HU213344B - Process for producing of stable dezintegrating plasmid-vectors - Google Patents

Description

A találmány élesztő 2 pm alapú, az élesztőben stabil széteső vektoroknak a vektorok élesztőben való fenntartásához és replikációjához szükséges 2 pm plazmid elemeket tartalmazó plazmid további DNS-szekvenciák beiktatása útján történő előállítására vonatkozik.

Külső DNS felvételét élesztő sejtekbe, és ennek a DNSnek az ezt követő öröklődését és kifejezését olyan eljárással végezzük, amelyet transzformációnak neveznek. A transzformációt először a hetvenes évek végén írták le, olyan módszereket a alkalmazva, amelyek DNS hozzáadásán alapulnak az élesztő sejtfal enzimes eltávolításával készített protoplasztokhoz (Hinnen és munkatársai, 1978; Beggs, 1978). Nemrégiben mutatták be az ép élesztősejtek transzformálását (Hisao és munkatársai, 1983).

Az élesztőt megfelelő plazmidokkal lehet transzformálni; az erre a célra alkalmazott plazmidokat általában ingázó („shuttle”) plazmidokként alkotják meg, amelyek képesek sokszorozódni mind Escherichia coli-ban, mind élesztőben (Hinnen és munkatársai, 1978; Beggs, 1978; Struhl és munkatársai, 1979). Az E.coli plazmid DNS szekvenciák, pl. pBR322 szekvenciák (Bolivár, 1978) bevonása megkönnyíti a vektor DNS kvantitatív előállítását E.coliban, és ilyen módon megkönnyíti az élesztők hatékony transzformálását.

Az élesztő transzformálásához általában alkalmazott plazmid-vektorok két típusba oszthatók: (i) replikálódó vektorok, vagyis azok, amelyek képesek közvetíteni saját fenntartásukat az élesztő kromoszomális DNS-étől függetlenül, a DNS replikáció egy funkcionális origója jelenlétének következtében, és (ii) integrálódó vektorok, amelyek a kromoszomális DNS-sel való rekombináción alapulnak, hogy megkönnyítsék a replikációt és ilyen módon a rekombináns DNS folyamatos fenntartását a gazdasejtben. A replikálódó vektorokat tovább lehet osztani az alábbiakra: (a) 2 pm alapú plazmid-vektorok, amelyekben a DNS replikáció origója az élesztő endogén 2 pm plazmidjából származik; (b) autonóm módon replikálódó vektorok (ARS), amelyekben a „látszólagos” replikációs origó az élesztő kromoszomális DNS-éből származik, és (c) centromérás plazmidok (CEN), amelyek a fenti DNS replikációs origók valamelyikén kívül hordoznak egy olyan élesztő kromoszomális DNS szekvenciát, amelyről ismeretes, hogy egy centromérát foglal magában.

Abból a célból, hogy egy élesztőt hatékonyan transzformáljunk a fentebb említett vektorok bármelyikével, szükséges szelekciót végezni abból a célból, hogy azonosítsuk azokat a transzformánsokat, amelyek hordozzák a rekombináns DNS-t. Ezt úgy érjük el, hogy a vektor DNS-en belül beépítünk egy megfigyelhető fenotípussal bíró gént. Laboratóriumi élesztők transzformálására használt vektorok esetében általában prototróf géneket alkalmazunk, pl. LEU2-1, URA3-at vagy TRP1 et (Hinnen és munkatársai, 1979), hogy kiegészítsük az auxotróf hiányokat a gazdaszervezetben. Abból a célból azonban, hogy sütőélesztőt vagy más ipari élesztőt transzformáljunk, amelyek gyakran poliploidok és nem mutatnak auxotróf igényeket, szükséges olyan szelekciós rendszert alkalmazni, amely domináns szelektálható génen alapul. Ezzel kapcsolatban írtak le replikálódó 2 pm-alapú plazmid-vektorokat, amelyek az alábbiakra való rezisztenciát közvetítő géneket hordoznak: (i) antibiotikumok, pl. G418 (Jiminez és munkatársai, 1980; Webster és munkatársai, 1983), higromicin B (Gritz és munkatársai, 1983), klóramfenikol (Cohen és munkatársai, 1980; Hadfield és munkatársai, 1986); és (ii) egyéb toxikus anyagok, pl. a szulfometuron-metil herbicid (Falco és munkatársai, 1985), kompaktin (Rine és munkatársai, 1983) és réz (Henderson és munkatársai, 1985).

A rekombináns gének öröklődési stabilitása élesztőben függ a transzformáció megkönnyítésére alkalmazott élesztő-vektor típusától. A korábban leírt vektor-rendszerek két típusa közül a legstabilabbak az integrálódó vektorok. Az integratív élesztő-transzformáció elveit és gyakorlatát leírták már az irodalomban (Botstein és Davis, 1982; Winston és munkatársai, 1983; Orr-Weaver és munkatársai, 1983; Rothstein, 1983). Az integratív transzformáció általában viszonylag kevéssé hatékony; zárt, kör alakú integrálódó plazmidokat írtak már le, amelyek mintegy 1-10 transzformánst termeltek 1 pg DNS-re számítva (Hinnen és munkatársai, 1979; Hicks és munkatársai, 1979). A lineáris DNS azonban, az élesztő kromoszomális DNS-sel homológ DNS szekvenciákban elhelyezkedő szabad végekkel, nagyobb hatékonysággal transzformálja az élesztőt (100-1000-szer), és a transzformáló DNS általában a hasítás helyével homológ szekvenciákban integrálódva található (Orr-Weaver és munkatársai, 1981). Ilyen módon a vektor DNS-t megfelelő restrikciós endonukleázzal hasítva lehetséges növelni a transzformáció hatékonyságát és megcélozni a kromoszomális integráció helyét. Az integratív transzformáció alkalmazható a sütőélesztő genetikai módosítására, feltéve, hogy a transzformáció hatékonysága elegendően nagy, és az integrációhoz célzott DNS szekvencia olyan területen belül van, amely nem pusztít el a gazdasejt metabolizmusához nélkülözhetetlen géneket. Integrálódó élesztő-vektort írtak le nemrégiben sütőélesztőhöz (Yocum, 1985).

Az integrálódó vektorokkal ellentétben, amelyek nagyfokú öröklődési stabilitást mutatnak szelekciós tényező távollétében is, a replikálódó vektorok haj lamosak arra, hogy kevésbé stabilak legyenek. Az öröklődő stabilitás függ az alkalmazott replikálódó vektor típusától. Az ARS plazmidok, amelyeknek nagy kópiaszáma van (mintegy 20-50 kópia sejtenként) (Hyman és munkatársai; 1982) hajlamosak arra, hogy a legkevésbé stabilak legyenek, és nagyobb gyakorisággal vesszenek el, mint 10% generációnként (Kikuchi, 1983). Az ARS plazmidok stabilitását azonban lehet növelni egy centromérához való rögzítéssel; a centromérás plazmidok 1-2 kópiával vannak jelen sejtenként (Clarké és Carbon, 1980) és csupán mintegy 1% gyakorisággal vesznek el generációnként (Walmsley és munkatársai, 1983). A kiméra 2 pm-alapú plazmidok különböző mértékű öröklődő stabilitást mutatnak, mind a gazdatörzstől, mind a plazmidban jelen lévő 2 pm DNS szekvenciáktól függően.

A 2 pm plazmidról ismeretes, hogy a sejten belül nukleáris helyzetű (Nelson és Fangman, 1979;

HU 213 344 Β

Livingston ésHahne, 1979; Seligy és munkatársai, 1980, Taketo és munkatársai, 1980; Sigurdson és munkatársai, 1981) de nem-mendeli módon öröklődik (Livingston, 1977). A 2 pm plazmiddal nem rendelkező sejtekről (cir°) kimutatták, hogy olyan haploid élesztő populációból keletkeznek, amely sejtenként átlagosan 50 kópia 2 pm plazmidot tartalmaz, ahol a keletkezési arány a sejtek 0,001%-a és 0,01%-a között van generációnként (Futcher és Cox, 1983). Az öröklődő instabilitásnak erre a nagyon alacsony szintjére lehetséges magyarázat az, hogy a plazmid nem nyújt nyilvánvaló előnyöket a sejt számára normális növekedési körülmények között (Broach, 1981; Futcher és Cox, 1983; Sigurdson és munkatársai, 1981), bár beszámoltak kisebb hatásokról a növekedési sebességre néhány, 2 pm plazmidot magában foglaló törzsnél (Walmsley és munkatársai, 1983). Különböző S. cerevisiae törzsek elemzése kimutatta, hogy ez a plazmid jelen van a legtöbb élesztőtörzsben (Clark-Walker és Miklós, 1974), beleértve a sütőélesztőt is (Tubb, 1980; Aigle és munkatársai, 1984; Hinchliffe és Daubney, 1986). Ilyen módon kitűnik, hogy ez a plazmid mindenütt jelen van, amely nagyfokú öröklődő stabilitást von magával a természetben.

