JPS63501616A

JPS63501616A - 改良された酵母菌株

Info

Publication number: JPS63501616A
Application number: JP61506357A
Authority: JP
Inventors: ロジャース，デービッド・ティー; スゾスタック，ジャック・ダブリュー
Original assignee: ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド
Priority date: 1985-11-08
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1988-06-23
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: DK350287D0; IL80510A0; DE3688743T2; PT83701B; DD265426A5; ES2002659A6; EP0245481A1; WO1987003006A1; BR8606980A; OA08631A; CN86108803A; PT83701A; NO872735L; ZA868495B; MA20812A1; CA1312567C; AU613307B2; JP2619865B2; GR862687B; DE3688743D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

改良された酵母菌株発明の分野本発明は酵母、特に比較的高い二酸化炭素およびエタノール産生速度を有するパン酵母およびビール酵母に関する。たとえば二酸化炭素の発生速度が高いｆ’ｌどパン酵母にとってより速やかな発酵が得られ、あるいはエタノール産生速度が高いほどビール酵毎にとって醸造時間が短縮される。また本発明は制御下に転写ブロックを取り除くことにより遺伝子発現を制御するための新規な手段に関する。酵母は最も古い培養プラン）・０１つである。それらの利用は紀元前約２０００年にさかのぼる。種々の酵母属のうちではサツカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａａ　）が経済的にも実用上も最も賞賛である。これはベーキング、醸造およびワイン製造工業に、ならびにバイオマス産生に広く用いられているからである。たとえばジー・リード、（ジョン・ワイター・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９８４年）を碇照されたい。発酵における酵母の主要な（唯一ではない）機能は、二酸化炭素およびエタノールを供給することである。目的とする二酸化炭素およびエタノール産生速度を得るために十分な酵母をドウ、ワード（麦芽汁）その他の発酵可能な基質に添加しなければならない。活性の高い酵母を用いるほどより少量の酵母を使用でき、これに応じて原価が低くなる。酵母の発酵力を改良するために現在も研究努力がなされている。乾燥酵母および湿潤酵母いずれの形態もそれらの二酸化炭素産生能を高めて（１１発酵時間を短縮しおよび／または（２）より少量の酵母を可能にするために改良することができる。これらはベーキングおよび醗造において考慮すべき原価要因である。酵母の発酵力の改良はまた、より安定な活性乾燥酵母（ＡＤＹ）の形態の調製をより魅力的なものにする。一般に新鮮な酵母培養物からＡＤＹを調製する際に約４０％の発酵能が失われる。この問題を除き、または軽減する方法が絶えずめられている。乾燥酵母の活性を改良するための一方法は、乾燥法または酵母菌株の乾燥性を改質して、乾燥に際して起こる活性損失を防止することによる。プロセス改良がなされ、この問題に古典的な遺伝学的取組みが施されて、ある程度の成果が得られた。たとえば米国特許第３，９９３，７８３号明細書を参照されたい。低活性の乾燥酵母という問題を解決するための他の取組みについては米国特許第４，４２０，５６３号明細書に記載されている。特に糖分の高い甘いドウにおいて改良された発酵活性をもつ酵母が、増殖中の酵母培養物に増殖後期、に塩類を漸増添加することにより製造された。本発明はあらゆる酵母菌株の二酸化炭素およびエタノール産生活性を高める遺伝学的および化学的に誘発された改良法を目的とする。発明の要約ここには酵母により産生される二酸化炭素、エタノールその他の発酵生成物（たとえばクエン酸）の産生率を高める方法が開示される。一般にこれらの方法は酵母細胞中のＡＴＰ水準を低下させ、これにより解糖を刺激することを伴う。本発明の一観点においては、酵母遺伝子型において代謝酵素をコードする遺伝子の天然プロモーターを、調節可能なプロモーターに置換しくたとえばシングルコピーもしくはマルチコピーベクターにより、または酵母ゲノム中への同時挿入（ｃｏｔｎｔｇｇｒａ百錦）により）、こうしてこの酵素の調節発現を可能圧し、これによりこの酵素が触媒する代謝反応をＡＴＰが消費される逆反応と同時に進行させることによって、ＡＴＰ水準が低下する。本発明の他の観点においては、修飾は酵母遺伝子型に代謝酵素をコードする遺伝子を挿入することをも伴う。ただしこの場合はこの遺伝子の構成性発現を可能にするプロモーターの発現制御下に行われ、これＫよりこの酵素が触媒する代謝反応をＡＴＰか消費される逆反応と同時に進行させることができる。本発明の他の修飾は、代謝酵素をコードする遺伝子を修飾して、たとえば酵素のアロステリックその他の抑制または不活化を防止し、または除くことによる。一形態においては酵素はＦＤＰアーゼである。ＦＤＰアーゼ遺伝子の付加的な突然変異を誘発し、これによりこの酵素のＳ−デー１２に対するコドンをセリン以外のアミノ酸に対するコドンと置換するか、あるいはこれによりたとえばＡＭＰおよび／またはフルクトース−２，６−ジホスフェートによるアロステリック抑制を低下させ、または除去する。他の形態においては、遺伝学的修飾は細胞外ＡＰアーゼに関する遺伝子を、たとえばリーダー配列をコードする部分の遺伝子の除去により修飾することを伴う。これにより、修飾された簿累は酵母の細胞質内に留まジ、細胞内ＡＴＰの加水分解を触媒する。本発明によシ与えられる一利点は、遺伝学的修飾がパン発酵（１ｍαマー％ｉｎｇ　）期間中（好ツしくけ初期）にのみ“活動”し、酵母の生産水準における増殖中には活動しないことである。これはパン酵母においては重要な利点である。あるいは遺伝学的修飾が構成性発現可能でちゃ、これによりこの修飾全発酵生成物（たとえばエタノール）の産生増加のための大規模生産（すなわち酵母の商業的規模での増殖）に際して活動させることができる。遺伝学的修飾の調節は温度感受性プロモーター、または特定の物質の存在によって誘発されるプロモーターの使用により達成され、これにより酵素はあらかじめ定められた温度において、またはその物質の存在によってのみ発現する。あるいは発現制御はここに詳述するＦＬＰ遺伝子構造を酵母ゲノムに挿入することによって与えられる。これらの方法に有用なベクターには、セントロメア（動原体）を含むシングルコピープラスミド、および酵母２μ複製原点を含むマルチコピープラスミド、ならびに酵母ゲノムへのこれらの同時挿入を可能にするベクターが含まれる。本発明はさらに、ＡＴＰ消費を直接的もしくは間接的に誘発し５る化学物質と共に酵母を増殖させるか、または酵母をこれと接触させることによってＡＴＰ水準を低下させる方法をも包含する。この種の化学物質には比較的小型の有機分子および蛋白質、たとえば酵母キラートキシンが含まれる。本発明はさらに、ここｉＣ開示される方法により製造された遺伝学的に修飾された酵母をも包含する。最後に本発明は異種（ｈｅｔａｒｏｌｏｇｏｕｚ　）遺伝子を酵母、細菌、ならびにより高等の真核細胞、たとえば植物細胞および咄乳動物細胞において制御された発現を行うための方法ならびにベクター系をも包含する。図面の簡単な説明第１図はＧａ１ｌプロモーターからの発現ＦＬＰ遺伝子を含む挿入酵母プラスミドの構成を示す。第２図は大腸菌（Ｅ、ｃａｌｉ）　からのβ−ｇａＬコード部位に融合したＧａｌプロモーターを含む酵母プラスミドを示す。第３図はグルコース制限増殖下におけるＧａｇ　ｌ　プロモーターからのＩ−ガラクトシダーゼ活性の誘発を示す。第４図は調節された部位特異性組換えによる異種遺伝子の消失を示す。第５図は酵母ＦＤＰアーゼ遺伝子を発現するＧＰＤＨプロモーターからの転写ブロックの消失を示す。第６図ハＳａｌ　１／Ｂｇｌ　Ｉ［制限部位が結合した発現ブロックを含むプラスミドを示す。第７図は複製原点ならびに酵母および大腸菌双方に対する選択可能なマーカーを含む発現ベクターの構成を示す。第８図はクローン化された酵母ＦＤＰアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。第９ＡおよびＢ図はそれぞれクローン化ＦＤＰアーゼ′＃素の推定アミノ酸配列、およびブタＦＤＰアーゼのアミノ酸配列を示す。第１０図は異種プロモーターからの発現のためのＦＤＰアーゼカ七ッドツト成を示す。第１１図はＦＤＰアーゼがＧＰＤＨプロモーターが１現する発現ベクターの合成を示す。第１２図はＦＤＰアーゼの７ミノ末端欠失の構成を示す。第１３図はプロティンキナーゼ認識部位のセリン残基をアラニンと交換することにつき示す。第１４図は野生型ＦＤＰアーゼまたはアミノ末端欠失ＦＤＰアーゼを発現する酵母培養物の発酵に際しての二酸化炭素の発生を示す。第１５図はサイクリックＡＭＰ依存性プロティンキナーゼに対する認識部位が欠如したＦＤＰアーゼ発現酵母培養物の発酵に際しての二酸化炭素の発生を示す。第１６図はガス発生試販に用いた装置を示す。第１７図は非リン酸化ＦＤＰアーゼ酵素に関する遺伝子を発現する酵母菌株のガス発生力の改良を示す。第１８図は酵母発現ベクター中への酵母酸性ホスファターゼプロモーターの導入を示す。第１９図は酵母酸性ホスファターゼプロモーターのＤＮＡ配列および酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）に関する構造遺伝子の開始部位を示す。第２０図は酸性ホスファターゼプロモーターの３′末端におけるユニークＥｇｌｆＪ部位の導入を示す。第２１図は成熟蛋白質発現に関する酸性ホスファターゼ遺伝子中への制限部位の導入を示す。第２２図は酸性ホスファターゼプロモーターカラの、成熟散性ホスファターゼ遺伝子を発現する発現ベクターの合成を示す。第２３図は修飾された酸性ホスファターゼ遺伝子を含むプラスミド中への酵母セントロメアの導入を示す。詳細な説明酵母の解糖経路については長年広く研究されてきた。ロミセス属菌の分子生物学：代謝および遺伝子発現（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、ニューヨーク）を参照されたい。糖類の解糖代謝はエネルギーおよびバイオマス転化双方の見地からみてきわめて非効率的な過程である。それにもかがわらず酵母は好気的増殖の酸化的リン酸化によるよシも、エネルギーが基質レベルのリン酸化に由来する嫌気的解糖による方がいっそう速やかに増殖する。本発明に至る研究の過程で、本発明者らは解糖速度が酵母の細胞レベルにおけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によって調節されていることを見出した。ある種の酵素工程においてはＡＴＰの調節的役割が認められているが、本発明者らの知るところでは解糖についてこれまで広範な研究がなされてきたにもかかわらず、解糖経路全体におけるＡＴＰの調節的役割はこれまで証明されて２らず、示役すらされていないのであるから、この知見は全く意外でめった。不発明は細胞形質ＡＴＰの細胞レベルを低下させるための修飾を施し、こうして解糖を刺激し、これにより酵母による二酸化炭素およびエタノールの発生速度を高めることによって、上記の知見を利用している。前記のようにパン酵母はパン発簿中のその二酸化炭素産生ｆ［を高めることができれば改良されるでろろう。ビール酵母も発酵（すなわちアルコール産生）速度を高め、醸造過程に必要な時間を短縮することによって改良されるであろう。本発明により修飾させた酵母を用いて発酵過程テノハイオマス産生を低下させることによジェタノール産生のための発酵過程も改良された。本発明は、細胞内ＡＴＰ水準の異常な低下によって解糖速度を調節することによりこれらの改良を行うための修飾を提供する。１細胞内ＡＴＰ水準の異常な低下”とは、単に本発明方法により誘発された低下を意味する。解糖に付随する酵素は普通は過剰であるので、解糖速度は後記の研究に際して見出されたように、特定の解糖酵素の細胞内代謝産物（細胞内アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）水準を含む）ＶＣよるアロステリック抑制によって制限される可能性がある。従って本発明に従って細胞内ＡＴＰ水準を低下させると解糖が促進され、これによって二酸化炭素およびエタノールの放出速度が高まり、バイオマスの産生は低下する。