DE3888381T2

DE3888381T2 - Hefevektor.

Info

Publication number: DE3888381T2
Application number: DE3888381T
Authority: DE
Inventors: Simon Andrew Chinery; Edward Hinchliffe
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 1987-04-09
Filing date: 1988-04-08
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2008-04-09
Also published as: AU1540388A; WO1988008027A1; GB2210621B; AU613030B2; CA1339099C; JP2873012B2; ES2052712T3; GB2210621A; EP0286424B1; FI885705A; FI95285B; GB8828753D0; IE63424B1; FI885705A0; DE3888381D1; BR8806573A; HUT52560A; EP0286424A1; US5637504A; FI95285C

Description

Diese Erfindung betrifft gentechnologische Eingriffe bei Hefe, insbesondere an Saccharomyces cerevisiae.
Die Aufnahme von exogener DNA durch Hefezellen und die sich anschließende Überführung dieser DNA in die Erbsubstanz und ihre Expression werden mit Hilfe eines Verfahrens bewirkt, das mit Transformation bezeichnet wird. Transformation wurde zuerst in den späten 70er Jahren beschrieben, wobei man Methoden einsetzte, die auf der Zugabe von DNA zu Protoplasten beruhen, welche durch die enzymatische Entfernung der Zellwand der Hefe erzeugt worden waren (Hinnen et al., 1978; Beggs, 1978). In jüngerer Zeit wurde die Transformation intakter Hefezellen gezeigt (Hisao et al., 1983)
Hefe kann durch geeignete Plasmide transformiert werden; für diesen Zweck verwendete Plasmide werden normalerweise als sog. "Schaukelvektoren" (engl.: "shuttle vectors") konstruiert, die sowohl in Escherichia coli als auch in Hefe propagiert werden können (Hinnen et al., 1978; Beggs, 1978; Struhl et al., 1979). Der Einschluß von aus E. coli stammenden Plasmid-DNA-Sequenzen wie beispielsweise pBR322 (Bolivar, 1978) erleichtert die quantitative Erzeugung von Vektor-DNA in E. coli und damit auch die wirksame Transformation von Hefe.
Die gängigen Plasmidvektoren für die Hefetransformation können in zwei Gruppen eingeteilt werden: (i) replizierende Vektoren, das heißt solche, die in der Lage sind, ihr eigenes Verbleiben sicherzustellen, unabhängig von der chromosomalen DNA von Hefe, und zwar mit Hilfe des Vorhandenseins eines funktionellen Ursprungs der DNA-Replikation, und (ii) integrierende Vektoren, deren Funktion auf der Rekombination mit der chromosomalen DNA beruht, wodurch die Replikation und damit der ständige Verbleib der rekombinanten DNA in der Wirtszelle erleichtert wird. Replizierende Zellen können weiterhin unterteilt werden in: (a) Plasmidvektoren auf der Basis von 2u, in denen der Ursprung der DNA-Replikation aus dem endogenen 2u-Plasmid von Hefe stammt, (b) autonom replizierende Vektoren (ARS), in denen der "scheinbare" Ursprung der Replikation aus der chromosomalen DNA von Hefe stammt, und (c) centromere Plasmide (CEN), die zusätzlich zu einem der oben erwähnten Ursprünge der DNA- Replikation eine chromosomale DNA-Sequenz von Hefe tragen, von der man weiß, daß sie ein Centromeres beinhaltet.
Um Hefe wirksam mit einem der vorgenannten Vektoren zu transformieren, ist es erforderlich, eine Selektionierung vorzunehmen, um diejenigen Transformanten zu identifizieren, die die rekombinante DNA tragen. Dies erreicht man durch den Einbau eines Gens mit einem unterscheidbaren Phänotyp in die Vektor-DNA. Wenn es sich um für die Transformation von Laborhefe verwendete Vektoren handelt, werden üblicherweise prototrophe Gene wie beispielsweise LEU2, URA3 oder TRP1 (Hinnen et al., 1978; Beggs, 1978; Gerbaud et al., 1979) verwendet, um auxotrophe Läsionen im Wirt zu komplementieren. Um jedoch Brauhefe und andere industrielle Hefen, die häufig polyploid sind und bei denen keine speziellen Erfordernisse bezüglich der Auxotrophie vorliegen, zu transformieren, ist es notwendig, ein auf einem dominanten selektierbaren Gen beruhendes Selektionssystem zu verwenden. Diesbezüglich sind replizierende Plasmidvektoren auf der Basis von 2u beschrieben worden, die Gene tragen, welche Resistenz gegenüber: (i) Antibiotika, beispielsweise G418 (Jiminez et al., 1980; Webster et al., 1983), Hygromycin B (Gritz et al., 1983), Chloramphenicol (Cohen et al., 1980; Hadfield et al., 1986), und (ii) in anderer Weise toxischen Substanzen, beispielsweise dem Herbizid Sulfometuron-Methyl (Falco et al., 1985), Compactin (Rine et al., 1983) und Kupfer (Henderson et al., 1985) vermitteln.
Die vererbbare Stabilität rekombinanter Gene in Hefe hängt von der Art des zur Erleichterung der Transformation eingesetzten Hefevektors ab. Die stabilste der beiden Arten von zuvor beschriebenen Vektorsystemen sind die integrierenden Vektoren. Die Prinzipien und die Praxis integrativer Hefetransformation ist in der Literatur beschrieben worden (Botstein & Davis, 1982; Winston et al., 1983; Orr-Weaver et al., 1983; Rothstein, 1983). Im allgemeinen ist die integrative Transformation relativ unwirksam; es wurden geschlossene kreisförmige integrierende Plasmide beschrieben, die ungefähr ein bis zehn Transformanten pro ug DNA liefern (Hinnen et al., 1979; Hicks et al., 1979). Lineare DNA dagegen, deren freie Enden in DNA-Sequenzen homolog zu chromosomaler DNA aus Hefe angeordnet sind, transformiert Hefe mit höherer Effizienz (100- bis 1000-fach), und man findet im allgemein, daß die transformierende DNA in Sequenzen integriert worden ist, die zu der Schnittstelle homolog sind (Orr-Weaver et al., 1981). Deshalb ist es durch Spalten der Vektor-DNA mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease möglich, die Wirksamkeit der Transformation zu steigern und die Stelle der chromosomalen Integration im vorhinein festzulegen. Integrative Transformation ist für die genetische Modifikation von Brauhefe anwendbar, sofern die Effizienz der Transformation ausreichend hoch ist und die für die Integration vorgesehene DNA-Sequenz sich innerhalb einer Region befindet, die-keine solchen Gene auseinanderreißt, welche für den Metabolismus der Wirtszelle essentiell sind. Vor kurzem wurde ein integrierender Hefevektor für Brauhefe beschrieben (Yocom, 1985).
Anders als integrierende Vektoren, die, ohne daß Selektion stattfindet, einen hohen Grad an vererbbarer Stabilität zeigen, sind replizierende Vektoren eher weniger stabil.
Der Grad an vererbbarer Stabilität hängt von der Art des eingesetzten Replikationsvektors ab. ARS-Plasmide, die eine hohe Kopienzahl besitzen (ungefähr 20 bis 50 Kopien pro Zelle) (Hyman et al., 1982), sind tendenziell am wenigsten stabil und gehen mit einer Frequenz von mehr als 10% pro Generation verloren (Kikuchi, 1983). Die Stabilität von ARS-Plasmiden kann jedoch durch die Anfügung eines Centromeren erhöht werden; centromere Plasmide sind mit ein oder zwei Kopien in der Zelle vorhanden (Clake & Carbon, 1980) und werden nur ungefähr zu 1% pro Generation verloren (Walmsley et al., 1983). Chimäre, auf 2u basierende Plasmide zeigen verschiedene Grade von vererbbarer Stabilität, und zwar in Abhängigkeit sowohl vom Wirtsstamm als auch von den 2u-DNA-Sequenzen, die auf dem Plasmid vorhanden sind.
Man weiß, daß das 2u-Plasmid in zellulärer Anordnung nukleär ist (Nelson & Fangman, 1979; Livingston & Hahne, 1979; Seligy et al., 1980; Taketo et al., 1980; Sigurdson et al., 1981), es ist jedoch in einer von der Mendel'schen Art abweichenden Weise eingebaut (Livingston, 1977). Man hat zeigen können, daß aus haploiden Hefepopulationen mit einer durchschnittlichen Kopienzahl von 50 Kopien des 2u-Plasmids pro Zelle Zellen ohne das 2u-Plasmid (cirº) mit einer Rate von zwischen 0,001% und 0,01% Zellen pro Generation hervorgehen (Futcher & Cox, 1983). Eine mögliche Erklärung für diesen geringen Wert an vererbbarer Instabilität ist, daß das Plasmid unter normalen Wachstumsbedingungen keinen sichtbaren Vorteil für die Zelle liefert (Broach, 1981; Futcher & Cox, 1983; Sigurdson et al., 1981), obwohl geringe Effekte auf die Wachstumsraten für manche Stämme bekannt wurden, die das 2u-Plasmid beherbergen (Walmsley et al., 1983). Die Analyse verschiedener Stämme von S. cerevisiae hat gezeigt, daß das Plasmid in den meisten Hefestämmen (Clark-Walter & Miklos, 1974) und auch in Brauhefe (Tubb, 1980; Aigle et al., 1984; Hinchliffe & Daubney, 1986) vorhanden ist. Es scheint deshalb, daß das Plasmid ubiquitär ist, was einen natürlicherweise vorhandenen hohen Grad an vererbbarer Stabilität impliziert.