A 2 pm plazmid genetikai és molekuláris elemzése a plazmid replikációjára és stabil fenntartására vonatkozó információk bőséges tárházát tárta fel (Volkert és Broach, 1987). A plazmid lényegében egy 6318 bázispáros, kör alakú DNS molekulából áll (Hartley és Donelson, 1980). Ez magában foglal egy egyedi, kétirányú DNS replikációs origót (Newlon és munkatársai, 1981), amely elengedhetetlen komponense az összes 2 pm alapú vektornak. A plazmid négy gént tartalmaz, ezek a REP1, REP2, STB és FLP, amelyek szükségesek a sejtenként! nagy plazmid kópiaszám stabil fenntartásához (Broach és Hicks, 1980; Jayaram és munkatársai, 1983). A REP1 és REP2 gének transz működő fehérjéket kódolnak, amelyekről úgy véljük, hogy a STB lókusszal kölcsönhatásban, azzal együtt működnek, hogy biztosítsák a plazmid stabil megosztását a sejtosztódásnál (Volkert és Broach, 1987). Ebből a szempontból a STB gén úgy viselkedik, mint egy cisz-működő lókusz, amely hat a plazmid stabil szegregációjára, és fenotípusosan analóg a kromoszomális centromérával (Jayaram és munkatársai, 1983; Kikuchi, 1983). A 2 pmplazmidnak egyik fontos vonása két megfordított DNS szekvencia ismétlődés (egyenként 559 bázispár hosszúságú) jelenléte, amelyek a kör alakú molekulát két egyedi területre bontják. A megfordított ismétlődő szekvenciák közötti intramolekuláris rekombináció az egyik egyedi tartománynak a másikhoz viszonyított megfordulására vezet, és in vivő két strukturális izomerből álló vegyes populáció termelését eredményezi, ahol a két izomert A-nak, illetve B-nek nevezzük (Beggs, 1978). A rekombinációt a két megfordított ismétlődés között egy olyan gén fehérje-terméke közvetíti, amelyet FLP génnek nevezünk, és az FLP fehérje képes nagy gyakoriságú rekombinációt közvetíteni a megfordított ismétlődési területen belül. Erről a hely-specifikus rekombinációról úgy hisszük, hogy olyan mechanizmust nyújt, amely biztosítja a plazmid kópiaszám sokszorozását (Futcher, 1986;

Volkert és Broach, 1986; Som és munkatársai, 1988; Murray és munkatársai, 1987).

Minden megfordított ismétlődő szekvencia három ismétlődő DNS szekvencia alegységet tartalmaz (amelyet háromszöggel jelzünk a 3. ábrában); két szomszédos alegység kölcsönösen azonos orientációban van és a harmadik ellentétes orientációban van és a többi alegységek egyikéhez egy 8 bázispáros kapcsoló vagy térkitöltő (spacer) terület révén kapcsolódik. Ez a spacer tartomány egy egyedi Xbal helyet tartalmaz; az FLP gén terméke felismeri és hasítja szélein. A szomszédos szekvenciák természetesen homológok a másik megfordított ismétlődő szekvencia megfelelő szekvenciáival és ezáltal pontos rekombinációt biztosítanak az említett hasítás után.

Andrews és munkatársai (1985) úgy találták, hogy egy 74 bázispáros szekvencia, amely magában foglalja a 8 bp-s spacer területet, a minimális követelmény az FLP helyspecifikus rekombinációhoz.

pm plazmid replikációs rendszerén alapuló élesztővektorokat alkottak meg heterológ DNS szekvenciák beiktatásával a 2 pm plazmid olyan területeibe, amelyek nem esszenciálisak replikációjuk szempontjából (Beggs, 1981). Ez a vektorok két alaptípusát eredményezi: (i) teljes 2 pm vektorok és (ii) 2 pm origó vektorok. Az előbbi esetében ezek a vektorok magukban foglalják a teljes 2 pm plazmidot, amelybe különböző heterológ szekvenciák, pl. E.coli plazmid DNS, lehetnek beiktatva. Ezek a plazmidok képesek fenntartani magukat nagy kópiaszámmal, nagy mértékű öröklődési stabilitással mind cir⁺ (2 pm-tartalmú) mind cir° (2 mm hiányos) gazdaszervezetben. A második esetben a origó vektorok általában egy minimális DNS szekvenciát tartalmaznak, amely magában foglalja a DNS replikáció 2 pm origóját és a 2 pm 599 bázispáros ismétlődésének egyedi kópiáját; az ilyen vektorok csak cir⁺ gazdasejtekben maradnak fenn, mivel ezeknek szükségük van a REP1 és REP2 gének által kódolt fehérjékre, melyeket az endogén plazmid; transz formában szolgáltat, ilyen módon biztosítva stabil fenntartásukat.

Amikor egy iparilag fontos polipeptid nagy hozammal történő termelésére alkalmas heterológ gén kifejezésére képes, genetikailag módosított élesztőt kívánunk létrehozni, általában kívánatos nagyszámú kópiájú élesztő-vektort választani. A 2 pm alapú vektorok nagyon sikeresnek bizonyultak kifejező plazmidként való felhasználáshoz, és ezért gyakran alkalmazzák ezeket vektorként (Kingsman és munkatársai, 1985).

Az EP-0201239 Al szám alatt közzétett európai szabadalmi bejelentés (Delta Biotechnology Ltd.) leírása olyan eljárást ismertet heterológ fehérjék termelésére sörélesztőben, amelyben egy ipari élesztötörzset genetikailag módosítanak, hogy képes legyen egy heterológ gén kifejezésére oly módon, hogy a heterológ gén kifejezése nem történik meg a primer sörfermentáció során, hanem itt csak élesztő-biomassza gyülemlik fel, és a heterológ fehérje szintézise csak azután kezdődik meg, amikor már az élesztőt eltávolították a képződött sörből. Ezt úgy érik el, hogy a sörélesztőt olyan 2 pm alapú plazmiddal transzformálják, amely magában foglalja a

HU 213 344 Β

CUP-1 szelektálható markert és magában foglal egy módosított humán szérum fehérjét, az N-metionil-albumint (Met-HSA) kódoló gént is, amelynek kifejeződését átírási szinten egy galaktózzal indukálható promotor szabályozza. Abból a célból, hogy maximálissá tegyük a heterológ fehérje kifejeződését az említett folyamat működése során, az alábbiakat szükséges biztosítani: (i) a kifejezendő (Met-HSA-t kódoló) gén nagy kópiaszáma;

(ii) a szóban forgó gén öröklődési stabilitásának nagy mértéke a nem-szelektív növekedés körülményei között;

(iii) az, hogy a sörélesztőbe transzformált rekombináns gének nem rendelkezhetnek káros hatással az élesztőre és ennek arra a képességére, hogy sört és azt követően heterológ fehérjét termeljen; és (iv) az, hogy az élesztőben jelen levő rekombináns gének, amennyire csak lehetséges, korlátozódjanak csak a kívánt génekre és a szomszédos élesztő-szabályozó génekre. Az (ii) követelmény különösen fontos, mivel sem nem célszerű, sem nem kívánatos kiegészíteni a sörélesztő normális tápközegét, nevezetesen a komlózott malátakivonatot, olyan toxikus anyagokkal, mint pl. réz-ionok, mivel ez növelné az eljárás költségeit és káros és valószínűleg elfogadhatatlan hatással lenne a sör minőségére, amely a fermentáció elsődleges terméke. A (iv) követelménnyel kapcsolatban kívánatos, hogy a genetikailag módosított élesztőnek ne legyenek többlet DNS szekvenciái, különösen olyanok, amelyek a rekombináns plazmid bakteriális részéből származnak.

Az EP-A-251744 számon közzétett bejelentésünkben eljárást írtunk le élesztősejteknek a módosítására a kívánt fehérjét vagy pepiidet kódoló DNS szekvenciának az endogén 2 pm plazmidba történő beiktatásával, oly módon, hogy egy integrációs vektort készítünk, amely egy homológ 2 pm plazmid DNS szekvenciának két, a kívánt DNS szekvenciát azonos orientációban körülfogó kópiáját tartalmazza, és azután ezzel az integrációs vektorral élesztőt transzformálunk, majd a kapott transzformált élesztőből izoláljuk azokat a sejteket, amelyek tartalmazzák az emített DNS szekvencia beépítésével módosított endogén 2 pm plazmidot. Az integrációs vektor maga nem él tovább a transzformált élesztősejtben. A homológ 2 pm plazmid DNS szekvenciák lehetnek, bár általában nem azok, a 2 pm plazmid ismétlődő szekvencia kópiái.

Úgy találjuk, hogy az említett bejelentés eljárásának módosítása lehetővé teszi élesztősejtek transzformálását egy módosított 2 pm plazmid beépítésével.

A jelen bejelentés eljárásában az alkalmazott plazmid-vektor tartalmaz egy olyan DNS szekvenciát, amely lehetővé teszi a vektor szaporítását baktériumokban, ahol ez a szekvencia két homológ azonos orientációjú 2 pm plazmid DNS FLP rekombinációs hely között van befogva, tartalmaz egy, a kívánt heterológ fehérjét vagy peptidet kódoló DNS szekvenciát, amely előnyösen, de nem szükségszerűen élesztőhöz képest heterológ szekvencia és előnyösen tartalmaz még egy szelektálható marker DNS szekvenciát is. A jelen találmány szerinti 2 pm plazmid-vektor az FLP rekombinációs hely három kópiáját tartalmazza, amelyek közül két kópia azonos orientációban van, a harmadik pedig ellentétes orientációban. Amikor élesztőt transzformálunk olyan plazmidvektorral, amely, ezzel a konstrukcióval bír, arról a DNS szekvenciáról, amely lehetővé teszi a vektor szaporodását baktériumokban, úgy találjuk, hogy spontán elvész és a plazmid-vektor módosított 2 pm plazmiddá válik, amely képes helyettesíteni az endogén 2 pm plazmidot a transzformált élesztőben. Az ilyen típusú plazmid-vektorokat ezután „széteső” vektoroknak nevezzük. Az ilyen vektorokkal transzformált élesztő tartalmazhatja egy módosított 2 pm plazmid sokszoros extrakromoszomális kópiáját, ahol a plazmid tartalmazza a kívánt gént, de nem tartalmaz bakteriális DNS-t; ezekről a plazmidokról úgy találjuk, hogy stabilan öröklődnek nem szelektív növekedés körülményei között.

