JP2002534054A

JP2002534054A - 改良したイーストポリペプチドを製造するための発現ベクター

Info

Publication number: JP2002534054A
Application number: JP2000510878A
Authority: JP
Inventors: シュライヤートーマス; フェーゲリライナー
Original assignee: ペンタファルムアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1997-09-05
Publication date: 2002-10-15
Also published as: PL339076A1; WO1999013093A1; BR9714828A; HUP0003541A3; US6451559B1; CA2301909A1; KR20010023688A; SK1662000A3; US20030049785A1; IL134446A0; HUP0003541A2; AU4620797A; AU748759B2; EP1009836A1

Abstract

(57)【要約】ポリペプチドをコードする配列、および該ポリペプチドをイーストのみで発現させるための他の配列を含み、該他の配列が非−イースト配列を有さない、イースト中で該ポリペプチドを製造するための新規ベクター、そのようなベクターを含むイースト株、そのような新規発現ベクターの製造方法、そのような新規ベクターで形質転換したイースト株の製造方法およびそのような形質転換イースト株の発酵から成るポリペプチドの製造方法を提供する。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、イースト中でポリペプチドを製造するための新規発現ベクター、こ
のようなベクターで形質転換したイースト株、該ベクターの製造方法、該イース
ト株および該ポリペプチドに関する。

【０００２】イースト中の発現に関する遺伝子操作技術において、特定のポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列とイーストプロモーターのようなイースト中の該発現
に必要とされる配列とを組み合わせたシャトルベクターを慣用する。このような
シャトルベクターはバクテリア、一般的にたとえば大腸菌、またはその他の微生
物中での発現を促す配列をも含有する。こういった付加的な非−イースト配列は
、ベクター構築に関してのみ有用である。しかし、イーストでの発現に関しては
不要物である。実際、これらの不要なヌクレオチドも二本鎖にならなければなら
ないので、イーストにおけるポリペプチドの効率的発現の妨害や有機体の複製の
遅延が起こり、これはエネルギーの浪費である。

【０００３】イーストのサッカロミセスセレビシエは、その熟知された遺伝子システム、速
やかな増殖および操作上の技術利点から、同種タンパクおよび異種タンパクのい
ずれを製造するにも適した微生物として一般的に使用される。さらに、クローン
化した遺伝子を導入するための様々なＤＮＡ形質転換システムが開発されている
ことや、それらが安価でかつ単純な発酵条件で安全に大量生産できることは、こ
の有機体を大規模工業利用する際に特に有利にしている。

【０００４】多くのイーストポリペプチドは従来技術で公知である。特に興味深いものは、
スーパーオキシドジスムターゼである。イーストのサッカロミセスセレビシエは
銅／亜鉛含有型（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ）およびマンガン含有型（ＭｎＳＯＤ）の２
種類のスーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ１.１５.１１）を有する。前者（Ｃ
ｕ／ＺｎＳＯＤ）が細胞質に局在するのに対して、マンガン含有型酵素はミトコ
ンドリアのマトリクスに限定されて存在する。この酵素は、正常な代謝中間物と
して細胞中に発生する有毒なフリーラジカルに対するin vivoでの保護機能を提
供すると考えられている（Bilinski, T. et al. Biochem. Biophys. Res. Commu n. 130: 533〜539 (1985) , Van Loon A.P.G.M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 83: 3820〜3824 (1986) , Lee F.J. et al. J. Free Rad. Biol. Med. 1: 319〜325(1985), Galiazzo F. et al. Biochim. Biophys. Acta 965: 46〜51(19 88)）。そこで、ヒトの潜在的な損傷、特に細胞のエージングおよびセネッセン
スが原因となる損傷の予防または治療のための使用が期待されている（Rosen D. R. et al. Nature 362, 59〜62 (1993) , McCord J. M. および Fridovich I. J . Biochem 244: 6049〜6055(1969), McCord J. M. et al. Proc. Natl. Acad. S ci. USA 68: 1024〜1027 (1971) , McCord J. M. N. Engl. J. Med. 312: 159〜
163 (1985)）。

【０００５】イーストサッカロミセスセレビシエのＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子はクローン化お
よびシークエンスされており（Bermingham-MaDonogh O. et al. Proc. Natl. A cad. Sci. USA 85 : 4789〜4793 (1988) ）酵素の構造および作用機序も明確に
特徴付けられている（Djinovic K. et al. J. Mol. Biol. 225 : 791〜809 (199 2), O'Neill P. et al. Biochem. J. 251 : 41〜46(1988)）。Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ
は、殆ど全ての好気性有機体および多くの嫌気性有機体の細胞質中に豊富に存在
する金属結合酵素であり、その活性は、スーパーオキシドアニオンの二原子酸素
および過酸化水素への相互変換を触媒する。

【０００６】本発明の課題は、ポリペプチドをコードする発現ベクターで形質転換したイー
ストの発酵過程において、該ポリペプチドの収量を改良することである。別の課
題は、これまでに使用されてきた方法と比較して、より多くの所望ポリペプチド
を有するイーストを発現できる新規ベクターを提供することである。更なる課題
は、このようなベクターで形質転換され、野生型よりも優れており、或いはシャ
トルベクターで形質転換した新規イーストである。

【０００７】本発明は、発現ベクターの他に、野生株あるいはシャトルベクターで形質転換
した株よりも多量のイーストまたは非−イーストポリペプチド、たとえばＣｕ／
Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼのような酵素を生産する、該ベクターで形質
転換したイースト株、特にサッカロミセスセレビシエを提供する。このような発
現ベクター、イースト株および内因性イーストポリペプチドの製造方法を開示す
る。詳細な説明および本発明の具体的な実施態様を例証した図面を考察すれば、
本発明の多くの特徴および利点は当業者に明きらかな事項である。

【０００８】本発明において、以下のプライマーＤＮＡ配列を使用し、その構成を配列証明
リスト（Sequence Identification Listing )に正確に示す（プライマーの塩基
対領域はＥＭＢＬベクター；ジーンバンク寄託番号ＪＯ３２７９から獲得した）
。

【０００９】ＳＥＱＩＤＮＯ１：ＳＯＤ−３外来プライマー、上流域８１〜１０２ｂｐＳＥＱＩＤＮＯ２：ＳＯＤ−２外来プライマー、下流域１０１８〜１０３６
ｂｐＳＥＱＩＤＮＯ３：ＳＯＤ−４内因性プライマー、領域９７１〜９９１ｂｐ
。

【００１０】以下は本発明を容易に理解できるようにするための、図面の簡潔な説明である。

【００１１】図１は、イースト株Ｓ２８８Ｃ由来Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子のコード領域を図式
化した図であり、外来プライマーのＳＯＤ３およびＳＯＤ２と内因性プライマー
のＳＯＤ４がＳＯＤ遺伝子座の上流域および下流域に位置するように設計されて
いる。

【００１２】図２は、新規分子プラスミド構造ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４を示す図であり、こ
のプラスミドはイーストＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターで制御されたイーストＣｕ
／ＺｎＳＯＤ遺伝子の３７４ｂｐ上流域、コード配列および下流域を有するプラ
スミドｐＥＭＢＬｙｅｘ４である。

【００１３】図３は、最終プラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳｗ／ｏＣｏｌｉの遺伝
子マップであり、イーストＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターで制御され、ＥｃｏＲ１
およびＨｉｎｄＩＩの制限部位で挟まれた範囲にイーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝
子の３７４ｂｐ上流域、コード配列および下流域を有し、イースト配列のみから
成り、イースト中でのみ複製される。

【００１４】第一の実施態様において、本発明はイースト中でペプチドを製造するための新
規発現ベクターに関し、このベクターは該ペプチドをコードする配列、およびイ
ースト中のみで該ペプチドを発現させるために必要であり、どのような非−イー
スト配列も有さない、その他の配列を含有する。

【００１５】発現ベクターとはベクター、特にＤＮＡベクターを意味し、たとえばポリペプ
チドをコードする配列、コード配列といっしょに読みとり枠に存在するプロモー
ター、および場合によってはベクターを効果的に製造または使用するのに必要な
その他の配列、たとえば複製起点、リーダー配列、ターミネーターをおよびベク
ターの選択に必要なポリペプチドをコードする配列を含有するプラスミドを意味
する。このような配列はイーストからのみ由来し、当業者に公知である。

【００１６】該ポリペプチドをコードする配列はイーストまたは非−イースト配列である。
イースト配列とは、たとえばスーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ、チオール特
異的抗酸化剤ＴＳＡ、またはチトクロムｃペルオキシダーゼのような抗酸化酵素
、セレビジン前駆体ＰＲＢ１のようなプロテアーゼ、プロテイナーゼＢインヒビ
ター２のようなプロテイナーゼインヒビター、サイトカインおよびその類似物の
ような酵素機能を有するイーストポリペプチドをコードする配列である。