しかしパン酵母の場合、酵母のこの変化が正常な増殖に際して作動するならば、酵母はバイオマス産生時にはきわめて非効率的であろう。従って商業的に酵母を増殖させることが生産費の増大のため実施できないであろう。従って本発明の遺伝学的修飾がパン酵母の生産についてはそれが発酵（１ｍａｖａｎｉｎｇ　’ｉたはｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　）過程に際してのみ作用し、酵母自体の生産（増殖期）に際しては作用しないように調節することが望ましい。本発明の一つの重要な利点は、ドウ発酵期（ｄｏ％ｇルーｒｉｓｉｎｇｐにα ８−）の開始段階または最初の段階で生産増加が起こるべく遺伝学的修飾およびこれに付随する二酸化炭素産生の増大を作動させうろことである。しかしこの制限はビール酵母またはエタノール産生酵母については８蚤ではブよい。これらの場合、生産は発酵に際して同時に得られる。細胞質のＡＴＰ水準水準下低下るための幾つかの方法およびその詳細な例を以下に述べる。一般にこれらの方法にはｆｉｌ　Ａ　Ｔ　ｐ　７ｉｌ−消費する’ｆＪＯｍされた無益（ｆｕｔイ１ｍ）代謝サイクルを確立すること、（１１）調節された様式で細胞質ＡＴＰアーゼ活性を導入または増大させること、および＋ｉｎ原形質膜の機能に影響を与えることにより細胞質ＡＴＰ水準を低下させることが含まれる。以下の記述から明らかになるように、上記の方法ｍおよび（１１１は組換えＤＮＡ法により変異した遺伝子または変異した遺伝子機能を酵母菌株に導入することを伴う。上記の方法についてさらに詳述する前に、まずこの種の遺伝学的修飾を行うための道具、すなわちこれらの変化をパン酵母またはビール酵母に導入するのに適したベクター、調節されたベクターおよび方法について述べることは有用であろう。無段サイクルの導入に関与する遺伝子または細胞質酸性ホスファターゼ遺伝子を、プロモーターの転写制御下［２種の自己複製型発現ベクター、すなわちシングルコピーセントロメア含有プラスミド、筐たはマルチコピープラスミド中へクローン化することができる。わるいはＤＮＡを酵母染色体中へ組換えにより導入することもできる。さらに当技術分野で周知のように、これらのベクターは選択遺伝子および３′非コ一ド部位を含む。ベクターを酵母の一菌株中へ形質転換し、酵ｆ＆細胞を当技術分野で周知の選択プロトコールによりそのベクターを含むものＫつき選択する。そのベクターを含む選択された酵母細胞（すなわち形質転換された細胞）を適切な増殖培地中で増殖させると、プロモーターが誘発されて細胞質ＡＴＰの消費が開始する。適切な選択遺伝子は尚技術分野で周知である。選択試薬はその選択遺伝子の不在下で細胞の増殖を阻止するものであることが好ましい。大規模培養において、プラスミドを失った細胞は選択遺伝子を含まず、覚醒に際して過剰増殖することがないであろう。しかし目的生成物の商業的生産に際しては特定の細胞毒素の使用を避けることが望ましいでおろう。これによって生成物の精製工程が単純になる。従って望号しい選択遺伝子は、親株の増殖に必要な栄養素の欠如した培地で形質転換体全増殖させうるものである。本発明の実施に有用な選択遺伝子には、たとえばＵＥＡ３、ＬＥＵ２などが含まれる。ここで有用なベクターは当業者に周知の方法で合成できる。ベクターの構成９累、たとえば選択遺伝子、プロモーターなどは天然源から得られるか、あるいは後記のように合成することができる。基本的には大量に入手できる構成要素（すなわち天然プラスミド、たとえば酵母の２μプラスミド上に存在するもの、または容易に合成できるもの）を、適宜制限酵素およびＴ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼを用いて組立てることができる。、ある構成要素を大量に入手できない場合、当技術分野で周知のようにこれを細菌クローニングベクター、たとえばプラスミドまたはファージ中への挿入によって増幅することができる。その際、適宜制限酵素を使用して、当技術分野で周知の方法により、単にその細菌を培養し、適宜なエンドヌクレアーゼでそのＤＮＡを消化し、ＤＮＡ断片を分離し、目的とする構成Ｗｇを含有するＤＮＡを同定し、これを採取することにより、大量のベクターが得られる。通常は形質転換ベクターを少量組込み、次いで大量の形質転換ベクターＤＮＡ’ｚ産生ずるために適切な自己複製合成ベクター、たとえばプラスミドまたはファージにリゲートする。たとえば周知のｐＥＲ３２２プラスミドを大部分の場合採用できる。合成ベクターを用いて常法により、たとえば受容される原核生物を形質転換し、合成ベクターを高コピー数にまで複製し、合成ベクターを細胞溶解により回収し、細胞破片から合成ベクターを分離することにより、リゲートした形質転換ベクターをクローン化する。得られた合成ベクター収穫物をそのまま酵母細胞中に形質転換することができる。種々の型の酵母ベクターが容易に入手でき、適宜代替することができる（ペアレントら、イースト　（’ｒｌａａｔ）　１　：８３（１９８５））　。形質転換ベクター、ならびに種々の構成要素たとえば特定のプロモーター、ＦＤＰ遺伝子およびＦＤＰアーゼ遺伝子を含有するベクターを含む特定のベクターが１９８６年１１月５日に大腸菌ＨＢ１０．１中においてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１、パークローン・ドライブ、ロックビル、マリ−ランド２０８５２（米国））に寄託された。これには下記のものが含まれる。１、ＡＺ４０２　プラスミドはＢｇｌ　Ｈ／Ｓａ！　１　カセット内のＦＬＰ認識配列によりフランク（ｆｌａ％ｋ）されたＵＲＡ３転写ブロックを含む（ＡＴＣＣ屑６７２５７）２、ＡＵ１２５　プラスミドは作動可能な状態でＧＰＤＨプロモーターに結合したＦＤＰアーゼ遺伝子を含む（ＡＴＣＣ屑６７２５６）３、ＡＴ８２３　プラスミドはＦＤＰアーゼ遺伝子を含む４．１Ｒ９００プラスミドは作動可Ｉｉ！な状態でＧａｇ　［プロモーターに結合したＦＬＰアーゼを含む（ＧσＩＩプロモーターを他のプロモーターに置換するための制限部位が含まれる）；プラスミドはＦＤＰ遺伝子を調節発現する（ＡＴＣＣ屑６７２５９）５、ＹＯア１゛　プラスミドは選択可能な２μプラスミドの実例である（ＡＴＣＣ４６７２６０）６、Ｂ１２Ｏ３プラスミドは作動可能な状態でＧＰＤＨプロモーターに結合した突然変異誘発した（ｍａｙ−１２ｋａｌａに）ＦＤＰアーゼ遺伝子を含む（ＡＴＣＣ４６７２６１）７、Ｎ１３８　細胞質（突然変異誘発した）ＡＰアーゼ遺伝子の発現のためのマルチコピープラスミド（ＡＴＣＣ４６７２６２）８、Ｎ３０５　Ｎ１３８と類似。ただしプラスミドは酵母セントロメアを含み、従ってシングルコピープラスミドである（ＡＴＣＣ調節されたプロモーター酵母形質転換ベクターに使用できる多数のプロモーターが当技術分野で知られており、これらを本発明の笑施に際し使用することができる。ここに詳述するようＫ。調節されたプロモーター（それらの多くは当技術分野で知られている）が本発明の特定の形態に好ましい。調節された酵母プロモーターの例はガラクトース、マル）−ス、リン酸もしくは窒素代謝、イソチトクローム類およびアルコールデヒドロゲナーゼ■に由来するものである。調節されたプロモーターの詳細な例は酵母酸性ホスファターゼ（ｐｎ０５）遺伝子に由来するものである。報告によればこのプロモーターは培地中の無機ホスフェート水準に応じて作用する。強力なプロモーター、たとえば酸性ホスファターゼ（ＡＰアーゼ）Ｋ由来するものが、本発明の特定の形態（たとえば無益サイクル形成）については最適なものよりも高い発現水準を与える可能性がある。目的とする調節されたプロモーターは幾つかの方法で調節することができる。たとえば酸性ホスファターゼプロモーターのクローン化コピーをインビトロでジョートルの方法により突然変異誘発することができる（シヨ（１９８２））。あるいはプロモーター内のわずかな欠失／置換は既知の方法でリンカ−を挿入することにより行うことができる（マツフナイトおよびキンゲスバリー、６０１２（１９７８））。突然変異された酸性ホヌ７アターゼプロモーターを含むＤＮＡ断片のプールを酵母／大腸周シャトルプラスミドに挿入し、ここでプロモーターは検出可能なマーカー、たとえば大腸菌由来のＩ−ガラクトシダーゼまたはβ−ラクタマーゼ遺伝子を発現する（ガレンテおよびブタシュン、クロル・ナショナル・アカデ・サイ・ニーニスニー（Ｐｒｏｏ、ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。ＵＳＡ）、７８：２１９９（１９８１）；　ローズら、クロル・ｉ−チネツおよびカサダバン、モレ、セル、バイオ口。シルバーマンら、モレ、セル、バイオ口、（Ｍｏ１．Ｃａ１ｌ。た酵母コロニーを次いで検出可能なマーカーの産生について、たとえば５−ブロム−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−カラクトシド（Ｚ−ｇａｊ）を含有する培地上でスクリーニングする。その際、目的とする表現型は高ホスフェ−１［地上では白色コロニー、低ホスフエート培地上では淡宵色コロニーを与える。従って強いプロモーターおよび弱いプロモーターを共に同足することができる。適切な表現型を示す酵母細胞からＤＮＡを採取し、常法により大ｌｉ！ｌＪ菌中へ形質転換する。アンピシリン耐性コロニーは酵母プラスミドを含むはずである。これらの大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡが調製され、このプラスミドからの酸性ホスファターゼプロモーターが発現に用いられる。る。たとえば酸性ホスファターゼａ路のｐｋｏ　Ｒおよびｐｋｏ　Ｕ調節遺伝子に？ける多数の突然変異が、３６℃では得成性発現、２３℃では普通の調節を与えることが認められる（ウエダら、ジエイ、バクチー　（Ｊ、Ｊ？ｇｅｔ、　）　＋１２２：９１１（１９７５））。ＰＨ０５を含む目的プラスミドがｐｋａＲｌたはｐｒｏ　Ｕ温度感受性突然変異を含む酵母菌株中へ形質転換され、酸性ホスファターゼプロモーターが高ホスフェート含量培地中での培養温度を変化させること性ホス７アターゼプロモーターと組合わせて用いることもできる。不発明の修飾を調節する他の方法は、天然では酸性ホスファターゼプロモーターよりもはるかに弱い他の調節されたプロモーターを用いるものである。この種のプロモーターが数種確認されている。たとえば酵母ＨＯ遺伝における潜在交配型遺伝子の調節および転位、Ｐに、Ｄ学位論文、ニージーン、オレゴン大宇（１９７９年））。ｙａｔａ’を交配型座に、アルファカセットＨＪＩＬおよびＨＯ対立遺伝子をホモタリツク座にもつ普通の１野生型”細胞においてはＨＱプロモーターが作動するであろう。しかしこの菌株がシヱ突然変異を保有する場合は、蛤ター土ＲよびＡｆａｔ　７ｆｉｙ７７　（ｆｆＡμ由米）の双方が発現し、ＨＯプロモーターは作動しな− いであろう。従ってＨＯプロモーターが低温では発現するが高温では抑制される場合に、温度感受性Ｓｉｒ突然変異を保有する菌株を使用することができる。調節されたプロモーターはパン酵母の増殖中は１作動せず１、発酵終了時、すなわちパンのドウ甲で、酵母の培養俵件を変えることによって１作動する”。たとえばＡＰアーゼプロモーターを用いる場合、酵母は培警物が節された量のホスフェートの存在下で増殖する。この時点で、ホスフェートが発酵槽から枯渇したことによりＡＰアーゼブμモーターが誘発される。温度感受性発現系を用いる場合、プロモーターが増殖中には１作動せず”、発酵終了時に“作動する”ように温度が設定される。ＡＴＰ減少法の発現を最適なものにするための問題は、酵母の増殖中に作動セず、発酵中に作動すべく調節できるプロモーターを同定すること力Ｓ困難な点である。酵母は調節嘔れたプロモーターに影響を与える可能性のある種々の取扱い条件のだめ酵母のコンシスチンシー＜−−３−ａｉｓ＆＃％ｃｙ）を匍Ｊ＠し得ない種々の型のベーキング用に用いられるので、これは特に困難である。ＣＯ２０産生（すなわち解糖）に普通に要求されるものと同じ増殖条件によって制御されるプロモーターを用いるならば％酵母は標準的パン酵母と同じコンタステ／クーをもつはずである。残念ながら解糖遺伝子は転写によって強く調節されず、またこれらはパン酵母の増殖中に絶えず抑制されることもない。しかし増殖終了時に解糖プロモーターによりＡＴＰ減少過程の発現′！ｉ−始動させることによって、発酵はこれらの難点を見服するであろう。促りて酵母はＡＴＰを浪費することなく増殖するが、発酵過程ではＡＴＰ減少過程が解糖プロモーターから発現するのを可能にする新規な方法が提供された。これはプロモーター（たとえばＧＰＤＨプロモーター）内の転写ブロックを除去する、調節された部位特異性組換え法を採用することにより達成される。これについて以下に詳述する。この異例の発現法は多種多様の遺伝子の発現の調節に採用できることを留意すべきである。これには無益サイクルに関する酵素または細胞質ホスファターゼをコードする遺伝子が含まれるが、これらに駆足されるものではない。