Bruschi /13. Nemzetközi Konferencia az élesztő genetikájáról és molekuláris biológiájáról (13th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology), 1986. ősz/ ismertette, hogy a rekombináció egy 2 pm-alapú plazmidban bakteriális DNS szekvenciák kimetszését eredményezheti, de csupán azt sugallta, hogy a rendszert lehet alkalmazni a DNS molekulában lévő szerkezeti-működési kapcsolatok tanulmányozására. Mi most úgy találtuk, hogy hasonló rendszert lehet alkalmazni előnyös kifejező vektorok előállítására, amelyeknek meglepően jó stabilitásuk van.

Az „FLP rekombinációs hely” kifejezés, ahogyan itt használjuk, bármely olyan helyet jelent, amely lehetővé teszi a rekombinációt, mint az FLP géntermékkel való kölcsönhatás eredményét. Ha Andrews felfedezése (v.ö. Andrews és munkatársai: Cell 40, 795 1985) helytálló, akkor az FLP rekombinációs hely általában minimumként tartalmazza az általa azonosított 74 bp-s szekvenciát. Gyakorlatban nincs példa arra, hogy több lenne benne, mint a teljes ismétlődő szekvencia 599 bázispáija.

A jelen találmány 2 pm alapú „széteső” vektorairól úgy találjuk, hogy képesek transzformálni mind laboratóriumi, mind ipari törzseket. A „széteső” vektor fennmarad nagy sejtenkénti kópiaszámmal és rendkívül nagy mértékű öröklődő stabilitása van. Ezen kívül, az eddig leírt más 2 pm alapú plazmid-vektoroktól eltérően, a „széteső” vektor úgy van megalkotva, hogy az élesztő transzformálásakor a bakteriális plazmid DNS szekvenciák spontán kiiktatódnak. így sörélesztő olyan genetikailag módosított törzseit lehet megalkotni, amelyekben a kívánt gén, amely a 2 pm plazmidba be van építve, stabilan fennmarad, még a nem szelektív növesztés körülményei között is, nagy sejtenkénti kópiaszámnál, többlet bakteriális plazmid DNS szekvenciák nélkül. Az ilyen vektor alkalmazása egy genetikailag módosított sörélesztő megalkotásában biztosítja, hogy csak a kívánt gén marad fenn stabilan az egymást követő generációk során a sörélesztőben, ezáltal kizárva minden olyan lehetséges káros hatást, amelyet a többlet DNS szekvenciák okozhatnak az élesztő technológiai viselkedése és/vagy az élesztővel termelt sör íz-, illat-, és minőségi jellemzőire.

A kívánt gén gyakorlatilag bármilyen rekombináns gén lehet, akár homológ, akár heterológ az élesztő szempontjából. A „széteső” vektort alkalmazhatjuk pl. a MetHSA gén stabil integrálására sörélesztőben, amely

HU 213 344 Β gén vagy egy konstitutív élesztő promotorból van kifejezve, pl. a foszfoglicerát kináz promotorból (PGK) az EP-A-147 198 európai közzétételi iratban leírt módszer szerint, vagy egy szabályozott élesztő promotorból, pl. a GAL10/CYC1 hibrid promotorból, amint ezt az EP-A-201 239 európai közzétételi iratban leírták, vagy a GAL/PGK promotorból, amint ezt az EP-A-258 067 európai közzétételi iratban leírták.

A további gének között, amelyek stabilan fenntarthatok ebben a rendszerben, találjuk a Saccharomyces diastaticus DEX1 génjét, amely egy extracelluláris glukoamiláz enzim termelését határozza meg sörélesztőben, és a Bacillus subtilis β-glukanáz génjét, amely egy endo-1,2-1,4-p-glukanáz termelését határozza meg sörélesztőben (Hinchliffe és Box, 1985). Az ilyen géneket először módosíthatjuk, hogy szabályozzuk a gén kifejeződés szintjét és/vagy biztosítsuk, hogy a fehérje, amelynek szintézisét közvetítjük a gén segítségével, kiválasztódjék a sörélesztő segítségével.

Az új „széteső” (dezintegrációs) vektor alkalmazása különösen előnyös abban az eljárásban, amelyet az EPA-201 239 európai közzétételi irat ír le, mivel az eljárás szerint a kívánt gént úgy szabályozzuk, hogy az nem fejeződik ki sem a sör-fermentáció folyamán, sem az élesztő növesztés normális körülményei között, viszont indukálódik a fermentációs folyamat után. Következésképpen a kívánt gén magas szintű kifejeződése időben elkülönül a sejt szaporodása révén keletkező élesztő biomassza szintézisétől, így a génkifejeződés bármiféle káros hatása a plazmid stabilitására minimálisra csökken.

A jelen találmány szerinti vektor előnyösen „széteső” vektor (amint ezt korábban meghatároztuk), amely tartalmaz egy teljes 2 pm-os plazmidot, amely hordoz még (i) egy olyan bakteriális DNS szekvenciát, amely a vektor szaporításához szükséges egy bakteriális gazdaszervezetben (ii) egy többlet 2 pm FLP rekombinációs helyet; (iii) egy kívánt fehérjét vagy peptidet kódoló DNS szekvenciát; és (iv) egy szelektálható marker DNS szekvenciát élesztő transzformáláshoz; az említett bakteriális plazmid. DNS szekvenciát és a többlet FLP rekombinációs helyet a 2 pm plazmid két megfordított ismétlődő szekvenciájának egyikében levő restrikciós helynél alakítják ki, az említett többlet FLP rekombinációs hely azonos orientációban van az említett egyik ismétlődő szekvencia endogén FLP rekombinációs helyéhez viszonyítva, és a bakteriális plazmid DNS szekvencia szendvicsként be van fogva a többlet FLP rekombinációs hely és az említett egyik ismétlődő szekvencia endogén FLP rekombinációs helye közé.

Az előnyös „széteső” vektor tehát egy teljes 2 pm plazmidból áll, amelybe egy vagy több bakteriális plazmid DNS szekvencia van beiktatva, valamint be van iktatva egy többlet-kópia a 2 pm plazmidból származó 74 bázispáros FLP rekombinációs helyből. A kívánt gént, egy élesztő transzformáláshoz szolgáló szelektálható markerrel együtt egy másik helynél iktatjuk be a 2 pm plazmidba. A bakteriális plazmid DNS szekvenciákat és az élesztő DNS ismétlődést beiktatjuk pl. egy Xbal helynél, a teljes 2 pm plazmid két megfordított ismétlődésének egyik kópiájába. A DNS ismétlődés korrekt orientációja lényeges a plazmid működéséhez; a plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a DNS szaporításához pl. E.coliban szükséges bakteriális plazmid szekvenciát szendvicsként beiktatjuk a 2 pm plazmid FLP rekombinációs helyének két kópiája közé, amelyek önmagukban ellentétes orientációban vannak. A DNS szekvenciák konfigurációját a 3. ábrában mutatjuk be, és ezt a későbbiekben részletesen leírjuk. Ez a konstrukció a bakteriális plazmid DNS szekvenciákat a DNS olyan területére szorítja be, amely, amikor a plazmidot élesztőbe transzformáljuk; kimetsződik a plazmidból, egy hely-specifikus rekombinációs művelet segítségével a két azonosan orientált DNS ismétlődés között. Ezt a hely-specifikus rekombinációt a 2 pm plazmid FLP génjének terméke közvetíti, amely terméket szolgáltathatjuk az élesztő endogén 2 pm plazmidjával, amikor cir⁺ sejteket transzformálunk, vagy szolgáltathatjuk a „széteső” vektorral magával, amikor cir°sejteket transzformálunk. Mivel ajelen találmány szerinti vektorokat lehet alkalmazni arra, hogy a transzformált élesztőt megszabadítsuk saját endogén 2 pm plazmidjaitól, és mivel a rekombináció gyorsabb a cir° sejtekben, előnyös azt a találmány szerinti vektort alkalmazni, amely egy teljes 2 mm plazmidon alapul. Ha azonban a találmány vektora együtt létezik az endogén 2 pm plazmiddal, az olyan géneknek, mint a REP1, REP2, STB és FLP, nem szükséges, hogy jelen legyenek a vektorban, mivel ezeknek a géneknek a termékeit transz formában szolgáltatjuk; minden, ami szükséges, egy replikációs origó.

Amint az alábbiakban részletesebben leírjuk, a bakteriális szekvenciákat hordozó beiktatott DNS hordozhatja mindkét végén az ismétlődő szekvencia megfelelő részét, amely esetben az említett DNS egy endogén ismétlődő szekvenciába lesz beiktatva úgy, hogy az endogén rekombinációs hely ténylegesen elroncsolódik, de két új FLP rekombinációs hely képződik, amelyek mindegyike tartalmazza az endogén rekombinációs hely egy részét, és tartalmaz egy komplementer részt a beiktatott DNSből.

