CN110628761A - 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 - Google Patents
一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110628761A CN110628761A CN201910922002.9A CN201910922002A CN110628761A CN 110628761 A CN110628761 A CN 110628761A CN 201910922002 A CN201910922002 A CN 201910922002A CN 110628761 A CN110628761 A CN 110628761A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- genome editing
- bacterial
- cas9
- sgrna
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
细菌是代谢工程中的主要宿主,基因组编辑是细菌工程改造的主要途径,而现有的针对细菌的基因组编辑方法都需要过表达外源的同源重组系统或非同源末端连接系统。本发明公开了一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法。本发明所提供的基因组编辑方法是按照包括以下步骤进行:构建一个双质粒基因组编辑系统,通过转化将该系统导入待编辑的菌株。将含有基因组编辑系统的菌株在液体培养基中培养使其进行繁殖,待细胞数目足够时加入诱导剂诱导CRISPR/Cas9系统表达,随后发生DNA双链切割和修复,实现基因组编辑。本发明先通过细胞繁殖增加细胞的数量和活性再启动基因组编辑,显著提高了基因组编辑效率,并成功在大肠杆菌中实现了基因敲除和大片段删除。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
合成生物学是21世纪最重要的生物技术平台,合成生物学在生物能源、生物材料、生物医药、生物修复等领域具有广泛的应用。基因组编辑技术与DNA组装技术、定向进化技术一起组成合成生物学的三大前沿技术。
细菌是合成生物学中的主要宿主生物,对微生物的代谢工程改造是合成生物学中必不可少的环节,而基因组编辑又是细菌代谢工程改造的主要手段。
CRISPR/Cas9技术已经被广泛应用于细菌的基因组编辑,多种基于CRISPR/Cas9技术的细菌基因组编辑方法已被报道。这些方法的原理可以简单概括为:Cas9-sgRNA复合体特异性识别目标DNA并切割产生DNA双链断裂,随后断裂的DNA被修复系统所修复,在修复的过程中完成基因组编辑。然而,这些针对细菌的基因组编辑方法都依赖外源的同源重组系统或非同源末端连接系统来修复被Cas9蛋白切割的基因组DNA,这个限制到目前为止尚未被打破。产生这种依赖的原因是,大部分细菌內源的同源重组系统和非同源末端连接系统在修复DNA双链断裂时活性很弱,这一点与酵母等真核生物不同。
为了打破细菌基因组编辑所受到的这种限制,本发明提出了一种新的方法。使用严谨性强的诱导型启动子控制Cas9和sgRNA的表达,这样一来,只有当加入诱导剂时,CRISPR/Cas9系统才会启动,在此之前,细胞能够正常生长,而不会因为Cas9的切割而死亡。在诱导Cas9和sgRNA表达之前,通过一段时间的液体培养让细胞增殖,在这个过程中,细胞的数量和活性增加。加入诱导剂之后,CRISPR/Cas9系统启动并产生DNA双链断裂,随后细胞內源的DNA修复系统将断裂的DNA修复,实现基因组编辑。绝大部分的细胞因为DNA修复失败而死亡,但由于细胞的基数足够大,仍有大量的修复成功的细胞存活下来。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单高效的细菌基因组编辑方法,解除已有方法对外源修复系统的依赖,加快细菌代谢工程改造的进程。
按照本发明提供的技术方案,一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,采用以下方法步骤:
1.构建一个以质粒为载体的基因组编辑系统,该系统由Cas9编码基因和sgRNA编码基因组成,Cas9编码基因和sgRNA编码基因由诱导型启动子控制。
2.将负载了基因组编辑系统的质粒转化至待编辑的宿主菌株中,得到的转化子在液体培养基中培养使细胞增殖。
3.待细胞增殖至指数期,加入诱导剂诱导Cas9蛋白和sgRNA表达。
4.诱导2–3小时后,将菌液以不同的稀释度涂在含有诱导剂的平板上。
5.从步骤4中的平板上挑取单菌落做PCR验证,获得正确的编辑菌株。
附图说明
图1为针对大肠杆菌构建的双质粒基因组编辑系统。(a)质粒p15A-PBAD-Cas9的图谱。该质粒用于表达Cas9蛋白。(b,c)质粒pSC101-PBAD-sgRNA的图谱。该质粒用于表达sgRNA,分为只表达一种sgRNA的pSC101-PBAD-sgRNA质粒(如图1b)和同时表达两种sgRNA的pSC101-PBAD-sgRNA质粒(如图1c)。
图2为pSC101-PBAD-sgRNA质粒的构建流程图
图3为在大肠杆菌中进行基因敲除的流程图
图4为在大肠杆菌中进行基因组大片段敲除的流程图
图5为基因敲除和大片段删除的结果图。(a,b,c)敲除lacZ基因。(d,e)删除81kb基因组片段。
序列表
序列1为质粒pSC101-PBAD-sgRNA-T1
序列2为质粒pSC101-PBAD-sgRNA-T2
序列3为质粒pSC101-PBAD-sgRNA-T3
具体实施方式
下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获取。
以下实例是对本发明的进一步说明,并不构成对本发明实质内容的限制。
实施实例1:在大肠杆菌MG1655菌株中敲除lacZ基因
构建质粒p15A-PBAD-Cas9,如图1a。该质粒以p15A为复制子,以卡那霉素抗性基因为筛选标记,质粒上带有PBAD启动子控制的Cas9编码基因。该质粒只需要构建一次,进行其他的基因敲除时无需重复构建。
构建表达一种sgRNA的质粒pSC101-PBAD-sgRNA,如图1b。该质粒以pSC101为复制子,以氨苄青霉素抗性基因为筛选标记,质粒上带有一个PBAD启动子控制的sgRNA编码基因。该质粒专门用于敲除lacZ基因,其表达的sgRNA特异性靶向lacZ基因的开放阅读框。若要敲除其他基因,则需重新构建表达其他sgRNA的pSC101-PBAD-sgRNA质粒。
构建pSC101-PBAD-sgRNA质粒之前,需要先选择合适的靶向位点,靶向位点必须位于待敲除基因的开放阅读框内,靶向位点的选择原则为(1)效率高(2)脱靶率低。选择靶向位点可借助专门的网站或软件等工具,这里利用的是网站https:// chopchop.cbu.uib.no/#。选择的靶向位点序列为5’-cagtatccccgtttacagggcgg-3’,由protospacer(20bp)和PAM(3bp)组成。在pSC101-PBAD-sgRNA质粒中,spacer序列为靶向位点中的protospacer序列,即cagtatccccgtttacaggg。