Die genetische und molekulare Analyse des 2u-Plasmids hat eine große Zahl von Informationen bezüglich der Replikation und des stabilen Verbleibs des Plasmids geliefert (Volkert & Broach, 1987). Im wesentlichen besteht das Plasmid aus einem kreisförmigen DNA-Molekül aus 6318 Basenpaaren (Hartley & Donelson, 1980). Es beherbergt einen einzigen bidirektionalen Ursprung der DNA-Replikation (Newlon et al., 1981), der ein essentieller Bestandteil aller auf 2u basierenden Vektoren ist. Das Plasmid enthält vier Gene, REP1, REP2, REP3 und FLP, die für den stabilen Verbleib einer hohen Zahl von Plasmid-Kopien pro Zelle erforderlich sind (Broach & Hicks, 1980; Jayaram et al., 1983). REP3 wird auch als der STB-Ort bezeichnet. Die Gene REP1 und REP2 codieren für trans wirkende Proteine, von denen man annimmt, daß sie gemeinsam durch Interaktion mit dem REP3- Ort wirken, um die stabile Teilung des Plasmids bei der Zellteilung sicherzustellen (Volkert & Broach, 1987) . In dieser Hinsicht verhält sich das REP3-Gen als ein cis agierender Ort, der die stabile Teilung des Plasmids bewirkt, und es ist phänotypisch einem chromosomalen Centromeren analog (Jayaram et al., 1983; Kikuchi, 1983). Ein wichtiges Merkmal des 2u-Plasmids ist das Vorliegen von zwei invertierten DNA-Sequenz-Repititionen (jeweils mit einer Länge von 559 Basenpaaren), die das kreisförmige Molekül -in zwei einzelne Regionen trennen. Die intramolekulare Rekombination zwischen den invertierten Wiederholungssequenzen führt zu Inversion einer einzelnen Region im Verhältnis zu der anderen und zur in vivo erfolgenden Bildung einer gemischten Population von zwei strukturellen Isomeren des Plasmids, die mit A und B bezeichnet werden (Beggs, 1978). Die Rekombination zwischen den zwei invertierten Sequenzwiederholungen wird durch das Proteinprodukt eines Gens vermittelt, das als das FLP-Gen bezeichnet wird, und das FLP-Protein ist in der Lage, die Rekombination innerhalb der invertierten Wiederholungsregion mit hoher Frequenz zu vermitteln. Dieses ortsspezifische Rekombinationsereignis stellt, wie man glaubt, einen Mechanismus bereit, der die Amplifizierung der Kopienzahl des Plasmids sicherstellt (Futcher, 1986; Volkert & Broach, 1986; Som et al., 1988; Murray et al., 1987).
Jede invertierte Wiederholungssequenz umfaßt drei DNA-Wiederholungssequenz-Untereinheiten (in Fig. 3 als Dreiecke dargestellt), wobei zwei benachbarte Untereinheiten in direkter Orientierung zueinander angeordnet sind und die dritte in indirekter Orientierung angeordnet und über eine 8 Basenpaare lange Verknüpfungs- oder Distanzregion mit einer der anderen Untereinheiten verbunden ist. Diese Distanz-Region enthält eine einzelne XbaI-Schnittstelle und erkennt das Produkt das FLP-Gens, von dem es an seinen Begrenzungen geschnitten wird. Die benachbarten Sequenzen sind selbstverständlich zu den entsprechenden Sequenzen der anderen invertierten Wiederholungssequenz homolog und erlauben daher nach diesem Schneiden eine genaue Rekombination. Andrews et al. (1985) haben gefunden, daß eine 74 Basenpaare lange Sequenz, die die 8 Bp umfassende Distanzregion beinhaltet, das kleinstmögliche Erfordernis für die FLP-ortsspezifische Rekombination ist.
Hefevektoren, die auf dem Replikationssystem des 2u-Plasmids basieren, sind durch Insertion heterologer DNA-Sequenzen in solche Regionen des 2u-Plasmids erzeugt worden, die für seine Replikation nicht essentiell sind (Beggs, 1981).
Dies führte zu zwei grundlegenden Arten des Vektors: (i) ganze 2u-Vektoren und (ii) Vektoren mit dem 2u-Ursprung. Im ersteren Falle beherbergen diese Vektoren das gesamte 2u- Plasmid, in das verschiedene heterologe Sequenzen insertiert worden sind, beispielsweise E. coli Plasmid-DNA. Diese Plasmide sind in der Lage, sich mit einer hohen Kopienzahl mit einem hohen Grad an vererbbarer Stabilität sowohl in cir&spplus;-Wirten (2u enthaltend) als auch cirº-Wirten (denen 2u fehlt) zu halten. Auf der anderen Seite enthalten Vektoren mit dem 2u-Ursprung gewöhnlich eine möglichst kleine DNA-Sequenz, die den 2u-Ursprung der DNA-Replikation und eine einzelne Kopie der 599 Basenpaare langen Wiederholungssequenz von 2u beherbergt; solche Vektoren können nur in cir&spplus;-Wirtsstämmen gehalten werden, da für sie erforderlich ist, daß die von den REP1- und REP2-Genen codierten Proteine trans vom endogenen Plasmid geliefert werden müssen, um ihren "stabilen" Verbleib zu sichern.
Wenn eine genetisch modifizierte Hefe konstruiert wird, die in der Lage ist, ein heterologes Gen für die Erzeugung von großen Mengen eines wirtschaftlich bedeutenden Polypeptids zu exprimieren, ist es gewöhnlich wünschenswert, einen Hefevektor zu wählen, der in einer hohen Kopienzahl vorliegt. Von 2u abgeleitete Vektoren haben sich als sehr erfolgreich für die Verwendung als Expressionsplasmide erwiesen und stellen daher häufig den Vektor der Wahl dar (Kingsman et al., 1985)
In der Europäischen Patentanmeldung 86303039.1 (Veröffentlichungs-Nummer 0201239 A1 für Delta Biotechnology Ltd.) ist ein Verfahren für die Herstellung von heterologen Proteinen in Brauhefe beschrieben, worin ein industrieller Hefestamm genetisch so modifiziert wird, daß er ein heterologes Gen exprimieren kann, derart, daß während der zuerst erfolgenden Biervergärung keine Expression des heterologen Gens stattfindet, sondern statt dessen Hefemasse akkumuliert wird, und die Synthese von heterologen Proteinen erst dann induziert wird, wenn die Hefe vom Bier abgetrennt worden ist. Dies wird durch Transformieren von Brauhefe mit einem auf 2u basierenden Plasmid erreicht, das den dominanten selektierbaren Marker CUP-1 sowie ein Gen enthält, das für ein modifiziertes menschliches Serumprotein, N-Methionylalbumin (Met-HSA) codiert, dessen Expression auf der transkriptionalen Ebene durch einen mittels Galaktose induzierbaren Promotor reguliert wird. Um die Ausbeute bei der heterologen Proteinsynthese während der Durchführung dieses Verfahrens maximal zu halten, ist es erforderlich, folgendes sicherzustellen: (i) eine hohe Kopienzahl desjenigen Gens, das exprimiert werden soll (das für Met-HSA codiert); (ii) einen hohen Grad an vererbbarer Stabilität des interessierenden Gens unter den Bedingungen eines nicht-selektiven Wachstums; (iii) daß die in Brauhefe transformierten rekombinanten Gene keinen nachteiligen Effekt auf die Hefe und ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Bier und anschließend von heterologem Protein zeigen; (iv) daß die in Hefe vorhandenen rekombinanten Gene soweit wie möglich auf das "interessierende Gen" und benachbarte regulatorische Hefegene beschränkt bleiben sollten. Das Erfordernis (ii) ist besonders wichtig, da es sowohl unpraktisch als auch unerwünscht ist, das normale Wachstumsmedium von Brauhefe, nämlich gehopften Malzextrakt, mit toxischen Materialien wie zum Beispiel Kupferionen anzureichern, da dies die Verfahrenskosten steigert und eine nachteilige und wahrscheinlich unakzeptable Wirkung auf die Qualität des Biers haben wird, welches das Primärprodukt der Fermentation ist. Im Zusammenhang mit dem Erfordernis (iv) ist es wünschenswert, daß die genetisch modifizierte Hefe keine fremden DNA-Sequenzen besitzen sollte, beispielsweise solche, die aus dem bakteriellen Teil des rekombinanten Plasmids stammen.