Másik esetben a beiktatott DNS az egyik vége felé hordozhat egy teljes FLP rekombinációs helyet; ebben az esetben a DNS-t egy endogén ismétlődő szekvencia mellé vagy attól bizonyos távolságra iktatjuk be, úgy, hogy a bakteriális DNS az endogén ismétlődő szekvencia és a beiktatott ismétlődő szekvencia között helyezkedjék el.

Ha a beiktatott DNS az endogén szekvenciától bizonyos távolságra levő helyzetbe kerül beiktatásra, akkor az endogén ismétlődő szekvencia és a beiktatott ismétlődő szekvencia közötti endogén DNS később kiesik a bakteriális DNS-sel együtt. így, ha erre a DNS-re szükség van, akkor ennek egy további kópiájáról kell gondoskodni (előnyösen a beiktatott DNS-en) a beiktatott ismétlődő szekvenciának az endogén ismétlődő szekvenciától távoli oldalán.

A „széteső” vektor egyik előnyös jellemzője az, hogy amikor cir⁺ élesztőtörzsekbe vezetjük be, mivel ez rendelkezik egy integrális 2 pm plazmiddal, képes megszabadulni az endogén 2 pm plazmidtól, vagy a bakteriális

HU 213 344 Β plazmid szekvenciák kimetszése során, vagy az után. Analóg szituációról számoltak be élesztő cir+ gazdatörzseibe transzformált teljes 2 mm vektoroknál (Harford és Peters, 1987). így a „széteső” vektort lehet alkalmazni, hogy az élesztőtörzseket megszabadítsuk az endogén 2 pm plazmidtól.

A „széteső” vektorok alkalmazhatók a kívánt gének stabil fenntartásához élesztőben.

A pS AC3 hordoz egy egyedi PstI helyet és egy egyedi SnaBI helyet, amelyek mindegyikébe DNS szekvenciákat lehet beiktatni, amint fentebb leírtuk, anélkül, hogy ez károsan hatna a plazmid így létrejött „széteső” származékának fenotípusos stabilitására élesztőben. Ezeket a helyeket alkalmazhatjuk a kívánt gének bevetéséhez alkalmas helyekként; ilyen gének lehetnek pl. a S. diastaticus DEX-1 génje és a humán szérum albumin génje, amelyek egy élesztő promotor segítségével fejeződnek ki. Ismert módszereket alkalmazva az ilyen géneket ezekbe az egyedi helyekbe megfelelő szelektálható markerrel együtt lehet beiktatni az élesztő transzformálásához. Egy másik módszer szerint a pSAC3Ul, pS AC3U2, pSAC310 vagy pS AC3C1 plazmidokat alkalmazhatjuk befogadóként egy megfelelő, kívánt gén beiktatásához. Ebből a szempontból a pSAC3Ul, pSaC3U2 és pSAC310 plazmidok magukban foglalnak egy egyedi Smal helyet az URA3 gén 3'-nem-transzlalált területen belül elhelyezve (Rose és munkatársai, 1984). Ezt a Smal helyet alkalmazhatjuk egy megfelelő kívánt gén beiktatására alkalmas helyként.

A SnaBI hely alkalmazásának előnyös volta egy kívánt gén azonos vagy ellentétes orientációban való beiktatása esetén (például amikor az URA3 gén be van iktatva, majd a kívánt gént iktatjuk annak Smal helyébe) független a vektor szétesésétől, azaz a bakteriális DNS szekvenciák elvesztésétől.

Az új eljárással meg kívánjuk gátolni, hogy az átírás folytatódjék a beiktatott génből vagy génekből az endogén 2 pm területekbe, különösen az úgynevezett STB területbe, amely a SnaBI hely oldalán van az élesztő replikációs origótól (őri) távol. így, előnyösen, a beiktatott szekvencia tartalmaz (a) egy kívánt gént, (b) egy hozzá tartozó promotort az ori-val szomszédos oldalán, és (c) egy 3' transzkripciós terminátort a kívánt géntől „lefelé” és a gén és az STB terület között.

Az alábbiakban rövid magyarázatokat füzünk a mellékelt ábrákhoz. Megjegyezzük, hogy a 4., 5., 6. és 8. ábrán szemléltetett pSAC3Ul, pSAC3U2, és pSAC300 és pSAC3Cl plazmidok alkalmazása önmagában nem tartozik az 1. igénypont oltalmi körébe, hanem ezek a plazmidok azt a „szétesést” okozó hatást szemléltetik, amelynek révén a nem kívánt DNS kiesik; ezek a plazmidok azonban - amint ezt leírásunk utolsó fejezetében megmagyarázzuk - a kívánt génnek az STB és őri közötti tartományba történő beiktatása útján alakíthatók az 1. igénypont szerinti eljárásban alkalmazható plazmidokká. A 7. ábra szerinti pSAC310 plazmid alkalmazása az 1. igénypont oltalmi körébe tartozik, minthogy itt az SnaBI hely az STB és őri közötti tartományban van.

Az 1. ábra a pBA112 plazmidot mutatj a be (Andrews és munkatársai, 1985). A vékony vonal azokat a DNS szekvenciákat képviseli, amelyek a pUC9 bakteriális plazmidból származnak; a nyitott keret az FLP rekombinációs helyet tartalmazó 74 bázispáros DNS fragmentumot képviseli; a háromszögek a három belső DNS ismétlődés orientációját jelzik az egyes FLP rekombinációs helyeken belül (Andrews és munkatársai, 1985).

A 2. ábra a pSAC112 plazmidot mutatja be. A pSACl 12 plazmid azonos a pBAl 12-vel, azzal a kivétellel, hogy a BamHI, PstI és HindlII helyek ki vannak iktatva.

A 3. ábra a pSAC3 plazmidot mutatja be. A vastag vonal a pUC9 bakteriális plazmidból származó DNS szekvenciákat mutatja be; a nyitott keretek az FLP rekombinációs helyet tartalmazó 74 bázispáros DNS fragmentumot képviselik; a vékony vonal a 2 pm plazmid DNS szekvenciákat képviseli; a háromszögek a három belső DNS ismétlődés orientációját jelzik az egyes FLP rekombinációs helyekben.

A 4. ábra a pSAC3Ul plazmidot mutatja be. A jelölések ugyanazok, mint a 3. ábrában.

' Az 5. ábra a pSAC3U2 plazmid térképe. A jelölések ugyanazok, mint a 3. ábrában.

A 6. ábra a pSAC300 plazmid térképe. A jelölések ugyanazok, mint a 3. ábrában.

A 7. ábra a pSAC310 plazmid térképe. A jelölések ugyanazok, mint a 3. ábrában.

A 8. ábra a pSAC3Cl plazmid térképe. A jelölések ugyanazok, mint a 3. ábrában.

A 9. ábra alapja olyan fénykép, amely haploid élesztőtörzsek növekedését mutatja be és illusztrálja az URA⁺ és a bakteriális bla⁺gén együttes öröklődését.

A 10. ábra. Teljes élesztő DNS autoradiogrammja ³²p-vel jelzett pSAC3 DNS-sel, mint vizsgáló mintával.

Az alábbi példák ismertetik a találmányt.

I. PÉLDA

Plazmidok megalkotása

A pSACl 12 plazmidot (2. ábra) úgy alkotjuk meg, hogy a pBAl 12 plazmidot (1. ábra; Andrews és munkatársai, 1985) együtt emésztjük BamHI és HindlII endonukleázokkal. A lineáris plazmid DNS-t DNS polimeráz I-gyel (Klenow) kezeljük 0,3-0,3 mmól/1 különböző dNTP (dATP, dTTP, dCTP és dGTP) jelenlétében 10 percig, 37 °C hőmérsékleten. A DNS-t fenol: kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és egy éjszakán át inkubáljuk 15 °C hőmérsékleten T4 DNS ligáz jelenlétében. A ligáit DNS-t E.coli MCI061 törzsbe transzformáljuk (Casadaban és Cohen, 1980). Az így létrejött transzformánsokból a pSACl 12 plazmidot izoláljuk a Bimbóim és Doly (1980) eljárásával végzett azonosítást és jellemzést követően.

A pSAC3 plazmidot (3. ábra) az alábbi eljárással alkotjuk meg. Élesztő 2 pm plazmid DNS-t izolálunk DRI9 törzsből, amint ezt Guerinean és munkatársai leírták (1974). A tisztított 2 pm plazmid DNS-t részlegesen emésztjük Xbal restrikciós endonukleázzal, amint ezt Maniatis és munkatársai leírják (1982), és ligáljuk Xbalgyel hasított pSACl 12-vel. A ligáit DNS-t E.coli AG1 törzsbe (NBL Enzymes Ltd., Cramlington, Anglia)

HU 213 344 Β transzformáljuk. Az így létrejött, ampicillin-rezisztens transzformánsokat átvizsgáljuk 2 pm plazmid DNS-re való homológiára, telephibridizálással (Grunstein és Hogness, 1975), ³²p-vel jelzett, pvF92 plazmidból (Storms R.K. és munkatársai, 1979) származó 2,2 kilobázispáros EcoRI fragmentumhoz. Azokat a telepeket, amelyek homológiát mutatnak a 2 pm fajlagos DNS vizsgáló mintával, izoláljuk, és plazmid DNS-üket jellemezzük restrikciós endonukleázos térképezési eljárásokkal. így kapjuk meg a pSAC3 plazmidot.