２ミクロンの酵母プラスミドが２個の逆行反復鎖間の部位特異性組換えを行５ことが示された（ハートレイおよびドネルラン（１９８０）ネイチャー２８６　：　８６０−８６４）。この組換えはその遺伝子が２ミクロンのプラスミド上に位置する特異的リコンビナーゼ（ＦＤＰ）によって触媒される（ブローチおよびヒックス（１９８０）セル２１：５０１　５０Ｂ））。Ｇａｇ　Ｉプｏ　％　−ｐ　−はグルコースにより抑制され、ガラクトースにより誘発さ？Ｌる（ヨカムら（１９８４）モレ、セル、バイオ口。（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｅｉｏｌ、）４：　１９８５　１９９８）。従って天然の２ミクロンプラスミドカニ失われた場合にＧａｇＩプロモーターを用いてパン酵母のＦＬＰの発現全調節するならば、ＦＤＰ遺伝子はガラクトースが存在する壇では発現しないであろう。増殖用発酵槽は普通はクラブツリー（Ｃｒａｂｔｒａｍ　）効果Ｒよびエタノール生成を防止するために、また細胞の生成を最大限にするために、グルコース制限下に操作される。本発明者らはＧａｇ　ｌプロモーターが、これらの条件下ではグルコース抑制性でないことを見出した。次いで発酵槽にガラクトースを添加することによってＧａｇ　ｌプロモーターが誘発され、その結果ＦＤＰ遺伝子が発現する。酵母の２ミクロンプラスミドのキユアリング（ｃｕｒｉｎｇ　）はたとえばエルハルトおよびホレンバーグの方法によシ行うことができる（ジエイ、バクテ、（ＪＪ？ａａＬ）１５６：６２５−６３５）。ＦＤＰ遺伝子を前記のように他の調節可能なプロモーターによって発現することもできる。従ってＦＤＰ遺伝子のクローンを分離し、調節可能なＧａｇ　ｌプロモーターから発現させた。このために酵母の２′ミクロンプラスミドｆＸｂａｌでｍ化し、次いでＨ４ｎｄ■で消化し、１，４５０＆ｐ、Ｙ６αｌ／Ｈｉ％ｄＩＩＩ断片を調製用ゲル電気泳動法によシ分離した。次いで分離された断片を、Ｇａｇ　ｌプロモーターを含む一般の酵母プラスミド中へ％Ｐｖｘ　ｌ　／　Ｓｐｈ　１部位において、ＦＬＰｆｆｉ片がＧａｇ　１プロモーターから発現する状態で挿入し、プラスミドＡＲ９００を得た（第１図）。これによりＦＬＰ遺伝子転子質がＧａ１ｌプロモーターから発現するのが可能となった。グルコース制限下での連転増殖期間中のＧａ１ｌプロモーターの調節場うにＦＤＰ遺伝子制御のための機爾としてのＧａｇ−夏プロモーターを試験するために、大腸菌出来のβ−ガラクトシダーゼコード部位に融合したＧａ１Ｋプロモーターを含むプラスミド（ｐＥＹ１７１％第２図）（ペアレントら、前掲）を笑験室酵母菌株（たとえばＫＹ１１４）のゲノム中へ挿入することにより形質転換した。この菌株をケモスタット中へ接種し、ここで酵母用最少培地中でグルコース制限下に培養物を増殖させた。培養物は倍加時間３．５時間で、４８時間の増殖にょシ安定化した。ガラクトースを発酵槽に最終濃度２チにおいて添加し、−足期間毎に試料を採取した。常法によりβ−ガラクトシダーゼ活性および蛋白質濃度を測定した（ミラー、１９７２、分子遺伝学における実験、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュ・−ヨーク；ローズら、１９８１．プロ７゜ナショナル、アカデ、サイ、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｅ仁）７８　：　２４６０−２４６４）。第３図に見られるように、Ｇａｇ　ｌプロモーターはガラクトースが存在する場合にグルコースＷｆｉＩ限された増殖条件下でβ−ガラクトシダーゼ活性を誘発した。このガラクトース誘発性ＦＤＰ遺伝子を組換え調節に使用することの実用性を調べるために、固有２ミクロンプラスミドを欠如し、酵母の２ミクロンプラスミドからの反復により７ランクされた異種遺伝子を含むプラスミドの挿入によシあらかじめ形質転換された酵母菌株（ハートレイおよびドネルンン、１９８０ネイチャー２８６：−８６０−８６４；セネコ７ら、１９８５、プロシ、ナシヨナル、アカデ、サイ、ニーニスニー（Ｐｒａｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃαｄ。Ｓｅｔ、ＵＳＡ）８２ニア２７０−７２７４；アントリユースら（１９８５）セル４０ニア９５−８０３）をＧａｇ／ＦＬＰ融合遺伝子を含むプラスミドで形質転換した。Ｇａｇ／ＦＬＰｆａ合が作動するならば、　その菌株はグルコース（Ｇａｇ　ｌプロモーターを抑制する）上で増殖させた場合、異種遺伝子を発現するはずである。しかしこの菌株をガラクトース上で増殖させた場合、異種遺伝子は組換えによシゲノムから切除され、その結果この遺伝子は消失するはずである（第４図）。グルコース培地上では９７％のコロニーがこの異種遺伝子を発現し、−万ガラクトース培地上では異種遺伝子活性を含むコロニーは０チであったので、これは災際に起こることが認められた。次いで発現ブロック、たとえば転写ブロックを含むＤＮＡ配列、たとえばＵＲＡ３　Ｈｉ％ｄ［［断片、またはサイＶ７を−（ｍｌｌｅ％６＃ｒ）領域もしくは転写ターミネータ−（ブランドら、１９８５セル２１　：　５０１−５０８）をプロモーター（たとえばＧＰＤＨプロモーター）中の上流活性化配列と翻訳開始部位の間に挿入する。この転写ブロック要素は、ＦＤＰ遺伝子産物により部位特異性組換えの基質であることが認識嘔れたＤＮＡ配列（表１に示す合成オリゴヌクレオチドとして挿入）によって７ランクされる（セネコ７う、前掲；アントリユースら、前掲）。こうしてガラクトースを増殖中の非グル；−ス抑制酵母培養物に添加することにより調節が作動する。ガラクトースはＦＤＰ蛋白質の合成を誘発し、これが発現ブロックをフランクするＤＮＡ配列間の組換え金触媒する。この組換えによって発現ブロックが除去され、これによシ異種遺伝子、たとえばＧＰＤＨプロモーター由米のＦＤＰＩ−ゼに関する遺伝子の発現が可能となる（第５図）。第６図に示す組換え部位によって囲１れたブロックは寄託されており、選ばれたプロモーター甲に当業者によって、１ずＢｙｌ　Ｉ／Ｓａ！　Ｉ　リンカ−をプロモーター配列中の発現可能な部位に、報告されている部位指向性突然変異によシ挿入しくシラーおよびスミス、ＮＡＲＮＯ：６４８７−６５００（１９８２）；メソッズ・エンサイモロ、（Ｍ＊１ａｄｒＡｌ’ｓｇｙｍａ！、）ｌ　ＯＯ：　４６　Ｂ−５００（１９８３）、ＤＮＡ　３：４７９−４８８（１９８４））％次いでプラスミドＡ７４０２かもの転写ブロックｆＥｇ１厘／Ｓａｌ　ｌ断片として挿入することによって挿入することができる。表　１ＦＬＰＰｆ１媒による部位特異性組換え部位に関する配列ＴＣＧＡＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＧＣＧＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＪＬＩ′ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣＧＣＴＴＡＡＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＧこのＦＬＰ発現発現剤いて事案上種々の宿主細胞におけるいかなる遺伝子の発現も調節することができる。一般に２棟のベクター系を用い℃、異種ＤＮＡ配列の宿主細胞における発現を調節することができる。第１ベクターは調節可能なプロモーターに作動可能な状態で結合したＦＤＰ蛋白質をコードするＤＮＡ配列（ＦＬＰ　Ｉ）ＨＡ）を含む。この程のベクターの一例は、ＧｃＬＥ１プロモーターに操作可能な状態で結合したＦＤＰ遺伝子を含む、４Ｒ９００である。他のプロモーターを含む同椋なベクターを常法により、ＡＲ９００からＧａＥ　ｌプロモーター　ｆ　Ｅ　ｅ　ａ　ＲＸおよびｓｐｈ　ｒと共に切除し、これらの代わシに目的プロモーターを同様に常法によシ、必要な場合には適宜なリンカ−を用いて挿入することによシ構成でざる。第２ベクターは、ＦＤＰ蛋白質により認識されるＤＮＡ配列（クラ／キングＤＮＡ）によりフラ／りされた発現ブロック全挿入含有するプロモーターに作動可能な状態で結合、駿た５発現すべき異種ＤＮＡ配列を含む。これらのベクターは常法によりＡＺ４０２由釆のＳａｇＩ　−ＥＱＥ　［カセットを、容易に入手できる、および／ｉたは合５ｙ、−ｇれた構成要素と共に用いて構成することができる。ＡＺ４０２由示のＳａｇ　Ｉ　Ｂｇｌ　厘カセットはＦＤＰ認識した組供え部によシフランクされたＨ（％ｄ■断片としてＵＲＡ３発現ブロックを含む。ＵＲＡ　３の代わりに他の発現ブロックを常法により、同様に必要な場合には一般のリンカ−を用い

【挿入することができる。発現ブロック、たとえばＡＺ４０２由米のＳａｇ　Ｉ−ＢｔｔＬ　Ｉカセツ）ｔ −次いで必要な場合には一般のリンカ−を用いて、プロモーターに作動可能な状態で結合した異種ＤＮＡ配列を含むベクターのプロモーター領域中へ挿入し、これによシ発現がブロックされる。挿入が適切になされたことは経験的にそのベクターによシ形質転換された細胞の表現型を観察することによって、および／または培地を発現生成物の不在について監視することによって、容易に確認することができる。宿主細胞を上記の第１および第２ベクターによシ形質転換すると、第１ベクター甲のＦＬＰ−ＤＮＡの発現によって生成したＦＤＰ蛋白質が第２ベクターのフランキングＤＮＡ間の組換えを触媒する発現系が得られ、これにより発現ブロックが除去され、異種ＤＮＡ配列の発現が可能となる。もちろん、いずれかの特定の宿王細ＦＩ己を用いた場合、各ベクターは当技術分野で周知のようにその宿主が要求するいかなる遺伝子要素？も富んでいなければならない。上記のベクターＳよび調節されたプロモーターを用いて本発明者らはより肩いＧＯ，Ｍ住速尻′（ｉ−特色とする酵母菌株１−得た。この種の菌株は宿主菌株に（１１Ａ　Ｔ　Ｐ消費性の無段サイクルを％筐た不発明の他の形態においてはｔｌｌｔ高い細胞１ｘＡＴＰアーゼ活性を導入することによって得られた。パン酵母菌株およびビール酵母菌株の遺伝学的修飾パン酵母およびビール酵母の菌株は実験室菌株よりも難しい形質転換用基質を提示する。これらは当技術分野で周知の選択処理に用いるものだからである。しかし修飾または異種遺伝子／プロモーター構成、たとえば後記のＧＰＤＨプロモーターに結合したＦＤＰアーゼ遺伝子を、優性薬剤耐性遺伝子、たとえば抗菌薬ゲンタマイシン（Ｇ４１８　）　（ジミネツおよびディピース、ネイチャー２８７：８６９（１９８０））萱たはハイグロマイシンＢ（グリッツおよびディピース、ジーン２５：１７９−１８８（１９８３））に関するもの管用いてベーキング用酵母菌株に導入することができる。この方法の一例として、アミノサイクリトールホスフォトランスフェラーゼ（ＡＣＦＴ）をコードする耐性遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を与えるがそのプロモーターが弱いため耐性付与に際して部分的に有効であるにすぎない絽菌トランスポゾンＴＮ６０１によって導入される（ジメネツおよＵｆ’イビース、前掲）。このプロモーター金酵７−１−−ドア’ヒドロゲナーゼブロモ−ターンと交換する。次いで目的遺伝子／プロモーターをその天然染色体フランキング領域および前記ｒｓ６ｏｘ　Ａｃｐｒと共に含むプラスミドを構成する。このプラスミドは酵母複製原点を苫まない。パン酵母菌株をこのプラスミドによｐ形質転換し、形質転換体をＧ４１８プレート上で選択する。ＡＣＦＴのプラスミドコピーはこのプラスミドが天然の遺伝子座において酵母ゲノムに挿入された場合にのみ安定反復が得られる。これらの形質転換体１ｋＧ４１ｇの不在下で増殖させると、プラスミドが１ルーピングアウト”により失われ、″野生型”の、または導入された配列が残される。これらのＧ４１８感受性クローンを、次いでオリゴヌクレオチドプローブを用いるゲノムＤＮＡのサザン（５ｏｕｔｈａｒ％）ハイブリダイゼーションによって、異種構成の存在につぎ゛常法によシスクリーニングする。細胞ＡＴＰ水準を低下させるための遺伝学的修飾の一方法は、正常代謝経路をＡＴＰが消費される異常な様式で利用し、これによｐ解糖を刺激するものである。よｐ好ましくは１選ばれた経路か循環性であシ、従って七の異常な利用により【、必要な代謝中間体、基５Ｒ筐たは産物のいずれかか有意の蓄積筐たは枯渇を生じることはない。酵母における代謝経路の多くは細胞の増殖条件または要求条件によりて逆方向へ進行することができる。たとえば細胞の要求に応じて、代謝産物″″Ａ″が代謝産物１Ｂ″に、またはＢ′″が＠Ａ”に転化しうる。この種の経路を同時に両方向に進行させると、代謝産物の正味蓄積または損失は起こらないが、経路の進行に必要なエネルギーは消費され、この点で１無益（１８ｇ４１ｇ）”サイクルである。もちろん付加工程を伴う他の無益サイクルも採用できる（たとえば、Ａ　−＋　Ｂ　−＋　（ニー＋Ａ　）。転写、翻訳および翻訳後制御を採用してこの種の無益サイクルを作動または停止することかでき、その際サイクルの循環毎に１分子のＡＴＰが消費され、産物の蓄積または基質の損失を生じることはない。