL，200ng/μL DNA 1μL，蒸馏水1.5μL。取5μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，转化产物涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，30度过夜培养后从平板上挑取单菌落验证。

进行基因组编辑时，如图3所示，先将质粒p15A-P_BAD-Cas9转化至MG1655感受态细胞中，在转化产物中加入1mL SOC培养基，37度复苏40分钟后转接至装有4mL LB培养基(含卡那霉素)的摇菌管中，37度培养。当培养至细胞生长指数期时(OD₆₀₀为0.4–0.6)，制备感受态细胞，并将质粒pSC101-P_BAD-sgRNA转化至感受态细胞中，在转化产物中加入1mL SOC培养基，30度复苏40分钟后转接至装有4mL LB培养基(含卡那霉素、氨苄青霉素和葡萄糖)的摇菌管中，30度过夜培养。取1mL过夜培养物转接至装有4mL LB培养基(含卡那霉素和氨苄青霉素)的摇菌管中，30度培养1小时后加入L-阿拉伯糖诱导Cas9和sgRNA表达，继续30度培养2–3小时后取菌液以不同的稀释度涂LB平板(含卡那霉素、氨苄青霉素和L-阿拉伯糖)，30度过夜培养后从平板上挑取单菌落验证。菌落PCR结果和测序结果如图5所示。

获得lacZ基因敲除成功的菌落后，若要进行新一轮的基因编辑，则将该菌落接种至LB培养基(含卡那霉素)，42度培养8小时除去温敏型质粒pSC101-P_BAD-sgRNA后再转入新的pSC101-P_BAD-sgRNA质粒；若不进行新一轮的基因编辑，则将该菌落接种至LB培养基(不含抗生素)，40度培养20小时除去质粒p15A-P_BAD-Cas9和pSC101-P_BAD-sgRNA。

以上操作过程中所用到的卡那霉素、氨苄青霉素和L-阿拉伯糖的工作浓度分为别0.05g/L、0.1g/L和3g/L。LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L(固体培养基：琼脂20g/L)。SOC培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，硫酸镁10mM，葡萄糖20mM。

实施实例2：在大肠杆菌MG1655菌株中敲除81kb基因组片段。

构建质粒p15A-P_BAD-Cas9，同[0025]。

构建表达两种sgRNA的质粒pSC101-P_BAD-sgRNA，如图1c。该质粒以pSC101为复制子，以氨苄青霉素抗性基因为筛选标记，质粒上带有两个P_BAD启动子控制的sgRNA编码基因。该质粒表达的sgRNA特异性靶向81kb基因组片段的两端。若要删除其他的基因组片段，则需重新构建表达其他sgRNA的pSC101-P_BAD-sgRNA质粒。

构建pSC101-P_BAD-sgRNA质粒时，如图2b所示，以质粒pSC101-P_BAD-sgRNA-T2为模版，以F2和R2为引物，通过PCR扩增得到第一个DNA片段；以质粒pSC101-P_BAD-sgRNA-T3为模版，以F3和R3为引物，通过PCR扩增得到第二个DNA片段。PCR产物通过胶回收的方式纯化和Dpn1酶消化后利用Gibson组装将两个DNA片段连接，获得带有两种spacer序列的pSC101-P_BAD-sgRNA质粒。取5μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，转化产物涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，30度过夜培养后从平板上挑取单菌落验证。