A pSAC3Ul (4. ábra) és pSAC3U2 (5. ábra) plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pSAC3 plazmidot elhasítjuk PstI restrikciós endonukleázzal. A lineáris DNS-t tompa végűvé tesszük T4 DNS polimerázzal végzett kezeléssel 0,3-0,3 mmól/1 különböző dNTP (dATP, dTTP, dCTP és dGTP) jelenlétében, 10 percen át 37 °C hőmérsékleten. A DNS-t fenol: kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk a ligálás előtt. pJDBllO plazmidot (Beggs, 1981) emésztünk HindlII restrikciós endonukleázzal, és a DNS fragmentumokat agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá 1%-os gélen. Az

1,1 kilobázispáros DNS fragmentumot, amely magába foglalja az élesztő URA3 gént, izoláljuk a gélről (Maniatis és munkatársai, 1982) és DNS polimeráz Igyel (Klenow) kezeljük 0,3-0,3 mmól/1 különböző dNTP (dATP, dTTP, dCTP és dGTP) jelenlétében. A

1,1 kilobázispáros HindlII fragmentumot fenol: kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és tompavégü módon ligáljuk a fentebb leírtak szerint készített lineáris pSAC3 DNS-sel. A ligáit DNS-t E;coli AGl-törzsbe transzformáljuk. Az így létrejött ampicillin-rezisztens transzformánsokat átvizsgáljuk homológiára URA3 génnel, telephibridizálással (Grunstein és Hogness, 1975) a ³²p-vel jelzett pJD8110 plazmidból tisztított

1,1 kilobázispáros HindlII fragmentumhoz. A pSAC3Ul (4. ábra) és pSAC3U2 (5. ábra) plazmidokat izoláljuk azokból a telepekből, amelyek homológiát mutatnak az URA3 génvizsgáló mintához. Az URA3 gént hordozó

1,1 kilobázispáros HindlII DNS fragmentumot tompa végű módon ligáljuk a pSAC3 egyedi Eag I és SnaBI helyeibe, így kapjuk meg a pSAC300-nak (6. ábra) és pSAC310-nek (7. ábra) nevezett plazmidokat.

A pSAC3Cl plazmidot (8. ábra) úgy alkotjuk meg, hogy tompa végű módon ligálunk egy 694 bázispáros Xbal-Kpul DNS fragmentumot, amely a pET13 : 1 plazmidból (Henderson és munkatársai, 1985) származó CUPI gént hordozza, a pSAC3 egyedi PstI helyébe.

Élesztő transzformálása pSAC3Ul és pSAC3U2 plazmidokkal

A pSAC3Ul (4. ábra) és pSAC3U2 (5. ábra) „széteső” vektorokat úgy alkotjuk meg, hogy ezek mindegyike tartalmazza az URA3 szelektálható élesztő gént a 2 pm B-forma egyedi PstI helyénél beiktatva. Ezen kívül mindegyik plazmid magában foglalj a a pUC9 bakteriális plazmidból származó DNS szekvenciákat az FLP rekombinációs hely két kópiájával szegélyezve, amelyek azonos orientációban helyezkednek el. A pUC9 DNS elhelyezkedése olyan, hogy az FLP közvetített rekombináció e között a két azonosan orientált FLP rekombinációs hely között a bakteriális plazmid DNS kimetszését eredményezi az élesztő transzformálásakor. Az S150-2B haploid élesztőtörzs (Cashmore és munkatársai, 1986) cir⁺ és cir® származékait uracil prototrófiára transzformáljuk pSAC3Ul és pSAC3U2 plazmidokkal Ito (1983) módszere szerint. Az URA transzformánsokat átvizsgáljuk a bakteriális bla génnel való együtt-öröklődésre, amely gén a β-laktámra fajlagos β-laktamáz enzimet kódolja élesztőben, az átvizsgáláshoz Chevalier és Aigle eljárását (1979) alkalmazva. A 9. ábrában bemutatott eredmények azt mutatják, hogy mindkét plazmid elválasztja a bla gént az URA géntől a cir° törzs összes transzformánsában, jelezve a bakteriális DNS szekvenciák kiiktatását a plazmidokból az élesztő transzformációjakor. A cir⁺ törzsek URA⁺ transzformánsainak többségéről azonban megfigyeljük, hogy együtt öröklődnek a bla génnel (15 a 20-ból és 18 a 20-ból pSAC3 Ul-nél, illetve pSAC3U2-nél). Ezek az adatok azt sugallják, hogy a plazmid szétesésének, vagyis a bakteriális plazmid DNS szekvenciák FLP által közvetített kimetszésének hatékonysága nagyobb a cir° törzsek transzformálásánál, mint a cir⁺ törzsek transzformálásánál.

A transzformánsok molekuláris elemzése

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon az URA⁺ transzformánsok, amelyek kiválasztották a bla gént (vagyis β-laktamáz negatív kiónok, bla ), elvesztették-e valóban a bla gént és a szomszédos bakteriális plazmid DNS szekvenciákat, az élesztőt elemezzük. A pSAC3Ul-gyel és pSAC3U2-vel transzformált cir⁺ és cir® törzsek két URA⁺ bla~ transzformánsát növesztjük szelektív minimál tápközegen, amelyből hiányzik az uracil, és a teljes DNS-t extraháljuk az alábbi eljárással. Aktívan növekvő sejteket nyerünk ki és újra szuszpendáljuk 5 ml oldatban, amely 1 mól/1 szorbitot, 0,025 mól/1 etilén-diamin tetraecetsavat (EDTA) (pH 8,0) és 8 mg/ml ditiotreitolt tartalmaz és 28 °C hőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk. A sejteket kinyerjük és szuszpendáljuk 5 ml olyan oldatban, amely 1,2 mól/1 szorbitot, 0,1 mól/1 nátrium-citrátot, 0,02 mól/1 EDTA-t (pH 5,8), és 0,025 pl/ml zimolázt (Kirin Brewery Co., Ltd.) tartalmaz 28 °C hőmérsékleten tartjuk, amíg protoplasztokat kapunk. A protoplasztokat háromszor mossuk 1,2 mól/1 szorbitban az újra szuszpendálás előtt; az újra szuszpendálást 1 ml olyan oldatban végezzük, amely 3% szarkozilt, 0,5 mól/1 trisz.HCl-t (pH 7,5), 0,2 mól/1 EDTA-t és 100 pl/ml K-proteinázt tartalmaz, a szuszpenziót 55 °C hőmérsékleten 60 percig tartjuk. A DNS készítményt kloroform: izopropanollal, fenollal, kloroformmal és éterrel extraháljuk, majd dialízist végzünk 10 mmól/1 trisz.HCl-t és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldattal (pH8) szemben. A teljes élesztő DNS-t emésztjük EcoRI, Xbal és PstI restrikciós endonukleázokkal és a DNS fragmentumokat agaróz gélelektroforézissel különítjük el. A Southern átvitelt követően (Maniatis és munkatársai, 1982) teljes élesztő DNSt hibridizálunk³²P-vel jelzett pSAC3 DNShez. Az eredményeket a 10. ábrában mutatjuk be, amely a ³²P-vel jelzett pSAC3 DNS-sel átvizsgált teljes élesztő DNS autoradiogrammja. A pSAC3Ul és pSAC3U2 plazmidokkal transzformált S150-2B cir⁺ törzsekből DNS-t izolálunk. Az egyes törzs/plazmid kombinációk

HU 213 344 Β két független transzformánsát, amelyeket A-nak, illetve B-nek nevezünk, elemezzük. A DNS-t az alábbi restrikciós endonukleázokkal elemezzük: Xbal (1-4 és 21-24 sávok); PstI (5-12 sávok); EcoRI (13-20 sávok).

Sáv	Plazmid	• + < · 0 cir /cir	Izolátum (A/B)
6, 14, 22 8, 16, 24	pSAC3Ul pSAC3Ul	. + cir - + cir	A B
5, 13, 21 7, 15, 23	pSAC3Ul pSAC3Ul	cir° cir0	A B
2, 10, 18 4, 12, 20	pSAC3U2 pSAC3U2	. + cir • + cir	A B
1, 9, 17 3, 11, 19	pSAC3U2 pSAC3U2	cir° cir0	A B

Az élesztő endogén 2 pm plazmidjában (Hartley és Donelson, 1980) és a pSAC3Ul és pSAC3U2 rekombináns plazmidokban jelen levő ismert restrikciós helyekre alapozva meg lehet jósolni a hibridizálási mintasort a pSAC3 plazmidhoz. A „megjósolt” hibridizációs mintasort az 1. Táblázatban mutatjuk be.

I. TÁBLÁZAT

A pSAC3Ul-gyel és pSAC3U2-vel transzformált S150-2B cir⁺ és cir° származékok várt hibridizálási mintasora pSAC3-hoz

Plazmid DNS Resrikciós endonukleázos fragmentum

2 pm (endogén)	EcoRI 4.1 3,9 2,4 2.2	(kilobázispár) Xbal 3,2 3,1	Pstl 6,3
pSAC3Ul és	5,3	4,3	10,2
pSAC3U2 (ép)	4,1	3,2
	0,72	2,8
pSAC3Ul és	(5,0)	4,3	7,4
pSAC3U2	4,1	3,2
(„széteső”)	3,3

(2,4)

A zárójelben levő számok akkor érvényesek, ha a „széteső” plazmidok FLP-közvetített kölcsönös átalakuláson mennek keresztül.