【００１７】非−イーストポリペプチドをコードする配列は、いかなる生物、特にヒトおよ
び動物に由来する。このようなポリペプチドは医療分野に特に有効であり、ヒト
インスリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インターフェロン、エリス
ロポエチン、角質細胞増殖因子のような増殖因子、トリプターゼのような酵素、
プロテインＣアクチベーター、メタロプロテアーゼ組織インヒビター（ＴＩＭＰ
’ｓ）のような酵素阻害剤、エラスターゼインヒビターおよびその類似物を含む
。このような有益なポリペプチドをコードする配列は当業者に公知である。

【００１８】これらの配列は全てイースト−プロモーターの制御下にある。有用なイースト
プロモーターは当業者に公知であり、たとえばＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターが含
まれる。

【００１９】本発明の最終ベクターは、イースト細胞中でのみ複製できる。どうしても必要
とされる非−イーストポリペプチドをコードする非−イースト配列を除いては、
いかなる非−イースト配列も存在しない。

【００２０】本発明の有利なベクターは、ＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターで制御されたＣｕ／
ＺｎＳＯＤ遺伝子を含むイーストプラスミドであり、特にｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ，
ｗ／ｏＭＣＳ, ｗ／ｏＣｏｌｉと呼ばれるプラスミドである。

【００２１】このプラスミドは、発現ベクターを構築するための出発プラスミドとして使用
でき、ここでＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子はその他のペプチドをコードする配列に置
換される。

【００２２】本発明の別の実施態様において、前記に定義した新規発現ベクターの製造方法
を提供する。本発明の新規発現ベクターの製造方法は、イースト株中にポリペプ
チドを発現できるシャトルベクターからいかなる非ーイースト配列をも削除し、
場合によっては該ポリペプチドをコードする配列が別のポリペプチドをコードす
る配列で置換されることに特徴がある。

【００２３】新規発現ベクターは、ポリペプチド遺伝子を含有し、かつ任意の非−イースト
ＤＮＡ配列を含まないように設計した、イースト組み込みプラスミドＹＩｐ、イ
ースト複製プラスミドＹＲｐ、イースト動原体プラスミドＹＣｐまたはイースト
エピソームプラスミドＹＥｐのような公知のシャトルベクターから慣用の方法で
獲得される。

【００２４】この出発シャトルベクターは、ＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターのようなイースト
プロモーターの制御下に、所望のポリペプチドをコードする配列を予め含有して
いてよい。このようなベクターは、たとえばｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４またはｐ
ＥＭＢＬ−ＳＯＤＡＴＧである。これらのブラスミドを本発明の最終ベクター
を製造するための中間体として使用する。遺伝子の入手が不可能な場合、その遺
伝子を含有することが知られている起源体、たとえばヒトまたは動物または野生
型微生物株から所望のペプチドをコードする遺伝子を単離することから構築を開
始する。この遺伝子を合成プライマーを使用した公知のＰＣＲ法で増幅し、ベク
ター、通常はシャトルベクター、に挿入する。中間ベクターから全ての非−イー
スト配列、たとえばバクテリアの複製起点ＯＲＩ、選択マーカー、糸状菌バクテ
リオファージの複製起点ｆ１、アンピシリン耐性遺伝子およびその類似物のよう
なマルチクローニング部位を含むバクテリアの配列を、慣用の制限酵素を使用し
て取り除く。

【００２５】以下は、使用した方法のさらに詳細な説明である：遺伝子発現には、遺伝子す
なわち相補的メッセンジャーＲＮＡの合成を調節する強力なイーストプロモータ
ーの制御下に所望のポリペプチドをコードしているＤＮＡの組込が欠かせない。
発現に必要なＤＮＡ調節要素は、イーストベクターによって運搬される。

【００２６】これらのベクターは「シャトルベクター」であり、好都合な操作および異なる
中間プラスミドの大規模製造のために、バクテリア大腸菌中だけでなくイースト
株中で増殖させてよい。

【００２７】多くの異なるイースト結合プラスミド（ＹＩｐ）ベクター、イースト複製プラ
スミド（ＹＲｐ）ベクター、イースト動原体プラスミド（ＹＣｐ）ベクターおよ
びイーストエピソームプラスミド（ＹＥｐ）ベクターが開発されている（Rose A . B., Broach J. R. Methods in Enzymology, 185: 234〜279 (1990), Schneide r J. C.,およびGuarente L. Methods in Enzymology, 194: 373〜383(1991) ）
。

【００２８】Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子の発現のために選択されたプラスミドは、８８００塩
基対を有する特異的ＹＥｐ（イーストエピソームプラスミド）シャトルベクター
ｐＥＭＢＬｙｅｘ４である（CesaraniおよびMurray,in Setlow J. K. (ed) Gene tic Engineering: Principle and Methods, Volume 9, Plenum Press, NY 134〜
135(1987) ）。

【００２９】このようなベクターは２ミクロンのイーストエピソーム（小さな二本鎖ＤＮＡ
プラスミドであり、ほとんどのサッカロミセスセレビシエ株の核内に存在する）
を運搬しており、これは高い有糸分裂安定性および自己複製能力を有する（Murr ay J. A. H., Mol. Microbiol., 1: 1〜4(1987), Hartley および Donelson, Na ture, 286: 860〜864(1980), Clark-Walker G.D. および Miklos G.L.G., Eur. J. Biochem., 41: 359〜365(1974), Futcher A. B., and Cos B. S. J., Bacter iol., 157: 283〜290(1984) ）。

【００３０】プラスミドの存続は、２−ミクロンの成分中に含まれるＲＥＰ３遺伝子座(
細胞分裂時のプラスミドの分配に働く）およびＡＲＳ配列（複製起点）の存在に
に依存する。

【００３１】ｐＥＭＢＬｙｅｘ４プラスミドは選択マーカーであるＬＥＵ２およびＵＲＡ３
を運搬しており、いずれも最初の形質転換イースト細胞の選択に極めて有効であ
り、イースト細胞中へプラスミドを維持するために継続的にプレッシャーをかけ
る（Alani E.et at., Genetics., 116: 541(1987), Gritz L. およびDavies J., Gene, 25: 179 (1983), Kaster K. R. et al., Curr. Genet., 8: 353 (1984), Rine J. et al., Proc. Natl. Acod. Sci., USA, 80: 6750(1983)）。

【００３２】しかし、通常、このようなプラスミドは正の選択が為されない場合でさえ良好
に維持される。そのような状況において、細胞は１世代あたり約４％の割合でプ
ラスミドを喪失することもある。ｐＥＭＢＬｙｅｘは、２−ミクロンベクターの
特異的クラスの一部を非常に高いコピー数で形成する（細胞あたり１００〜２０
０）。

【００３３】また、プラスミドを増殖させるために２−ミクロンエピソームを欠いたイース
ト株（cir^。）を使用する。このような株におけるｐＥＭＢＬｙｅｘ４の安定性は
、継続的な選択プレッシャーのない場合でさえも、かなり高いことが知られてい
る。

【００３４】ｐＥＭＢＬｙｅｘ４プラスミドは、全イーストの発現ハイブリッドカセットＵ
ＡＳＧＡＬ／ＣＹＣを含有する。プロモーターカセットは、下流遺伝子の高レベ
ルな転写および発現の制御の両方を担う上流活性部位（ＵＡＳ配列）およびプロ
モーター領域（ＴＡＴＡボックス）、遺伝子挿入のためのマルチクローニング部
位（ＭＣＳ）および末端領域を有する（Guarente L. et al., Proc. Natl. Sci, USA, 79: 7410〜7414(1982)）。ハイブリッドカセットＵＡＳｇａｌ／ＣＹＣは以下の領域の５’から３’までを運搬する：ＧＡＬ４産物との結合領域を含む、イーストＧＡＬ４およびＧＡＬ１０遺伝子
間に存在する上流活性化配列由来の３６５塩基対断片（Ｓａｕ３Ａ−ＸｈｏＩ）
；ＴＡＴＡボックスおよびｍＲＮＡ開始部位を運搬しＡＴＧ領域を運搬しない、
イースト遺伝子ＣＹＣ１のプロモーターを含有する２５０塩基対領域（ＸｈｏＩ
−ＳｓｔＩ）；特殊な制限酵素部位を含む９５塩基対のポリリンカー（ＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）；２−ミクロンＦＬＰ遺伝子由来のポリアデニル化および転写終了シグナルを運
搬する２５０塩基対領域（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｎａＢＩフラグメント内）。

【００３５】発現系はＧＡＬ４およびＧＡＬ８０遺伝子産物により調節される。ＧＡＬ４タ
ンパクは、ＵＡＳｇａｌ配列と結合する転写活性因子である。ＧＡＬ４タンパク
の活性は、ＧＡＬ８０タンパクがそのカルボキシ末端領域へ結合することにより
阻害される。この系は、ＧＡＬ４タンパクのＵＡＳｇａｌへの結合を阻害するグ
ルコースにより抑制され、ＧＡＬ８０タンパクのＧＡＬ４タンパクからの解離を
引き起こすガラクトースにより誘導される。