进行基因组编辑时，同[0029]，如图4所示。菌落PCR结果和测序结果如图5所示。

序列表

<110> 北京理工大学

苏州工业园区洛加大先进技术研究院

<120> 一种基于细菌内源末端连接系统的基因组编辑方法

<141> 2019-09-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3893

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

tcagatcctt ccgtatttag ccagtatgtt ctctagtgtg gttcgttgtt tttgcgtgag 60

ccatgagaac gaaccattga gatcatactt actttgcatg tcactcaaaa attttgcctc 120

aaaactggtg agctgaattt ttgcagttaa agcatcgtgt agtgtttttc ttagtccgtt 180

acgtaggtag gaatctgatg taatggttgt tggtattttg tcaccattca tttttatctg 240

gttgttctca agttcggtta cgagatccat ttgtctatct agttcaactt ggaaaatcaa 300

cgtatcagtc gggcggcctc gcttatcaac caccaatttc atattgctgt aagtgtttaa 360

atctttactt attggtttca aaacccattg gttaagcctt ttaaactcat ggtagttatt 420

ttcaagcatt aacatgaact taaattcatc aaggctaatc tctatatttg ccttgtgagt 480

tttcttttgt gttagttctt ttaataacca ctcataaatc ctcatagagt atttgttttc 540

aaaagactta acatgttcca gattatattt tatgaatttt tttaactgga aaagataagg 600

caatatctct tcactaaaaa ctaattctaa tttttcgctt gagaacttgg catagtttgt 660

ccactggaaa atctcaaagc ctttaaccaa aggattcctg atttccacag ttctcgtcat 720

cagctctctg gttgctttag ctaatacacc ataagcattt tccctactga tgttcatcat 780

ctgagcgtat tggttataag tgaacgatac cgtccgttct ttccttgtag ggttttcaat 840

cgtggggttg agtagtgcca cacagcataa aattagcttg gtttcatgct ccgttaagtc 900

atagcgacta atcgctagtt catttgcttt gaaaacaact aattcagaca tacatctcaa 960

ttggtctagg tgattttaat cactatacca attgagatgg gctagtcaat gataattact 1020

agtccttttc ctttgagttg tgggtatctg taaattctgc tagacctttg ctggaaaact 1080

tgtaaattct gctagaccct ctgtaaattc cgctagacct ttgtgtgttt tttttgttta 1140

tattcaagtg gttataattt atagaataaa gaaagaataa aaaaagataa aaagaataga 1200

tcccagccct gtgtataact cactacttta gtcagttccg cagtattaca aaaggatgtc 1260

gcaaacgctg tttgctcctc tacaaaacag accttaaaac cctaaaggct taagtagcac 1320

cctcgcaagc tcggttgcgg ccgcaatcgg gcaaatcgct gaatattcct tttgtctccg 1380

accatcaggc acctgagtcg ctgtcttttt cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct 1440

ctggcagtga atgggggtaa atggcactac aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa 1500

ctacccataa tacaagaaaa gcccgtcacg ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg 1560

ctatgtggtg ctatctgact ttttgctgtt cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc 1620

tgaccacttc ggattatccc gtgacaggtc attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc 1680

agcggtatca tcaacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 1740

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 1800

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 1860

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 1920

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gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 2040

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 2100

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 2160

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 2220

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 2280

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 2340

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 2400

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ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 2580

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 2640

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 2700

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gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 3000

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<211> 2998

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

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<211> 3942

<212> DNA

<213> Escherichia coli

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accatcaggc acctgagtcg ctgtcttttt cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct 1440

ctggcagtga atgggggtaa atggcactac aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa 1500

ctacccataa tacaagaaaa gcccgtcacg ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg 1560

ctatgtggtg ctatctgact ttttgctgtt cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc 1620

tgaccacttc ggattatccc gtgacaggtc attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc 1680

agcggtatca tcaacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 1740

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 1800

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agtagggata acagggtaat 1860

acttttcata ctcccgccat tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca tcagacattg 1920

ccgtcactgc gtcttttact ggctcttctc gctaaccaaa ccggtaaccc cgcttattaa 1980

aagcattctg taacaaagcg ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca aaagtgtcta 2040

taatcacggc agaaaagtcc acattgatta tttgcacggc gtcacacttt gctatgccat 2100

agcattttta tccataagat tagcggatcc tacctgacgc tttttatcgc aactctctac 2160

tgtttctcca tttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 2220

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 2280

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 2340

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 2400

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 2460

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 2520

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 2580

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 2640

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 2700

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 2760

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 2820

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 2880

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 2940

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 3000

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 3060

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 3120

caaatagggg ttccgcggca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg 3180

ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 3240

cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 3300

cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtcgactct 3360

agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga 3420

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 3480

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 3540

cagtcgggaa acctgtcata acaccgtgcg tgttgactat tttacctctg gcggtgataa 3600

tggttgcgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 3660

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttagcat ccaaactcga gtaaggatca ttaaggatcc 3720

catggtacgc gtgctagagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct 3780

ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccccatg 3840

ggtatggaca gttttccctt tgatatgtaa cggtgaacag ttgttctact tttgtttgtt 3900

agtcttgatg cttcactgat agatacaaga gccataagaa cc 3942

Claims (6)

1.一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，其特征是将负载了基因组编辑系统的质粒转化至宿主细胞之后先不启动基因组编辑系统，而是通过细胞繁殖增加细胞的数量和活性，细胞繁殖一段时间之后再启动基因组编辑系统，通过CRISPR/Cas9系统对DNA的切割和內源末端连接系统对DNA的修复实现对细菌基因组的高效编辑。

2.如权利要求1所述一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，其特征在于采用如下步骤：

A.构建一个以质粒为载体的基因组编辑系统,该系统由Cas9编码基因和sgRNA编码基因组成，Cas9编码基因和sgRNA编码基因由诱导型启动子控制；

B.将负载了基因组编辑系统的质粒转化至待编辑的宿主菌株中，得到的转化子在液体培养基中培养使细胞增殖；

C.待细胞增殖至指数期，加入诱导剂诱导Cas9蛋白和sgRNA表达；

D.诱导2–3小时后，将菌液以不同的稀释度涂在含有诱导剂的平板上；

E.从步骤D中的平板上挑取单菌落做PCR验证，获得正确的编辑菌株。

3.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤A中，所述的质粒载体为单质粒载体或双质粒载体，所述的诱导型启动子包括但不限于P_BAD等所有严谨性强的诱导型启动子。

4.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤A中，构建基因组编辑系统时，只利用Cas9编码基因和sgRNA编码基因，而没有利用任何λ-Red等外源修复蛋白的编码基因，所利用的Cas9包括SpCas9和所有SpCas9的突变体。

5.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤B中，所述的宿主菌株包括但不限于大肠杆菌等所有可以采用CRISPR/Cas9技术的细菌菌株。

6.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤C中，诱导剂诱导发生在细胞增殖至指数期时。