Ha összehasonlítjuk a hibridizálás eredményeit (10. ábra) a várt eredményekkel (1. táblázat), látható, hogy az egyes transzformánsokban a rekombináns plazmidban bizonyos kiiktatás megy végbe, amely egybevág a bakteriális plazmid DNS szekvenciák kimetszésével, amelyeket az azonasan, orientált FLP rekombinációs helyek tartalmaznak. Ezenkívül a pSAC3U2/B elnevezésű transzformánsok esetében az S150-2B törzs endogén pm plazmidja már nincs tovább jelen. Ez arra utal, hogy egy cir⁺ törzs transzformálása pSAC3U2 plazmiddal az endogén 2 pm plazmid kiküszöbölését eredményezi.

Arra, hogy a pSAC3Ul és pSAC3U2 plazmidok a bakteriális plazmid DNS kimetszésén mennek keresztül az élesztő transzformálásakor, további bizonyítékokat kapunk, ha hibridizáljuk a fentebb említett DNS készítményeket ³²P-vel jelzett pUC9 DNS-hez (Vieira és Messing, 1982). URA⁺ bla^- transzformánsok nem hibridizálnak ehhez a DNS vizsgáló mintához.

A pSAC300,pSAC3I0és pSAC3Cl plazmidok szétesnek az élesztő transzformációjakor

A pSAC300 és pSAC310 URA⁺ plazmidokat alkalmazzuk az S150-2B cir⁺ és cir° származékainak transzformálására, és az így létrejövő transzformánsok URA és bla fenotípusait meghatározzuk. Minden esetben a „széteső” fenotípust figyeljük meg; így a pSAC300 és pSAC310 képesek kimetszeni a bakteriális vektor DNS-t az élesztő transzformálásakor. Ebből a szempontból megfigyeljük, hogy a pSAC300 az S150-2B cir⁺ származékai közül jelentősen nagyobb arányban idéz elő bla^- transzformánsokat. Ennek magyarázata nem ismert. Lehetséges azonban, hogy az EagI hely szétesése az URA3 gén beiktatásával a pSAC300-ba hatással van a szomszédos FLP gén kifejeződésére, ez pedig az FLP rekombináz túlzott kifejeződését eredményezi.

A pSAC3C 1 -et úgy tervezzük, hogy rézérzékeny ipari élesztő, főleg sörélesztő transzformálására használhassuk. így a pSAC3Cl-et Bass sörélesztő szabadalmazott, BB11.0-nak nevezett törzsébe transzformáljuk, amelyet Hinchliffe és Daubney (1986) írtak le. Ezután a rézre rezisztens transzformánsokat ellenőrizzük bla fenotípusra β-laktamáz lemezvizsgálattal. Az átvizsgált transzformánsok mintegy 18%-a bizonyul réz-rezisztensnek, jelezve a pSAC3Cl plazmid in vivő szétesését a sörélesztő gazdaszervezetben.

A pSAC300, pSAC310 és pSAC3Cl plazmidok in vivő szétesését igazoljuk ezután, a „széteső” fenotípussal bíró megfelelő gazdatörzsek teljes molekuláris jellemzését követően. így amikor teljes élesztő DNS-t hibridizálunk ³²P-pUC9 DNS-hez, amint korábban leírtuk, homológia nem mutatható ki a bla^- származékokban,

A „széteső transzformánsok plazmid stabilitása

Az URA⁺ fenotípus öröklődő stabilitását meghatározzuk S150-2B-nek a pSAC3Ul és pSAC3U2, valamint pSAC300 és pSAC310 széteső származékait magában foglaló cir⁺ és cir° törzseiben, a meghatározást úgy végezve, hogy az élesztőt nem szelektíven növesztjük 2% (tömeg/térfogat) glükózt tartalmazó YPD tápközegen, szélesztjük ugyanilyen tápközegre, és replikon-lemezre visszük, olyan tápközegre, amely uracilt nem tartalmaz. A generációnkénti százalékos plazmid-veszteséget kiszámoljuk, és a 2. Táblázatban mutatjuk be.

HU 213 344 Β

2. TÁBLÁZAT

Százalékos plazmid-elvesztés generációnként

Plazmid származék („széteső” vektor)	Százalékos plazmid-elvesztés, generációnként
	S150-2B • + cir	S15O-2B cirO
pSAC3Ul	0,22	0,19
pSAC3U2	0,31	0,14
pSAC300	2,5	-
PSAC310	0	0,89

A 2. Táblázatban bemutatott eredményekből látható, hogy egyik „széteső” származék sem stabil az S150-2Bnek sem cir⁺, sem cir° származékaiban. A pSAC3Ul-nél, pSAC3U2-nél és különösen a pSAC310-nél megfigyelt instabilitás szintje azonban legalább egy nagyságrenddel kisebb annál, mint amely más URA⁺ 2 pm alapú rekombináns vektorokban megfigyelhető S150-2B-ben (Cashmore és munkatársai, 1986).

Érdekes megjegyezni, hogy az URA3 gén beiktatása a pSAC3 2 pm részének egyedi EagI helyébe egy olyan „széteső” származékot eredményez, amely jelentősen kevésbé stabil, mint azok a „széteső” származékok, amelyek a pSAC3U 1-ből pSAC3U2-ből és pSAC310-ből származnak. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy a szelektálható marker beiktatásának helye jelentős hatással lehet az így létrejövő „széteső” származék stabilitására. Ebből a szempontból világos, hogy a 2 pm plazmid egyedi SnaBa és PstI helyei megfelelő helyeket képeznek rekombináns gének bevezetéséhez, mivel a plazmid stabilitását az ilyen beiktatások nem befolyásolják károsan.

Sörélesztő „széteső” transzformánsainak plazmidstabilitása

BB11.0 pSAC3Cl transzformánsainak „széteső” származékait is elemezzük a réz-reszisztens fenotípus stabilitására. A plazmid stabilitási kísérleteket úgy hajtjuk végre, amint korábban leírtuk, és ez 0,014% becsült plazmid-veszteséget eredményez generációnként nemszelektív növekedési körülmények között: Ezekből az eredményekből nyilvánvaló, hogy a pSAC3Cl „széteső” származékai rendkívül stabilak a BB 11.0 sörélesztő törzsben, ez a stabilitás olyan nagy mértékével bír, amelyet még sohasem figyeltek meg rekombináns 2 pm alapú élesztő vektornál.

Törzsek és tenyésztési feltételek

A plazmidok kialakításához Escherichia coli DH5a törzset (F, <|>80d/acZdeltaM15, delta(/acZYA-argF) U169, re/Al, ewc/Al, /wíZR.17 (r_k-, m_k+), sn/?E44, lambda, thi-\,gyrA, re/Al) alkalmaztunk. Az M13 vektorok szaporításához E. coli XLl-blue törzset alkalmaztunk (Stratagene; e«t/Al, úó'í7R17 (r_k—, m_k+), snpE44, thi-1, lambda, recAl, gyrA96, re/Al, (lac-), [F', pro AB, /acI^qZdeltaM15, TnlO, (tét¹)]. Rekombináns albumint expresszáló gazdaként Saccharomyces cerevisiae DB1 cir° törzset (a, leu2) alkalmaztunk. Alkalmaztunk három másik 5. cerevisiae törzset is; ezek az AH22 cir⁺ (a, canl, leu2, his4)·, aBJ1991 cir⁺ (a.,prbl-l 122, pep4-3, leu2, trpl, ura3-52) és az S22 cir⁺ törzs (a, adel, ade2, ural, his7, tyrl, lys7, gall, gut2f Az élesztősejteket megfelelő szénforrással kiegészített (1 m/V % élesztőkivonat, 2 m/V % „bactopeptone”) tápagaron, 30 °C-on növesztettük. A S. cerevisiae transzformánsokat 50 ml-es Erlenmeyer-lombikokban, 2 m/V % szacharózt tartalmazó 10 ml YEP tápközegben, 30 °C-on, 200-as percenkénti fordulatszámmal keverve 72 órán át növesztettük. A HSA antitest lemezek előállításához 1 m/V% (elektroforézises tisztaságú) agarózt tartalmazó YEP tápközeget 50 °C-ra hűtöttünk, majd a megfelelő szénforrással együtt 2,5 V/V % koncentrációban nyúl anti-humánalbumin antiszérumot (Cambio, Cambridge, Egyesült Királyság) adtunk hozzá, a tápközeget petricsészébe öntöttük, és hagytuk lehűlni.

DNS-manipulációk

Munkánk során standard DNS-manipulációs technikákat alkalmaztunk [Maniatis és mtsai.: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, 2. kiadás (1989)]. A DNS-fragmenseket centrifugálással nyertük ki az agarózgélből [Vogelstein, B.: Anal. Biochem. 160, 115-118 (1987)]. Radioaktívon jelölt DNS előállításához /a-³²P] dATP-t (Amersham International PLC) és random primerjelölési eljárást ([Feinburg, A.P. és Vogelstein, B.: Anal. Biochem. 137, 266-267, (1984)] alkalmaztunk. Restrikciós endonukleázokat, T4 DNS-ligázt, T4 DNS-polimerázt és E. coli DNS-polimeráz I-et (Klenow-ffagmens) a Boehringer-Mannheimtől kaptunk.

A glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz (GUT2) élesztő promoterfragmenst élesztő-DNS BglII restrikciós enzimmel végzett emésztésével kapott fragmensekből készített genomiális könyvtárból kaptuk. A BglII restrikciós fragmenseket a Herpes Simplex timidin-kináz (TK) gént tartalmazó plazmid egyetlen BglII helyére inszertáljuk. Az ilyen plazmiddal transzformált élesztő csak akkor fog folát-antagonista (pl. szulfanil-amid és amethopterin) [ld. Goodey és mtsai.: Molecular and General Genetics, 204, 505-511 (1986), melyet teljes terjedelmében hivatkozásként tekintünk] jelenlétében növekedni, ha a promoter-fragmenseket a timidin-kináz gén elé inszertáljuk.