パン酵母の場合、ＡＴＰ水準を低下させ、これにより解糖を刺激する代謝変化は好１しくはこれが発酵に際してのみ作動すべく調節される。ＡＴＰｔ−消費するために好ましい無益サイクルは下記のものである。フルクトース−６−ホスフェート→フルクトース−１，６−１ホスフェート→フルクトース−６−ホスフェート。この経路に関与する酵素ホスホフルクトキナーゼおよびフルクトース−１，６−ジホスフェート（ＦＤＰアーゼ萱たはＦＢＰアーゼ）については広範にその特性が調べられている（プロキサムおよびラルデイ、ジ・エンサイムズ　８さ、ボイキー（ｐλ、Ｄ）ｌｅｍ、６（ｏ！、）、１２９．２１５　２２０　（１９８１）、；フナヤマら（１９７９））。ＦＤＰアーゼに関する遺伝子をクローニングし、七のプロモーターを制御されたプロモーターと交換することによって、その遺伝子は任意に発現する。不発明者らは、この遺伝子をグルコース上での増殖に際して発現させると、ＡＴＰのかなりの消費およびその結果としての解糖速度の上昇を達成するのに十分であることを見出した。ＦＤＰＩ−ゼによシ駆動される無筋ｆ：理解する必要がある。明ＮＫするためにＦＤＰアーゼの調節について簡単に論じる。ＦＤＰアーゼの調節ＦＤＰアーゼの調節については多数の研究者が研究してきた。野生型酵母においてフルクトース−１，６−ジホスフェートの合成と分解の間の無益サイクルが生じるのを防ぐために、非発酵性炭素源上で増殖している細胞にグルコースが添加される際、この酵素は速ｆかに不活化される。このＦＤＰアーゼ不活化は３段階で起こると思われる。最初の酵素活性抑制はアロステリック調節により行われる（レンツおよびホルタ−１Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、レタ。ニー・ベイネｉ１ジョ／・ワイター、テンテニスター、１９８０年；トルトラら、バイオケミ、バイオフィシ。６８Ｂ−６９５（１９８１））。グルコースを酵母細胞に添加すると、酵母細胞にグルコースを添加すると、フルクトース−２，６−ジホスフェートの濃度は数秒以内に検出不可能な水準から数μＭ（ＦＤＰアーゼを部分的に抑制するのに十分）の濃度にまで上昇する。フルクトース−２，６−ジホスフェートの合成ｔ− ｎ節する機構は分かつていない（ガンセドら、ジエイ、バイオロ、クミ。（１９８３））。最初の速やかな阻害ののち、ＦＤＰアーゼのリン酸化を伴う第２工程が数分間にわたって起こる（ミュラーおよびホルツエル、バイオケミ、バイオフ掲；プルマンら、バイオケミ、バイオフィシ、リプ。コミ（Ｅｉｏｅｈａｍ、Ｂｉｏｐｈｙａ、Ｒａｓ、Ｃｏｍｍ、　）、１０７　１４８２−１４８９（１９８２））。ＦＤＰアーゼのリン酸化状態は特だのキナーゼおよび特定のホスファターゼによシ制御される。す／酸化は特定のセリン残基において起こる（ミュラーおよびホルツェル％前掲；マシンら、ジェイ、バイオ、ケも（Ｊ、Ｂｔｏｌ、Ｃｈａｍ、）、　２５７　１１２８−１１３０（１９８２））。この修飾されたＦＤＰアーゼは修飾されていない＃累よりも活性が低い。最初に、このリン酸化された酵素は特定のプロテアーゼの基質となるらしく、これ’２ｉ　ｒ　ｎ　ｐアーゼの不可逆的不活化を約１時間にわたって触媒する。ＦＤＰアーゼ詞節のための遺伝学的修飾このＦＤＰアーゼをブロックするために採用できる遺伝学的方法が幾つかある。フルクトース−２，６−ジホスフェートを合成しないか、またはこの抑制物質に結合しないＦＤＰアーゼを含む突然変異体は段階的不活化を初期にブロックする。セリンの部位特異性突然変異（そうでない場合はリン酸化式れる）により第２および第３工程に対し抵抗性の酵素が得られる。若干の酵素活性はフルクトース−２，６−ジホスフェートによる初期の部分的凪害後にも残存する（レンツおよびホルツエル、前掲；ウォル７およびホルツエル、前掲；トルトラら、前掲）。この酵素活性は有意の無益サイクルを生じるのく十分である。本発明者らは、クローン化ＦＤＰアーゼ遺転子中に存在する、ｅＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼに関する唯一のコンセンサス認ｖＩｔ部位である。ＦＤＰアーゼ（Ａ＃＊−Ａｒｔｒｏ、Ａａｐｎ＊Ｓ＃９ｎ＞中のリン酸化部位（Ｓ　ｇ　ｒ４ｔ　）を確認し、亘ちにこれを一般的な部位特異性突然変異鍔発によ少変化させた（シラーおよびスミス、前掲）。不発明者らは、リン酸化を阻止するためにセリンｔアミノｔｉｉｔｔ換すること力ξ有意水準の無益サイクル形成に十分な＃素活性を生じるのに十分であることを見出した。しかしこの酵素は高ａ度のＡＭＰによっても阻害される（タケタおよびボーゲル、ジエイ、バイオロ、ケミ。Ｊ、Ｅｉｏｌ。Ｃｋ−惟、、２４０　６５１−６６２（１９６５）ン。いっそう至適化するために、この酵素（すでにＳ　ａ　ｒｌｌにおける置換によりてＡＭＰ阻害に対し若干は抵抗性になっている）をそのＡＭＰ結合部位においてさらに変化させることができる。この酵素上のＡＭＰ結合部位は明らかＫされている。無益サイクルに関する酵素活性を高めるため（、この部位をインビトロで突然変異させ、酵母に再導入し、ＡＭＰによる阻害の消失を間接的にアッセイすることができる。プレート上で、もはやＡＭＰによシ阻害されない突然変異体は、糖新生炭素源上では酵母を正常に増殖させるが、グルコース上では増殖がきわめて貧弱であシ、従ってこの徳の変異についての簡便なアッセイ法が得られる。この無益サイクルに関与する酵素はかなシ主要な酵母蛋白質であり、この経路は相当な量のＡＴＰを消費するのに十分である。解糖の刺激は１微細に調整され” 、変化した７Ａ／クトースジホスフアターゼ遺伝子のコピー数、プロモーターの強度、または前記のＦＤＰアーゼもしくはＦＤＰアーゼ変異体発現ベクターに用いられるプロモーターを変化させることによって、目的とするいかなる水準の二ば化炭素出力をも与える。別形態の無益サイクル（ｆｓｔｉＥａ　ｃｙａＥｓ）ＡＴＰの消費に関与しうる別形態の無益サイクルが意外にも多数ある。たとえばピルビン酸キナーゼによるホスホエノールピρと７酸からピルビン酸への転化は逆行させることができる（ジエイ、カッッおよびアール、ログ１２５　５３１（１９７１））。あるいは他の多くの無益サイクルがＡＴＰｔ−消費すると思われ、これにはアミノ酸の生合成および分解、ポリホスフェートの合成および分解、脂肪酸の生合成ならびにピリミジンの生合成にお厳密に制御されるので、関与する酵素の調節をそれらのプロモーターの変化により変化させることによって、無益サイクルを誘発することができる。しかしこの種のサイクルは付加的な調節機構金もつ。一般にこの付加的調節は中間体またはエネルギー代謝産物による、酵素機能のフィードバック阻害またはアロステリック変異を伴５゜所望によりこの糧のアロステリック結合部位を修飾して、ここに具体的なＦＤＰアーゼの例において記述した方法と同様な様式で７０ステリツク阻害を除去または低下させることができる。他の一群の調節は、基質の利用性を制御し５る細胞器官において酵素のうちの１種を＠鎖すること、あるいは酵素複合体において不安定な中間体を捕捉し、これらを速やかに安定な中間体に転化することによる。これらの経路はすべてポテンシャル誘発可能なＡＴＰ加水分解プロセスであり、従って適宜な遺伝学的修飾によってＡＴＰを消費するために利用できる。所望によシ、修飾された細胞によシ消費されるＡＴＰの量を、ＣＯ，Ｓよびエタノールの産生が最大となるべく調節することができる。これはよシ強いもしくはよシ弱いプロモーターを用いるか、またはその活性を調整することによって、あるいは前記のようにその調節の程度が培養の温度に依存する温度感受性調節遺伝子を用いることによって行うことができる。解糖速度ｔｌ−調節するための別形態の修飾は、細胞質葭性ホスファターゼを産生して、ＡＴＰを含む有機ホスフェートを加水分解するものである。普通は細胞外のものであるビール酵母菌の酸性ホスファターゼは周辺細胞質（ｐｇｒｔｐＥａａｍ）内に位置する誘発可能な非特異的ホスファターゼである。この酵素に関する遺伝子が最近クローン化され、特性が明らかにされた（ロジキーら、ブロク。（１９８２）を参照されたい）。ホスファターゼが細胞の周辺細胞質中へ分泌されるのを阻止すると（たとえばこの酵素の分泌リーダーを除去する遺伝学的修飾によ〕）、細胞質中で有機ホスフェ−）　（ＡＴＰｆ、含む）が脱リン酸化されるであろう。しかしこの非特異的ホスファターゼは他の重要な有機ホスフェートをも脱リン酸化し、細胞の代謝に重大な損傷を与えるであろう。従って１捕捉される１′細胞質ホスフアターゼの水準は厳密に制御されたけれｄならない。たとえば酵母の酸性ホスファターゼに対する天然のブロモ−クー（？ＨＱ５）は解糖速度の増大を達成すべく十分に誘発された場合、過度のＡＴＰアーゼ活性を発現する。細胞質酸性ホスファターゼによる調節されたＡＴＰ加水分解法を得るためには、十分に誘発された際に目的の効果を示すほど弱いプロモーターを使用することが好ましく、あるいは下記のように基礎的水準の誘発可能なプロモーターを使用することもできる。これは数種の方法で行うことができる。その例は先きに述べた。不発明の他の形態は原形質膜ＡＴＰアーゼを伴５ものであシ、これは細胞質中のイオンの濃度を調節するために発酵により産生されたＡＴＰの３分の１以上を使う。これは細胞における主要なＡＴＰ加水分解経路である。従ってこの上路の刺激を細胞のＡＴＰ水準の低下に利用炭素の産生）を刺激することができる。原形質膜プロトンポンプに影響を与えるある種の薬物が発＃？刺激すべく細胞を誘発するという証明がある（セラノ、ヨーロ、ジエイ、バイオクミ、　（Ｅｓｒｊ、Ｂｉｏ−ｃＡ＊ｍ−）、１０５：４１９（１９８０））ｏｇめられた刺激はきわめて低い。この知見の重要性は見落されていたようであり、冥験誤差の範囲内のものとして無視され、それ以上の研究は行われなかった。同様に原形ＩＸ膜プロトン濃度勾配を混乱させる他の業物（すなわちジシクロへキシルカルボジイミドおよびジエチルスチルベストロール）は発＃を刺激しないので、この刺激の理由は完全には明らかでない。この研究によシ支持されたー説明は、ジシクロへキシルカルボジイミドおよびジエチルスチルベストロールが原形質膜ＡＴＰアーゼを阻害し、従って細胞ＡＴＰ水準を低下させないというものである。細胞の一般代謝に対するかなルの損傷を、他のＡＴＰ依存性膜機能の破壊によって受ける可能性もある。ジニトロフェノールは原形質膜のプロトン濃度勾配を直接に破壊することＫよシ作用すると思われる。これにより原形質膜ＡＴＰアーゼが刺激され、これによって細胞ＡＴＰ水準が低下する可能性がある。原形質膜ＡＴＰアーゼを刺激する別法は、小型蛋白質、たとえばリボヌクレアーゼ（アルペルら（１９６７）ジエイ、バクテ、　（Ｊ、Ｂａａｔ　）、９３　：　７５９−７６５　；イ７アンチスら（１９６７）ジエイ、バクテ、　（／Ｊａｅり　９４　：１５０９−１５１５）−！たは酵母キラートキシン（バッセイおよびジャーマン（１９７３）ビオヒミ力・工・ビオフィジカ・アクタ２９８：８６８−８７５）の使用によるものであろう。不発明を下記の例に関連してさらに説明する。これらは純粋に例示であり、請求の範囲に示された本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。ＤＮＡ制限醇累酵素び代謝酵素はすべてニュー・イングランド・バイオラボズから購入された。これらの酵素はニュー・イングランド・バイオラボズにより指示された条件および緩衝中で使用された。ただしマングビーン（ｍ＊＊ｇ　ｈａα リエキンヌクレアーゼはＰＬバイオケミカルズから入手され、指示に従って使用された。ＡＴＰおよびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰおよびｄＴＴＰはｐｒ、バイオケミカルズから購入され、ｃｙ：＋　はニュー・イングランド・ニュークリアー・コーポレーションから得られた。ニーヨーク州（１９８２））の記載に従って（その記載をここに参考として引用する）、その２４６頁に記載さｆ”Ｌ、りＨＳＰＫ’ｆｒ使用シ、ＤＮＡ＠に１〜１００Ｐｆ／ｌ１ｔｔ採用して、平滑末ｇＡ（６！ｕｎｔ　ｅｎｄｅｄ）ＤＮＡについては２３℃、７接着末Ｑ’Ａ　（５ｔｉｃｋｙ　ｅｎｄｅｄ）　ＤＮＡについては１６℃の温度で行われた。電気泳動は９０ｖ＋ｑＡｆ）リスボレート、１０ｍＭ−ＥＤＴＡｆ含有する０、５〜１．５％アガロースゲル中で行われた。ＤＮＡ消化ののち制限酵素を６５℃に１０分間加熱することによシネ活化した。 −遍の反応を行う場合は、各工程ののちＤＮＡｋ７０％エタノールで沈殿させた。制限部位を大型のＤＮＡポリメラーゼ断片（クレノー、Ｋｌｇｎｏｗ　）および４種のｄＮＴＰ　との反応により“フィル−イン”したのち、反応混合’＃ｌ　ｋ　１０　ｍＷ塩化マグネシウムとなし、等容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを添加した。ＤＮＡ’（−２０℃で２倍容量のエタノールにより沈殿させ、エツペンドルフ微量遠心磯で４℃において１０分間遠心分離することによってＤＮＡｆペレット化した。