【００３６】本発明の更なる実施態様において、本発明の発現ベクターを用いて形質転換さ
せた新規イースト株を提供する。

【００３７】イーストの種類は、イーストまたは非−イーストのポリペプチドの発現に有用
な、どのような公知種であってよく、たとえばサッカロミセスセレビシエまたは
サッカロミセスオシデンタリス（Saccharomyces occidentalis)、または非−サ
ッカロミセスイースト種、たとえばハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymor pha)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、シュワニオミセスオシデンタリス( Schwanniomyces occidentalis)、およびピキアスチピチス(Pichia stipitis)が
ある。

【００３８】有利な新規イースト株は、細胞内区画への相対相同遺伝子の挿入をしてＣｕ／
ＺｎＳＯＤ酵素合成能を向上させた、たとえばサッカロミセスセレビシエである
。

【００３９】本発明の有利な中間イースト株は、プラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４また
はプラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤＡＴＧで形質転換されたＧＲＦ１８であり、こ
れは製造、単離および特徴付けがされている。

【００４０】本発明の課題は、外来イーストポリペプチドをコードし、非−イースト配列を
含まない発現ベクターで形質転換し、前記の新規ベクターで形質転換されたイー
スト株として特徴づけられた該イースト株中に該イーストポリペプチドを過剰発
現できる、イースト株を生産する方法を提供することである。

【００４１】形質転換を、R.H. Schiestl等により改良されたIto等のＬｉＣｌ法（（1989）
Current Genetics. 16, 339〜346）、またはHinnen等による方法（(1987), Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929〜1933）のような従来技術に慣用される方法
で実施する。

【００４２】本発明の更なる実施態様において、本発明の発現ベクターで形質転換したイー
スト株の発酵から成る、イースト株でのポリペプチドの製造方法を提供する。

【００４３】発酵を、増殖期のグルコース供給を制御した供給−バッチ法（fed-batch meth od)およびAlberghina, Lilia等（1991）,Biotech. and Appl. Biochem. 14, 82
〜92による、増殖期中期でのガラクトース添加による発現の誘導のような従来技
術に慣用される方法で実施する。

【００４４】以下の実施例は本発明をより詳細に説明するものであり、従来のサッカロミセ
スセレビシエ株由来のイースト遺伝子、たとえばＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子、の単
離および特徴付けを行う方法、強力なイーストプロモーターの制御下にイースト
株中でイースト酵素遺伝子を発現する方法、ならびに高レベルの酵素、たとえば
ＳＯＤタンパク、を製造できるイースト株の開発および特徴付けに関して記載し
ている。

【００４５】略語前記および後記にわたり、以下のような略語を使用する：ＡＲＳ自律複製配列ＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸ＥＭＢＬヨーロッパ分子生物実験施設ＬＢルリアベルタニ培地（Luria Bertani Medium) ＭＣＳマルチクローニング部位ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応ＰＩＵピロガロール阻害単位ＲＥＰレプリコン（ＤＮＡ複製の起点として細胞中に存在する短いＤ
ＮＡ配列）ＳＤＳドデシル硫酸ナトリウムＳＯＤスーパーオキシドジスムターゼＴＢＥトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡバッファーＴＥトリス−ＥＤＴＡバッファーｗ／ｏＣｏｌｉ大腸菌（Escherichia coli) 配列なしｗ／ｏＭＣＳマルチクローニング部位なしＹＣｐイースト動原体プラスミドＹＥｐイーストエピソームプラスミドＹＥＰＤイーストエキストラクト−ペプトン−デキストロース培地ＹＩｐイースト形成プラスミドＹｒｐイースト複製プラスミド例１：イーストゲノムＤＮＡの抽出および精製。

【００４６】この例は、イーストのＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を単離するための遺伝子源とし
て使用するイーストのゲノムＤＮＡの抽出と精製とに関する。

【００４７】Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を単離するためのＤＮＡ源は、どのようなイーストの
野生型株でも構わない。この特殊例においては、ＤＮＡをサッカロミセスセレビ
シエ株Ｓ２８８Ｃの野生型ｇａｌ２およびＷ３０９株の野生型から抽出した。

【００４８】同様のＤＮＡ抽出は、ＤＮＡ源としてＷ３０３のような別の野生型イースト種
を使用しても実施できる。

【００４９】一倍体株Ｓ２８８Ｃは、世界中の殆どの分子生物実験施設において、昨今、イ
ースト遺伝子の単離や遺伝子研究ならびに生化学研究に使用される典型的なイー
スト株である（Mortimer R.K.およびJohnson J.R., Genetics, 113: 13(1986))
。Ｗ３０９株は代替可能なＤＮＡ源とみなされる。両方の株がそのゲノム中に野
生型Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子のコピーを運搬していることは公知である。これら
の株は、ミラノ大学生理学および遺伝子生化学部より提供された。

【００５０】イーストの全ゲノムＤＮＡを抽出するために使用するプロトコールは、以下の
ように、Cryer, Ecclesial および Marmur, Methods Cell Biology, 12:39〜44( 1975)を改変した方法に従って実施される：ＹＥＰＤ培地の入ったペトリ皿から採取したイースト細胞をＹＥＰＤの完全培
地（バクト−イーストエキストラクト１％、バクト−ペプトン２％、デキストロ
ース２％）２００ｍｌ中に摂取し、指数増殖期の終了（約８×１０7細胞／ｍｌ
）まで、１ｌのフラスコ中で振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。

【００５１】合計８×１０8個の細胞をＤＮＡ抽出に使用した。細胞１０ｍｌをポリプロピ
レンチューブに入れてスピンし、濃縮し、沈澱を１.５ｍｌのエッペンドルフチ
ューブに移動した。細胞溶解バッファー（lysis buffer、ＮａＣｌ０.１５Ｍ
、ＥＤＴＡ０.１ＭｐＨ８、ＳＤＳ１％）３００μｌとガラスマイクロビ
ーズ（直径０.５ｍｍ）３００μｌとをエッペンドルフチューブに添加した。細
胞を１分間の小休止をはさんで氷上で５回ボルテックスにかけた。

【００５２】細胞懸濁液をフェノール−クロロホルム−ＴＥ溶液６００μｌとともにボルテ
ックスにかけて均質化し、２分間スピンした。上部水相を新しいエッペンドルフ
チューブへ移動し、クロロホルム−イソアミル−アルコール溶液（２４：１）６
００μｌを添加し混合した。

【００５３】新しいエッペンドルフチューブに移動させた上部相へ終濃度が１ｍｇ／ｍｌと
なるようにＲＮａｓｅを加え、３７℃で３０分インキュベートした。エタノール
沈澱後に、沈殿物をＴＥバッファー（Ｔｒｉｓ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、
ｐＨ８）に再懸濁した。

【００５４】この方法で実施した実験準備により約１ｍｇ／ｍｌ濃度のイーストゲノムＤＮ
Ａ約１００ｍｇが獲得され、これは複数の実験を実施するのに十分な量である。

【００５５】例２：Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬する染色体領域の単離。

【００５６】Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬する染色体領域を単離するために、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した。

【００５７】Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子は、サッカロミセスセレビシエＸ染色体の右腕におけ
るcyc1-rad6-SUP4-cdc8クラスターおよびcdc11領域で挟まれた場所に位置する（
Chang et al., J. Biol. Chem. 266: 4417〜4424(1991))。コード配列中にはイ
ントロンが存在しないので、ＰＣＲ法によりゲノムＤＮＡから直接全翻訳領域を
単離できる。さらに、遺伝子の５’上流域および３’下級域は公知である。

【００５８】ＰＣＲ反応を実施するには、上流域と下流域との間にＳＯＤ遺伝子を挟み込ん
だ対の合成オリゴヌクレオチド（プライマー）が必要である。

【００５９】ＰＣＲのためのプライマーは、Bermingham-McDonogh O, Garalla E, Valentin e J. PNAS. 85, p. 4789 (1988) (EMBL /ジーンバンク、寄託番号Ｊ０３２７９
）に掲載されている、１０３７塩基から成るＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子配列領域を
包含するＯＬＩＧＯプライマーアナリシスソフトウェア、バージョン４.０（Nat ional Bioscience Inc. Plymouth）を使用して設計した。

【００６０】プライマーを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３９２核酸合成装置（
Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA）で合成し、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５
ＤＮＡｇｒａｄｅＮＡＰ−２５カラム（Pharmacia P-L biochemicals Inc; Milw aukee, Wisconsin）を用いてゲル濾過により精製した。