构建pSC101-PBAD-sgRNA质粒时,如图2a所示,以质粒pSC101-PBAD-sgRNA-T1为模版,以F1和R1为引物,通过PCR扩增得到含有spacer序列的DNA片段。PCR反应体系为:PrimerSTAR Max Premix(2×)25μL,引物1(10μM)1μL,引物2(10μM)1μL,模板10ng/μL 1μL,蒸馏水22μL。PCR程序为:98度变性10秒、56度退火10秒、72度延伸1分20秒(35个循环);72度延伸2分钟。PCR产物通过胶回收的方式纯化(赛默飞GENEJET RNA PURIFICATION KIT EA),随后用Dpn1酶(赛默飞FastDigest Dpn1)37度消化40分钟除去纯化产物中残留的模板质粒。利用Gibson组装将DNA片段自连,获得带有spacer序列的pSC101-PBAD-sgRNA质粒。Gibson组装体系为:1.33×Master Mix 7.5μL,200ng/μL DNA 1μL,蒸馏水1.5μL。取5μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中,转化产物涂在含有氨苄青霉素的LB平板上,30度过夜培养后从平板上挑取单菌落验证。
进行基因组编辑时,如图3所示,先将质粒p15A-PBAD-Cas9转化至MG1655感受态细胞中,在转化产物中加入1mL SOC培养基,37度复苏40分钟后转接至装有4mL LB培养基(含卡那霉素)的摇菌管中,37度培养。当培养至细胞生长指数期时(OD600为0.4–0.6),制备感受态细胞,并将质粒pSC101-PBAD-sgRNA转化至感受态细胞中,在转化产物中加入1mL SOC培养基,30度复苏40分钟后转接至装有4mL LB培养基(含卡那霉素、氨苄青霉素和葡萄糖)的摇菌管中,30度过夜培养。取1mL过夜培养物转接至装有4mL LB培养基(含卡那霉素和氨苄青霉素)的摇菌管中,30度培养1小时后加入L-阿拉伯糖诱导Cas9和sgRNA表达,继续30度培养2–3小时后取菌液以不同的稀释度涂LB平板(含卡那霉素、氨苄青霉素和L-阿拉伯糖),30度过夜培养后从平板上挑取单菌落验证。菌落PCR结果和测序结果如图5所示。
获得lacZ基因敲除成功的菌落后,若要进行新一轮的基因编辑,则将该菌落接种至LB培养基(含卡那霉素),42度培养8小时除去温敏型质粒pSC101-PBAD-sgRNA后再转入新的pSC101-PBAD-sgRNA质粒;若不进行新一轮的基因编辑,则将该菌落接种至LB培养基(不含抗生素),40度培养20小时除去质粒p15A-PBAD-Cas9和pSC101-PBAD-sgRNA。
以上操作过程中所用到的卡那霉素、氨苄青霉素和L-阿拉伯糖的工作浓度分为别0.05g/L、0.1g/L和3g/L。LB培养基的配方为:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L(固体培养基:琼脂20g/L)。SOC培养基的配方为:胰蛋白胨20g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠0.5g/L,氯化钾2.5mM,氯化镁10mM,硫酸镁10mM,葡萄糖20mM。
实施实例2:在大肠杆菌MG1655菌株中敲除81kb基因组片段。
构建质粒p15A-PBAD-Cas9,同[0025]。
构建表达两种sgRNA的质粒pSC101-PBAD-sgRNA,如图1c。该质粒以pSC101为复制子,以氨苄青霉素抗性基因为筛选标记,质粒上带有两个PBAD启动子控制的sgRNA编码基因。该质粒表达的sgRNA特异性靶向81kb基因组片段的两端。若要删除其他的基因组片段,则需重新构建表达其他sgRNA的pSC101-PBAD-sgRNA质粒。
构建pSC101-PBAD-sgRNA质粒时,如图2b所示,以质粒pSC101-PBAD-sgRNA-T2为模版,以F2和R2为引物,通过PCR扩增得到第一个DNA片段;以质粒pSC101-PBAD-sgRNA-T3为模版,以F3和R3为引物,通过PCR扩增得到第二个DNA片段。PCR产物通过胶回收的方式纯化和Dpn1酶消化后利用Gibson组装将两个DNA片段连接,获得带有两种spacer序列的pSC101-PBAD-sgRNA质粒。取5μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中,转化产物涂在含有氨苄青霉素的LB平板上,30度过夜培养后从平板上挑取单菌落验证。
进行基因组编辑时,同[0029],如图4所示。菌落PCR结果和测序结果如图5所示。
序列表
<110> 北京理工大学
苏州工业园区洛加大先进技术研究院
<120> 一种基于细菌内源末端连接系统的基因组编辑方法
<141> 2019-09-20
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3893
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
tcagatcctt ccgtatttag ccagtatgtt ctctagtgtg gttcgttgtt tttgcgtgag 60
ccatgagaac gaaccattga gatcatactt actttgcatg tcactcaaaa attttgcctc 120
aaaactggtg agctgaattt ttgcagttaa agcatcgtgt agtgtttttc ttagtccgtt 180
acgtaggtag gaatctgatg taatggttgt tggtattttg tcaccattca tttttatctg 240
gttgttctca agttcggtta cgagatccat ttgtctatct agttcaactt ggaaaatcaa 300
cgtatcagtc gggcggcctc gcttatcaac caccaatttc atattgctgt aagtgtttaa 360
atctttactt attggtttca aaacccattg gttaagcctt ttaaactcat ggtagttatt 420
ttcaagcatt aacatgaact taaattcatc aaggctaatc tctatatttg ccttgtgagt 480
tttcttttgt gttagttctt ttaataacca ctcataaatc ctcatagagt atttgttttc 540
aaaagactta acatgttcca gattatattt tatgaatttt tttaactgga aaagataagg 600
caatatctct tcactaaaaa ctaattctaa tttttcgctt gagaacttgg catagtttgt 660
ccactggaaa atctcaaagc ctttaaccaa aggattcctg atttccacag ttctcgtcat 720
cagctctctg gttgctttag ctaatacacc ataagcattt tccctactga tgttcatcat 780
ctgagcgtat tggttataag tgaacgatac cgtccgttct ttccttgtag ggttttcaat 840
cgtggggttg agtagtgcca cacagcataa aattagcttg gtttcatgct ccgttaagtc 900