エタノールを注ぎ出し、ベレットをα２ＭｒｎｒＲナトリウム１０μｔ７ｐｙ・ＤＮＡとなるよ５に溶解した。ＤＮＡを２倍容量のエタノールで再沈殿させ、前記と同様に遠心分離した。ＤＮＡな天空下に乾燥嘔せたのち１次の構成工程に進んだ。合成オリゴヌクレオチドをマニアテスらの前掲文献の記載に従ってキナーゼ処理し、６５℃に加熱し、４℃にまで徐冷することによりアニールしたのち使大ｐＡ菌からの１スーパーコイル”プラスミドＤＮＡの精製および大腸菌の形質転換はマニアチスら（１９８２）の前掲文献の記載に従った。酵母の形質転換はヒネンら（１９７８）に従った。ただし１．２Ｍンルビトールを１．０Ｍの代わりに用いた。形′Ｘ転換嘔れた細菌をスクリーニングするための小規模プラスミド調製は本質的には報告に従った（マニアチスら、１９８２．前掲；ホームズＳよびクイツ、グレイ、アナリ、バイオケミ、（Ａｎａｌ。Ｅｔｏｅｈａｍ、　）　１４　１９３　（１９８１）。ただしＲＮアーゼ消化は制限酵素消化後に、電気泳動直前にＲＮアーゼ（ベーリ／ガー・マンハイム）のＩＦ１９／ＩＬｔ溶液１μｔをアカロースゲルのウェルに添加することにより行われた。菌株および培地大腸菌株ＨＢ１０１をすべての細菌形質転換に用いた。酵母菌株ＤＥ７４５（ポットクユタインら、：）−ｙ８．１７−２４（１９７９））、ＫＹ１１４’！、たはＡＴＣＣ２６６７５を用いた。大腸菌は前記（マニアチスら、Ｉ　Ｓ　８２．前掲）の記載に従って、アンピシリン（４９μ２〜）を含むか筐たは台筐ないＬＥ培地中で増殖させた。酵母は形質転換前に３０℃で、酵母抽出物（ディフコ）１％、バクト・ペプトン（ディフコ）１％、およびグルコース２チを含有する培地において増殖させた。酵母用最少培地は下記のものを含有していた。硫酸アンモニウム５ｆ１グルコース１０？、アデニン４０７９．ロイシン６０■、ビオチン２μｍ、パントテン酸カルシウム４００μ２、葉酸２μｍ、イノ７トール２μ２、ナイアシン４００　Ｐｆ、ｐ−アミノ安息香酸１００μ？、塩酸ピリドキシ／４００μＶ、ホウ酸５００μり、硫酸銅４０μ？、ヨウ化カリウム１００　Ｐｒ、モリブデンナトリウム２００μ２％硫酸亜鉛４００μ？、硫酸マグネシウム５００■、塩化ナトリウム；ｐｏｍ９．塩化カルシウム１００■、およびリン酸カリウム（−塩基性）１２（高ホスフェート培地ンもしくは１０〜（低ホスフエート培地）（１を当たシ）。散性ホス７アターゼプロモーターの誘発のために、細胞を３０℃で高ホスフェート酵母用最少培地で予備増殖させ、ホスフェートを含まなくなる壜で洗浄し、低ホスフエート酵母用最少培地に移し、３０℃で増殖を再開した。移したのち８〜１２時間で最大誘発が起こった。ジニトロフェノール実験については、この実験に用いた酵母菌株はフライシュマンの活性乾燥酵母であった。酵母を酵母エキス（ディ７コ）１％、バクトベプトン（ディフコ）１％、リン酸二カリウム０．０５　Ｍを含有し、クエン酸′ｔ−ｐＨ５，６になるまで滴加したＣＯ中で増殖させた。培地は１５を容カルボイ中で１０ｔずつのバッチに調製し、１２１℃で２時間オートクレーブ滅菌した。冷却後に無菌のグルコースを２％（ｗ／ｖ）になるまで添加した。消泡剤を２４時間毎に添加して、起泡を防止した。供給培地をケモスタットおよび培養器に接続する直前に１５Ｌ容カルボイの培地に直接にジニトロフェノールを添加し、供給培地を同一濃度にした。ジニトロフェノールはエタノール甲の原液に調製した。細胞をケモスタットに接種する前にＣＯ中で一夜増殖させた。ケモスタットｍｏｗはニュー・ブルンスビック・サイエンティフィツク、モデルＦ−２０００甲で増殖？せた。培養器はサイドアーム ′の付加によ、９１ｔの作動容積を得るべく、あらかじめ調整された。使用済み培地はｇ、同オーブンチューブによって流出させ、培養物の表面に留まる傾向をもつ消泡剤の流失を防止した。発酵槽は３０℃で１．撹拌調整４において操作された。容器に窒素′ｔ−５００ｃｉ−／分の速度で連α的に吹込み、排出ガスはドライ −ライト（Ｄｒｙ−Ｒ４ｔｅ　）の真空トラップを通過させ、二酸化炭素測定のためパーキン・エルマー・マス・スペクトロメーターガス分析器へ送られた。迷紐培養においては培地を７アルマシアモデルＭ３ボ累の測定を行う場合は、すべての鉤整、容量および温度を監視し、必要に応じ調節した。培地の供給量、温度および撹拌はかなり安定であることが認められたが、窯素ガスの供給量は４時間の期間にわたって１０％程度変動した。従ってガス分析器からの出力をチャートレコーダーに送り、窒素の流量を２時間の期間にわたって手動で調整した。培養物中の細胞密度の測定を行５前にこの期間にわたって排出ガス中の窒素の流量および二酸化炭素の水準の安定性につぎ調べた。従って培養物は測定を行う前に検出限界内において安定であることが証明された。これはデータの再現性によって立証された。培養物の密度は、培養物を水に１０倍に希釈し、バラシュ・アンド・ロム・モデル・スペクトロニク２０により６００％ｍで密度を読取ることによって測定された。ベクターの構成発現プラスミドの大きさを最小限に抑え、かつ制限部位の数を少なくするために、選択遺伝子としてのウラシル３遺伝子＜ＵＲＡ３）％よび２μの復製原点を含むプラスミドを構成した。あるいは他の酵母プラスミド、たとえばＹＥｐ２４もしくはＹＥｐ１３またはこれらの均等物（ペアレントら、前掲）も使用でさる。本発明者らによるプラスミドはＹＩｐ５（ポートクユタインら、前掲）に由来し、Ｈａｍ　ｆｌ／Ｈｐａ　Ｉ　！ｉｆｆ片を付加され、酵母の２μプラスミド由来の複製原点を含んでいた。プラスミドＹＯｐＩ（第７図）が２μ原点をｙｒｐｓのＥａｏＲｒ部位に導入することによυ構成された。ＹＥｐ２４からのプラスミドＤＮＡ（ポートシュタインら、前掲）を制限酵素Ｈａａ　［［およびＨｐａ　ｌで切断し、このＤＮＡを調製用１．０％アガロースゲル上で泳動させた。２ μ複製原点を含む１．４ｋｂの断片を分子量マーカー断片の泳動パターンとの比較により同定し、アガロース中に切取られたウェル中ＫｉＩ気的に溶離した。ウェルから得た緩衝液をＤＥＡＥセファセルカラム上に導通することにより、このＤＮＡ断片をｆ＃製した。プラスミドＹＩｐ５をＥｃａＲｌで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー（Ｋ　ｌ　ｇ％ｏｖ）断片および４種のｄＮＴＰすべてを用いて１接着性宋端（ａｔイｃｋｙ　ｇｔｓｄａ　）　’を”フィル−インした”。ＹＥｐ２４かものｌ１ａｅ　ｍ／Ｈアα！断片をこの１フィル−インしたＹＩｐ５のＥａｏＲ１部位にリゲートした（第７図〕。リゲーション混合物をＨＢ１０１中へ形質転換し、侍られたアンピシリン耐性コロニーを２μ原点断片の存在につざスクリーニングした。Ｈａａ＠部位にリゲートした１フィル−インされた”ＥｃｏＥ■部位はＥｃｏＲ１部位を再生するので、断片の配列は得られたＥｃｏＲ１部位をプラスミド上の制限部位にマツピングすることによって決定された。アンピアリン耐性遺伝子内のＰａ１１部位の近位にＥｅｏＲ１部位をもつプラスミドＣＹＯｐ　Ｏを後続の構成に用いた。。子の分離大腸菌（菌株　ＤＦ５６７％ＣＧＳＣ番号６６９５）においてＦＤＰアーゼの欠失突然変異体の相補によりＦＤＰアーゼに関する遺伝子を分離した。ｐＢＲ３２２プラスミドベクターにおける１野生型′″酵母ゲノムＤＮＡのプラスミドライブラリーを抗生物質耐性に関する選択によってＤＦ６５７中へ形質転換し、酵母ＦＤＰＩ−ゼ遺伝子を保有するプラスミドを、これが細菌を糖新生炭素源上で増殖させる能力によって同定した。サンガーら、ブロン。ナショナル、アカデ、サイ、ニーニスニー（Ｆｒａφ、Ｎａｔｌ。Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７４　：　５４６３−５４６７．１９７７のジデオキシヌクレオチド配列決定法によシ酵母ＦＤＰアーゼクローンの配列を決定した（第８図）。ＤＮＡ配列から誘導された酵母ＦＤＰアーゼのアミノ酸配列を比較したところ、ａｍブタＦｌ）Ｐアーゼのアミノ酸配列（マーカスら（１９８２）、ブロン。ナショナル、アヵデ、サイ。ニーｘｘｘ　−（Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌ、Ａｏａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ）　７９　ニア１６１−７１６５）（第９図）と５０チ以上の相同性を示し、酵母クローンの同定か正しかったことが確認された。ＡＴＰの早期浪費を防止するために無益サイクルを慎重に制御しなければならないので、天然ＦＤＰアーゼ遺伝子の第１適応はそのプロモーターを発酵に際して調節でさる配列のものと交換することであった。酵母ＦＤＰＩ−ゼのＤＮＡ配列の制限部位分析によって、コード部位の開始領域のきわめて近くにＮｄａ　１部位が確認された（第１０図）。インビトロ突然変異誘発法によって、Ｎｄｇ　１部位なｓｐ五１部位に変えることによシこのクローンの５′末端を異種酵母プロモーターからの発現に適応させた。ＦＤＰアーゼ遺伝子を１ずｐＢＲ３２２中へサブクローン化してプラスミドＡＲ７０５を形成した（第１０図）。プラスミドＡＲ７０５をＮｄａ　（で消化し、マングビーンエキソヌクレアーゼで処理した。Ｓｐｈ　１部位の６塩基対のうち４対を含むアダプターを一端に、Ｘｈｏ　Ｉオーバーハングな他端に含むアダプターをプラスミドにリゲートし、Ｘｈｏ　（で消化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドを閉環して、プラスミドＡＴ８２３を得た（第１０図）。リゲーション混合ｇＪを細菌中へ形質転換し、アンピシリン耐性コロニーをＳｐん■およびＸｈａ　１部位の存在についてスクリーニングした。プラスミドＡＴＳ２３中のＦＤＰアーゼ遺伝子を下記によジグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ４９１）に関する遺伝子からのプロモーターにリゲートした〔ホランドおよびホランド（１９８０）、ジエイ、バイオロ、グミ、（Ｊ、Ｂイｔｒ１．ｃｈ−慣、）２５！１２５９６−２６０５３゜プラスミドＭ９０３から誘導されたプラスミド０６０５（ｇ１３図）をにア、１で消化し、ＤＮＡ　Ｐａｌ　ｌのりＶナラ断片で処理し、Ｈｔ＊ｄｍで切断した。プラスミドＡＴ８２３をｓｐｈ　１で切断し、ＤＮＡ３．８Ａ＆のＳｐｈ　Ｅ／Ｈｉｎｄ　ｍ断片を分離し、Ｈ４＊ｄ　ｍ／Ｋｐｍ１ｉＭ化した０６０５にリゲートして、プラスミドＡＵ１２５を得た。プラスミドＡＵ１２５中のＦＤＰアーゼの発現はＧＰＤＨプロモーターによシ調節される。ＦＤＰアーゼ突然変異誘発ＦＤＰアーゼを異種プロモーターと共に含有するプラスミドを酵母中へ形質転換し、形質転換体をＦＤＰアーゼクローンの発現について調べた。ＦＤＰＩ−ゼ活性は糖新生または解糖炭素源上で誘発条件下に増殖させた場合、検出可能であった。発酵法により増殖させた場合、アロステリック阻害剤および酵素の不活化によって酵素活性が低下すると期待されるであろう。不活化はセリン残基のリン酸化によって媒介されるので、本発明が意図する構造遺伝子の変化はこのリン酸化部位を除去することである。リン酸化されるセリン残基は残基１２であると確認されている（この配列において唯一のａＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ認誠部位、精製リン酸化酵素のペプチドマツビ／グＳよびリン酸化ペプチドのアミノ酸配列決定から；リツテンハウスら（１９８６）、ジエイ、バイオロ、ケミ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６１　：　３９３９−ことによって活性を保有するアミノ末端欠失が得られることは先きに認められている（チャタージエーら、１９−．８５　）。噴孔動物および酵母のＦＤＰアーゼはぎわめて高い水準の保守（６ｏｎｓ−デ５ａｔｉｎ％）を示す０酵母酵素のアミン末端欠失を調製し、活性につき試験した。フルクトース−１，６−ジホスフェート（ＦＤＰ７−ゼ）を遺伝子の７ミノ末端内のＤＮＡ配列中に存在するＥｅｏＥＶ制限部位から、＃母ＧＰＤＨプロモーターへ連結した（第１２図、Ａｒ１　）。これによってアミノ不備欠失（残基１９となる）が得られ、これは蛋白質キナーゼ認識部位を欠如していた。さらに部位指向性突然変異誘発によりセリン（残基１２）をアラニンに変えた（シラーおよびスミス、前掲）。これは保守性変化であり、これは非リン酸化蛋白質の活性に影響を与えないと予想され、ただし酵素のリン酸化は阻止されるであろう。セリンは部位指向性突然変異誘発によりスレオニン、バリン筐たはシスティンその他のアミノ酸に変えることもできる（第１３図）。これはこの残基の周りの部分の配列を一本＠ＤＮＡウィルスＭ１３中ヘクローン化することにより達成された。この領域のＤＮＡにハイブリダイズし、ただしセリン残基において不整合（ｍｌ綿αｔ　ＣＡ）であ九従ってこの配列が代替コドンｆｃ置換する合成オリゴヌクレオチドが作成された。次いでこのハイブリッドからＤＮＡポリメラーゼＰａｌ　ｌのりＶノー断片を用いて二重鎖分子を作成した。