In unserer als EP-A-251744 veröffentlichen Anmeldung haben wir ein Verfahren zum Modifizieren von Hefezellen durch den Einbau einer für ein interessierendes Protein oder Peptid codierenden DNA-Sequenz in das endogene 2u-Plasmid beschrieben, indem ein integrierender Vektor erzeugt wird, der zwei Kopien einer homologen 2u-Plasmid-DNA-Sequenz in direkter Orientierung, welche die interessierende DNA-Sequenz umfassen, enthält, Hefe mit dem genannten integrierenden Vektor transformiert wird und dann aus der transformierten Hefe erhaltene Zellen isoliert werden, die das endogene 2u-Plasmid, durch den Einbau der interessierenden DNA-Sequenz modifiziert, enthalten. Der integrierende Vektor selbst überlebt in den transformierten Hefezellen nicht. Die homologen 2u-Plasmid-DNA-Sequenzen können Kopien der 2u-Plasmid-Wiederholungssequenz sein, sind es gewöhnlich aber nicht.
Wir haben nun gefunden, daß eine Modifizierung des Verfahrens der genannten Anmeldung es möglich macht, Hefezellen durch den Einbau eines modifizierten 2u-Plasmids zu transformieren.
Im Verfahren der vorliegenden Anmeldung enthält der verwendete Plasmidvektor eine DNA-Sequenz, die die Propagation des Vektors in Bakterien ermöglicht und die zwischen zwei homologe 2u-Plasmid-DNA-FLP-Rekombinationsstellen in direkter Orientierung eingepaßt ist, eine DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, welches bevorzugt aber nicht notwendigerweise eine zu Hefe heterologe Sequenz ist, und vorzugsweise auch eine selektierbare Marker-DNA-Sequenz. Der 2u-Plasmidvektor der Erfindung umfaßt also drei Kopien der FLP-Rekombinationsstelle, von denen ein Paar in direkter Orientierung und die anderen beiden Paare in indirekter Orientierung angeordnet sind. Wenn Hefe mit einem Plasmidvektor mit dieser Konstruktion transformiert wird, geht, wie man gefunden hat, die DNA-Sequenz, die die Propagation des Vektors in Bakterien ermöglicht, spontan verloren, und der Plasmidvektor wird zu einem modifizierten 2u-Plasmid, welches in der Lage ist, das endogene 2u-Plasmid in der transformierten Hefe zu ersetzen. Plasmidvektoren dieser Art werden deshalb hier im folgenden als Disintegrations-Vektoren bezeichnet. Die mit solchen Vektoren transformierte Hefe kann mehrere extrachromosomale Kopien eines modifizierten 2u-Plasmids mit einem interessierenden Gen, aber ohne bakterielle DNA, enthalten, von denen man inzwischen weiß, daß sie unter Bedingungen des nicht-selektiven Wachstums stabil vererbt werden.
Bruschi (13th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Herbst 1986) offenbarte, daß Rekombination in einem auf 2u basierenden Plasmid zum Ausschneiden bakterieller DNA-Sequenzen führen könnte, er schlug jedoch nur vor, daß das System verwendet werden könnte, um Verhältnisse zwischen Struktur und Funktion im DNA-Molekül zu studieren. Bruschi (Plasmid 1987, 17(1); Seite 98) ist ähnlich, erwähnt jedoch Klonierungsgene. Hollenberg (Curr. Topics in Microbiol. & Immunol., 1982, 96, Seiten 119-144) diskutiert die Rekombination in Plasmiden auf 2u-Basis. Keines dieser Dokumente lehrt eine bevorzugte Insertionsstelle für die gewünschte kodierende Sequenz. Wir haben nun gefunden, daß ein vergleichbares System verwendet werden kann, um vorteilhafte Expressionsvektoren herzustellen, die unerwartete Stabilität besitzen, wenn die gewünschte codierende DNA-Sequenz zwischen ori und das STB- Gen der aus dem 2u-Plasmid stammenden DNA insertiert wird.
Der Ausdruck "FLP-Rekombinationsstelle" wird vorliegend verwendet, um eine beliebige Stelle zu bezeichnen, die als Ergebnis der Interaktion mit dem FLP-Genprodukt Rekombination ermöglicht. Wenn die Erkenntnis von Andrews (1985) richtig ist, dann sollte die FLP-Rekombinationsstelle im allgemeinen als Minimum die von ihm identifizierte 74 Bp lange Sequenz enthalten. In der Tat gibt es keinen Anhaltspunkt dafür, mehr als die 599 Basenpaare der gesamten Wiederholungssequenz einzubeziehen.
Es wurde gefunden, daß der erfindungsgemäße Disintegrations-Vektor auf 2u-Basis in der Lage ist, sowohl Laborhefe als auch industrielle Hefe zu transformieren. Der Disintegrations-Vektor wird in einer hohen Kopienzahl pro Zelle beibehalten und besitzt einen extrem hohen Grad an vererbbarer Stabilität. Darüber hinaus ist der Disintegrations- Vektor, anders als alle anderen bisher beschriebenen Plasmidvektoren auf 2u-Basis, so konstruiert, daß nach der Transformation von Hefe die bakteriellen plasmidischen DNA- Sequenzen spontan verlorengehen. So können genetisch modifizierte Stämme von Brauhefe konstruiert werden, in denen das in das 2u-Plasmid eingebaute "interessierende Gen" mit einer hohen Kopienzahl pro Zelle in Abwesenheit fremder bakterieller Plasmid-DNA-Sequenzen stabil erhalten bleibt, und zwar auch unter Bedingungen des nicht-selektiven Wachstums. Die Verwendung eines solchen Vektors bei der Konstruktion einer genetisch modifizierten Brauhefe stellt sicher, daß nur das "interessierende Gen" für nachfolgende Generationen in Brauhefe stabil erhalten bleibt, wodurch mögliche nachteilige Effekte, die zusätzliche DNA-Sequenzen auf das technologische Verhalten der Hefe und/oder das Aroma und die Qualitätseigenschaften von durch die Hefe erzeugtem Bier haben können, umgangen werden.
In der Praxis kann das "interessierende Gen" ein beliebiges rekombinantes Gen sein, das entweder homolog oder heterolog zur Hefe ist. Der Disintegrations-Vektor kann beispielsweise verwendet werden, um das Met-HSA-Gen in Brauhefe stabil zu integrieren, wobei das Gen entweder von einem konstitutiven Hefepromotor, beispielsweise dem Phosphoglyceratkinase-Promotor (PGK), gemäß dem in der EP-A-147 198 beschriebenen Verfahren, oder einem regulierten Hefepromotor, beispielsweise dem in der EP-A-201 239 beschriebenen GAL10/CYC1 Hybridpromotor oder dem in der EP-A- 258 067 beschriebenen GAL/PGK-Promotor, exprimiert werden.
Weitere Gene, die in diesem System stabil beibehalten werden können, umfassen das DEX1-Gen von Saccaromyces diastaticus, welches die Produktion eines extrazellulären Glucoamylase-Enzyms in Brauhefe spezifiziert, und das J3- Glucanase-Gen von Bacillus subtilis, welches die Produktion einer endo-1,2-1,4-β-Glucanase in Brauhefe spezifiziert (Hinchliffe & Box, 1985). Solche Gene können zuerst genetisch modifiziert werden, um die Höhe der Genexpression einzuregeln und/oder sicherzustellen, daß das Protein, dessen Synthese durch das Gen vermittelt wird, von der Brauhefe sezerniert wird.
Die Verwendung des neuen Disintegrations-Vektors ist besonders bei dem in der EP-A-201 239 beschriebenen Verfahren von Vorteil, da gemäß diesem Verfahren das "interessierende Gen" so reguliert ist, daß es im Verlauf der Bierfermentation und auch unter normalen Wachstumsbedingungen für Hefe nicht exprimiert wird, sondern statt dessen in einem auf die Fermentation folgenden Prozeß induziert wird. Als Folge davon ist die Überexpression des "interessierenden Gens" zeitlich von der Synthese der Hefe-Biomasse durch Zellproliferation getrennt, und deshalb werden mögliche nachteilige Einflüsse der Genexpression auf die Stabilität des Plasmids minimiert.
Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Vektor ein Disintegrations-Vektor (wie hier voranstehend definiert), der ein vollständiges 2u-Plasmid umfaßt und zusätzlich (i) eine bakterielle plasmidische DNA-Sequenz, die für die Propagation des Vektors in einem bakteriellen Wirt erforderlich ist; (ii) eine zusätzliche 2u-FLP-Rekombinationsstelle; (iii) eine zwischen ori und dem STB-Gen insertierte DNA-Sequenz, die für ein gewünschtes Protein oder Pepid codiert; und (iv) eine selektierbare DNA-Markersequenz für die Hefetransformation trägt; wobei die genannte bakterielle plasmidische DNA-Sequenz an einer Restriktionsschnittstelle in einer der beiden invertierten Wiederholungssequenzen des 2u-Plasmids vorhanden ist und die zusätzliche FLP-Rekombinationsstelle dort erzeugt wird, die genannte zusätzliche FLP-Rekombinationsstelle in direkter Orientierung in Relation zu der endogenen FLP-Rekombinationsstelle der genannten einen Wiederholungssequenz angeordnet ist und die bakterielle plasmidische DNA-Sequenz zwischen die zusätzliche FLP-Rekombinationsstelle und die endogene FLP-Rekombinationsstelle der genannten einen Wiederholungssequenz eingeschoben ist.
Der bevorzugte Disintegrations-Vektor besteht demzufolge aus einem vollständigen 2u-Plasmid, in welches eine oder mehrere bakterielle plasmidische DNA-Sequenzen sowie eine zusätzliche Kopie einer 74 Basenpaare langen FLP-Rekombinationsstelle, die aus dem 2u-Plasmid stammt, insertiert sind. Zusätzlich ist das "interessierende Gen", co-linear mit einem selektierbaren Marker für die Hefetransformation, beispielsweise CUP-1, zwischen ori und dem STB-Gen im 2u- Plasmid insertiert. Die bakteriellen plasmidischen DNA-Sequenzen und DNA-Wiederholungssequenzen der Hefe werden, beispielsweise an einer XbaI-Schnittstelle, in eine Kopie der beiden invertierten Wiederholungen des gesamten 2u- Plasmids insertiert. Die korrekte Orientierung der DNA-Wiederholungssequenz ist für die Funktion des Plasmids wesentlich; das Plasmid wird so konstruiert, daß die bakterielle plasmidische Sequenz, die für die Propagation der DNA in beispielsweise E. coli notwendig ist, zwischen zwei Kopien der FLP-Rekombinationsstelle des 2u-Plasmids, die selbst in direkter Orientierung zueinander liegen, eingeschoben ist. Die Konfiguration der DNA-Sequenzen ist in Fig. 3, die weiter unten genauer beschrieben wird, dargestellt. Diese Konstruktion beschränkt die bakteriellen plasmidischen DNA- Sequenzen auf eine DNA-Region, die, wenn das Plasmid in Hefe transformiert wird, infolge eines ortsspezifischen Rekombinationsereignisses zwischen den beiden direkt orientierten DNA-Wiederholungssequenzen aus dem Plasmid ausgeschnitten wird. Diese ortsspezifische Rekombination wird durch das Produkt des FLP-Gens von 2u mediiert, dessen Produkt entweder durch das endogene 2u-Plasmid von Hefe zur Verfügung gestellt werden kann, wenn cir&spplus;-Zellen transformiert werden, oder aber vom Disintegrations-Vektor selbst, wenn cirº-Zellen transformiert werden. Da die erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden können, um die transformierte Hefe von ihren endogenen 2u-Plasmiden zu befreien, und auch aus dem Grund, weil die Rekombination in cirº-Zellen schneller ist, ist es bevorzugt, daß der erfindungsgemäße Vektor auf einem vollständigen 2u-Plasmid basiert. Wenn jedoch der erfindungsgemäße Vektor mit den endogenen 2u-Plasmiden koexistieren soll, dann ist es nicht erforderlich, daß Gene wie REP1, REP2, REP3 und FLP auf dem Vektor vorhanden sind, da die Produkte dieser Gene in trans zur Verfügung gestellt werden können; was einzig benötigt wird, ist ein Replikationsursprung.
Wie weiter unten genauer beschrieben wird, kann die insertierte DNA, die die bakteriellen Sequenzen trägt, an jedem Ende einen entsprechenden Teil der Wiederholungssequenz tragen, in welchem Falle die genannte DNA in eine endogene Wiederholungssequenz so insertiert wird, daß die endogene Rekombinationsstelle wirksam zerstört wird, jedoch zwei neue FLP-Rekombinationsstellen gebildet werden, von denen jede einen Teil der endogenen Rekombinationsstelle und einen ergänzenden Teil aus der insertierten DNA umfaßt. Alternativ kann eine vollständige FLP-Rekombinationsstelle in Richtung auf das eine Ende des Inserts enthalten sein, wobei dieses Insert dann in Nachbarschaft oder einem gewissen Abstand zu einer endogenen Wiederholungssequenz insertiert wird, derart, daß die bakterielle DNA zwischen der endogenen Wiederholungssequenz und der insertierten Wiederholungssequenz liegt. Wenn die insertierte DNA an einem Ort insertiert wird, der einen Abstand zu der endogenen Sequenz aufweist, wird die endogene DNA zwischen der endogenen Wiederholungssequenz und der insertierten Wiederholungssequenz später zusammen mit der bakteriellen DNA ausgeschnitten werden. Wenn diese DNA benötigt wird, muß deshalb (vorzugsweise auf der insertierten DNA) eine weitere Kopie von ihr auf der Seite der insertierten Wiederholungssequenz bereitgestellt werden, die von der endogenen Wiederholungssequenz abgewandt liegt.
Die Stelle innerhalb des integralen 2u-Plasmids, an der das "interessierende Gen" insertiert wird, wird im Hinblick darauf ausgewählt, daß der Einfluß der Insertion sowohl auf die Kopienzahl des Plasmids als auch auf die vererbbare Stabilität möglichst gering gehalten wird. Es ist also vorteilhaft, das "interessierende Gen" an einer Stelle zu insertieren, die die Integrität der REP1-, REP2-, REP3- und FLP-Gene nicht unterbricht, insbesondere dann, wenn das Plasmid für die Verwendung bei der Transformation eines cirº-Wirtsstamms von Hefe vorgesehen ist. Der Bereich zwischen ori und dem STB-Gen entspricht diesen Anforderungen.
Eine vorteilhafte Eigenschaft des Disintegrations-Vektors ist, daß er, wenn er in cir&spplus; Hefestämme eingeführt wird, das endogene 2u-Plasmid wiederherstellen kann, und zwar während des Ausschneidens der bakteriellen Plasmidsequenzen oder im Anschluß daran, da er ein integrales 2u-Plasmid enthält. Über eine vergleichbare Situation wurde kürzlich bezüglich ganzer 2u-Vektoren berichtet, die in cir&spplus;-Wirtsstämme von Hefe transformiert worden waren (Harford & Peters, 1987). Der Disintegrations-Vektor kann also auch dazu verwendet werden, um das endogene 2u-Plasmid aus Hefestämmen wiederherzustellen.
In den beigefügten Zeichnungen
- zeigt Fig. 1 das Plasmid pBA112 (Andrews, et al., 1985). Die dünne Linie stellt DNA-Sequenzen dar, die aus dem bakteriellen Plasmid pUC9 stammen; der offene Balken stellt das 74 Basenpaare lange DNA-Fragment dar, das die FLP-Rekombinationsstelle enthält; die Dreiecke geben die Orientierung der drei internen DNA-Wiederholungssequenzen an, die sich innerhalb jeder FLP-Rekombinationsstelle befinden (Andrews, et al., 1985);
- zeigt Fig. 2 das Plasmid pSAC112. Das Plasmid pSAC112 ist mit pBA112 identisch, mit der Ausnahme, daß die BamHI-, PstI- und HindIII-Schnittstellen entfernt worden sind;
- zeigt Fig. 3 das Plasmid pSAC3. Die dicke Linie stellt die DNA-Sequenzen aus dem bakteriellen Plasmid pUC9 dar; die offenen Balken stellen das 74 Basenpaare lange DNA-Fragment dar, welches die FLP-Rekombinationsstelle enthält; die dünne Linie stellt die DNA-Sequenzen des 2u-Plasmids dar; die Dreiecke geben die Orientierung der drei DNA- Wiederholungssequenzen an, die sich innerhalb jeder FLP-Rekombinationsstelle befinden;
- zeigt Fig. 4 das Plasmid pSAC3U1. Die Bezeichnungen sind wie in der Fig. 3;
- ist Fig. 5 eine Plasmidkarte von pSAC3U2. Die Bezeichnungen sind wie in Fig. 3;
- ist Fig. 6 eine Plasmidkarte von pSAC300. Die Bezeichnungen sind wie in Fig. 3;
- ist Fig. 7 eine Plasmidkarte von pSAC310. Die Bezeichnungen sind wie in Fig. 3;
- ist Fig. 8 eine Plasmidkarte von pSAC3C1. Die Bezeichnungen sind wie in Fig. 3;
- basiert Fig. 9 auf einer Fotografie, die das Wachstum von haploiden Hefezellen zeigt, und zeigt sie die Vererbung des URA3- und des bakteriellen bla-Gens; und
- ist Fig. 10 eine Autoradiographie von vollständiger Hefe-DNA, die mit ³²P-markierter pSAC3-DNA als Sonde zus ammengegeben wurde.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