atagcgacta atcgctagtt catttgcttt gaaaacaact aattcagaca tacatctcaa 960
ttggtctagg tgattttaat cactatacca attgagatgg gctagtcaat gataattact 1020
agtccttttc ctttgagttg tgggtatctg taaattctgc tagacctttg ctggaaaact 1080
tgtaaattct gctagaccct ctgtaaattc cgctagacct ttgtgtgttt tttttgttta 1140
tattcaagtg gttataattt atagaataaa gaaagaataa aaaaagataa aaagaataga 1200
tcccagccct gtgtataact cactacttta gtcagttccg cagtattaca aaaggatgtc 1260
gcaaacgctg tttgctcctc tacaaaacag accttaaaac cctaaaggct taagtagcac 1320
cctcgcaagc tcggttgcgg ccgcaatcgg gcaaatcgct gaatattcct tttgtctccg 1380
accatcaggc acctgagtcg ctgtcttttt cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct 1440
ctggcagtga atgggggtaa atggcactac aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa 1500
ctacccataa tacaagaaaa gcccgtcacg ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg 1560
ctatgtggtg ctatctgact ttttgctgtt cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc 1620
tgaccacttc ggattatccc gtgacaggtc attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc 1680
agcggtatca tcaacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 1740
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 1800
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 1860
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 1920
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 1980
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 2040
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 2100
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 2160
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 2220
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 2280
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 2340
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 2400
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 2460
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 2520
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 2580
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 2640
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 2700
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 2760
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcggc acagatgcgt 2820
aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 2880
gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 2940
gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 3000
tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 3060
cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 3120
catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 3180
attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcat agggataaca 3240
gggtaatact tttcatactc ccgccattca gagaagaaac caattgtcca tattgcatca 3300
gacattgccg tcactgcgtc ttttactggc tcttctcgct aaccaaaccg gtaaccccgc 3360
ttattaaaag cattctgtaa caaagcggga ccaaagccat gacaaaaacg cgtaacaaaa 3420
gtgtctataa tcacggcaga aaagtccaca ttgattattt gcacggcgtc acactttgct 3480
atgccatagc atttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac 3540
tctctactgt ttctccatgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 3600
ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgcttagca tccaaactcg agtaaggatc 3660