A sejtkivonatban a timidin-kináz-aktivitás mérésével aktív promoterrel rendelkező plazmidot szelektáltunk ki.

A promoter-fragmens a pXL5 plazmid (1. ábra) Bg 1II restrikciós fragmensén belül helyezkedett el. A glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz 1,48 kb hosszúságú fragmensét megszekvenáltuk (2. szekvencia). A promoter-fragmenst úgy módosítottuk, hogy az élesztő promoter 3'-végére Sfil restrikciós endonukleázos hasítási helyet vittünk be:

Természetes GTACACCCCCCCCCTCCACAAACACAAATATTGATAATATAAAGATG ATG-környék Met

Transzláció

Módosított GACGGCCCCCCCGGCCACAAACACAAATATTGATAATATAAAGATGATG környék Met

Sfil Transzláció (Ez a két szekvencia a 6., illetve 7. szekvencia.)

HU 213 344 Β

Rekombináns humán szérumalbumin expresszálása

A GUT2-promoter 282 bp-os Pstl-Rsal fragmensét (vagyis az 1. szekvencia 1031-1036. helyen lévő CTGCAG szekvenciájától az 1314-1317. helyen lévő GTAC szekvenciájáig húzódó fragmenst) és egy 56 bpos kétszálú oligonukleotid-linkert:

5'-ACGGCCCCCCCGGCCACAAAC ACAAATATTGATAATATAAAG ATG AAG TGG GTA

3’-TGCCGGGGGGGCCGGTGTTTGTGTTrATAACTATTATATTTC TAC TTC ACC CAT

-5'

TCGA-3’ (melynek 5-3’ szála a 12. szekvenciát alkotja) az M13mpl8 vektor [Yanisch-Perron és mtsai.: Gene 33, 103-109 (1985)] PstI és HindlII helyei közé inszertáltuk, miáltal a pAYE274 plazmidot (12. ábra) kaptuk, amely az inszerció eredményeként a transzlációs kezdőhelytől 5'irányban egyetlen Sfil helyet tartalmaz. A pAYE274 plazmidot EcoRI-gyel és Pstl-gyel linearizáltuk, majd a pXL5 plazmidból (11. ábra) származó 2,3 kb-os EcoRIPstl fragmenssel ismét gyűrűvé zártuk, miáltal a pAYE275 plazmidot (13. ábra) kaptuk. Ezt a plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztettük, és a 2,3 kb-os GUT2 promoter-fragmenst tisztítottuk.

A következő lépésben alkalmazott pAYE334 plazmid kialakításának leírása megtalálható az EP-A-431 880 számú európai szabadalmi bejelentésben, azonban itt is megismételjük.

A pAAH5 plazmidot [Goodey és mtsai.: „Yeast Biotechnology”, szerk.: Berry, D.R., Russel, I. és Stewart, G.G; Allén and Unwin, 401—429. old. (1987)] részleges BamHI-emésztéssel linearizáltuk. Az 5'-túlnyúló szálakat T4 DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, és a kétszálú oligonukleotidlinkerrel ligáltuk:

5’-GCGGCCGC-3'

3'-CGCCGGCG-5'

Notl

Egy rekombináns pAYE334 plazmidot (14. ábra) szelektáltunk ki, amelyben az ADH1 terminátor 3'-végén lévő BamHI helyet Notl restrikciós hely helyettesíti.

A pAYE275 plazmidból (13. ábra) származó módosított promoteríragmenst és a pAYE334 plazmidból származó, 450 bp-os HindlII-NotI ADH1-terminátor fragmenst pATl 53 plazmidba (Twigg és Sherratt, 1980) ligáltuk (melyet a ligálás előtt Notl felismerési hely (5'-GCGGCCGC-3') bevitelével módosítottunk, megszüntetve a BamHI helyet), s ezáltal a pAYE276 plazmidot kaptuk (15. ábra).

A pAYE276 plazmidot EcoRI-gyel és SstlI-vel linearizáltuk, a 3' beugró végeket T4 DNS-polimerázzal és dNTP-vel feltöltöttük, majd feleslegben lévő Notllinkerrel (5'GCGGCCGC-3') ismét gyűrűvé zártuk, miáltal a pAYE323 plazmidot (16. ábra) kaptuk. A kapott plazmidot HindlII-mal linearizáltuk, majd egy kétszálú oligonukleotid-linkerrel:

í-AGCTTTATTTCGCTTGTTTTTCTCTTTAGGTCGGCTTATTCCAGGAGCTTGGATAAAAGA-S'

3'-AATARAGGGRAGAAAAAGAGAAATCGAGCCGAATAAGGTCCTCGAACCTATTTTGT-5'

HindlII (melynek 5-3' szála a 13. szekvenciát alkotja), valamint egy - Xhol-gyel linearizált mpl9.7 plazmidból (EP-A-201 239) felszabadított - 1,9 kb-os HA cDNSfragmenssel ismét gyűrűvé zártuk, SÍ nukleázzal tompa végűvé alakítottuk, majd HindlII-mal emésztettük, miáltalapAYE324 plazmidot(17. ábra) kaptuk. A pAYE324 plazmidban létrehozott 3,72 kb-os Notl restrikciós fragmenst ezután egyedi Notl restrikciós helyet tartalmazó megfelelő (élesztőben replikációra képes) vektorba vihetjük be (pl. a pSAC35 plazmidba, 18. ábra), miáltal pl. egy pAYE321 plazmidot (19. ábra) hozhatunk létre.

A pSA35 plazmid a Chinery és Hinchliffe által [Curr. Génét. 16, 21-25 (1989)] és az EP 286424 számú európai szabadalomban leírt pSAC plazmid származéka. A LEU2 szelektálható marker a pSAC3 plazmid SnaBI helyére inszertált 1,95 kb-os Sall-Hpal fragmens, amely a YEP13-ból [Broach, J.R. és mtsai.: Cell 16, 827 (1979)] származik. A LEU2 gén egyedi Tth 1111 helyet tartalmaz. A TthlllI enzimmel végzett emésztést követően az 5' túlnyúló végeket az E. coli DNS-polimeráz-I Klenowfragmensével végzett kezeléssel eltávolítottuk. A pSAC35 plazmid kialakítása érdekében a Notl felismerési hely inszercióját úgy valósítottuk meg, hogy a linearizált, tompa végű DNS-t a következő szekvenciájú kétszálú oligonukleotiddal ligáltuk:

5'-GCGGCCGC-3'

3'-CGCCGGCG-5'.

A szakemberek számos olyan technikát ismernek, amellyel a különböző proteineket kódoló DNS-szegmensek - Sfil restrikciós helyre történő inszerció érdekében - módosíthatók.

Ebben a példában egy találmány szerinti promotert magában foglaló HSA szekréciós vektort (pAYE321) írunk le. Ezt a vektort öt különböző élesztőtörzs transzformálásához alkalmaztuk; ezek közül mind az öt HSA-t választott ki a tenyészeti felülúszóba. Tanulmányoztuk a promoter irányítása alatt álló HSA-expresszió időzítését is. A HSA mRNS-t akkor mutattuk ki először, amikor a sejtek a kései logaritmikus növekedési fázisba értek. A HSA mRNS még akkor is nagy mennyiségben volt jelen, amikor a tenyészet stacionárius fázisba került.

A pAYE324 plazmid (17. ábra) egy pAT153-alapú vektor, amely a - Notl restrikciós helyekkel szegélyezett - teljes promoter/HSA szekréciós kazettát tartalmazza. A 3,715 kb-os szekréciós kazetta a következő komponenseket tartalmazza: i) 1,35 kb-os promoter-fragmenst, amely a természetes ATG-kömyék promotert foglalja magában, azzal a különbséggel, hogy - a fentebb leírtak szerint (7. szekvencia) - az ATG triplettől „upstream” irányban a 30. és 40. bázispár közötti helyen négy nukleotid-szubsztitúciót tartalmaz, melyek a promoter 3'-régiójában egyedi Sfil restrikciós helyet alakítanak ki;

ii) a természetes HSA/a-faktor fúziós vezérlőszekvenciát (WO 90/01063 számú nemzetközi közzétételi irat), amely az érett, HSA szekrécióját irányítja;

iii) az élesztő alkohol-dehidrogenáz ADH1 terminátor régiót.

A 3,715 kb-osNotl-promoter/HSA-szekréciós-kazettát tisztítás után a pSAC35 (18. ábra) plazmid egyedi Notl-klónozóhelyére inszertáltuk, miáltal a pAYE321 plazmidot kaptuk (19. ábra).