BEISPIEL I

Konstruktion von Plasmiden

Das Plasmid pSAC112 (Fig. 2) wurde durch gleichzeitig erfolgendes Verdauen des Plasmids pBA112 (Fig. 1, Andrews, et al., 1985) mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII konstruiert. Lineare Plasmid-DNA wurde 10 Minuten lang bei 37ºC mit DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart von 0,3 mM dNTP's (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) versetzt. DNA wurde mit Phenol:Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und über Nacht bei 15ºC in Gegenwart von T4 DNA-Ligase inkubiert. Ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm MC1061 (Casadaban und Cohen, 1980) transformiert; das Plasmid pSAC112 wurde aus den gebildeten Transformanten nach Identifizierung und Charakterisierung mittels des Verfahrens von Birnboim und Doly (1980) isoliert.
Das Plasmid pSAC3 (Fig. 3) wurde gemäß folgendem Verfahren konstruiert. DNA aus dem 2u-Hefeplasmid wurde aus dem Stamm DRI9 wie von Guerineau et al., (1974) beschrieben isoliert. Gereinigte DNA des 2u-Plasmids wurde mit der Restriktionsendonuklease XbaI wie von Maniatis et al., (1982) beschrieben verdaut und mit durch XbaI gespaltenem pSAC112 ligiert. Ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm AG1 (erhalten von NBL Enzymes Ltd., Cramlington, England) transformiert. Die gebildeten ampicillinresistenten Transformanten wurde nach Kolonie-Hybridisierung (Grunstein und Hogness, 1975) an ein ³²P-markiertes, 2,2 Kilobasenpaare langes EcoRI-Fragment aus dem Plasmid pYF92 (Storms, R.K. et al., 1979) auf Homologie zu 2u-plasmidischer DNA durchgetestet. Kolonien, die Homologie zu der für 2u spezifischen DNA-Sonde zeigten, wurden isoliert, und ihre Plasmid-DNA wurde mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen-Kartierungsverfahren charakterisiert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pSAC3 erhalten.
Die Plasmide pSAC3U1 (Fig. 4) und pSAC3U2 (Fig. 5) wurden durch Spalten des Plasmids pSAC3 mit der Restriktionsendonuklease PstI konstruiert. Lineare DNA wurde durch 10minütiges Behandeln mit T4 DNA-Polymerase in Gegenwart von 0,3 mM dNTP's (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) bei 37ºC glattendig gemacht. Die DNA wurde mit Phenol:Chloroform extrahiert und vor der Ligierung mit Ethanol ausgefällt. Das Plasmid pJDB110 (Beggs, 1981) wurde mit der Restriktionsendonuklease HindIII verdaut, und die DNA-Fragmente wurden auf einem 1%-igen Gel einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Ein 1,1 Kilobasenpaare langes DNA-Fragment, das das URA3-Gen von Hefe beherbergt, wurde aus dem Gel isoliert (Maniatis et al., 1982) und mit DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart von 0,3 mM dNTP's (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) behandelt. Das 1,1 Kilobasenpaare lange HindIII- Fragment wurde mit Phenol:Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in glattendiger Form mit linearer, wie oben beschrieben hergestellter pSAC3-DNA ligiert. Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm AG1 transformiert. Die gebildeten ampicillinresistenten Transformanten wurden nach Koloniehybridisierung (Grunstein und Hogness, 1975) an ein ³²P-markiertes 1,1 Kilobasenpaare langes HindIII-Fragment, das aus dem Plasmid pJDB110 gereinigt worden war, auf Homologie mit dem URA3-Gen durchgetestet. Die Plasmide pSAC3U1 (Fig. 4) und pSAC3U2 (Fig. 5) wurden aus denjenigen Kolonien isoliert, die Homologie zu der URA3-Gensonde zeigten. Das 1.1 Kilobasenpaare lange HindIII DNA-Fragmemt, welches das URA3-Gen trägt, wurde in glattendiger Form auch in die einzigen EagI- und SnaBI-Schnittstellen von pSAC3 ligiert, wobei die mit pSAC300 (Fig. 6) bzw. pSAC310 (Fig. 7) bezeichneten Plasmide entstanden.
Das Plasmid pSAC3C1 (Fig. 8) wurde durch glattendiges Ligieren eines 694 Basenpaare langen XbaI-KpnI-DNA-Fragmentes, das das CUP1-Gen aus dem Plasmid pET13 : 1 (Henderson et al., 1985) trägt, in die einzige PstI-Schnittstelle von pSAC3 erzeugt.