【００６１】イーストゲノムからのＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子の単離のチャンス増大を意図す
る一般的な戦略として、いわゆる“セミ−ネストＰＣＲ（semi-nested PCR)”を
利用した。この戦略では、３種類の異なるプライマーを要する２工程プロトロー
ルを適用する（図１）。

【００６２】最初の工程では、２種類のプライマー（一つは上流プライマーであり、もう一
つは下流プライマーである。例：ＳＯＤ−３とＳＯＤ−２）を使用し、ゲノムの
より広い領域を増幅させる。この工程に続く２回目の増幅では、新規の内因性プ
ライマー（ＳＯＤ−４）と前記の２種類のプライマーの片方（ＳＯＤ−３）とを
使用し、最終的にＳＯＤ遺伝が単離回収できる。

【００６３】ＰＣＲ増幅の第一ラウンドは、以下のプライマーを使用して実施した：ＳＯＤ−３（上流プライマー、ＥＭＢＬ／ジーンバンクに寄託番号Ｊ０３２７９
で登録された配列の８１〜１０２領域）：ＳＥＱＩＤＮｏ１：

【００６４】

【化１】

【００６５】（２２マー、ＴＭ＝６６℃）ＳＯＤ−２（下流プライマー、ＥＭＢＬ／ジーンバンクに寄託番号Ｊ０３２７９
で登録された配列の１０１８〜１０３６領域）ＳＥＱＩＤＮｏ２：

【００６６】

【化２】

【００６７】（２８マー、ＴＭ＝６４℃）ＳＯＤ−２は、１９塩基長さの一致した領域（ＴＭ＝６４℃）とＢａｍＨＩ制
限部位を含む５’側の不一致な領域とを有する。

【００６８】反応容積１００ｍｌ中の５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐ
Ｈ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ2、各デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）５００ｍＭ、各プライマー０.５ｍＭ、ゲノムＤＮＡ
５０または１００ｎｇ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Corp. ）２.５単位でＤＮＡ増幅を実施した。それぞれの複製過程で適用した時間およ
び温度は以下の通りであった：変性を９４℃で１分間、アニーリングを６３℃で
１.５分間、伸長を２分間。

【００６９】ＰＣＲ反応により９６５塩基対（ｂｐ）の長さを有するＤＮＡ断片が生成し、
これはアガロース電気泳動により視覚化され、ここにはＳＯＤ遺伝子を全てコー
ドする４６２ｂｐの配列、３３１ｂｐの上流配列および１７２ｂｐの下流配列が
含まれる。

【００７０】第２ラウンド（セミ−ネストＰＣＲ）はプライマーＳＯＤ−３と、ＥＭＢＬ／
ジーンバンクに寄託番号Ｊ０３２７９で登録された配列の９７１〜９９１領域を
包含し、以下のような配列を有する、第３の内因性プライマーＳＯＤ−４を使用
して実施する：ＳＥＱＩＤＮｏ３：

【００７１】

【化３】

【００７２】プライマーＳＯＤ−４は、２１塩基長さの一致した領域（ＴＭ＝６０℃）とＳ
ａｌＩ制限部位を含む５’側の不一致な領域とを有する。

【００７３】セミ−ネストＰＣＲをアニーリング温度が６０℃ではない上記条件で実施する
と、ＳＯＤ遺伝子を全てコードする４６２ｂｐの配列、３３１ｂｐの上流配列お
よび１２７ｂｐの下流配列を含む、９２０塩基対（ｂｐ）から成る短めのＤＮＡ
断片を生じた。

【００７４】例３：Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子のプラスミドベクターｐＣＲＩＩへのサブクロ
ーニングこの実施例は、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子のプラスミドベクターｐＣＲＩＩへの
サブクローニングに関する。

【００７５】増幅に続き、反応生成物を１.２％の低融点アガロースゲルにのせ、電気泳動
装置（MiniSubgel DNA cell, BIO-RAD Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA
）を起動した。目的のＤＮＡのバンドを、標準的な方法でアガロースゲルから単
離し、フェノール抽出により精製した（Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniat is T. Molecular Cloning. A namual laboratory, Cold Spring Harbor Laborat ory, New York. 1989）。

【００７６】精製したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼという酵素を使用して１２℃で１６
時間かけて連結させることにより、ＴＡクローニングシステム（Invitrogen Cro p. San Diego, CA）を用いて、３９３２ｂｐ長さから成る直線化プラスミドｐＣ
ＲＩＩのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）へと挿入した。

【００７７】ｐＣＲＩＩベクターは、単一の３’デオキシチミジレートの突出が直接ＰＣＲ
産物と連結できるクローニングベクターであり、Ｅ／Ｃｏｌｉ細胞中での選択の
ためにアンピシリンおよびカナマイシンの両方の耐性遺伝子を有する。

【００７８】この構築物（すなわちプラスミドｐＣＲＩＩ＋挿入物）を次にＥ．Ｃｏｌｉ細
胞ＨＢ１０１中に移入し、複製した。

【００７９】最後に、BirnboimとDolyのアルカリ性細胞溶解法（alkaline lysis method）
（Birnboim H. C., J. Doly. 1979 Nucleic Acids Resarch. 7:1513）によりバ
クテリア細胞からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄＡＸ−１０
０カートリッジ（Macherey-Nagel GmbH, Duren, Germany）により精製した。

【００８０】例４：プラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４の構築ＳＯＤ遺伝子、下流域および修飾上流域を含む予め単離した遺伝子座をクロー
ン化したベクターとしてｐＥＭＢＬｙｅｘ４プラスミドを使用し、構築物を製造
した。

【００８１】この構築物はｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４と呼ばれ、図２に示されている。これ
は、サブクローン化断片にＳＯＤ遺伝子（４６２ｂｐ）および３７４ｂｐの上流
域をコードした領域を有する構築物である。

【００８２】このような構築を実施するために、予めｐＣＲＩＩプラスミド中でサブクロー
ン化したＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬する断片を、制限酵素ＢａｍＨＩおよび
ＳａｌＩによって直接切り出した。

【００８３】前記の酵素切断でＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ９６３ｂｐ断片が生じ、この断片をゲ
ル電気泳動により精製してベクターｐＥＭＢＬｙｅｘ４のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ
部位へとサブクローン化した。

【００８４】例５：ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４で形質転換したイースト株Ｘ４００４および
ＧＲＦ１８の製造プラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４からのイーストＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ遺伝
子の発現を、イースト中に同種または異種遺伝子を発現させる際に典型的に慣用
されるサッカロマイセスセレビシエの異なる２つの株への挿入により調査した（
Martegani et al., Appl. Microbiol. Biotechnology. 37: 604〜608(1992), Al berghina L. et al., Biotechnology and Applied Biochemistry. 14: 82〜92(1 991), Pradyumna K. et al., Biotechnology and Bioeng. 40: 235〜246(1992), Yong Soo Park et al., Biotechnology and Bioeng. 41: 854〜861(1993), Sco tt. et al., Biotechnology and Bioeng. 41: 801〜810(1993), Jih-Han Hsieh et al., Biotechnology and Bioeng.32:334〜340(1988)）。

【００８５】以下の一倍体株を使用した: −Ｘ４００４、遺伝子型：ＭＡＴａ／ｌｙｓ５／ｕｒａ３／ｍｅｔ２／ｔｒｐ１
および、 −ＧＲＦ１８、遺伝子型：ＭＡＴａ／ｌｅｕ２〜３、１１２／Ｈｉｓ３〜１１、
１５。

【００８６】ｌｅｕ２−ＧＲＦ１８株にはロイシン要求性を（ＧＲＦ１８株はｌｅｕ２〜３
、１１２に２つのフレームシフト変異を起こしており、これが元に戻ることはほ
とんどない）、ｕｒａ３−ｘ４００４株にはウラシル要求性をそれぞれを補足し
たプラスミドベクターｐＥＭＢＬｙｅｘ４上にマーカー（ＬＥＵ２−ｄおよびＵ
ＲＡ３）が存在するので、これらの株は選択培地または半合成培地中でかなり顕
著に大量に発酵しうる。

【００８７】実際、プラスミドの挿入により、新規株はこれらの要求特性を弱める。新規プ
ラスミドを有するＧＲＦ１８はヒスチジン要求性のままであるのに対し、新規プ
ラスミドを有するＸ４００４はメチオニンおよびトリプトファン要求性のままで
ある。

【００８８】構築プラスミドによるイーストの形質転換は以下のように実施した。

【００８９】形質転換前： −イースト株（Ｘ４００４またはＧＲＦ１８）を“ペトリ皿”上で線状に培養す
る −プレートからループを使用して掬い取った少量の細胞を滅菌蒸留水１０ｍｌ中
に溶解する −５分間細胞破砕し、コールターカウンターで計数する（Ｏ.Ｄ.６００で０.１
未満） −ＹＥＰＤ培地（１ｌフラスコ）２００ｍｌに合計約４×１０7個の細胞を接種
する（２〜３×１０5細胞／ｍｌ、Ｏ.Ｄ.６００で約０.６） −ゆっくりと振盪しながら約１×１０7細胞／ｍｌになるまで３０℃で１６時間
増殖させる（約６世代）（Ｏ.Ｄ.６００＝２〜３）。