この反応は４種すべてのデオキシヌクレオチド三リン酸およびＤＮＡＩ）ガーゼの存在下で行われた。次いでこのハイブリッド二重＠ＤＮＡを細菌中ヘクローン化し、複製し、再分離し、細菌中へ再形質転換し、２本の鎖をほどいた。子孫の半数はセリンに関する配列を含み、半数はアラニンその他の選ばれたコドンに関する置換された配列を含む。これらは置換配列に対し相補的な短鎖オリゴヌクレオチド（１７ｈｐ）へのハイブリダイゼーションにより区別された。次いでこの置換された遺伝子を前記のマルチコピーＧＰＤＨ発現ベクター中へ戻し、酵母の実験室菌株たとえばＫＹ１１４中へ形質転換した。解糖速度を測定するために、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）プロモーターからのＦＤＰアーゼのクローンを発現する酵母の培養物を小型の１を容発酵槽中で試験した。培養物をバッチ式で増殖させ、音素を１１０ｄ／分で培養物に吹込んだ。二酸化炭素および細胞密度を足期的に測定した。最初に、野生型酵素（プラスミドＡＵ　１２５）およびアミノ末端欠失（プラスミドＡＸ４）を発現した酵母培養物を、非発現ＦＤＰアーゼを含む対照プラスミド（プラスミドＡＵ　１１０）と比較した（第１４図）。これらの培養物が産生ずる二酸化炭素の水準は増殖サイクルの開始時点ではきわめて類似する。しかし増殖サイクル終了時には実質的にはよシ高い水準のＣＯ３が生成した。アミノ末端ＦＤＰアーゼ欠失を保有する菌株の二酸化炭素出力の上昇は、野生型酵素を発現しているものよシも低い。しかしこの酵母菌株ではＦＤＰアーゼは不活化していないと思われ、アミノ末端欠失体は１野生型′″酊素よシもかなシ低い比活性を示す。従って野生型酵素は欠失を含む酵素よりも高い解糖刺激を与えると予想されたであろうが、二酸化炭素出力が増殖サイクルの終了時にのみ上昇するのはきわめて興味深い。これはＦＤＰアーゼが指数増殖期にはアロステリックに調節されていることを示唆するであろう。この調節に対して最も可能性があると思われるのはフルクトース−２，６−ジホスフェートまたはＡＭＰである。ＦＤＰアーゼのリン酸化部位における特定の地点における突然変異体を作成し、発酵実験を繰返した。これらの実験においては、ＧＰＤＨプロモーター由来のセリンからアラニンへの突然変異を含むＦＤＰアーゼを発現する菌株ＡＴＣＣ２６６７５（プラスミドＢＡ６０１）またはＦＤＰアーゼを発現しない対照プラスミド（シラスミ）”Ｂａ２Ｏ３）を試験しり。菌株ＡＴＣＣ２６６７５は多数の被験酵母菌株のうちで最高水準の不活化を与えることが認められた。このようにこれらの培養は可能なガス発生力に対する保守的推足を与える。前記のように発酵を行い、二酸化炭素および細胞密度を測定した。二酸化炭素出力はこの場合もＦＤＰアーゼを発現する菌株では増殖サイクルの終了に伴って増大した（第１６図）。発酵実験を反復し、良好な再現性を与えた。培養物を増殖サイクルの終了時に採取し、遠心分離し、下記のガス発生試験により調べた。ガス発生試験は第１６図に示した装置内で行われた。フラスコは細胞１？、グルコースＩｙおよび培地（酵母用窒素ベース、ディフコ）　ｌ　Ｑｍｊを含み、ｉｋ終０Ｄ６００％惰は１２であった。溶液はすべて３２℃であった。水浴も３２℃であった。フラスコを水浴に入れたのち、管Ａを最初の１０分間開いた。ＣＯ７発生の測定は、管Ａを閉じ、ビユレットＹ内の液面をビュレッ）Ｚ内の液面に合わせてビユレット１円のガスを大気圧にしたのちビユレットＸ内に発生したＣＯ７の量を測定することによって、足期的に行われた。１００−のＣＯ，が産生されるまで測定を行った。前記プラスミドを含む菌株におけるＣＯ！産生速度を第１７図に示す。この試験では災然変異ジＤＰアーゼを発現する菌株は２５％のガス発生力増大を示した。前記の変異のほかに不発明はさらにフルクトース−２゜６−ジホスフェートまたはＡＭＰによるＦｌ）ｐアーゼのアロステリック調節の変化をも意図する。フルクトース−２，６−ホスフェートはフルクトース−６−ホスフェートから酵素フルクトース−６−ホスフェート−２−キナーゼによる酵素経路によって合成され２５９：９４９（１９４９））。酵素活性を抑制するための一方法は、ＦＤＰアーゼのクローン化コピーをインビトロで突然変異させ（たとえばショートレら、ブロン。ナショナル、アカデ、サイ。（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、）、７９　；　１５８８　（１９８２）を参照されたい）、これを細胞内の自己複製選択性酵母プラスミドに逆導入し、次いでフルクトース−２，６−ジホスフェートおよびＡＭＰの阻害効力損失をアッセイするものである。王として、アロステリック阻害物質が結合する部位は酵素構造内のかなシ保守的変化である場合が多い。結合部位のわずかな変異ですらフルクトース−２，６−ジホスフェートに対するその親和性を大幅に変化させると予想されるからである。この方法は変化した酵素についての優れたアッセイ法を必要とする。ＦＤＰアーゼは誘発可能なプロモーターの制仇下にあるので、無益サイクルが有効に作動している場合、誘発性条件下では発酵可能な炭素源上で渭殖している突然変異コロニーはきわめ℃小さいＤＳ、非誘発性条件下ではコロニーは普通の大きさである。突然変異が推測されるコロニーを楯新生炭素源上にも接種した。ここではこれは誘発性条件下に普通に増殖する。従ってこの種のコロニースクリーニング法を採用して、変化した酵素についてアッセイすることができる。最後に、変化したＦＤＰアーゼをベーキングに用いる酵母菌株中に前記の方法で導入する。変化１−たＦＤＰアーゼを含むパン酵母は実質的に増大した発酵能をもつことが認められた。ｆｆｉ胞ｊ［性ホスファターゼの発現ＡＰアーゼのプロモーター断片の調製酸性ホスファターゼ酵素の大型サブユニ”：／　ｌ−７６０（ロージャーら、１９８２、前掲）を各種の制限酵素でマツピングした。Ｈｙａ　ｌ［は７００　ｈｐ制限断片を与え。これはその断片上の（Ａａ　Ｔ部位を参照することによシその位置が知られている、構造遺伝子に関する開始コドン（チルラ、モレキュラー・セル・バイオロジー３５７０−９（１９８３））から５００ｂｐの上流ＤＮＡ配列を含むことが認められた。プラスミドＹＩｐＡＰ１１をＨｐａ■で切断し、ＤＮＡを調製用１．５％アガロースゲル上で泳動させた。プロモーターを含む７００　ｈｐ　ノハントヲ前記のようにゲル中に切取られたウェル中へ電気的に溶離し、ＤＥＡＥ’セファセルカラムで精製した。この断片をＣ１ａ　ｌで切断したＹＯア　！　と混合し、ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼでリゲートした。Ｈｐａ　ｌおよびＣ１ａ、Ｉは自己相補性の１粘着末端２をもつので、これらのＤＮＡは互いにリゲートするであろう。このリゲーション混合物をＨＢ１０１中へ形質転換し、アンピクリンコロニーをプロモーター断片の存在に関してスクリーニングした。この種のプラスミドの１ｆｉ９２０（第２０図参照〕をその後の構成に用いた。酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子の断片のＤＮＡ配列から（ｉ３図）（チルら、１９８３．前掲；アリマら、Ｎ、Ａ、Ｒ，Ｉｒ　１６５７−７２（１９８３）、Ｅｇｇ　Ｎ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の６塩基のうち４塩基を含む領域が開始ＡＴＧから５？＋ｐ上流に確認された。この領域を用いて、自己相補性配列ＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧの合成オリゴヌクレオチドリンカーにより、ＡＰアーゼプロモーター配列内のこの地点ＫＢｇｌ！１部位を形成した。プラスミド９２０をにア％ｌで切断しく第２０図参照）、ＤＮＡを二重鎖エキソヌクレアーゼＢａ、１３１で処理した（レゲルスキーら、■Ｊ、且　１１４５− １４６３（１９７８））。設定された時間毎にエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＩ）ＴＡ）ｅｏ、０５Ｍに添加することにより反応を停止した（レゲルスキーら、（１９７８）、前掲）。各時点で得たプラスミドの一部をＣＩ（Ｉ　ｌで消化し、１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。３００ｂｐＣ１α１／Ｋｐｎ　Ｉ断片が消化されて約２７０　ｈｐとなった時点を記録した。この時点で得た残りのＢａ！３１処理プラスミドをＤＮＡポリメラーゼ■のフレナラ断片Ｓよび４種のｄＮＴＰで処理した。自己相補性配列ＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧのリンカ−をキナーゼ処理し、アニールし、このプラスミドＤＮＡにリゲートした。次いでこのＤＮＡをＴ４　ＤＮＡリガーゼで閉環し、ＨＢ１０１中へ形質転換した。約２０００個のアンピシリン耐性コロニーをプレートから洗い出し。これらの大腸菌細胞からスーパーコイルプラスミドＤＮＡを形成させた（マニアチスら、１９８２．前掲）。このプールしたプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅｇｇ＠で切断し、ＤＮＡを調製用アガロースゲル上で泳動させた。切断された直線バンドとして泳動するＤＮＡをアガロース中に切取られたウェル中へ溶離し、ＤＥＡＥセファセルカラム上で精製した。この＠ｌｌＤＮＡをＴ４　ＤＮＡＩ）ガーゼで再閉環し、ＨＢ１０１中へ形質転換した。アンピシリン耐性コロニーをＢＱｌｆＪ部位の存在につきスクリーニングした。プラスミドがＥｇｌＨ部位を獲得する唯一の方法は。この部位がＥａｌ　３１消化ＤＮＡとリンカ−の結合部に形成されることであった。これがＫｐ％１部位の数百ｈｐ上流で起こる唯一の可能な配列は、ＡＴＧ開始コドンの前号５ｂである。Ｅｇｌ　１１部位を含むこの種のプラスミドの１種Ｄ７１８（第２０図）をす／ガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法により調べたところ、予想とおシであることが示された（サンガーら、ブロン。ナショナル。＝６７（１９７７））。プラスミドＹＩｐＡＰＨは大腸菌において下記のとおりアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。大腸菌ＨＢ　１０１（ＹＩアＡｐＨン−ＡＴＣＣ４３９５７０１−−然蛋　合部に２ける制限部位の形成酸性ホスファターゼ遺伝子の配列から認められるように（第１図）、成熟配列の開始部付近にＫｐ％■部位がある。これによって、配列　ＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣを用いＣＧＡＧＣＴＣてリーダー配列と成熟蛋臼質配列の結合部に制限部位を導入することが可能となった。酸性ホスファターゼ遺伝子には幾つかのＫｐ％！部位があるので、断片を遺伝子の５′末端からサブクローン化しなければならない。プラスミドＹｌｐＡＰ１１　をＢａｔ＋％Ｈ！およびＳａｇ　Ｅで切断し、このプロモーターを含む断片をｙｏｐｌのＨａ情ＨＩ／Ｓａ！　１部位にサブクローン化した（第２１図）。形質転換された細菌なスクリーニングし、プラスミド８０１が正しい配列を含むことが認められた。成熟配列の５１宋端に制限部位を導入するために、プラスミド８０１ｆＫｐ％Ｉで切断し、上記のアダプターをに、％■部位にリゲートした（第２１図）。次いでプラスミドをＥａｍ　Ｈｌで切断し、この部位ＫＤＮＡポリメラーゼ■のフレナラ断片な″フィルーインし”、プラスミドを再閉環した。形質転換した細菌コロニーをアダプターの存在に関してスクリーニングした。この種のプラスミドの１種（，７４０１）を後続の構成に用いた。第２１図から分かるように、アダプターはリーダーと成熟酸性ホスファターゼの結合部にＸｋｏ　１部位を形成する。従ってプラスミドをＸｈｏｌで切断し、オーバーハングをマングビーンエキソヌクレアーゼで消化すると、成熟コード部位の開始部の配列内の適正な位置に平滑（ｂＥｔＬ％ｔ）部位が形成嘔れる。性ホスファターゼの１リーダー欠如　Ｅｇａｄａｒ　ｌａｍｌ）’クローンの合成まず酸性ホスファターゼの全長コピーをプラスミドＪ４０１から構成した。プラスミドＹＩｐＡＰ１１をｌａｍｌ５で切断し％５′−オーバーハングにＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ断片を１光横し”、次いでＳａｇ　ｌで切断し、ＡＰアーゼ遺伝子を含むＥａｍＨ７ｌＳａ！　ｌ断片を調製用ゲル電気泳動によう精製した。次いでこの断片をプラスミドＪ４０１のＳａｌ　Ｉ／Ｎｒ襲■部位にリゲートした（第２２図）。Ｍｒ％！部位にリゲートした“フィル−イン”ＢａｍＨ１部位はＥａｍＨ１部位を再生する。次いで酸性ホスファターゼプロモーターを構造遺伝子に再結合させた。