Transformation von Hefe mit den Plasmiden pSAC3U1 und pSAC3U2

Die Disintegrations-Vektoren pSAC3U1 (Fig. 4) und pSAC3U2 (Fig. 5) wurden so konstruiert, daß sie jeweils das selektierbare Hefegen URA3 an der einzigen PstI-Schnittstelle der 2u-B-Form insertiert enthalten. Darüber hinaus beherbergt jedes Plasmid aus dem bakteriellen Plasmid pUC9 stammende DNA-Sequenzen, die von zwei Kopien der FLP-Rekombinationsstelle, in direkter Orientierung angeordnet, flankiert sind. Die Position der pUC9-DNA ist derart, daß die FLP-mediierte Rekombination zwischen diesen beiden in direkter Orientierung befindlichen FLP-Rekombinationsstellen nach Transformation der Hefe das Ausschneiden der bakteriellen Plasmid-DNA bewirkte. Cir&spplus;- und cirº-Derivate des haploiden Hefestamms S150-2B (Cashmore et al., 1986) wurden mit den Plasmiden pSAC3U1 und pSAC3U2 nach dem Verfahren von Ito (1983) zu Uracil-Prototrophie transformiert. Die URA&spplus;-Transformanten wurden mit Hilfe des Verfahrens von Chevalier und Aigle (1979) auf die gleichzeitige Vererbung des bakteriellen bla-Gens durchgetestet, das für das β- Lactam-spezifische Enzym β-Lactamase in Hefe codiert. Die in Fig. 9 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß beide Plasmide das bla-Gen in allen Transformanten des cirº-Stammes vom URA&spplus;-Gen abspalten, was die Deletion der bakteriellen DNA-Sequenzen aus den Plasmiden nach der Hefe-Transformation deutlich macht. Die Mehrzahl der URA&spplus;-Transformanten des cir&spplus;-Stamms enthielten jedoch, wie man beobachten konnte, gleichzeitig das bla-Gen (15 von 20 und 18 von 20 in pSAC3U1 bzw. pSAC3U2). Diese Daten legen nahe, daß die Wirksamkeit der Plasmid-Disintegration, d. h., das FLP-mediierte Ausschneiden der bakteriellen Plasmid-DNA-Sequenzen, nach Transformation eines cirº-Stammes größer als nach einer solchen eines cir&spplus;-Stammes ist.

Molekulare Analyse von Transformanten

Um festzustellen, ob die URA&spplus;-Transformanten, die das bla- Gen abgespalten hatten (d. h. β-Lactamase-negative Klone, bla&supmin;) tatsächlich das bla-Gen und benachbarte bakterielle Plasmid-DNA-Sequenzen verloren hatten, wurde die Hefe-DNA analysiert. Zwei URA&spplus; bla&supmin; Transformanten der cir&spplus;- und cirº-Stämme, die mit pSAC3U1 und pSAC3U2 transformiert worden waren, wurden auf selektivem Minimalmedium gezüchtet, dem Uracil fehlte, und die gesamte DNA wurde gemäß folgendem Verfahren extrahiert. Aktiv wachsende Zellen wurden geerntet und in 5 ml 1M Sorbitol, 0,025M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0, 8 mg/ml Dithiothreitol bei 28ºC 15 Minuten lang resuspendiert. Die Zellen wurden geerntet und in 5 ml 1,2M Sorbitol, 0,1M Natriumcitrat, 0,01M EDTA pH 5,8, 0,025 ul/ml Zymolyase (Kirin Brewery Co Ltd.) bei 280 C resuspendiert, ,bis man Protoplasten erhielt. Die Protoplasten wurden dreimal in 1,2M Sorbitol gewaschen, bevor sie in 1 ml 3%-igem Sarkosyl, 0,5M Tris/HCl pH 7,5, 0,2 M EDTA, 100 ul/ml Proteinase K bei 55ºC 60 Minuten lang resuspendiert wurden. Die DNA-Präparationen wurden vor der Dialyse gegen 10 mM Tris/HCl 1 mM EDTA pH 8 mit Chloroform: Isopropanol, Phenol, Chloroform und Ether extrahiert. Die gesamte Hefe-DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI, XbaI und PstI verdaut, und die DNA-Fragmente wurden mit Hilfe von Agarose-Elektrophorese voneinander getrennt. Nach einem Southern-Transfer (Maniatis et al., 1982) wurde die gesamte Hefe-DNA mit ³²P-markierter pSAC3-DNA hybridisiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt, die eine Autoradiographie der Gesamthefe-DNA ist, welche mit ³²P-markierter pSAC3-DNA als Sonde versetzt worden war. Die DNA wurde aus S150-2B cir&spplus;-Stämmen isoliert, die mit den Plasmiden pSAC3U1 und pSAC3U2 transformiert worden waren. Zwei unabhängige Transformanten einer jeden Stamm/Plasmid-Kombination, die mit A und B bezeichnet sind, wurden analysiert. Die DNA wurde mit Restriktionsendonuklease wie folgt verdaut: XbaI, Spuren 1 bis 4 und 21 bis 24; PstI, Spuren 5 bis 12; EcoRI, Spuren 13 bis 20.
Spur Plasmid Cir&spplus;/cirº Isolat
Auf Basis der bekannten Restriktionsschnittstellen, die im endogenen 2u-Plasmid von Hefe (Hartley und Donelson, 1980) und den rekombinanten Plasmiden pSAC3U1 und pSAC3U2 vorhanden sind, kann man das Hybridisierungsmuster mit dem Plasmid pSAC3 vorhersagen. Das vorhergesagte Hybridisierungsmuster ist in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 Erwartetes Hybridisierungsmuster von mit pSAC3U1 und pSAC3U2 transformierten S150-2B cir&spplus;- und cirº-Derivaten mit pSAC3. Plasmid-DNA Restriktionsendonukleasen-Fragmente (Kilobasenpaare) 2u (endogen) pSAC3U1 und pSAC3U2 (intakt) pSAC3U1 und pSAC3U2 (disintegriert)
Die Zahlen in Klammern werden erscheinen, wenn die disintegrierten Plasmide eine FLP-mediierte Interkonversion eingegangen sind.
Wenn man das Ergebnis der Hybridisierung (Fig. 10) mit den erwarteten (Tabelle 1) vergleicht, kann man sehen, daß das rekombinante Plasmid in jeder Transformante eine Deletion erfahren hat, die mit dem Ausschnitt der bakteriellen Plasmid-DNA-Sequenzen, die innerhalb der direkt orientierten FLP-Rekombinationsstellen enthalten waren, übereinstimmt. Darüber hinaus ist im Falle der mit pSAC3U2/B bezeichneten Transformanten das endogene 2u-Plasmid des Stamms S150-2B nicht mehr vorhanden. Dies bedeutet, daß die Transformation eines cir&spplus;-Stammes mit dem Plasmid pSAC3U2 zur Wiederherstellung des endogenen 2u-Plasmids führt.
Ein zusätzlicher Hinweis darauf, daß die Plasmide pSAC3U1 und pSAC3U2 bei Transformation von Hefe dem Ausschneiden der bakteriellen Plasmid-DNA unterworfen sind, wurde durch Hybridisieren der vorgenannten DNA-Präparationen mit ³²P- markierter pUC9-DNA (Vieira und Messing, 1982) erhalten. URA&spplus; bla&supmin;-Transformanten hybridisierten nicht mit dieser DNA-Sonde.