【００９０】形質転換前に細胞を通常通りに増殖させるためのＹＥＰＤ完全培地は以下のよ
うにして作る：イーストエキストラクト１％、ペプトン２％、グルコース
２％、バクトアガー（ペトリ皿用）２％、および蒸留水。全ての成分を１２０℃
で２０分間、オートクレーブにかける。

【００９１】形質転換を以下のように実施した：総数２×１０8個の細胞を処理に使用し（
プラスミドＤＮＡ１ｍｇにより株を形質転換させる）、すなわち５回の処理には
総数１×１０9個の細胞を要する（１×１０7細胞／ｍｌを含む細胞培養液１００
ｍｌ）。形質転換を、SchiestlおよびGietzにより改変されたItoの塩化リチウム
法（R.H. Schiestl, R.D. Gietz, High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier, (1989), Cu rrent Genetics. 16: 339〜346）により実施した。形質転換体をロイシンを欠如
させた（プラスミド含有ＧＲＦ１８細胞を選択するため）またはウラシルを欠如
させた（プラスミド含有Ｘ４００４細胞を選択するため）アガープレート（合成
最少培地）にのせ、３０℃で増殖させる。シングルコロニーを新しい選択培地プ
レートに線状にまいて４℃で保存するか、または１５％のグリセロール中でー８
０℃で保存する。

【００９２】全ての形質転換は、以下のスキームに従って２回実施した：プラスミドＤＮＡ（１ｍｇ）イースト株（２×１０8細胞）ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４Ｘ４００４ｐＥＭＢＬｙｅｘ４Ｘ４００４（ネガティブコントロール）ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４ＧＲＦ１８ｐＥＭＢＬｙｅｘ４ＧＲＦ１８（ネガティブコントロール）ＧＲＦ１８株を、プラスミド産生株の選択のためにアミノ酸のロイシンを欠如
させた合成培地上で増殖させ、Ｘ４００４の場合には、この株をウラシルを欠如
させた合成培地上で増殖させる。いずれの場合も、グルコースを含有させた最少
培地から炭素源としてガラクトースを含有させた培地へと、以下のように移行す
ることによって発現を誘導した：プレートに接種してから形質転換体を穏やかに
振盪しながらグルコース２％を含有する合成最少培地（形質転換ＧＲＦ１８では
ロイシン欠如であり、また、形質転換Ｘ４００４ではウラシル欠如である）５０
ｍｌ中で、３０℃で１２〜１４時間かけて増殖させ、約２.５〜３×１０7細胞／
ｍｌまで曝気する（Ｏ.Ｄ.６００＝４〜５）。ガラクトース２％を含有する選択
合成培地５０ｍｌに５×１０7細胞（前培養液２ｍｌ）を接種し、約１×１０6細
胞／ｍｌとする。増殖は穏やかな振盪下に３０℃で約１７〜１８時間実施し（約
７世代）、約２〜３×１０7細胞／ｍｌまで曝気する（Ｏ.Ｄ.６００＝４〜５）
。２×１０8細胞（培養液約１０ｍｌ）を取分けて、タンパク抽出のために使用
する。

【００９３】形質転換細胞を増殖させるための培地を以下のようにして作った：合成選択培地（Ｘ４００４形質転換細胞の増殖用）：炭素源（グルコースまた
はガラクトース）２％、バクトアガー（ペトリ皿用）２％、Ｌ−リシンＨＣ
ｌ５０ｍｇ／ｌ、Ｌ−メチオニン５０ｍｇ／ｌ、および蒸留水。成分を１２
０℃で２０分間オートクレーブにかけ、アミノ酸不含であるディフコのイースト
窒素ベース（ＹＮＢ）（濾過した濃縮保存溶液１０Ｘ（６７ｇ／ｌ））およびＬ
−トリプトファン５０ｍｇ／ｍｌ（濾過した濃縮保存溶液）を添加する。

【００９４】合成選択培地（ＧＲＦ１８形質転換細胞の増殖用）：炭素源（グルコースまた
はガラクトース）２％、バクトアガー（ペトリ皿用）２％、Ｌ−ヒスチジン５０
ｍｇ／ｌ、蒸留水。成分を１２０℃で２０分オートクレーブにかけ、アミノ酸不
含のディフコイースト窒素ベース（ＹＮＢ）（濾過した濃縮保存溶液１０Ｘ（６
７ｇ／ｌ））を添加する。

【００９５】微生物株が有する、指定されたペプチドの産生能力をいくつかの研究手段によ
り試験する。

【００９６】最初に単純なペプチド鎖の生産能力を評価することが望ましい。実際、答えを
要する第一の問題は、新規細胞の発現機構が、所望の化学的本質を生合成する際
に効果的に働くかどうかである。よって、細胞抽出液中のポリペプチドのような
化学的本質が大量に存在するかを試験するために、まず総タンパク抽出物を、ポ
リペプチド鎖の分子量に応じて分離するＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲルに流
す。さらに、ＳＯＤ含有発現プラスミドを有さない“同遺伝子型”イースト株（
ネガティブコントロール参照）の問題を処理するために、プラスミド産生株から
得られる細胞抽出液の電気泳動プロファイルと通常株から得られる細胞抽出液と
を比較する。

【００９７】ＳＯＤの分子量（ＳＯＤポリペプチド鎖は分子量１５７００ダルトンに対応す
る１５４個のアミノ酸から成る）は公知であるので、ＳＯＤの前記の分子量に対
応したゲル領域中にバンドが存在することを２つのプロファイルで比較した。非
特異的なクーマシーブルー染色により視覚化した。

【００９８】クローンの生産性を評価するのに使用する分析技術は、以下に示すようなＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動で示される。

【００９９】ａ）タンパクイースト抽出液：イーストからの総タンパク抽出液の製造に使用するプロトコールは、Jazwinsk iの方法（S.Michail Jazwinski, 1990, Method in Enzymology, vol. 182 p. 15 4)を部分的に改変したもので、以下の通りである： −遠心（４０００ｒｐｍ、４℃、５分）により２×１０8細胞を濃縮する（１５
ｍｌファルコンチューブ） −４℃の滅菌水で沈澱を洗浄する（エッペンドルフバイアルへ移行） −１×ＰＢＳバッファー４００μｌ中に沈澱物を再懸濁する −ガラスマイクロビーズ（予め−２０℃とする）４００μｌを添加する −ペプスタチン（プロテアーゼインヒビター）４μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加す
る −３分間ボルテックスにかける（氷上で２回） −タンパクアッセー用に上清１０μｌを−２０℃で保存するクーマシーブルーでゲルを染色すると、サンプル（プラスミドｐＥＭＢＬｙｅ
ｘ４で形質転換したＧＲＦ１８細胞）の泳動バンドが同一のゲルに負荷したＣｕ
／ＺｎＳＯＤイーストタンパクの分子量に対応することが明らかになる。

【０１００】このようなバンドは、ネガティブサンプルコントロール（ＳＯＤ遺伝子を有さ
ないプラスミドｐＥＭＢＬｙｅｘ４で形質転換したＧＲＦ１８細胞およびＳＯＤ
遺伝子を有さないプラスミドｐＥＭＢＬｙｅｘ４で形質転換したＸ４００４細胞
）では観察されなかった。それぞれのサンプルに対してほぼ同量のタンパク抽出
物（約１ｍｇ）をポリアクリルアミドゲルに流した。

【０１０１】ｂ）ＰＩＵ−試験によるＳＯＤ活性の測定適切な活性測定により、同種または異種酵素の発現を測定できる。よって、２
つの分子構築物によるイースト形質転換細胞の発現の評価は、培養誘導後のＳＯ
Ｄ活性の定量により実施した。培養体の増殖をカウンター（コールターカウンタ
ーＺＢＩ）での細胞数の計数により（Lotti et al., Appl. Microbiol. Biotech nol. 28: 160〜165（1988））または６００ｎｍでの吸収の測定により管理した
。タンパク抽出物は、“タンパクイースト抽出”の記載に従って製造した。

【０１０２】総イースト細胞抽出物中のＣｕ／ＺｎＳＯＤの存在はMarklund and Marklund
の方法で検出し、これはピロガロールの自動酸化を阻害する酵素の活性に基づい
た方法である（Marklund S.およびMarklund G., Eur. J. Biochem. 47: 469〜47 4（1974））。