プラスミドＤ７１８をＢｇｘＢで切断し、開始メチオニンコドンに対する酸性ホスファターゼプロモーター配列をｌ　ｍ１位にリゲートした。次いでこのプラスミドをＥａ。Ｒ１で切断し、このＥａｏ　ＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉアダプター断片（第２２■）をあらかじめＸｈｏｌで切断したプラスミドに−ゼで処理してＩ）ＨＡ末端をフラッジし２、次いでＥａ。ＲＥで切断した。形質転換体をスクリーニングし、ジデオキシヌクレオチド配列決定法によシ適正な制限断片を含むプラスミドの配列を決定し、プラスミドｙ】３８がプロモーターと成熟遺伝子の結合部に適正な配列をもっことが認められた。プラスミドへの酵母セントロメアの付加酸性ホス７アターゼプロモーターは約ｘ、ｏｏｏ倍に誘発しうる。＃母プラスミドのコピー数は種々の複製原点または酵母セントロメアを用いることにより変更できる（クラークおよびカルボン、１９８０；チャンバーおよびカルボン、１９８３）。酵母セントロメアは２μ原点プラスミドのコピー数を細胞当たシ約１コピーに低下させる。プラスミドＭ１３８をＥｃｏＲｌで切断し、各末端をＤＮＡポリメラーゼ夏のクレノー断片でプラント処理した。次いで酵母の染色体４からのセントロメアを含むプラスミドＹＣＰ１９（第２３図）（ペアレントら、前掲）をＨ４５ｄ　ｍで切断し、各末端１ｋＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片で平滑化した。次いでセントロメアを含む断片をＭ２Ｂ５のＥｅｏＲ１部位にリゲートして、プラスミドＮ３０５を得た（第２２図）。Ｍ７２１と共に酵母中へ形質転換した。ウラシルプロトドロー７（原栄養体）を選択し、過剰のグルコース（４％）を含有する高ホスフェー１＝ＭＯ培地中で、１を容ニュー・ブルンスビック・サイエンティフィック・モデルＦ−２００発酵槽内において増殖させた。増殖中にバラシュ・アント・ロム・モデル・スペクトロニク２ｏにより６ｏ。％鴨で細胞密度を測定した。結果を下記の表１および２に示す。発酵槽は３０℃ で撹拌調整４において操作された。容器に窒素を４３０ｃｒ−７分の割合で連続的に吹込み、排出ガスをドライ−ライトＸ空トラップに導通し、パーキン瞼エルマー自マス・スペクトロメーターガス分析器に導入してＣＯｌを測定した。０　０．２５　０．０８８０　０、６４　０．２１１５０　０、９０　０．１６２１５　１．３５　０．１９２８０　１．８　０．２６３４０　２．３　０．３４４０５　３．３　０．４５４７０　４．７５　α６１５２０　６．２５　０．７３５８０　７．０　０．７９６３０　８．５　０．８５６９０　１０．０　α８５７１０　１１．０　０−７５０　１．１　０．１７６０　１．３５　０．２２１０８　１．５　０．２６１６５　２．０　０．３５２４５　３．０　０．５０３４５　５．０　０．７６３９０　６．５　０９２４６５　８．５　１．０５５２０　１０．０　１．１５６１０　１４．５　１．０２６８５　１６．０　０．８６０　２．７　０．７２４８　３−５　０．７７７７　４．０　０．８７１０７　５．０　１．０２１６５　７．２　１．３ｉ２００　８．０　１．５６２３８　８．５　１．７０２８６　１０．５　１．７５３６３　１３．０　１．７５４５０　１６．５　１．６５５６ｇ　２０．０　１．６０６３２　２１．０　１．４４３種のプラスミドを保ｎする各菌株が高ホスフェート培地上で増殖する際に産生ずる二酸化炭素の水準は異なることが認められた（表１）。その際高ホスフェート培地中のプロモーター活性の基礎水準は解糖速度に影響を与えるのに十分なものであった。データをコンパイルし、増殖サイクルの同一段階について正規化した場合、高ホスフェート培地で増殖している培養物が産生ずる二酸化炭素の水準はプラスミドのコピー数と共に高することが認められた。マルチコピープラスミドを保有する菌株は対照よシも２倍多い二酸化炭素を産生じ、単一コピープラスミドを保有する菌株は中間水準の産生を示した。このように不発明に従って酸性ホスファターゼを制御し、これによって細胞質ＡＴＰの水準を制御し、二酸化炭素の産生を増加させることができる。笑施例３゜形　アンカップラーが解糖に与える影響漸増する針の２．４−ジニトロフェノールをフライシュマンパン酵母の安友なりモスタット培養物に添加したところ、かなシの二酸化炭素産生刺激が認められた。ケモスタットにより足められた増殖榮件下での細胞当たシの二酸化炭素の基礎水準を測定するために、かつ培養物の安定性を調べるために、予備実験を行った。 −夜培養物をケモスタットに接糧し、バッチ培養物として２４時間増殖させた。培地の供給を開始し、培養物をさらに２４時間放置して安定化したのち測定を行った。二酸化炭素の産生および細胞数を４８時間にわたって監視した。これらの結果を表３に示す。培地の添加開始後の期間を時間で示す。二酸化炭素をガス流中のチとして示す。表　３　ケモスタット安定性２６　０、３３　１．１２．４２９．５　Ｑ、３２　１．１　２．３３２　０．３１　１．０　２．３３４　０．３３　１．１　２．２５０　０．３１　１．０　２．３培養物は比較的安定であることが望められた。ジニトロフェノールを供給培地に５ｐＨで添加した。実験法に示したようにジニトロフェノールは培養器にも５μＭで添加した。培養物ｔｌ−４８時間放置して安定化した。表４から認められるように、５ｐＭのジニトロフェノールは二酸化炭素の産生にほとんど影響を与えなかった。０　１．１　２．２　１．０５　１．１　２．３　１．０２０　０．７５　１．８５　１．２５０　０．７５　２．０　１．３１００　０．６７　２．０　１．５２００　Ｑ、５５　１．９　１．７０　１．１　２−３　１．０培養物のジニトロフェノールの濃度を徐々に段階的に２００　ｐＭに１で高めた。ジニトロフェノール添加の各工程後に培養物を３６〜４８時間放置し、安定化したのち、細胞密度および二酸化炭素水準を測定した。上記の表４に示されるように、ジニトロフェノール濃度の増大に伴って細胞当たシ産生される二酸化炭素水準は上昇した。ジニトロフェノールが細胞の代謝に与える影響が原形質ｇＡＴＰアーゼのアンカツブリングであるとすれば、二酸化炭素排出量の増加およびこれに対応する細胞密度の低下が予測されたであろう。原形質膜イオノ濃度勾配の散逸がこのイオン一度勾配に依存する他の細胞プロセス、すなわち輸送にも影響を与えることを思い起こすべきである。使って細胞の代謝効皐がこの処理によって低下したことが認められたとしても意外ではないと思われる。従ってこの解糖刺激の水準は最小であると予想されたであろう。上記の実験は二酸化炭素の産生をジニトロフェノールによって用量依存性の様式で刺激することを証明したのである。刺激の水準は再現性が高く、用いた最高濃度においては２倍以上の二酸化炭素を産生ずることが認められた。グ）レコース、うさセガラ２に一ス嬉地ＦＩＧ、４Ｂグルコ−４ス、迅勃＝組合り様１　飄カＬ砕へ１ＦＩＧ、　５Ａがツク１、−ス鳩セＦＩＧ、５ＢＦＩＧ、　６Ｆｉｇ、　ＪＩＢＴＬｇ、　８Ｃ０＠　ＯＱａ　Ｏφ　ＯＱＩ　ｏＫ　Ｏｆ：　ｏ％　Ｏ（ｌ　ＯＫ　ｏｅ　０１ −＋　ｏｗへＨ９切　リＰ４　Φφ　ロΦ　へψ　寸ＨψＨの００の　へ為　ぐ為Ｈ＜　Ｈ＜　−め　Ｈべ　−Ｃ５５ｒ−ｔ　＋切　へベ　ヘト　ヘーロｌ　＞　１．Ｉ　＞　帽　−づ　−ト　細　ΦΦ　−淵　−Ｐ−ＩＪ：Ｆ−１淵　−二　−−べ　ＬＩ　ｌ−Ｉ　Ｃべ　８　べ　Ｅ４Ｌ）Ｅ−１１−１（５１、ｌｌ＜　１１１　ｋ　１７１０　０ｔ＞ｌａ　ＱＩＩ＋５　０ｇ　陪　責　ｆ　ミ　と　芝　四　≧　ミ　四　号Ｑ＋１ｄｋａｌＪＪｅ０１−ＩＪＪ：ｊｌｌｌｌＵ芝　四　８　起　楽　起　３　晋　品　３３　起Φ　幻　−口　（１＋ｅ１４１６Ｌ１　ロ　しａ　Ｉｌｌ　ｌ１ｌｌ　１１１１−Ｉ　Ｉｌｌ　ｉｌｌ　ｏｓａｓｇ−べ　＞　＜　ぺ　〉＜ＣＩ）＜ｌ−１０８＞　ＯΦ　１．Ｉ　仁　Φ　駒　島　−Φ　０　い、１　＞　淵６＋　ＩＩＩＦ−１Φ　−＞、ｅ：　Ｕ　ｌ＜Ｌｌ！＋１＋（Ｑ　べ　Ｈり　ベ　ト　山　山　くツ　ａＩ　Φ　ｄ　ａＩ　り　細　０　φ　ト　ｏ　Φ四　ｇ　３　四　口　３　α　ｋ　汐　口　ｋ　号ｋ　ｌ：　Ｗ　＞ｅ　Ｑ、＞Ｅ　ＩｌＩ　Ｑ、　Φ　−ε　四　だ　四　起　−四　３　四　国　号　百−か　ブ　ッ　り　−旬　１　ひ　−Φ　Ｎｇ　！ｉｉ　！　！　！　＞、四　（ン　ｇ　＝　四ｏｌ−Ｉ　Ｃ０４０′：３　０＋−４０Ｉｎψ■　ｃｏｕｌ　ｏφ　Ｎｍｗ％への　へ＜　ｃａｐ　Ｍ＞　ｃｑｐ＞　の　ω　：１ｏＩＨト　淵　ａｌ　ψ ０　０　山　−く −１Ｏ１１１″ｌｌ　Φ ｄ　鈎　Ｈ切　Ｈ〉　山　＜　＜　１−１絢　１．Ｉ　４Ｊ　：Ｉ　コ〉１　ト　ω　ａｔ、−＋Ｅ−１？　工　−〇い　Ｉ′Ｉｊｏ　ω　ト１Ｈ絢−一＜　＜　山　Ｈ（！＋Ｌ４：ｊ　憤　コ　絢 Φ　Φ　Ｈ−〇 Ω　ｌ−１＜＋５（１） ω　＞　プ　洲　ト淵　ｒ）　ｒ−１ｓ　ｔ−を山　ｔＪｏｏａＯト　胸　い　ブー　−ス　−〇〜ｃ！ＪＥ−１＜− の　鈎　コ　島　１飄　Ｘ　ω　切　絢 −９−べ　− ｏＩ：　０Ｆ−１ｏ：Ｉ　ｏ日　ｏΦ 晧の　さづ　の■　Ｈの　肖Ｈへ＜　（す〉　へ１４　ｎぺ　（”１）−４Ｃ：ＣＪ　い　Ｈ細　口 ψ　、ｃ：　ｋ　ｆづ　Φ　Ｈく　山　べ　〉　ｑ　Ｏに　ｈ　プ　ｌｅＩ　−− の　淵　Φ　−Ｃ１ω ＜ｉ−＋　−ぺ　φ　ψ Ｑｌ　い　川　Ｗ　φ　φ ψ　鈎　ト　＞　ト　ｈ＜　ベ　−−１−１− 旬　の　ス　〉噌　Ｑｌ　飄Ｐ−１−Ｉ　Ｆ−１ｒ−＋　ω　ＣＩ＜０１８ｒ５ｃ５＜０口　、−４１：：）、、　の　φ 、−＋ｍ　φ　Ｆ−１−ｆ−ＩＨＯ＞　べ　０　嵩　Ｈプ　１　ａＩ　口４　へ　０　−　コ　に　口　ωＦ　ｉ５　＝　国　４　ｋ　 ≧　３　二　芝　起４Ｊａ＋＞１：　り　１　Φ　ロ　−ひ　コ粥　む　ｇ　国　Ｕ　ミ　＝　４　ｇ　シ　四Ｆ４　：Ｉ　Ｓ４　１　り　Φ　飄　ひ　ν　へ　１ｇ　！　≧　エ　Ｕ　餌　Ｕ　曝　契　闘　滑Φ　−：ｊ　：Ｉ　餉　Φ　 Φ　り　−　＋Ｓ起　エ　！　！　浜　む　ｇ　四　四　９ｇ　篇ｙ　ａ　ＥｌＩ　Ｐ４　Ｆ−Ｉ　Ｆ−１ａｌｏ　：ｊｐ　ｈシ　ミ　賞　ｇ　ｇ　ｇ　口　、２５．３　≧＄４　コ　−　ＱＩ：Ｉ＋　ｈ　Ｇ、−１＋１１　＞酉　！　−芝　３　ｇ　浜　四　２　ロ　Ｕプ　プ　Φ　プ　−−ｈ　り　り　Φ　コ３　！　口　、！ｉ　躍　≧　四　３　３　起　８絢　に　飄　ｌＩｌ　Φ　切　Φ　づ　υ　コ　に淵　−、−＋＞＞　飄　−ＨΦ　Ｈφ Ｅ−＋ｅＱＩＣＪ！＋　べ　工　Ｃベー　絢　−功　１−１＞＄４　へ　−ｈ　φ−淵　ｌ−１＞　淵　Ｈの　−焉　 −−＞Ｅ−１＜−Ｅ＠ＩＪ　ψ　べ　８　０　Ｈｌ：　り　ひ　α　Φ　φ　コ　コ　駒　づ　−、：ｉ　１）　シ　四　氏　汐　３　Ｕ　α　四　≧ＩＪ＞　ＩｌＩ　Ｑｌ　ｌ−１１Ｆ　駒　＞０１０ｇＰＩｍ　ｗΦＨトΦ＋−１１ａ　ｒ −ＩＥ−ＩＣ！ｌ＞＜ＣＱＱＣＪｌ、ＱＱＧｌ＜１−ＩＱ、４　Ｉｄ　＞ｈ　Ｏ０１０ｂ　ＱＩＬＩφ　ρ　Ｈｌ−Ｌ　Φ　ｌ−＋　φ　絢　ト　φ　Φべ　Ｅ４＜Ｃ５ψ　−べ　−−べ　リ Φ　＞１−１　細　φ　プ　Φ　プ　プ　り　飄沢　四　ｅ　ｆ　片　四　口　８　３　３　四づ　ゆ　し　Ｆ４　コ　−ロ　負　づ　ν　中篇　−品　ｇ　３　ｇ　足　芝　謂　避　汐Ｉ：　１）　ｍｋ　口　Φ　ｈ　−−１の＋−１＞　 −淵　ψ　−Φ　φ　−ト　洲Ｌ）ｔＪ＜Ｅ−１＜１−１　ψ　り　ＯＱ　−Ｑ　＞　鈎　の　− Ｋ　Ａ　＞　＞ｒ−ＩＬ（ＪＥ−１−Ｃ！１ｄ　し　り　＞　りＨ＞　Φ　−Φ ＜ｉ−ｔ＋、ａｃ！＋＋−＋１４　、−１　：ｌ　−〇ｃａｍ　Φ　Ｊ３　Ｈ φ　〉　−Ｅ−Ｌ　ＨＱｌ　鈎　：ｊ　づ　０　づ φ　淵　Φ　ｌ−１１−ＩＦ−１べ　［−４１−１ぺ　−ぺ０　い　ｖＩ　ａｒｍ　の −−為　ＣＩ　＋　−、−１山　＜１−１−り　閃０　の　＞　＞　い　り一・＠　？　＋−４１−１＞１１１＋繁ｕａ＜ｐ ■　Ｈ切　刃　く　口重　ｄ　飄　ＨＳＳへ　＞＋−２Ｃ！ｌ＋、５１ｊり　四　〇　づ　φ　細ト　ψ　陶　−−ｈ −＜　山　＜　繁　− ０ＬＩＩ　Ｏ［０１−１０ＣＱ　ＯΦ　ＯＱＩ”＋＞　ｌｊ’ｌＨｒ＋ｃｕ　Ｏ ’１％　ｒ−＋ｒ−＋　ｍｒ−１ヘー　ヘベ　ヘク　ヘ−１”１）−１曽Ｈ堕　Ｈφ　プ　島　り鈎　−＞　？　ＴＡ　ｒ＠べ　＞−Ｑ＜ｃｊ鈎　＞　ｌＩｊ＄、Ｉ　、−１：ｊ＞　ｔ＠　Ｐ−Ｉ＞　ｍ　ｒ＠Ｅ−ＩＬＩ　べ　−〉　０コ　＋ｏ　Ｉｄ　φ　１ −　ｄ　駒　Ｆ−１１−１淵Ｃ！ｌ　＞　Ｉｌｌ　＜　）−１，Ｅ−１タ　二　ピ　七　８　ｇ　片 −７Ｈ＜　Ｅ　Ｏ４１−１、＜ＦＩＧ、ＩＩｃｏＲＶＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｙミ）＠％Ｊ１７　＋８　１９　２０　２１　２２　２３ＦＩＧ、　１２大リゴスフレステｒに５　［牧ｘ　ｔｏ６＠／、ＣＯ２期間（時藺）％ＣＯ２］１ＹＬｑ、１９ＦＩＧ、　２１ａＦＩＧ、　２ｉｂＥｃｏＲＩＦＩＧ、　２２ａＦＩＧ、２２ｂｉｎｄｍＦＩＧ、２３補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１カ昭和６２年７月ｇ「紺特許庁長官　小　川　邦　夫　殿２、発明の名称改良された酵母菌株３、特許出願人住　所　アメ゛リカ合衆国マサチューセッツ州０２１４０−２３８７゜ケンブリッジ、ケンブリッジバーク・ドライブ　８７名　称　ジエネティックス・インスチチュート・インコーホレーテッド４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６号室５、補正書の提出日請求の範囲１、細胞内のＡＴＰの水準の低下を調節し、これによりパン発酵（１ａａｖａ？