Die Plasmide pSAC300, pSAC310 und pSAC3C1 disintegrieren als Folge von Hefe-Transformation

Die URA&spplus;-Plasmide pSAC300 und pSAC310 wurden verwendet, um die cir&spplus;- und cirº-Derivate von S150-2B zu transformieren, und die URA- und bla-Phänotypen der gebildeten Transformanten wurden bestimmt. In allen Fällen wurde der disintegrierte Phänotyp beobachtet; pSAC300 und pSAC310 sind also in der Lage, die bakterielle Vektor-DNA nach Hefe-Transformation auszuschneiden. Diesbezüglich wurde beobachtet, daß das Plasmid pSAC300 einen signifikant höheren Anteil an bla&supmin;-Transformanten des cir&spplus;-Derivats von S150-2B verursachte. Die Erklärung hierfür ist nicht bekannt. Es ist jedoch möglich, daß die Zerstörung der EagI-Schnittstelle durch die Insertion des URA3-Gens in pSAC300 die Expression des benachbarten FLP-Gens beeinflußte, was zu einer Überexpression der FLP-Rekombinase führte.
Das Plasmid pSAC3C1 wurde für die Verwendung bei der Transformation von gegenüber Kupfer empfindlicher Industriehefe und insbesondere von Brauhefe konstruiert. pSAC3C1 wurde deshalb in einen den Eigentümern gehörenden Stamm von Bass Lager-Hefe mit der Bezeichnung BB11.0, wie von Hinchliffe und Daubney (1986) beschrieben, transformiert. Kupferresistente Transformanten wurden dann mit Hilfe des β-Lactamase-Plattentests auf das Vorhandensein des bla-Phänotyps untersucht. Ungefähr 18% der untersuchten Transformanten waren bla&supmin; kupferresistent, was ein Anzeichen für die in vivo erfolgende Disintegration des Plasmids pSAC3C1 im Brauhefe-Wirt ist.
Die in vivo erfolgende Disintegration der Plasmide pSAC300, pSAC310 und pSAC3C1 wurde nachfolgend im Anschluß an eine vollständige molekulare Charakterisierung der passenden Wirtsstämme, die den disintegrierten Phänotyp besitzen, gesichert. So konnte nämlich, wenn Gesamthefen-DNA mit ³²P- pUC9-DNA wie zuvor beschrieben hybridisiert wurde, in den bla&supmin;-Derivaten keine Homologie festgestellt werden.

Plasmidstabilität der "disintegrierten" Transformanten

Die vererbbare Stabilität des URA&spplus;-Phänotyps in den cir&spplus;- und cirº-Stämmen von die des integrierten Derivate von pSAC3U1 und pSAC3U2, pSAC300 und pSAC310 beherbergendem S150-2B wurde durch unselektives Züchten der Hefe in YPD mit 2% (Gew./Vol.) Glucose, Ausplattieren auf dem gleichen Medium und Replikaplattieren auf uracilfreiem Minimalmedium bestimmt. Der Prozentsatz an Plasmidverlust pro Generation wurde berechnet und ist in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2 Prozentsatz an Plasmidverlust pro Generation Plasmidderivat Prozentsatz Plasmidverlust pro Generation (disintegrierter Vektor) pSAC3U1 pSAC3U2 pSAC300 pSAC310
Aus dem in Tabelle 2 dargestellten Ergebnis kann man ersehen, daß alle "disintegrierten" Derivate sowohl in den cir&spplus;- als auch den cirº-Derivaten von S150-2B instabil sind. Der für pSAC3U1, pSAC3U2 und insbesondere für pSAC310 beobachtete Wert an Instabilität ist jedoch mindestens eine Größenordnung geringer als derjenige, der für andere rekombinante URA&spplus; Vektoren auf 2u-Basis in S150-2B beobachtet wurde (Cashmore et al., 1986).
Interessanterweise ist zu vermerken, daß die Insertion des URA3-Gens in die einzige Eagl-Schnittstelle des 2u-Teils von pSAC3 zu einem disintegrierten Derivat führt, das deutlich weniger stabil als die von pSAC3U1, pSAC3U2 und pSAC310 abstammenden Disintegranten sind. Es ist deshalb offensichtlich, daß der Insertionsort des selektierbaren Markers einen grundlegenden Einfluß auf die Stabilität des gebildeten disintegrierten Derivats haben kann. Diesbezüglich ist klar, daß die einzigen SnaBa- und PstI-Schnittstellen von 2 um geeignete Orte für die Einführung rekombinanter Gene darstellen, da die Plasmid-Stabilität durch solche Insertionen nicht nachteilig beeinflußt wird.

Plasmidstabilität von "disintegrierten" Transformanten von Brauhefe

Disintegrierte Derivate von pSAC3C1-Transformanten von BB11.0 wurden auch auf Stabilität des kupferresistenten Phänotyps hin analysiert. Die Plasmidstabilität-Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt und-resultierten in einem auf 0,014% geschätzten Plasmidverlust pro Generation, und zwar unter nicht-selektiven Wachstumsbedingungen. Dieses Ergebnis zeigt klar, daß die disintegrierten Derivate von pSAC3C1 im Brauhefe-Stamm BB11.0 extrem stabil sind und einen Stabilitätsgrad besitzen, der bisher für einen rekombinanten Hefevektor auf 2u-Basis nicht beobachtet werden konnte.
Disintegrations-Vektoren können verwendet werden, um "interessierende Gene" in Hefe stabil zu erhalten
Das Plasmid pSAC3 trägt eine einzige PstI-Schnittstelle und eine einzige SnaBI-Schnittstelle, in die jeweils DNA-Sequenzen wie oben beschrieben insertiert werden können, ohne daß die Phänotyp-Stabilität des gebildeten disintegrierten Derivats des Plasmids in Hefe nachteilig beeinflußt würde. Diese Schnittstellen können als Orte verwendet werden, in die man "interessierende Gene", beispielsweise das DEX-1- Gen von S. diastaticus und das menschliche Serumalbumin- Gen, exprimiert von einem Hefepromotor aus, einführen kann. Unter Verwendung bekannter Verfahren ist es möglich, solche Gene zusammen mit einem geeigneten selektierbaren Marker für Hefetransformation in diese spezifischen Genorte zu insertieren. Alternativ können die Plasmide pSAC3U1, pSAC3U2, pSAC310 und pSAC3C1 als Empfänger für die Insertion eines geeigneten "interessierenden Gens" verwendet werden. Diesbezüglich enthalten pSAC3U1, pSAC3U2 und pSAC310 eine einzelne SmaI-Schnittstelle, die in der 3'- nichttranslatierten Region des URA3-Gens angeordnet ist (Rose et al., 1984) . Diese SmaI-Schnittstelle kann als Genort für die Insertion eines geeigneten "interessierenden Gens" verwendet werden.
Daß es wünschenswert ist, die SnaBI-Schnittstelle für die Insertion eines interessierenden Gens, entweder direkt oder indirekt (beispielsweise wenn das URA3-Gen insertiert wird und dann ein interessierendes Gen in dessen SmaI-Schnittstelle insertiert wird) zu verwenden, ist unabhängig von der Disintegration des Vektors, das heißt vom Verlust der bakteriellen DNA-Sequenzen, und bildet eine andere Ausgestaltung der Erfindung. Allgemein ausgedrückt würde man die Fortsetzung der Transkription von dem/den insertierten Gen(en) in die endogenen 2u-Regionen hinein vermeiden wollen, insbesondere in die sogenannte STB-Region, die sich auf der Seite der SnaBI-Schnittstelle befindet die abgewandt vom Hefe-Replikationsursprung (ori) liegt. Deshalb umfaßt die insertierte Sequenz vorzugsweise (a) ein interessierendes Gen, (b) einen Promotor hierfür auf derjenigen Seite von ihr, die zu ori benachbart liegt, und (c) einen 3 , -Transkriptionsterminator stromabwärts vom interessierenden Gen und zwischen diesem Gen und der STB-Region.