【０１０３】発現に関する実験は、完全合成培地中でのバッチ発酵として実施した：銅（０.００２５ｇ／ｌ）および亜鉛（０.０５ｇ／ｌ）含有または不含の完全
合成培地（Sherman F., Methods in Enzymology. vol 194, Academic Press）を
以下のようにして調整する（ｇ／ｌ）：バクトイースト窒素ベースｗ／ｏアミノ
酸（Difco Laboratories, Detroit, MI)、６.７；炭素源（グルコースまたはガ
ラクトース）、２０；アデニンスルフェート、５０；ウラシル、５０；Ｌ−トリ
プトファン、５０；Ｌ−ヒスチジン、５０；Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、５０；Ｌ
−メチオニン、５０；Ｌ−チロシン、５０；Ｌ−イソロイシン、５０；Ｌ−リシ
ン−ＨＣｌ、５０；Ｌ−フェニルアラニン、５０；Ｌ−グルタミン酸、５０；Ｌ
−アスパラギン酸、５０；Ｌ−バリン、５０；Ｌ−トレオニン、５０；Ｌ−セリ
ン、５０。

【０１０４】表１は３つの実験におけるＭＣＳおよびバクテリア配列の欠失前のＳＯＤ遺伝
子の発現に関するＳＯＤ活性データ（ＧＲＦ１８株）および平均値を示している
：

【０１０５】

【表１】

【０１０６】平均発現値は、ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４では３０１ＰＩＵ／ｍｌであり、ｐ
ＥＭＢＬｙｅｘ４（挿入部なし）では１３ＰＩＵ／ｍｌである。これらの値は標
的遺伝子の特異的発現を判断するのに重要である。この値は標準化実験室バッチ
発酵において規定されている。結果は、起源株（プラスミドを含むが挿入部を含
まないＧＲＦ１８）と比較して、発現レベルがして平均２３倍上昇することを示
している。実験室バッチアッセイにおいて、市販のワインイースト株（"Seccofe rm")と比較すると、発現が２２倍に上昇することが観察された。製造方法の経済
性が、新規構築物により著しく増加することが分かる。

【０１０７】例６：ベクターｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４ｗ／ｏＭＣＳの製造例５で実施した実験から、分子構築物ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４を含むイース
ト株ＧＲＦ１８の能力が大変良好であることが結論づけられる。いかなる構築物
も含有しない同一株をコントロールとして使用する。従って、すべての非ーイー
スト配列をも欠失させることにより、分子構築物ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４を最
終発現系の構築に使用する。

【０１０８】 “マルチクローニング部位”の合成配列を、酵素ＳｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉでポリリンカーの両端の２カ所を切断することにより完全に欠失させた。この
操作により分子構築物ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４から全９５塩基の人工配列を排
除し、残された天然部位間に完全なイーストＳＯＤ遺伝子を挿入できる。

【０１０９】プロトコールの詳細：１）ベクターの残りの部分からポリリンカーを切り出すために、クローンｐＥＭ
ＢＬ−ＳＯＤ３７４を酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（New England Biolabs Inc., USA）
およびＳａｃＩ（New England Biolabs Inc., USA)で切断した。酵素ＨｉｄＩＩ
Ｉは、マルチクローニング部位の一方の末端部に位置する特異的部位“Ａ／ＡＧ
ＣＴＴ”を認識し、他方、酵素ＳａｃＩは酵素ＳｓｔＩのアイソシゾマーであり
、マルチクローニング部位のもう一つの末端部に位置する同一の特異的配列“Ｇ
ＡＧＣＴ／Ｃ”を認識する。

【０１１０】この２カ所の切断に続き、ポリリンカーを除いたベクターｐＥＭＢＬの全ての
イーストおよびバクテリア配列を運搬する８７０５塩基のＨｉｎｄＩＩＩーＳａ
ｃＩ断片を電気溶出によりアガロースゲル電気泳動物から単離した。

【０１１１】この８７０５塩基対−断片をフェノール−クロロホルム処理により最終精製し
、エタノール沈殿により濃縮した。

【０１１２】２）８７０５塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片の両末端を、続く操作に適合
した断片末端を形成するために、酵素ポリメラーゼＩ“クレノウフラグメント”
で処理した。この処理ではＨｉｎｄＩＩＩ末端（５’突出末端）を補充し、Ｓａ
ｃＩ末端（３’突出末端）を切断することにより、断片の両末端を平滑にする。

【０１１３】平滑末端断片をフェノール−クロロホルムおよびエタノール沈殿により最終精
製した。

【０１１４】３）イーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬し、クローン化ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ
３７４上に存在するＤＮＡ断片を、それぞれ“Ｇ／ＡＡＴＴＣ”および“Ｇ／Ｔ
ＣＧＡＣ”を認識する酵素ＥｃｏＲＩ（New England Biolabs Inc., USA）およ
びＳａｌＩ（New England biolabs Inc., USA）で切断した。この２カ所の切断
により、３４２ｂｐのイースト上流配列、４６２ｂｐのイーストＣｕ／ＺｎＳＯ
Ｄ全読みとり枠および１１２ｂｐのイースト下流配列を運搬する、９１６ｂｐの
断片を単離できる。いかなる別種バクテリア配列または人工配列をも運搬しない
この９１６ｂｐの断片を、電気溶出によりアガロースゲル電気泳動物から単離し
、フェノールークロロホルム処理およびエタノール沈殿により精製した。

【０１１５】４）精製後、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片をポリメラーゼＩ“クレノウフラグメン
ト”で処理してＲｃｏＲＩおよびｓａｌＩ末端（いずれも５’突出末端）を補充
し、ポリリンカーを予め欠失させた精製ｐＥＭＢＬベクターの末端へのサブクロ
ーン化に適合させた。この平滑末端断片をフェノールークロロホルムおよびエタ
ノール沈殿により再度精製した。

【０１１６】５）イーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を含む平滑末端９１６ｂｐ断片を、酵素Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mnnheim GmbH, Mannheim）で連結させるこ
とにより、平滑末端８７０５ｂｐ断片ーｐＥＭＢＬへと最終的にサブクローン化
した。この連結反応は１６℃で２０時間かけて実施した。

【０１１７】６）連結混合物（平滑末端９１６ｂｐ＋平滑末端８７０５ｂｐ断片）をＥ．Ｃｏ
ｌｉバクテリア細胞（XL1-Blue 株）中へ形質転換させた後、ランダムスクリー
ニングを実施して正しい配列を有するクローンを単離した。多量の形質転換バク
テリアクローンをＬＢ液体培地中で３７℃で一晩増殖させ、クローン由来のＤＮ
Ａプラスミドを“ミニプレップ”法（"Wuzard" ミニプレップＤＮＡ精製システ
ム、Promega Crop., USA）により抽出した。

【０１１８】イーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を含む断片のクローン中での存在および正常
な配位の両方を確認するために、ＰＣＲ増幅ならびにＤＮＡシークエンスを利用
した。

【０１１９】シークエンスおよびアガロースゲル電気泳動により正しく実施されたことが確
認された。

【０１２０】例７：最終ベクターｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳｗ／ｏＣｏｌｉの製造例６で得られたクローン“ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４ｗ／ｏＭＣＳ”は、イー
スト配列（イースト機能的配列およびイーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子）および
バクテリア由来配列のみを運搬する。“ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４ｗ／ｏＭＣＳ
”クローンの非ーイースト部分は、バクテリアである大腸菌のための複製起点、
アンピシリンバクテリア選択マーカーおよび糸状菌バクテリオファージｆ１由来
の複製起点を有する。

【０１２１】この領域は４０００塩基よりも多く包含しており、イースト配列のみを運搬す
る最終ベクターを獲得するためには酵素切断による欠失が必要である。このよう
な操作で得られる最終ベクターはイースト株でのみ複製できる。実際、最終ベク
ターに存在する配列は： −イーストの形質転換細胞を選択するのに有用なＬｅｕ２−ｄイースト選択マー
カー −良好な有糸分裂安定性およびプラスミド複製効率を提供する２−ミクロンイー
ストエピソームの複製起点 −その制御下に高レベルの遺伝子転写を提供するイースト発現ハイブリッドＵＡ
ＳＧＡＬ／ＣＹＣの全システム −酵素Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼを製造するイーストＳＯＤ遺伝
子（上流および下流の機能的イースト配列を伴う）。

【０１２２】ベクター製造のための詳細なプロトコール：１）予めマルチクローニング部位を欠失させたクローン“ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３
７４ｗ／ｏＭＣＳ”を平滑エンドヌクレアーゼＳｔｕＩ（起源ｐＥＭＢＬｙｅｘ
４ベクターの５９４２部位）およびＮｒｕＩ（起源ｐＥＭＢＬｙｅｘ４ベクター
の１７９１部位）で切断した。酵素ＳｔｕＩ（Pharmacia, Uppsala）は特異的平
滑部位“ＡＧＧ／ＣＣＴ”を認識し、酵素ＮｒｕＩ（Pharmacia, Uppsala）は特
異的平滑部位“ＴＣＧ／ＣＧＡ”を認識する。獲得される、全てのバクテリア配
列を運搬する４６８９ｂｐのＳｔｕＩ−ＮｒｕＩ断片をゲル電気泳動によりｐＥ
ＭＢＬベクターの残部から分離した。２カ所切断により、ベクター上の選択マー
カーＵＲＡ３の一部もまた欠失するが、その他のイースト選択マーカーＬＥＵ−
２ｄの機能は完全に保存されており、続く操作におけるクローン選択に有用であ
る。