attaaggatc ccatggtacg cgtgctagag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 3720
agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa 3780
tccgccccat gggtatggac agttttccct ttgatatgta acggtgaaca gttgttctac 3840
ttttgtttgt tagtcttgat gcttcactga tagatacaag agccataaga acc 3893
<210> 2
<211> 2998
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cacacttttc 1200
atactcccgc cattcagaga agaaaccaat tgtccatatt gcatcagaca ttgccgtcac 1260
tgcgtctttt actggctctt ctcgctaacc aaaccggtaa ccccgcttat taaaagcatt 1320
ctgtaacaaa gcgggaccaa agccatgaca aaaacgcgta acaaaagtgt ctataatcac 1380
ggcagaaaag tccacattga ttatttgcac ggcgtcacac tttgctatgc catagcattt 1440
ttatccataa gattagcgga tcctacctga cgctttttat cgcaactctc tactgtttct 1500
ccatcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 1560
gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 1620
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 1680
actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 1740
acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 1800
cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 1860
gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 1920
cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 1980
gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 2040
tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 2100
tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 2160
gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 2220
aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctgcac agatgcgtaa ggagaaaata 2280
ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 2340
ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 2400
ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc 2460
atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg taatcatgtc 2520
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 2580
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 2640
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcataa caccgtgcgt gttgactatt 2700
ttacctctgg cggtgataat ggttgcgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 2760
ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttagcatc caaactcgag 2820
taaggatcat taaggatccc atggtacgcg tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct 2880
cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 2940
aggacaaatc cgccctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcga 2998
<210> 3
<211> 3942
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
tcagatcctt ccgtatttag ccagtatgtt ctctagtgtg gttcgttgtt tttgcgtgag 60
ccatgagaac gaaccattga gatcatactt actttgcatg tcactcaaaa attttgcctc 120
aaaactggtg agctgaattt ttgcagttaa agcatcgtgt agtgtttttc ttagtccgtt 180
acgtaggtag gaatctgatg taatggttgt tggtattttg tcaccattca tttttatctg 240
gttgttctca agttcggtta cgagatccat ttgtctatct agttcaactt ggaaaatcaa 300
cgtatcagtc gggcggcctc gcttatcaac caccaatttc atattgctgt aagtgtttaa 360
atctttactt attggtttca aaacccattg gttaagcctt ttaaactcat ggtagttatt 420
ttcaagcatt aacatgaact taaattcatc aaggctaatc tctatatttg ccttgtgagt 480
tttcttttgt gttagttctt ttaataacca ctcataaatc ctcatagagt atttgttttc 540
aaaagactta acatgttcca gattatattt tatgaatttt tttaactgga aaagataagg 600