Ｉｉｎｇ　）速度を高めることよりなる、酵母の二酸化炭素およびエタノール産生速度を高める方法。２、細胞内のＡＴＰＯ水準を低下させ、これにより醸造（ｂｒｅｗｉｎｇ　）速度を高めることよりなる、酵母の二酸化炭素およびエタノール産生速度を高める方法。３、細胞内のＡＴＰの水準を低下させ、これにより発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　）速度を高めることよりなる、酵母の二酸化炭素およびエタノール産生速度を高める方法。４、酵母遺伝子型において代謝酵素をコードする遺伝子の天然プロモーターを、調節可能なプロモーターに置換して、該酵素の調節可能な発現を可能にし、これに上り該酵素が触媒する代謝反応をその逆反応と同時に進行させてＡＴＰを消費することによってＡＴＰ水準を低下させる、請求の範囲第１項に記載の方法。５、さらに、代謝酵素をコードする遺伝子を遺伝学的に修飾し、該酵素のアロステリックまたは他の阻害または不活化を防止または除去することよりなる、請求の範囲第４項に記載の方法。６、酵素がフルクトース−１，６−ジホスフェート（ＦＤＰアーゼ）である、請求の範囲第４項に記載の方法。７、ＦＤＰアーゼをコードする遺伝子が突然変異誘発され、これにより突然変異遺伝子のコドン１２がセリン以外のアミノ酸全コードする、請求の範囲第６項に記載の方法。８、ＦＤＰアーゼをコードする遺伝子がさらに突然変異誘発され、これによりフルクトース−２，６−ジホスフェートによる酵素のアロステリック阻害が低下する、請求の範囲第７項に記載の方法。９、ＦＤＰアーゼをコードする遺伝子がさらに突然変異誘発され、これによりアデノシン−リン酸による酵素のアロステリック阻害が低下する、請求の範囲第７項に記載の方法。１０、酵素をコードする遺伝子が生産の酵母増殖期間中は発現しない、請求の範囲第４項に記載の方法。１１、調節可能なプロモーターが温度域受性プロモーターであり、これにより酵素をコードする遺伝子があらがじめ定められた温度においてのみ発現する、請求の範囲第４項に記載の方法。１２、発現がＦＤＰ蛋白質により触媒される調節された遺伝子組換えの制御下にある、請求の範囲第４項に記載の方法。１３、細胞外酸性ホスファターゼ（ＡＰアーゼ）に関する遺伝子を遺伝学的に修飾し、これによりＡＰアーゼが酵母細胞質内に留まることによってＡＴＰ水準が低下する、請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載の方法。１４、遺伝学的修飾が、成熟ＡＰアーゼをコードする遺伝子を含み、機能性分泌リーダー配列を含まないベクターを酵母に挿入することよりなる、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５、ベクターが自己複製単一コピー、セントロメア含有プラスミドからなる、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６、ベクターが酵母２μ複製原点を含有するマルチコピープラスミドからなる、請求の範囲第１４項に記載の方法。１７、ベクターが酵母のゲノムに挿入される、請求の範囲第１４項に記載の方法。１８、酵母遺伝子型に代謝酵素をコードする遺伝子を、プロモーターの発現制御下に挿入して、該遺伝子の構成性発現を可能にし、これにより該酵素が触媒する代謝反応をその逆反応と同時に進行させてＡＴＰを消費することによってＡＴＰ水準を低下させる、請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。１９、発現がさらに、ＦＬＰ蛋白質により触媒される調節された遺伝子組換えの制御下にある、請求の範囲第１８項に記載の方法。２０、ＡＴＰの消費を直接的または間接的に誘発しつる化学物質で酵母を処理することによりＡＴＰ水準を低下させる、請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載の方法。２１、改良が、細胞内のＡＴＰ水準を低下させ、これにより高い発酵活性をもつ酵母を得る遺伝学的修飾からなる、改良された酵母。２２、改良が、細胞内のＡＴＰ水準の低下を調節し、これにより高められた速度のパン発酵活性をもつ客母を得る遺伝学的修飾からなる、改良された酵母。２３、改良が、細胞内のＡＴＰ水準を低下させ、これにより高い醸造活性をもつ酵母を得る遺伝学的（：ξ飾からなる、改良された酵母。２４、修飾が、酵母内部に機能性分泌リーダー配列を欠如したＡＰアーゼ遺伝子を含むベクターＤ　Ｎ　Ａ　ｆ存在させ、これによりこれから発現したＡＰアーゼが細胞から分泌されないことよりなる、請求の範囲第２１項、第２２項または第２３項に記載の酵母。２５、修飾が、酵母内部に代謝酵素（で関する遺伝子金倉むベクターＤＮＡを調節可能なプロモーターの発現制御下に存在させて、該酵素の調節された発現を可能にし、これにより該酵素が触媒する代謝反応をその逆反応と同時に進行させてＡ　Ｔ　Ｐ　ｉｆ消費することよりなる、請求の範囲第２２項に記載の酵母。２６、修飾が、酵母内部に代謝酵素に関する遺伝子を含むベクターＤＮＡｆプロモーターの発現制御下に存在させて、該酵素の構成性発現を可能にし、これにより該酵素が触媒する代謝反応全その逆反応と同時に進行させてＡＴＰを消費することよりなる、請求の範囲第２１項または第２３項に記載の酵母。２７、発現がさらに、ＦＤＰ蛋白質により触媒される調節された遺伝子組換えの制御下にある、請求の範囲第２２項に記載の酵母。閥、（α）調節可能なプロモーターに作動可能な状態で結合したＦＤＰ蛋白質をコー　ドするＤＮＡ配列（ＦＬＰ　ＤＮＡ）を含む第１ベクター、および（ｂ＋　プロモーターに作動可能な状態で結合した異種（ｈ、ｅｔｔｒｏｌｏｇｏｕｓ　）ＤＮＡ配列を含み、このプロモーターが、Ｆ’　Ｌ　Ｐ蛋白質により認識されるＤＮＡ配列（フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ　）ＤＮＡ　）によりフランクされた発現ブロックを挿入含有する、第２ベクターからなり、これにより第１ベクター内のＦＬＰ　ＤＮＡの発現によって産生されたＦＤＰ蛋白質がフランキングＤＮＡの間の組換えを触媒し、これにより発現ブロックが除かれて異種ＤＮＡ配列の発現が可能となる、宿主細胞における異種ＤＮＡ配列の調節された発現のためのベクター系。゛２９、　ｆｃＬ）　宿主細胞を（１）調節可能なプロモーターに作動可能な状態で結合ＩまたＦＬＰ蛋白質をコードするＤＮＡ配列ＣＦＬＰ　ＤＮＡ）を含む第１ベクター、および（ＩＩ）プロモーターに作動可能な状態で結合した異種ＤＮＡ配列を含み、このプロモーターが、ＦＤＰ蛋白質により認識されるＤＮＡ配列（７ランギングＤＮＡ）によりフランクされた発現ブロックを挿入含有する、第２ベクターでトランスフェクションし、（ｂ）トランスフェクションされた宿主細胞を培養して、フランキングＤＮＡの間の組換えを触媒する、第１ベクターのＦＤＰ蛋白質を発現し、これにより発現ブロックを除去し、異種ＤＮＡ配列の発現を可能にする、宿主細胞における異種ＤＮＡ配列の調節された発現法。３０、実質的に第８図に示されたぺジチド配列をコードするｃＤＮＡ、ｉたは第８図のＤＮＡ配列とノ・イブリダイズするＤＮＡ配列。国際調査報告１″’−’−’　”””””　”’　ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４４７ＡＴｒＡＣＨＭＥＮＴ

Claims

【特許請求の範囲】

１．細胞内のＡＴＰの水準を低下させ、これにより解糖を刺激することよりなる、酵母の二酸化炭素およびエタノール産生速度を高める方法。
２．酵母遺伝子型において、代謝酵素をコードする遺伝子の天然プロモーターを、調節可能なプロモーターに置換して、該酵素の調節可能な発現を可能にし、これにより該酵素が触媒する代謝反応をその逆反応と同時に進行させてＡｔＰを消費することによつてＡＲＰ水準を低下させる、請求の範囲第１項に記載の方法。
３．さらに、代謝酵素をコードする遺伝子を遺伝学的に修飾し、該酵素のアロステリツクまたは他の阻害または不活化を防止または除去することよりなる、請求の範囲第２項に記載の方法。
４．酵素かフルクトース−１，６−ジホスフアターゼ（ＦＤＰアーゼ）である、請求の範囲第２項に記載の方法。
５．ＦＤＰアーゼをコードする遺伝子か突然変異誘発され、これにより突然変異遺伝子のコドン１２がセリン以外のアミノ酸をコードする、請求の範囲第４項に記載の方法。
６．ＦＤＰアーゼをコードする遺伝子さらに突然変異誘発され、これによりフルクトース−２，６−ジホスフエートによる酵素のアロステリツク阻害が低下する、請求の範囲第５項に記載の方法。
７．ＦＤＰアーゼをコードする遺伝子がさらに突然変異誘発され、これによりアデノシン−リン酸による酵素のアロステリック阻害が低下する、請求の範囲第５項に記載の方法。
８．酵素をコードする遺伝子が生産の酵母増殖期間中は発現しない、請求の範囲第２項に記載の方法。
９．調節可能なプロモーターが温度感受性プロモーターであり、これにより酵素をコードする遺伝子があらかじめ定められた温度においてのみ発現する、請求の範囲第２項に記載の方法。
１０．発現がＦＬＰ蛋白質により触媒される調節された遺伝子組換えの制御下にある、請求の範囲第２項に記載の方法。
１１．細胞外酸性ホスフアターゼ（ＡＰアーゼ）に関する遺伝子を遺伝学的に修飾し、これによりＡＰアーゼが酵母細胞質内に留まることによつてＡＴＰ水準が低下する、請求の範囲第２項に記載の方法。
１２．遺伝学的修飾が、成熟ＡＰアーゼをコードする遺伝子を含み、機能性分泌リーダー配列を含まないベクターを酵母に挿入することよりなる、請求の範囲第１１項に記載の方法。
１３．ベクターが自己複製単一コピー、セントロメア含有プラスミドからなる、請求の範囲第１２項に記載の方法。
１４．ベクターが酵母２μ複製原点を含有するマルチコピープラスミドからなる、請求の範囲第１２項に記載の方法。
１５．ベクターが酵母のゲノムに挿入される、請求の範囲第１２項に記載の方法。
１６．酵母遺伝子型に代謝酵素をコートする遺伝子を、プロモーターの発現制御下に挿入して、該遺伝子の構成性発現を可能にし、これにより該酵素が触媒する代謝反応をその逆反応と同時に進行させてＡＴＰを消費することによつてＡＴＰ水準を低下させる、請求の範囲第１項に記載の方法。
１７．発現がさらに、ＦＬＰ蛋白質により触媒される調節された遺伝子組換えの制御下にある、請求の範囲第１６項に記載の方法。
１８．ＡＴＰの消費を直接的または間接的に誘発しうる化学物質で酵母を処理することによりＡＴＰ水準を低下させる、請求の範囲第１項に記載の方法。
１９．改良が、細胞内のＡＴＰ水準を低下させ、これにより解糖を刺激し、高い発酵活性をもつ酵母を得る遺伝学的修飾からなる、改良された酵母。
２０．修飾が、酵母内部に機能性分泌リーダー配列を欠如したＡＰアーゼ遺伝子を含むベクターＤＮＡを存在させ、これによりこれから発現したＡＰアーゼが細胞から分泌されないことよりなる、請求の範囲第１９項に記載の酵母。
２１．修飾が、酵母内部に代謝酵素に関する遺伝子を含むベクターＤＮＡを調節可能なプロモーターの発現制御下に存在させて、該酵素の調節された発現を可能にし、これにより該酵素が触媒する代謝反応をその逆反応と同時に進行させてＡＴＰを消費することよりなる、請求の範囲第１９項に記載の酵母。
２２．修飾が、酵母内部に代謝酵素に関する遺伝子を含むベクターＤＮＡをプロモーターの発現制御下に存在させて、該酵素の構成性発現を可能にし、これにより該酵素が触媒する代謝反応をその逆反応と同時に進行させてＡＴＰを消費することよりなる、請求の範囲第１９項に記載の酵母。
２３．発現がさらに、ＦＬＰ蛋白質により触媒される調節された遺伝子組換えの制御下にある、請求の範囲第２２項に記載の酵母。
２４．（ａ）調節可能なプロモーターに作動可能な状態で結合したＦＬＰ蛋白質をコードするＤＮＡ配列（ＦＬＰ　ＤＮＡ）を含む第１ベクター、および（ｂ）プロモーターに作動可能な状態で結合した異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ■■）ＤＮＡ配列を含み、このプロモーターが、ＦＬＰ蛋白質により認識されるＤＮＡ配列（フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ＤＮＡ）によりフランクされた発現ブロツクを挿入含有する、第２ベクターからなり、これにより第１ベクター内のＦＬＰ　ＤＮＡの発現によつて産生されたＦＬＰ蛋白質がフランキングＤＮＡの間の想換えを触媒し、これにより発現ブロツクが除かれて異種ＤＮＡ配列の発現が可能となる、宿主細胞における異種ＤＮＡ配列の調節された発現のためのベクター系。