【０１２３】２）イースト配列およびイーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子のみを含むフラグメン
トｐＥＭＢＬベクターを電気溶出によりアガロースゲルから単離し、フェノール
ークロロホルムおよびエタノール沈殿により精製した。

【０１２４】３）精製したｐＥＭＢＬベクターの末端（両末端とも平滑末端）を酵素Ｔ４ＤＮ
Ａライゲース（Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim）で再連結させ、連結混合
物をＧＲＦ１８イースト株の形質転換のために使用した。

【０１２５】４）欠失プラスミドを含有するＧＲＦ１８細胞の選択のために、ロイシン欠損（
選択マーカーはＬｅｕー２ｄ）合成最小培地をまいたアガープレート上で形質転
換体から得たクローンを培養した。

【０１２６】５）形質転換体から得られたイーストクローンの数をＰＣＲで試験し、イースト
Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を含むイースト断片の存在およびＳｔｕＩとＮｒｕＩと
の酵素切断部位間のバクテリア配列の不在の両方を確認した。最終構築物“ｐＥ
ＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳｗ／ｏＣｏｌｉ”上にイースト断片が存在するかを
確認するために、２つのフランクプライマーＳＯＤｐｒｏＡおよびＳＯＤｐｒｏ
Ｂを用いてＰＣＲ増幅を実施した。推定された約１１３３ｂｐ長さの電気泳動バ
ンドにより、６個のイーストクローン中にイーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を含
む断片が存在することが確認された。

【０１２７】正しく実施されたことをシークエンスおよびアガロースゲル電気泳動により確
認した。

【０１２８】このような操作で得られた最終ベクター“ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳｗ
／ｏＣｏｌｉ”は、いかなるバクテリア配列または人工配列をも運搬せず、イー
スト配列のみが存在するのでイースト株中でだけ複製できる。この最終ベクター
は図３の制限地図に示されている。

【０１２９】例８：新規イースト株中でのイーストＣｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子発現の評価この例は、例６および７で構築された新規イースト株中でのイーストＣｕ／Ｚ
ｎＳＯＤ遺伝子発現の評価に関する。全ての実験は、完全合成培地中で増殖させ
たイースト細胞を使用して例５に従って実施した。

【０１３０】表２は、完全合成培地中のＧＲＦ１８ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４からＭＣＳお
よびバクテリア配列を欠失させた後のＳＯＤ発現に関する、イースト細胞総抽出
物におけるＳＯＤ活性の存在を示すものである：表２

【０１３１】

【表２】

【０１３２】試験結果は（ＧＲＦ１８において）、ベクターｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣ
Ｓｗ／ｏＣｏｌｉがベクターｐＥＭＢＬｙｅｘ４と比べて高い収量のイーストＣ
ｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を発現することを示している。

【０１３３】例９：イーストＣｕ／ＺｎＳＯＤの単離および精製標的ポリペプチド、たとえばイーストスーパージスムターゼの製造は空気接触
条件下にコンピューターで制御した発酵、たとえばアルベルギーナ等の方法によ
り実施される。発酵の制御パラメーターは、温度、溶解酸素、ｐＨおよびエタノ
ール濃度である。

【０１３４】ポリペプチドの精製には以下の工程が含まれる：１．発酵培養液中のイースト細胞をホモジナイザー、たとえばＡＰＶＧａｕｌｉ
ｎを用いて２０〜３０℃の間の温度、６００〜８００ｂａｒの間の圧力で３サイ
クル均質化することにより、または酸洗浄した０.３ｍｍ直径で占められたダイ
ノベッドミル（dynobed mill）、たとえばＤｙｎｏＭｉｌｌＭｏｄｅｌＫＤ
Ｌを用いて、室温で１〜２分間１６０ｍｌ／ｍｉｎでミルを通すことにより懸濁
液を再循環させることにより、直接細胞溶解させる。

【０１３５】２.細胞砕片とタンパクの分離を、たとえば固定角ローターＪＡ−１０を備える
ＢｅｃｋｍａｎｎＪ２−２１遠心機により速度１４０００ｇで６０分間の遠心分
離により、またはたとえば０.４５μｍの遮断膜を備えたミニタン（Millipore C orp., Bedford）による正接流濾過（tangential flow filtration）による精密
濾過で実施する。

【０１３６】３.限外濾過およびダイアフィルトレーションによる濃縮およびバッファーの変
化：条件：１００００ダルトンの遮断セルロース膜（PLGCOMP 04膜）を備えたミ
ニタン（Millipore Corp., Bedford）による接線流濾過。バッファー：Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ２０ｍＭｐＨ８.０。

【０１３７】４.陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、たとえばＤＥＡＥ−セファロース
による精製。条件：ローディングバッファー：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０ｍＭｐ
Ｈ８.０；エリューションバッファー：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０ｍＭｐＨ８.０
ＮａＣｌ１Ｍ。

【０１３８】５.バッファー処理した最終ＳＯＤ溶液を獲得するための、限外濾過およびダイ
アフィルトレーションによる濃縮およびバッファーの変化。条件：１００００ダ
ルトンの遮断セルロース膜（PLGCOMP 04膜）を備えたミニタン（Millipore Corp ., Bedford）による接線流濾過。バッファー：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０ｍＭｐ
Ｈ８.０。

【０１３９】発酵終了時の活性は少なくとも５０００ＰＩＵ／ｍｌである。本発明の新規株
で獲得できる収量は、市販のパン酵母から得られる収量と比較して少なくとも１
０倍を上回る。パン酵母１ｇからは５０００ＰＩＵが単離できるのに対して、ｐ
ＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４ＧＲＦ１８イースト１ｇからは少なくとも４００００Ｐ
ＩＵが単離できる。

【０１４０】

【配列表】

（１）一般的情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：ペンタファームＡＧ（Ｂ）通：エンゲルガッセ１０９（Ｃ）町：バーゼル（Ｄ）市：ＢＳ（Ｅ）国：スイス（Ｆ）郵便コード：ＣＨ−４００２（Ｇ）電話：ｘｘ４１−６１−７０６４８４８（Ｈ）ファックス：ｘｘ４１−６１−３１９９６１９（ｉｉ）発明の名称：改良したイーストポリペプチドを製造するための発現ベ
クター（ｉｉｉ）配列の数：３（ｉｖ）コンピューター読み取り可能形：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：パテントインリリース ♯１．０，バージョン♯
１．３０（ＥＰＯ）（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ(genomic) （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ（ｖ）フラグメントタイプ：内因性（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：サッカロミセスセレビシエ（Ｂ）株名：Ｓ２８８Ｃ（ｖｉｉ）直接的起源：（Ａ）ライブラリー：ＥＭＢＬＮｏＪ０３２７９（Ｖｉｉｉ）ゲノム位置：（Ｂ）地図上の位置：８１〜１０２（Ｃ）単位：ｂｐ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：１..２２（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ｐｒｉｍｅｒ＿ｂｉｎｄ（Ｂ）存在位置：１..２２（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１：

【０１４１】

【化４】

【０１４２】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ(genomic) （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ（ｖ）フラグメントタイプ：内因性（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：サッカロミセスセレビシエ（Ｂ）株名：Ｓ２８８Ｃ（ｖｉｉ）直接的起源：（Ａ）ライブラリー：ＥＭＢＬＮｏＪ０３２７９（Ｖｉｉｉ）ゲノム位置：（Ｂ）地図上の位置：１０１８〜１０３６（Ｃ）単位：ｂｐ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：１..２８（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ｐｒｉｍｅｒ＿ｂｉｎｄ（Ｂ）存在位置：１..２８（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２：

【０１４３】

【化５】

【０１４４】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ(genomic) （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ（ｖ）フラグメントタイプ：内因性（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：サッカロミセスセレビシエ（Ｂ）株名：Ｓ２８８Ｃ（Ｖｉｉｉ）ゲノム位置：（Ｃ）単位：ｂｐ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：１..３０（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ｐｒｉｍｅｒ＿ｂｉｎｄ（Ｂ）存在位置：１..３０（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：

【０１４５】

【化６】

【図面の簡単な説明】

【図１】イースト株Ｓ２８８Ｃ由来Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子のコード領域を図式化した
図である。