Leucin-prototrófia kialakítása érdekében öt (cir°) törzset (nevezetesen az 1. [cir°) törzset, a 2. [cir°) törzset, a

HU 213 344 Β

3. [cir°) törzset, az 5. [cir°) törzset és a 6. [cir°] törzset) pAYE321 plazmiddal transzformáltunk. A transzformálást lényegében Beggs leírása szerint [Natúré 275, 104 (1978)] végeztük, a következő módosításokkal. A transzformáló DNS-t 10 μΐ ioncserélt vízben (1,2 M szorbitolt és 10 mM kalcium-kloridot tartalmazó oldatban készített) 50 μΐ szferoplaszteleggyel és 12,5 μΐ 20 m/V % PEG 3500 (Sigma), 10 mM kalcium-klorid, 10 mM Tris/HCl (pH = 7,5) oldattal óvatosan összekevertük, majd 15 percig jégen tartottuk. A szferoplasztokat - újabb 500 μΐ 20 m/V % PEG 3500 (Sigma), 10 mM kalcium-klorid, 10 mM Tris/HCl (pH = 7,5) oldat hozzáadása után - óvatosan 5 ml 1,2 M szorbitol szelektív agar tápközeggel elegyítettük, és a kapott elegyből lemezt öntöttünk. Minden egyes törzsből két független transzformánst 10 ml YEP tápközegben (1 m/V % élesztőkivonat, 2 m/V % „bactopeptone” és 2 m/V % glükóz) 30 °C-on (percenként 200-as fordulatszámmal rázatva) 72 órán keresztül növesztettünk.

A HSA-t valamennyi transzformáns tenyészeti felülúszójában kimutattuk, ami azt jelzi, hogy a promoter élesztőben képes heterológ proteinek expresszióját/szekrécióját irányítani.

Az alábbiakban adjuk meg a szövegközi irodalmi hivatkozások pontos lelőhelyeit.

Aigle és munkatársai: Journal of the American Society of Brewing Chemists 42, 1 (1984).

Andrews és munkatársai: Cell, 40, 795 (1985).

Beggs: Natúré, 275, 104 (1978).

Beggs: a „Molecular Genetics in Yeast” című kiadványban, Alfréd Benzon Symposium No. 16, Munksgaard, Koppenhága (1981).

Bimbóim és Doly: Nucleic Acids Research, 7, 1513 (1980).

Bolivár: Gene, 4, 121 (1978).

Botstein és Davis (1982): a „Molecular Biology of Saccharomyces: Metabolism and gene Expression” című kiadványban; szerkesztők: Strathem és munkatársai: Cold Spring Harbour Laboratory, New York (1982).

Broach és Hicks: Cell, 27, 501 (1980).

Casadaban és Cohen: Journal of Molecular Biology, 138, 179(1980).

Cashmore és munkatársai: Molecular and General Genetics, 203, 154(1986).

Chevallier és Aigle: FEBS Letters, 108, 179 (1979). Chevallier és munkatársai: Gene, 77, 11 (1980).

Clarké és Carbon: Natúré, 287, 504 (1980).

Clark-Walker és Miklós: European Journal of Biochemistry, 41, 359 (1974).

Cohen és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 1078 (1980).

Falco és Dumas: Genetics, 109, 21 (1985).

Futcher: Journal of Theoretical Biology, 119, 197 (1986).

Futcher és Cox: Journal of Bacteriology, 154, 612 (1983).

Gerbaud és munkatársai: Gene, 5, 233 (1979).

Gritz és munkatársai: Gene, 25, 178 (1983).

Grunstein és Hogness: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 72, 3961 (1975).

Guerineau és munkatársai: Biochemical Biophysics Research Communication, 67, 462 (1974).

Hadfield és munkatársai: Gene, 45,149 (1986).

Harford és Gathoye: DNA, 4, 80 (1985).

Harford és Peters: Current Genetics, 77, 315 (1987).

Hartley és Donelson: Natúré, 286,280 (1980).

Henderson és munkatársai: Current Genetics, 9, 113 (1985).

Hicks és munkatársai: Cold Spring Harbour Symposium Quantitative Biology, 43,1305 (1979).

Hinchliffe és Box: Proceedings of the European Brewery Convention Congress, 20 th, Helsinki, 267 (1985).

Hinchliffe és Daubney: Journal of the American Society of Brewing Chemists, 44, 98 (1986).

Hinnen és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 75, 1929 (1978).

Ito és munkatársai: Journal ofBacteriology, 153,163. (1983).

Hyman és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 1578 (1982).

Jayaram és munkatársai: Cell, 34,95 (1983).

Jiminez és munkatársai: Natúré, 287, 869 (1980).

Kikuchi: Cell, 35,487 (1983).

Kingsman és munkatársai: Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 3, 377 (1985).

Livingston: Genetics, 86, 73 (1977).

Livingston és Hahne: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 3727 (1979).

Maniatis és munkatársai: A „Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, című kiadványban, Cold Spring Harbour, New York (1982).

Murray és munkatársai: The EMBO Journal, 6,4205 (1987).

Nelson és Fangman: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 6515 (1979).

Newlon és munkatársai: ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, 22, 501 (1981).

Orr-Weaver és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 6354 (1981).

Orr-Weaver és munkatársai: a „Methods in Enzymology” című kiadványban, 101,228 (1983); szerkesztők: Wu és munkatársai; kiadó: Academic Press, New York.

Rine és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80, 6750 (1983).

Rose és munkatársai. Gene, 29, 133 (1984).

Rothstein: a „Methods in Enzymology” című kiadványban, 707, 202 (1983); szerkesztők: Wu és munkatársai; kiadó: Academic Press, New York.

Seligy és munkatársai: Nucleic Acids Research, 8, 3371 (1980).

Sigurdson és munkatársai: Molecular and General Genetics, 183, 59 (1981).

Som és munkatársai: Cell, 52, 27 (1988).

Storms és munkatársai: Journal ofBacteriology, 140, 73 (1979).

Struhl és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 1035 (1979).

HU 213 344 Β

Taketo és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 3144 (1980).

Tubb: Journal of the Institute of Brewing, 86, 78 (1980).

Vieira és Messing: Gene, 19,259 (1982).

Volkert és Broach: Cell, 46, 541 (1986).

Volkert és Broach: nyomdában lévő közlemény (1987).

Walmsley és munkatársai: Molecular and General Genetics, 192, 361 (1983).

Webster és Dickson: Gene, 26, 243 (1983).

Winston és munkatársai: a „Methods in Enzymology” című kiadványban, 101,211 (1983); szerkesztők: Wu és munkatársai.

Wu és munkatársai: Az „UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology: Yeast Cell Biology” című kiadványban, 323 (1986); szerkesztő: Hicks.

Yocum: 163491 számú európai szabadalmi bejelentés (1985).

Claims (12)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás élesztő 2 pm plazmid alapú, az élesztőben stabil széteső vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy a vektorok élesztőben való fenntartásához és replikációjához szükséges 2 pm plazmidból származó plazmidba (i) egy vagy több, a plazmidban egy harmadik FLP rekombinációs helyet biztosító vagy létrehozó DNS szekvenciát, (ii) az így létrehozott azonos orientációban álló két FLP rekombinációs hely közé, a vektor élesztősejtbe történő bejuttatása után rekombináció révén elvesző DNS szekvenciát, (iii) a vektor 2 pm plazmidból származó szekvenciáján található STB és őri gének közé egy kívánt fehérjét vagy peptidet kódoló DNS szekvenciát és ennek az élesztőben való expresszi ójához szükséges DNS elemeket Egálunk. (Elsőbbség: 1988. 04. 08.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vagy egy szelektálható marker DNS szekvencia van jelen a plazmidban, vagy a plazmidba egy ilyen szelektálható jelző DNS szekvenciát iktatunk be. (Elsőbbség: 1988. 04. 08.).
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináció révén elvesző DNS szekvenciaként bakteriális eredetű DNS szekvenciát Egálunk. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináció révén elvesző DNS szekvenciaként egy a vektornak baktériumban történő replikációjához szükséges szekvenciát Egálunk. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)
5. 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont (i) lépés szerinti szekvencia az egyik végét egy FLP rekombinációs hely első részéhez és a másik végét egy FLP rekombinációs hely fennmaradó részéhez kapcsolva egy meglevő FLP rekombinációs helybe illeszthető szekvenciát hozunk létre. (Elsőbbség: 1987.04. 09.)
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont (i) lépés szerinti szekvenciát a meglevő FLP rekombinációs hely egyetlen Xbal helyére illesztjük be. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)
7. 7. A 3-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított vektorban valamennyi bakteriális DNS szekvenciát azonos orientációban az FLP rekombinációs helyek közé iktatjuk. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)
8. 8. A 3-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztőhöz képest heterológ kívánt fehérjét vagy peptidet kódoló DNS szekvenciát alkalmazunk. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérjét vagy peptidet kódoló DNS szekvenciaként az 5' végen egy az élesztősejtekben működőképes szekréciós vezetőszekvencián keresztül egy élesztősejtekben működőképes gén-promoterhez és a 3' végénél egy élesztősejtekben működőképes transzkripciós terminációs szignálhoz kapcsolt HSA-t kódoló DNS szekvenciát alkalmazunk. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)
10. 10. A 3-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérjét vagy peptidet kódoló DNS szekvenciát 5' végénél egy élesztősejtekben működőképes vezető szekvencián keresztül egy élesztősejtekben működőképes gén-promoterhez kapcsoljuk. (Elsőbbség: 1987. 08. 03.)
11. 11. Eljárás egy kívánt fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNS szekvencia kifejezésére képes plazmidot tartalmazó élesztősejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy élesztősejtet a 3-9. igénypontok bármelyike szerinti vektorral transzformálunk. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)
12. 12. Eljárás egy kívánt fehérje vagy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 11.igénypont szerinti eljárással előállított élesztősejteket fermentációnak vetünk alá, és a termelt fehérjét vagy polipeptidet elkülönítjük. (Elsőbbség: 1987. 04. 09.)