caatatctct tcactaaaaa ctaattctaa tttttcgctt gagaacttgg catagtttgt 660
ccactggaaa atctcaaagc ctttaaccaa aggattcctg atttccacag ttctcgtcat 720
cagctctctg gttgctttag ctaatacacc ataagcattt tccctactga tgttcatcat 780
ctgagcgtat tggttataag tgaacgatac cgtccgttct ttccttgtag ggttttcaat 840
cgtggggttg agtagtgcca cacagcataa aattagcttg gtttcatgct ccgttaagtc 900
atagcgacta atcgctagtt catttgcttt gaaaacaact aattcagaca tacatctcaa 960
ttggtctagg tgattttaat cactatacca attgagatgg gctagtcaat gataattact 1020
agtccttttc ctttgagttg tgggtatctg taaattctgc tagacctttg ctggaaaact 1080
tgtaaattct gctagaccct ctgtaaattc cgctagacct ttgtgtgttt tttttgttta 1140
tattcaagtg gttataattt atagaataaa gaaagaataa aaaaagataa aaagaataga 1200
tcccagccct gtgtataact cactacttta gtcagttccg cagtattaca aaaggatgtc 1260
gcaaacgctg tttgctcctc tacaaaacag accttaaaac cctaaaggct taagtagcac 1320
cctcgcaagc tcggttgcgg ccgcaatcgg gcaaatcgct gaatattcct tttgtctccg 1380
accatcaggc acctgagtcg ctgtcttttt cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct 1440
ctggcagtga atgggggtaa atggcactac aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa 1500
ctacccataa tacaagaaaa gcccgtcacg ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg 1560
ctatgtggtg ctatctgact ttttgctgtt cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc 1620
tgaccacttc ggattatccc gtgacaggtc attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc 1680
agcggtatca tcaacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 1740
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 1800
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agtagggata acagggtaat 1860
acttttcata ctcccgccat tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca tcagacattg 1920
ccgtcactgc gtcttttact ggctcttctc gctaaccaaa ccggtaaccc cgcttattaa 1980
aagcattctg taacaaagcg ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca aaagtgtcta 2040
taatcacggc agaaaagtcc acattgatta tttgcacggc gtcacacttt gctatgccat 2100
agcattttta tccataagat tagcggatcc tacctgacgc tttttatcgc aactctctac 2160
tgtttctcca tttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 2220
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 2280
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 2340
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 2400
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 2460
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 2520
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 2580
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 2640
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 2700
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 2760
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 2820
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 2880
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 2940
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 3000
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 3060
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 3120
caaatagggg ttccgcggca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg 3180
ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 3240
cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 3300
cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtcgactct 3360
agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga 3420
aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 3480
tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 3540
cagtcgggaa acctgtcata acaccgtgcg tgttgactat tttacctctg gcggtgataa 3600
tggttgcgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 3660
aaaaagtggc accgagtcgg tgcttagcat ccaaactcga gtaaggatca ttaaggatcc 3720
catggtacgc gtgctagagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct 3780
ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccccatg 3840
ggtatggaca gttttccctt tgatatgtaa cggtgaacag ttgttctact tttgtttgtt 3900
agtcttgatg cttcactgat agatacaaga gccataagaa cc 3942
Claims (6)
1.一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,其特征是将负载了基因组编辑系统的质粒转化至宿主细胞之后先不启动基因组编辑系统,而是通过细胞繁殖增加细胞的数量和活性,细胞繁殖一段时间之后再启动基因组编辑系统,通过CRISPR/Cas9系统对DNA的切割和內源末端连接系统对DNA的修复实现对细菌基因组的高效编辑。
2.如权利要求1所述一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,其特征在于采用如下步骤:
A.构建一个以质粒为载体的基因组编辑系统,该系统由Cas9编码基因和sgRNA编码基因组成,Cas9编码基因和sgRNA编码基因由诱导型启动子控制;
B.将负载了基因组编辑系统的质粒转化至待编辑的宿主菌株中,得到的转化子在液体培养基中培养使细胞增殖;
C.待细胞增殖至指数期,加入诱导剂诱导Cas9蛋白和sgRNA表达;
D.诱导2–3小时后,将菌液以不同的稀释度涂在含有诱导剂的平板上;
E.从步骤D中的平板上挑取单菌落做PCR验证,获得正确的编辑菌株。
3.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,其特征在于步骤A中,所述的质粒载体为单质粒载体或双质粒载体,所述的诱导型启动子包括但不限于PBAD等所有严谨性强的诱导型启动子。
4.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,其特征在于步骤A中,构建基因组编辑系统时,只利用Cas9编码基因和sgRNA编码基因,而没有利用任何λ-Red等外源修复蛋白的编码基因,所利用的Cas9包括SpCas9和所有SpCas9的突变体。
5.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,其特征在于步骤B中,所述的宿主菌株包括但不限于大肠杆菌等所有可以采用CRISPR/Cas9技术的细菌菌株。
6.如权利要求2所述的一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法,其特征在于步骤C中,诱导剂诱导发生在细胞增殖至指数期时。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910922002.9A CN110628761A (zh) | 2019-09-27 | 2019-09-27 | 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910922002.9A CN110628761A (zh) | 2019-09-27 | 2019-09-27 | 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110628761A true CN110628761A (zh) | 2019-12-31 |
Family
ID=68973190
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910922002.9A Pending CN110628761A (zh) | 2019-09-27 | 2019-09-27 | 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110628761A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111139258A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-12 | 义乌市颂健生物科技有限公司 | 一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒 |
CN112746075A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-05-04 | 山东大学 | 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用 |
CN114107302A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-03-01 | 山东启邦汇康生物技术有限公司 | 一种用于细菌的CRISPR-Cas9基因编辑载体及其应用 |
CN114231547A (zh) * | 2020-09-09 | 2022-03-25 | 中国科学院微生物研究所 | CRISPR/Cas9系统的一种新应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016054326A1 (en) * | 2014-10-01 | 2016-04-07 | The General Hospital Corporation | Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair |
CN109022476A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-12-18 | 天津科技大学 | 一种地衣芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用 |