【図２】新規分子プラスミド構造ｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４を示す図である。

【図３】最終プラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳｗ／ｏＣｏｌｉを示す図であ
る。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月１９日（２０００．１．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項４】本質的に、ポリペプチドをコードする配列、コード配列を有する読みとり枠中のプロモーター、およびＯＲＩ、リーダー配列、ターミネーター、およびベクター選択のためのポリペプチドをコードする配列から選択される必須の機能的配列を含む、請求項１記載のベクター。

【請求項５】ＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターで制御されたＣｕ／ＺｎＳＯＤ
遺伝子を含むイーストプラスミドである、請求項１または４記載のベクター。

【請求項６】本質的に以下の配列：ｌｅｕ２−ｄイースト選択マーカー、２−ミクロンイーストエピソームの複製起点、全イースト発現ハイブリッドＵＡＳＧＡＬ／ＣＹＣシステム、および酵素Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼを産生するイーストＳＯＤ遺伝子（上流および下流の機能的イースト配列を伴う）を有する請求項１記載のベクター。

【請求項７】配列が、本質的に図３に示すように配列する、請求項６記載のベクター。

【請求項８】サッカロミセスセレビシエ株からのイーストゲノムＤＮＡの単離、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子と上流および下流域とを運搬する染色体断片の単離、該断片のプラスミドベクターｐＣＲＩＩへのサブクローニングおよびプラスミドＤＮＡの抽出、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬する断片の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによる切り出し、切り出した断片の精製、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子と上流イースト由来配列を運搬するベクターｐＥＭＢＬ −ＳＯＤ３７４を製造するための、ベクターｐＥＭＢＬｙｅｘのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位への精製断片のサブクローニング、ポリリンカー両末端の、酵素ＳｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの２カ所の切断による、ベクターｐＥＭＢＬＳＯＤ３７４の第一サンプルからのポリリンカーマルチクローニング部位の欠失、前記のベクターｐＥＭＢＬのイーストおよびバクテリア配列を運搬し、ポリリンカー部位を含有しないＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片のアガロースゲル電気泳動物からの電気溶出による単離、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片の精製および濃縮、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子の全読みとり枠とイースト由来の上流配列および下流配列とを運搬する断片を単離するための、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬するクローンｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４の第２サンプルのＤＮＡ断片の、酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによる２カ所の切断、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片の平滑末端処理および精製、酵素連結反応によるＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片の平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片へのサブクローニング、ランダムスクリーニングによる連結混合物からの正常配列を有するクローンの単離およびベクターｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳを獲得するためのＰＣＲ増幅による確認とＤＮＡシークエンシング、クローンｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳの平滑エンドヌクレアーゼＳｔｕＩおよびＮｒｕＩによる切断および獲得される全バクテリア配列を運搬するＳｔｕＩ −ＮｒｕＩ断片のゲル電気泳動による分離、電気溶出によるアガロースゲルからのイースト配列のみを有する残りの平滑末端断片の単離およびその断片の精製、ベクターｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳｗ／ｏＣｏｌｉを製造するための酵素連結反応による断片の末端への再結合、から成る方法によって獲得できる、請求項１記載のベクター。

【請求項９】該ポリペプチドをコードする配列が、イーストのプロモータ
ーで制御された非−イースト配列である、請求項１、４または６記載のベクター
。

【請求項１０】該ポリペプチドをコードする配列が、イーストのプロモー
ターで制御されたヒトまたは動物由来の配列である、請求項１、４または６記載
のベクター。

【請求項１１】請求項１、４または６記載のベクターで形質転換したイースト株。

【請求項１２】請求項７または８記載のベクターで形質転換したイースト株。

【請求項１３】請求項８記載のベクターで形質転換したＧＲＦ１８イースト株。

【請求項１４】イースト株中でポリペプチドを発現できるシャトルベクタ
ーから非−イースト配列を欠失させ、場合によっては、該ポリペプチドをコード
する配列を別のポリペプチドをコードする配列に置換する、請求項１または４記
載の発現ベクターの製造方法。

【請求項１５】サッカロミセスセレビシエ株からのイーストゲノムＤＮＡの単離、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子と上流および下流域とを運搬する染色体断片の単離、該断片のプラスミドベクターｐＣＲＩＩへのサブクローニングおよびプラスミドＤＮＡの抽出、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬する断片の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによる切り出し、切り出した断片の精製、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子と上流イースト由来配列を運搬するベクターｐＥＭＢＬ −ＳＯＤ３７４を製造するための、ベクターｐＥＭＢＬｙｅｘのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位への精製断片のサブクローニング、ポリリンカー両末端の、酵素ＳｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの２カ所の切断による、ベクターｐＥＭＢＬＳＯＤ３７４の第一サンプルからのポリリンカーマルチクローニング部位の欠失、前記のベクターｐＥＭＢＬのイーストおよびバクテリア配列を運搬し、ポリリンカー部位を含有しないＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片のアガロースゲル電気泳動物からの電気溶出による単離、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片の精製および濃縮、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子の全読みとり枠とイースト由来の上流配列および下流配列とを運搬する断片を単離するための、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ遺伝子を運搬するクローンｐＥＭＢＬ−ＳＯＤ３７４の第２サンプルのＤＮＡ断片の、酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによる２カ所の切断、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片の平滑末端処理および精製、酵素連結反応によるＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片の平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片へのサブクローニング、ランダムスクリーニングによる連結混合物からの正常配列を有するクローンの単離およびベクターｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳを獲得するためのＰＣＲ増幅による確認とＤＮＡシークエンシング、クローンｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳの平滑エンドヌクレアーゼＳｔｕＩおよびＮｒｕＩによる切断および獲得される全バクテリア配列を運搬するＳｔｕＩ −ＮｒｕＩ断片のゲル電気泳動による分離、電気溶出によるアガロースゲルからのイースト配列のみを有する残りの平滑末端断片の単離およびその断片の精製、ベクターｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳｗ／ｏＣｏｌｉを製造するための酵素連結反応による断片の末端への再結合、の工程から成る請求項６記載の発現ベクターの製造方法。

【請求項１６】請求項１、４または６記載のベクターでイースト株を形質転換させる、イースト株の製造方法。

【請求項１７】請求項１５の方法でベクターを製造し、このベクターでサッカロミセスセレビシエ株を形質転換させることから成る、イースト株の製造方法。

【請求項１８】株がＧＲＦ１８株である、請求項１７記載の方法。

【請求項１９】請求項１、４または６記載のベクターを有するイースト株を好適な培地で増殖させ、ポリペプチドを単離する、イースト株中でポリペプチドを製造する方法。

【請求項２０】請求項１４、１５または１８記載の方法でイースト株を製造し、この株を好適な培地中で増殖させ、酵素を単離することから成る、イースト株中で酵素Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼを製造する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA05 BA09 CA04 DA12 EA04 FA02 FA20 GA11 HA01 4B064 AG01 CA06 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA80X AA80Y AB01 BA02 CA28 CA41 CA44 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】イースト中でポリペプチドを製造するための新規ベクターに
おいて、該ポリペプチドをコードする配列、および該ポリペプチドをイーストの
みで発現させるための他の配列を含み、該他の配列が非−イースト配列を有さな
い、イースト中でポリペプチドを製造するための新規発現ベクター。
【請求項２】該ポリペプチドをコードする配列が、イーストのプロモータ
ーで制御されたイーストの配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】イーストのプロモーターで制御された、イーストの酵素をコ
ードする配列を有する、請求項１記載のベクター。
【請求項４】ＧＡＬ／ＣＹＣプロモーターで制御されたＣｕ／ＺｎＳＯＤ
遺伝子を含むイーストプラスミドである、請求項１記載のベクター。
【請求項５】プラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳ、ｗ／ｏＣｏｌ
ｉである、請求項１記載のベクター。
【請求項６】該ポリペプチドをコードする配列が、イーストのプロモータ
ーで制御された非−イースト配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項７】該ポリペプチドをコードする配列が、イーストのプロモータ
ーで制御されたヒトまたは動物由来の配列である、請求項６記載のベクター。
【請求項８】請求項１記載のベクターを含むイースト株。
【請求項９】プラスミドｐＥＭＢＬ−ＳＯＤｗ／ｏＭＣＳ、ｗ／ｏＣｏｌ
ｉを含むＧＲＦ１８である、請求項８記載のイースト株。
【請求項１０】イースト株中でポリペプチドを発現できるシャトルベクタ
ーから非−イースト配列を欠失させ、場合によっては、該ポリペプチドをコード
する配列を別のポリペプチドをコードする配列に置換する、請求項１記載の新規
発現ベクターの製造方法。
【請求項１１】イースト株を請求項１記載のベクターで形質転換する、請
求項８記載のイースト株の製造方法。
【請求項１２】請求項８記載のイースト株の発酵およびポリペプチドの単
離から成る、イースト株中でポリペプチドを製造するための方法。