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Claims

1. 2u-Plasmid-Vektor, enthaltend

(a) eine bakterielle DNA-Sequenz,

(b) aus dem 2u-Plasmid der Hefe stammende DNA mit drei FLP- Rekombinationsorten, einem Replikationsursprung (ori) und einem STB-Gen sowie

(c) eine DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, wobei

ein Paar der genannten FLP-Rekombinationsorte in direkter Orientierung vorliegt und die beiden anderen Paare in indirekter Orientierung vorliegen,

die genannte bakterielle Sequenz zwischen den genannten FLP- Rekombinationsorten angeordnet ist, die in direkter Orientierung vorliegen, so daß dann, wenn Hefe mit dem Vektor transformiert wird, diese bakterielle Sequenz eliminiert wird,

die DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, nicht zwischen den Orten angeordnet ist, die in direkter Orientierung vorliegen, und

die DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, weiterhin zwischen ori und dem STB-Gen in der aus dem 2u-Plasmid der Hefe stammenden DNA so angeordnet ist, daß die Transkription dieser codierenden DNA-Sequenz sich nicht in ori oder STB erstreckt.

2. 2u-Plasmid-Vektor nach Anspruch 1, der außerdem eine selektionierbare Marker-DNA-Sequenz aufweist.

3. 2u-Plasmid-Vektor nach Anspruch 1 oder 2, worin die bakterielle Sequenz eine Sequenz umfaßt, die die Replikation des Vektors in einem Bakterium ermöglicht.

4. 2u-Plasmid-Vektor nach Anspruch 3, worin alle bakteriellen Plasmid-DNA-Sequenzen zwischen den in direkter Orientierung vorliegenden Orten angeordnet sind.

5. 2u-Plasmid-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die für ein interessierendes Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz zu Hefe heterolog ist.

6. 2u-Plasmid-Vektor nach Anspruch 5, worin die für ein interessierendes Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz ist, die für HSA codiert, das an seinem 5'- Terminus mit einem Genpromotor, der in Hefe über eine in Hefe wirksame Sekretions-Leader-Sequenz wirkt, und an seinem 3'- Terminus mit einem in Hefe wirksamen Transkriptions-Terminations-Signal fusioniert ist.

7. 2u-Plasmid-Vektor nach Anspruch 6, worin die für ein interessierendes Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz das MET-HSA-Gen ist, das an seinem 5'-Terminus mit dem GAL/CYCl- oder GAL/PGK-Hybridpromotor und an seinem 3'- Terminus mit einem in Hefe wirksamen Transkriptions-Terminations-Signal fusioniert ist.

8. 2u-Plasmid-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die für ein interessierendes Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz das Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus DEX-1-Gen oder eine DNA-Sequenz ist, die für die β-Glucanase von Bacillus subtilis codiert und an ihrem 5'- Terminus mit einem Genpromotor, der in Hefe über eine in Hefe wirksame Sekretions-Leader-Sequenz wirkt, und an ihrem 3'- Terminus mit einem in Hefe wirksamen Transkriptions- Terminations-Signal fusioniert ist.

9. 2u-Plasmid-Vektor nach Anspruch 1, der im wesentlichen die Konfiguration des in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen gezeigten pSAC3 aufweist.

10. 2u-Plasmid-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der ein interessierendes Gen trägt, das direkt oder indirekt an der SnaBI-Schnittstelle insertiert ist.

11. Verfahren zum Herstellen eines 2u-Plasmid-Vektors nach einem der voranstehenden Ansprüche, umfassend:

das Insertieren

(i) einer DNA-Sequenz zum Selektionieren von Hefe-Transformanten,

(ii) einer DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert und

(iii) eines Inserts, das

(a) bakterielle plasmidische DNA, um die Vermehrung des Vektors in Bakterien zu ermöglichen, und

(b) die Elemente eines FLP-Rekombinationsortes enthält,

in ein voll ständiges 2u-Plasmid, das einen Replikationsursprung (ori) und ein STB-Gen enthält, so daß ein zusätzlicher FLP-Rekombinationsort im Vektor geschaffen wird und die bakterielle DNA zwischen zwei FLP-Rekombinationsorten in wechselseitig direkter Orientierung eingepaßt wird, wobei die DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, zwischen ori und das STB-Gen der aus dem 2u-Plasmid stammenden DNA insertiert wird, und zwar derart, daß sich die Transkription der DNA-Sequenz nicht durch ori oder STB fortsetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Insert an der einzigen XbaI-Schnittstelle eines endogenen FLP-Rekombinationsortes insertiert wird, wobei ein Ende des Inserts einen Teil einer 2u-Repetition und das andere Ende des Inserts den Rest der 2u-Repetition trägt.

13. Hefezelle, enthaltend ein 2u-Plasmid mit einem Replikationsursprung (ori) und einem STB-Gen und ferner enthaltend eine nicht-bakterielle DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, welches heterolog zu Hefe ist, wobei das Plasmid keine bakterielle DNA enthält, die in diese Zelle transformiert worden ist, und wobei die für ein interessierendes Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz zwischen ori und dem STB-Gen so angeordnet ist, daß sich die Transkription der DNA-Sequenz nicht durch ori oder STB fortsetzt.

14. Hefezelle, die von einer Zelle nach Anspruch 13 abstammt, und zwar durch Reproduktion dieser Zelle und durch Reproduktion ihrer Nachkommen, enthaltend ein Plasmid, das eine für ein interessierendes, zu Hefe heterologes Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz umfaßt, wobei das Plasmid keine bakterielle DNA enthält.

15. Brauhefe oder Laborhefe, die mit einem in einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 beanspruchten 2u-Plasmid-Vektor transformiert ist.

16. Verfahren zum Herstellen eines interessierenden Proteins oder Peptids, umfassend das Fermentieren einer Hefe gemäß Anspruch 13, 14 oder 15 und das Abtrennen des interessierenden Proteins oder Gens.

17. 2u-Hefeplasmid-Vektor, der ein interessierendes Gen direkt oder indirekt an der SnaB1-Schnittstelle insertiert trägt.

18. 2u-Plasmid-Vektor, enthaltend eine bakterielle DNA- Sequenz, drei FLP-Rekombinationsorte, wobei sich ein Paar dieser Orte in direkter Orientierung befindet und die anderen beiden Paare in indirekter Orientierung befinden, und eine für ein interessierendes Protein oder Peptid codierende DNA- Sequenz, wobei die bakterielle Sequenz so zwischen den genannten Orten angeordnet ist, die sich in direkter Orientierung befinden, daß dann, wenn Hefe mit diesem Vektor transformiert wird, die bakterielle Sequenz eliminiert wird, und wobei die für ein interessierendes Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz nicht zwischen den genannten Orten angeordnet ist, die sich in direkter Orientierung befinden, wobei der Vektor ein interessierendes Gen direkt oder indirekt an der SnaBI-Schnittstelle insertiert trägt.