CN109706109A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-05-03 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用 |
-
2019
- 2019-09-27 CN CN201910922002.9A patent/CN110628761A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016054326A1 (en) * | 2014-10-01 | 2016-04-07 | The General Hospital Corporation | Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair |
CN109022476A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-12-18 | 天津科技大学 | 一种地衣芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用 |
CN109706109A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-05-03 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CHAOYONG HUANG等: "CRISPR-Cas9-assisted native end-joining editing offers a simple strategy for efficient genetic engineering in Escherichia coli", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111139258A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-12 | 义乌市颂健生物科技有限公司 | 一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒 |
CN114231547A (zh) * | 2020-09-09 | 2022-03-25 | 中国科学院微生物研究所 | CRISPR/Cas9系统的一种新应用 |
CN112746075A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-05-04 | 山东大学 | 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用 |
CN114107302A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-03-01 | 山东启邦汇康生物技术有限公司 | 一种用于细菌的CRISPR-Cas9基因编辑载体及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110628761A (zh) | 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 | |
CN110669779A (zh) | 一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法 | |
CN102959078B (zh) | 内源启动子在表达异源蛋白中的用途 | |
KR101778174B1 (ko) | 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제 | |
DK3108014T3 (en) | Methods and systems for rapid detection of microorganisms using recombinant bacteriophage | |
CA2794817C (en) | Cell suitable for fermentation of a mixed sugar composition | |
KR101027755B1 (ko) | 바이러스 생산용 불멸화된 조류 세포주 | |
Pham et al. | Growth and energy metabolism in aerobic fed‐batch cultures of Saccharomyces cerevisiae: Simulation and model verification | |
DK2970926T3 (en) | GENMANIPULATION OF MICROorganisms | |
DK2718440T3 (en) | NUCLEASE ACTIVITY PROTEIN, FUSION PROTEINS AND APPLICATIONS THEREOF | |
AU2013337574B2 (en) | Cytochrome P450 and cytochrome P450 reductase polypeptides, encoding nucleic acid molecules and uses thereof | |
US20040003420A1 (en) | Modified recombinase | |
CN113874501A (zh) | 使用碱基编辑器进行靶向诱变 | |
JPH10506013A (ja) | ヒトの凝固第viii因子及びフォンビルブラント因子を発現するトランスジェニック動物 | |
KR20220031642A (ko) | 인공 항원-특이적 면역조절 T (airT) 세포 | |
JPS63501616A (ja) | 改良された酵母菌株 | |
NZ312285A (en) | TNF-alpha converting enzyme (TACE) | |
CN107287236B (zh) | 一种人急性胰腺炎小鼠模型的构建方法 | |
KR20140043890A (ko) | 조절된 유전자 발현 시스템 및 그의 작제물 | |
CN112322512A (zh) | 基于crispr技术改造酿酒酵母利用dl-蛋氨酸合成s-腺苷蛋氨酸的方法 | |
KR100552634B1 (ko) | 돼지의 유로플라킨 ⅱ 유전자의 프로모터 및 이를 이용한유용단백질의 생산 방법 | |
CA2539262C (en) | Promoter for the epidermis-specific transgenic expression in plants | |
Guarna et al. | Effect of cDNA copy number on secretion rate of activated protein C | |
EP1395612A2 (en) | Modified recombinase | |
CN109971693A (zh) | 一种可视的连续空间定向进化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20191231 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |