DK176061B1 - Gærvektor - Google Patents

Description

DK 176061 B1

Den foreliggende opfindelse angår genetisk manipulation i gær, specielt Sac-charomyces cerevisiae.

Optagelsen af exogen DNA af gærceller og den påfølgende arv og expres-5 sion af denne DNA tilvejebringes af en fremgangsmåde, der kaldes transformation. Transformation blev først beskrevet sidst i 1970’eme, under anvendelse af metoder, som er baseret på additionen af DNA til protoplaster produceret ved den enzymatiske fjernelse af gærcellevæggen (Hinnen et al., 1978; Beggs, 1978). Senere er transformationen af intakte gærceller blevet 10 vist (Hisao et al., 1983).

Gær kan transformeres af passende plasmider; plasmider anvendt til dette formål konstrueres sædvanligvis som "skyttelvektorer”, som kan propageres i enten Escherichia coli eller gær (Hinnen et al., 1978; Beggs, 1978; Struhl, et 15 al., 1979). Indføringen af E. coli plasmid DNA-sekvenser, såsom pBR322 (Bolivar, 1978), letter den kvantitative fremstilling af vektor DNA i E. coli og dermed den effektive transformation af gær.

Plasmidvektorer, der sædvanligvis anvendes til gærtransformation, kan deles 20 i to grupper efter type: (i) replikerende vektorer, der er sådanne, som er i stand til at mediere deres egen vedligeholdelse, uafhængigt af gærens kromosomale DNA, ved hjælp af tilstedeværelsen af en funktionel origin for DNA replikation, og (ii) integrerende vektorer, som er baseret på rekombination med den kromosomale DNA for at lette replikation og således den fortsatte 25 opretholdelse af den rekombinante DNA i værtscellen. Replikerende vektorer kan yderligere underopdeles i: (a) 2 pm-baserede plasmidvektorer, hvori ori-ginen for DNA replikation er afledt fra det endogene 2 pm plasmid af gær, (b) autonomt replikerende vektorer (ARS), hvori den "tilsyneladende" origin for replikation er afledt fra kromosomal DNA fra gær og (c) centromere plasmi-30 der (CEN), som foruden en af ovennævnte originer for DNA replikation bærer en sekvens af gærkromosomal DNA, der er kendt for at huse en centromer.

DK 176061 B1 2

For at transformere gær effektivt med en vilkårlig af de før nævnte vektorer er det nødvendigt at foretage en selektion for at identificere de transformanter, som bærer den rekombinante DNA. Dette opnås ved i vektor DNA at in-5 korporere et gen med en skelnelig fænotype. I tilfælde af vektorer anvendt til at transformere laboratoriegær anvendes sædvanligvis prototrofe gener, såsom LEU2, URA3 og TRP1 (Hinnen et al., 1978; Beggs, 1978; Gerbaud et al., 1979) til at komplementere auxotrofe læsioner i værten. For at transformere bryggerigær og andre industrielle gærarter, som ofte er polyploide og 10 ikke stiller auxotrofe krav, er det imidlertid nødvendigt at anvende et selektionssystem baseret på et dominant selekterbart gen. I denne henseende er replikerende 2 pm baserede plasmidvektorer blevet beskrevet, som bærer gener, som medierer resistens overfor (i) antibiotika, f.eks. G418 (Jiminez et al., 1980; Webster et al., 1983), hygromycin B (Gritz et al., 1983), chlor-15 amphenicol (Cohen et al., 1980; Hadfield et al., 1986), og (ii) andre ellers toxiske materialer, f.eks. herbicidet sulfometuronmethyl (Falco et al., 1985), compactin (Rine et al., 1983) og kobber (Henderson et al., 1985).

Den arvelige stabilitet af rekombinante gener i gær afhænger af den type 20 gærvektor, der er anvendt til at lette transformation. Det mest stabile af de to typer vektorsystemer beskrevet i det foregående er de integrerende vektorer. Principperne og praksis for integrativ gærtransformation er blevet beskrevet i litteraturen (Botstein & Davis, 1982, Winston et al., 1983, Orr-Weaver et al., 1983, Rothstein, 1983). Generelt er integrativ transformation forholdsvis uef-25 fektiv; lukkede cirkulære integrerende plasmider er blevet beskrevet, som giver ca. 1-10 transformanter pr. pg DNA (Hinnen et al., 1979, Hicks et al., 1979). Lineær DNA med frie ender lokaliseret i DNA-sekvenser homologe med gærkromosomal DNA transformerer imidlertid gær med højere effektivitet (100-1000 gange), og den transformerende DNA findes generelt integre-30 ret i sekvenser homologe med stedet for kløvning (Orr-Weaver et al., 1981).

Ved kløvning af vektor DNA med en egnet restriktionsendonuclease er det DK 176061 B1 3 således muligt at forøge effektiviteten af transformation og målrette stedet for kromosomal integration. Integrativ transformation kan anvendes til den genetiske modifikation af bryggerigær, forudsat at effektiviteten af transformation er tilstrækkelig høj, og mål-DNA-sekvensen for integration ligger i et område, 5 der ikke afbryder gener, der er væsentlige for metabolismen af værtscellen.

En integrerende gærvektor er for nylig blevet beskrevet for bryggerigær (Yocum, 1985).

Ulig integrerende vektorer, som viser en høj grad af arvelig stabilitet i fravæ-10 ret af selektion, har replikerende vektorer en tendens til at være mere ustabile. Graden af arvelig stabilitet afhænger af den type replikerende vektor, der anvendes. ARS plasmider, som har et højt kopital (ca. 20-50 kopier pr. celle) (Hyman et al., 1982), har en tendens til at være de mest ustabile og tabes med en større hyppighed end 10 % pr. generation (Kikuchi, 1983). Stabilite-15 ten af ARS plasmider kan imidlertid forbedres ved tilknytning af en centromer; centromere plasmider er til stede med en eller to kopier pr. celle (Clarke & Carbon, 1980) og mistes med kun ca. 1 % pr. generation (Walmsley et al., 1983). Kimære 2 pm baserede plasmider udviser varierende grader af arvelig stabilitet afhængig af såvel værtsstammen som 2 pm DNA sekvenserne til 20 stede på plasmidet.

2 pm plasmidet er kendt for at være nucleært i cellulær lokation (Nelson &

Fangman, 1979, Livingston & Hahne, 1979, Seligy et al., 1980, Taketo et al., 1980, Sigurdson et al., 1981), men arves på en ikke-Mendelsk måde (Li-25 vingston, 1977). Celler uden 2 pm plasmidet (cir°) har vist sig at komme fra haploide gærpopulationer med et gennemsnitligt kopital på 50 kopier af 2 pm plasmidet pr. celle ved en mængde på mellem 0,001 % og 0,01 % af cellerne pr. generation (Futcher & Cox, 1983). En mulig forklaring på dette lave niveau af arvelig instabilitet er, at plasmidet ikke giver nogen synlig fordel til 30 cellen under normale vækstbetingelser (Broach, 1981, Futcher & Cox, 1983,

Sigurdson et al., 1981), skønt småvirkninger på væksthastigheder er blevet - _ .. _ - 4 DK 176061 B1 rapporteret for nogle stammer, der huser 2 pm plasmidet (Walmsley et al., 1983). Analyse af forskellige stammer S. cerevisiae har vist, at plasmidet er til stede i de fleste gærstammer (Clark-Walker & Miklos, 1974), herunder bryggerigær (Tubb, 1980, Aigle et al., 1984, Hinchliffe & Daubney, 1986). Det 5 ses således, at plasmidet er ubikvitært, hvilket giver en høj grad af arvelig stabilitet naturligt.

Genetisk og molekylæranalyse af 2 pm plasmidet har afsløret et væld af information vedrørende replikation og stabil vedligeholdelse af plasmidet (Vol-10 kert & Broach, 1987). Plasmidet består essentielt af et cirkulært DNA molekyle med 6318 basepar (Hartley & Donelson. 1980). Det huser en unik bidi-rektional origin for DNA replikation (Newlon et al., 1981), som er en væsentlig komponent af alle 2 pm baserede vektorer. Plasmidet indeholder fire gener, REP1, REP2, REP3 og FLP, som kræves for stabil opretholdelse af et højt 15 kopital pr. celle (Broach & Hicks, 1980, Jayaram et al., 1983) REP3 genfindes også som STB lokus. REP1 og REP2 generne koder for transvirkende proteiner, som menes at virke i forbindelse med interaktion med REP3 lokus ved at sikre den stabile fordeling af plasmidet ved celledeling (Volkert & Broach, 1987). I denne henseende opfører REP3-genet sig som et cis-20 virkende lokus, som bevirker den stabile segretion af plasmidet, og er fæno-typisk analog med en kromosomal centromer (Jayaram et al., 1983, Kikuchi, 1983). Et vigtigt træk for 2 pm plasmidet er tilstedeværelsen af to indsatte DNA-sekvensgentagelser (hver med en længde på 559 basepar), som adskiller det cirkulære molekyle i to unikke regioner. Intramolekylær rekombina-25 tion mellem de indsatte gentagelsessekvenser resulterer i invasionen af en unik region i forhold til den anden og produktionen in vivo af en blandet population af to strukturelle isomere af plasmidet, betegnet A og B (Beggs, 1978). Rekombination mellem de to indsatte gentagelser medieres af proteinproduktet fra et gen kaldet FLP-genet, og FLP-proteinet er i stand til at medi-30 ere højfrekvensrekombination inde i den indsatte gentagelsesregion. Denne stedsspecifikke rekombinationsbegivenhed menes at tilvejebringe en me- DK 176061 B1 5 kanisme, som sikrer forstærkningen af plasmidkopitallet (Futcher, 1986, Vol-kert & Broach, 1986, Som et al., 1988, Murray et al., 1987).

Hver indsat gentagelsessekvens omfatter tre DNA-gentagelsessekvens-5 underenheder (vist som trekanter i fig. 3), hvor to nabostillede underenheder er i fælles direkte orientering, og den tredie er i indirekte orientering og knyttet til en af de andre underenheder via en 8 basepar linking eller spacerre-gion. Denne spacerregion indeholder et unikt Xbal-sted og genkender og skæres ved dens grænser af produktet af FLP-genet. De tilstødende sekven-10 ser er selvsagt homologe med de tilsvarende frekvenser fra den anden ind satte gentagelsessekvens og giver derfor nøjagtig rekombination efter skæringen. Andrews et al., (1985) har fundet, at en 74 basepar sekvens indeholdende spacerregionen på 8 basepar er det minimale krav for FLP-stedsspecifik rekombination.

15 Gærvektorer baseret på replikationssystemet for 2 pm plasmidet er blevet konstrueret ved indsætning af heterologe DNA-sekvenser i regioner i 2 pm plasmidet, der ikke er væsentlige for dets replikation (Beggs, 1981). Dette har resulteret i to grundtyper vektor: (i) hele 2 pm vektorer og (ii) 2 pm origin-20 vektorer. I førstnævnte tilfælde huser disse vektorer hele 2 pm plasmidet, hvori der er blevet indsat forskellige heterologe sekvenser, såsom E. coli plasmid DNA. Disse plasmider er i stand til at opretholde sig selv ved højt kopital med en høj grad af arvelig stabilitet i såvel cir4 (2 pm holdige) som cir0 (uden 2 pm) værter. På den anden side indeholder 2 pm originvektorer sæd-25 vanligvis en minimal DNA-sekvens, der huser 2 pm originen for DNA replikation og en enkelt kopi af den 599 basepar store gentagelse for 2 pm; sådanne vektorer kan kun opretholdes i cir4 værtsceller, da de kræver de proteiner, der kodes for af REP1 og REP2 generne tilført i trans fra det endogene plasmid for at sikre deres stabile opretholdelse.

30 DK 176061 B1 6 Når en genetisk modificeret gær, som er i stand til at udtrykke et heterologt gen til at producere store mængder af et kommercielt vigtigt polypeptid, konstrueres, er det sædvanligvis ønskeligt at vælge en gærvektor med højt kopital. 2 pm baserede vektorer har vist sig meget succesfulde til anvendelse 5 som expressionsplasmider og udgør derfor ofte den valgte vektor (Kingsman et al., 1985).

I europæisk patentansøgning nr. 86 303 039 (Publikation nr. 0 201 239 A1 i navnet Delta Biotechnology Ltd.) er der beskrevet en fremgangsmåde til 10 fremstilling af heterologe proteiner i bryggerigær, i hvilke en industriel gærstamme er genetisk modificeret til at være i stand til at udtrykke et heterologt gen, så at ingen expression af det heterologe gen finder sted under den primære ølfermentering, men gærbiomassen akkumuleres, og syntesen af heterologt protein indføres, efter at gæren er blevet fjernet fra øllet. Dette 15 opnås ved at transformere bryggerigær med et 2 pm baseret plasmid husende den dominante selekterbare markør CUP-1 og et gen kodende for et modificeret humant serumprotein, N-methionylalbumin (Met-HSA), hvis expression reguleres ved det transkriptionale niveau af en galactoseinducerbar promotor. For at maximere udbyttet af heterolog proteinsyntese under ud-20 øvelsen af denne proces er det nødvendigt at sikre: (i) et højt kopital for det gen, der skal udtrykkes, (kodende for Met-HSA); (ii) en høj grad af arvelig stabilitet for genet af interesse under betingelser for ikke-selektiv vækst, (iii) at de rekombinante gener transformeret over i bryggerigær ikke har en skadelig virkning på gæren og dens evne til at producere øl og senere heterologt 25 protein, og (iv) at de rekombinante gener til stede i gær såvidt muligt er begrænset til genet af interesse og nabogærregulatoriske gener. Kravet (ii) er særlig vigtigt, fordi det er både upraktisk og uønsket at supplere det normale vækstmedium for bryggerigær, nemlig maltextrakt tilsat humle, med toxiske materialer, såsom kobberioner, da dette vil forøge procesomkostningerne og 30 have en skadelig og muligvis uacceptabel virkning på kvaliteten af øllet, som er det primære fermenteringsprodukt. I forbindelse med krav (iv) er det øn- DK 176061 B1 7 skeligt, at den genetisk modificerede gær ikke har fremmede DNA-sekvenser, såsom de, der er afledt fra den bakterielle del af det rekombinan-te plasmid.

5 I ansøgerens ansøgning publiseret som EP-A-251744 er der beskrevet en fremgangsmåde til modificering af gærceller ved inkorporering deraf i den endogene 2 pm plasmid af en DNA-sekvens kodende for et protein eller peptid af interesse ved at fremstille en integrationsvektor omfattende 2 kopier af en homolog 2 pm plasmid DNA-sekvens i direkte orientering omfattende DNA-10 sekvensen af interesse, transformering af gær med nævnte integrationsvektor og derpå isolering fra den transformerede gær af opnåede celler indeholdende det endogene 2 pm plasmid modificeret ved inkorporering af DNA-sekvensen af interesse. Selve integrationsvektoren overlever ikke i de transformerede gærceller. De homologe 2 pm plasmid DNA-sekvenser kan være, 15 men er sædvanligvis ikke, kopier af 2 pm plasmidgentagelsessekvensen.

Det har nu overraskende vist sig, at en modifikation af fremgangsmåden ifølge denne ansøgning gør det muligt at transformere gærceller ved inkorporering af et modificeret 2 pm plasmid.

20

Ved den foreliggende fremgangsmåde omfatter den anvendte plasmidvektor en DNA-sekvens, som tillader propagering af vektoren i bakterier indesluttet mellem to homologe 2 pm plasmid DNA FLP-rekombinationssteder i direkte orientering, en DNA-sekvens kodende for et protein eller peptid af interesse, 25 som foretrukkent, men ikke nødvendigvis, er en sekvens heterolog med gær, og foretrukkent også en selekterbar markør DNA-sekvens. 2 pm plasmidvek-toren ifølge opfindelsen omfatter således 3 kopier af FLP-rekombinations-stedet, af hvilke et par er i direkte orientering, og de andre to par er i indirekte orientering. Når gær transformeres med en plasmidvektor, der har denne 30 konstruktion, har den DNA-sekvens, som tillader propagering af vektoren i bakterier, vist sig at mistes spontant, og plasmidvektoren bliver et modificeret DK 176061 B1 8 2 pm plasmid, som er i stand til at erstatte det endogene 2 pm plasmid i den transformerede gær. Plasmidvektorer af denne type kaldes herefter sønderdelingsvektorer. Gæren transformeret med sådanne vektorer kan indeholde flere extrakromosomale kopier af et modificeret 2 pm plasmid indeholdende 5 et gen af interesse, men ingen bakteriel DNA, som har vist sig at være stabilt nedarvet under betingelser med ikke-selektiv vækst.

Bruschi (13. International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, efteråret 1986) beskrev, at rekombination af et 2 pm-baseret plasmid 10 kunne resultere i udskillelsen af bakterielle DNA-sekvenser, men foreslog kun, at systemet kunne anvendes til at studere strukturfunktionsrelationer i DNA-molekylet. Bruschi (Plasmid 1987, 17(1), p 98) er tilsvarende, men nævner kloningsgener. Hollenberg (Cuit. Topics i Microbiol. & Immunol., 1982, 96, pp 119-144) diskuterer rekombination i 2p-baserede plasmider.

15 Ingen af disse dokumenter foreslår et foretrukkent indsætningssted for den ønskede kodningssekvens. Det har nu overraskende vist sig, at et lignende system kan anvendes til at fremstille fordelagtige expressionsvektorer, som har uventet stabilitet, når den ønskede DNA kodende sekvens er indsat mellem ori og STB-genet af den 2 pm plasmid-afledte DNA.

20

Udtrykket "FLP-rekombinationsstedM anvendes heri i betydningen et vilkårligt sted eller site, som vil tillade rekombination som følge af interaktion med FLP-genproduktet. Hvis Andrews iagttagelse (1985) er korrekt, så vil FLP-rekombinationsstedet alment omfatte som et minimum den 74 bp sekvens, 25 der er identificeret af ham. I praksis er der ingen mening i at inkludere mere end de 599 basepar, der udgør hele gentagelsessekvensen.

Den 2 pm-baserede sønderdelingsvektor ifølge opfindelsen har vist sig i stand til at transformere såvel laboratoriegær som industrigær. Sønderde-30 lingsvektoren opretholdes med et højt kopital pr. celle og har en extrem høj grad af arvelig stabilitet. Desuden kan sønderdelingsvektoren, ulig alle andre DK 176061 B1 9 2 pm-baserede plasmidvektorer hidtil beskrevet, konstrueres, således at de bakterielle plasmid DNA-sekvenser efter transformation af gær udslettes spontant. Genetisk modificerede stammer af bryggerigær kan være konstrueret, så genet af interesse inkorporeret i 2 pm plasmidet opretholdes stabilt, 5 selv under betingelser med ikke-selektiv vækst, ved et højt kopital pr. celle, i fravær af fremmede bakterielle plasmid DNA-sekvenser. Anvendelsen af en sådan vektor ved konstruktionen af en genetisk modificeret bryggerigær sikrer, at kun genet af interesse opretholdes stabilt i på hinanden følgende generationer af bryggerigær, hvorved man kommer uden om eventuelle skade-10 lige virkninger, som yderligere DNA-sekvenser kan have på den teknologiske opførsel af gæren og/eller smagen og kvaliteten af øl produceret med gæren.

I praksis kan genet af interesse være et vilkårligt rekombinant gen, enten homologt eller heterologt i forhold til gær. Sønderdelingsvektoren kan anven-15 des f.eks. til stabilt at integrere Met-HSA-genet i bryggerigær udtrykt fra enten en konstitutiv gærpromotor, f.eks. phosphoglyceratkinasepromotoren (PGK) i forbindelse med den metode, der er beskrevet i EP-A-147 198, eller en reguleret gærpromotor, f.eks. GAL10/CYC1 hybrid promotoren som beskrevet i EP-A-201 239 eller GAL/PGK-promotoren som beskrevet i EP-A-20 258 067.

Yderligere gener, der kan opretholdes stabilt med dette system, omfatter DEX1 -genet af Saccharomyces diastaticus, som specificerer produktionen af et extracellulært glycoamylaseenzym i bryggerigær, og β-glucanasegenet af 25 Bacillus subtilis, som specificerer produktionen af en endo-1,2-1,4-β-glucanase i bryggerigær (Hinchliffe & Box, 1985). Sådanne gener kan først genetisk modificeres til at kontrollere mængden af genexpression og/eller sikre, at det protein, hvis syntese medieres af genet, udskilles af bryggerigæren.

30 Anvendelsen af den hidtil ukendte sønderdelingsvektor er særlig fordelagtig i den proces, der er beskrevet i EP-A-201 239, da genet af interesse ifølge DK 176061 B1 10 denne proces er reguleret, så at det ikke udtrykkes under forløbet af ølfermenteringen eller under normale betingelser for gærvækst, men snarere induceres i en efterfermenteringsproces. Følgelig udskilles der med høj expression gen af interesse i tidens løb fra syntesen af gærbiomasse ved celle-5 formering, og således minimeres eventuelle uheldige virkninger af gen-udtrykkelsen på plasmidstabiliteten.

Vektoren ifølge opfindelsen er foretrukkent en sønderdelingsvektor (som defineret i det foregående) omfattende et komplet 2 pm plasmid yderligere bæ-10 rende (i) en bakteriel plasmid DNA-sekvens nødvendig for propagering af vektoren i en bakterievært, (ii) et ekstra 2 pm FLP-rekombinationssted, (iii) en DNA-sekvens kodende for et ønsket protein eller peptid indsat mellem ori og STB-genet, og (iv) en selekterbar markør DNA-sekvens for gærtransformation, hvor nævnte bakterielle plasmid DNA-sekvens er til stede, og det 15 ekstra FLP-rekombinationssted dannes ved et restriktionssted i en af de to indsatte gentagelsessekvenser for 2 pm plasmidet, idet det ekstra FLP-rekombinationssted er i direkte orientering i forhold til det endogene FLP-rekombinationssted for den ene gentagelsessekvens, og den bakterielle plasmid DNA-sekvens er sandwich-indlagt mellem det ekstra FLP-20 rekombinationssted og det endogene FLP-rekombinationssted i den ene gentagelsessekvens.

Den foretrukne sønderdelingsvektor består således af et komplet 2 pm plasmid, i hvilket der er indsat en eller flere bakterielle plasmid DNA-sekvenser 25 og en ekstra kopi af et 74 basepar FLP-rekombinationssted afledt fra 2 pm plasmidet. Desuden er genet af interesse, co-lineært med en selekterbar markør for gærtransformation, f.eks. CUP-1, indsat mellem ori og STB-genet i 2 pm plasmidet. De bakterielle plasmid DNA-sekvenser og gær DNA-gentagelsen er f.eks. indsat ved et Xbal-sted i en kopi af de to indsatte gen-30 tageiser af hele 2 pm plasmidet. Den korrekte orientering af DNA-gentagelsen er væsentlig for plasmidets virkning; plasmidet er konstrueret DK 176061 B1 11 således, at den bakterielle plasmidsekvens, der er nødvendig for DNA propagering i f.eks. E. coli, er sandwich-indlagt mellem de to kopier af FLP-rekombinationsstedet for 2 pm plasmidet, som selv er i direkte orientering. Konfigurationen af DNA-sekvenser er vist i fig. 3 og beskrevet mere detaljeret 5 i det følgende. Denne konstruktion begrænser de bakterielle plasmid DNA-sekvenser til en region af DNA, som, når plasmidet transformeres i gær, udskæres fra plasmidet ved hjælp af en stedsspecifik rekombinationsbegivenhed mellem de to direkte orienterede DNA-gentagelser. Denne stedsspecifikke rekombination medieres af produktet af FLP-genet af 2 pm, hvis 10 produkt enten kan suppleres af det endogene 2 pm plasmid af gær, når man transformerer cir+ celler, eller af selve sønderdelingsvektoren, når man transformerer cir° celler. Fordi vektorerne ifølge opfindelsen kan anvendes til at kurere den transformerede gær for dens endogene 2 pm plasmider, og også fordi rekombinationen er hurtigere i cir° celler, er det foretrukkent for vektoren 15 ifølge opfindelsen at være baseret på et komplet 2 pm plasmid. Hvis vektoren ifølge opfindelsen imidlertid skal co-eksistere med de endogene 2 pm plasmider, så behøver gener, såsom REP1, REP2, REP3 og FLP, ikke være til stede på vektoren, da produkterne for disse gener kan suppleres i trans; alt hvad der er nødvendigt er en origin for replikation.

20

Som beskrevet mere detaljeret i det følgende kan den indsatte DNA, der bærer de bakterielle sekvenser, ved hver ende bære en respektiv del af gentagelsessekvensen, i hvilket tilfælde denne DNA indsættes i en endogen gentagelsessekvens, så at det endogene rekombinationssted ødelægges effek-25 tivt, men to nye FLP-rekombinationssteder dannes, hvert omfattende en del af det endogene rekombinationssted og en komplementær del fra den indsatte DNA. Alternativt kan et komplet FLP-rekombinationssted bæres mod en ende af indsatsen, hvilken indsats derpå indsættes nabostillet til eller med afstand fra en endogen gentagelsessekvens, således at den bakterielle DNA 30 ligger mellem den endogene gentagelsessekvens og den indsatte gentagelsessekvens. Når den indsatte DNA er indsat ved en lokalisering i afstand fra DK 176061 B1 12 den endogene sekvens, vil den endogene DNA mellem den endogene gentagelsessekvens og den indsatte gentagelsessekvens senere blive udskåret sammen med den bakterielle DNA. Hvis denne DNA derfor behøves, må en yderligere kopi deraf tilvejebringes (foretrukkent på den indsatte DNA) på den 5 side af den indsatte gentagelsessekvens, der er fjernest fra den endogene gentagelsessekvens.

Det sted i det intergrale 2 pm plasmid, ved hvilket genet af interesse indsættes, vælges med henblik på at minimere virkningen af indsætningen på såvel 10 plasmidkopitallet som arvelig stabilitet. Det er således fordelagtigt at indsætte genet af interesse ved et sted, som ikke afbryder integriteten af REP1, REP2, REP3 og FLP-generne, især hvis plasmidet er beregnet til anvendelse ved transformation af en cir° gærværtsstamme. Området mellem ori og STB-genet opfylder disse kriterier.

15

En fordelagtig egenskab ved sønderdelingsvektoren er, at når den indføres i cir+ gærstammer, er den, fordi den har et integralt 2 pm plasmid, i stand til at kurere det endogene 2 pm plasmid, enten under eller efter udskæringen af de bakterielle plasmidsekvenser. En analog situation er for nylig blevet rap-20 porteret for hele 2 pm vektorer transformeret i cir+ gærværtsstammer (Harford & Peters, 1987). Sønderdelingsvektoren kan således også anvendes til at kurere det endogene 2 pm plasmid fra gærstammer.

På tegningen viser 25 fig. 1 plasmid pBA112 (Andrews et al., 1985). Den tynde linie repræsenterer DNA-sekvenser afledt fra det bakterielle plasmid pUC9; den åbne streng repræsenterer det 74 basepar store DNA-fragment indeholdende FLP-rekombi-nationsstedet; trekanterne indikerer orienteringen af de tre indre DNA-30 gentagelser inde i hvert FLP-rekombinationssted (Andrews et al., 1985), DK 176061 B1 13 fig. 2 viser plasmid pSAC112. Plasmid pSAC112 er identisk med pBA112 med undtagelse af, at BamHI, Pstl og Hindlll-stedeme er blevet udslettet, fig. 3 viser plasmid pSAC3. Den tykke linie repræsenterer DNA-sekvenser fra 5 det bakterielle plasmid pUC9, de åbne strenge repræsenterer det 74 basepar store DNA-fragment indeholdende FLP-rekombinationsstedet, den tynde linie repræsenterer 2 pm plasmid DNA-sekvenser, trekanterne indikerer orienteringen af de tre indre DNA-gentagelser i hvert FLP-rekombinationssted, 10 fig. 4 viser et plasmidkort af pSAC3U1. Betegnelser er som for fig. 3, fig. 5 viser et plasmidkort af pSAC3U2. Betegnelser er som for fig. 3, fig. 6 viser et plasmidkort af pSAC300. Betegnelser er som for fig. 3, 15 fig. 7 viser et plasmidkort af pSAC310. Betegnelser er som for fig. 3, fig. 8 viser et plasmidkort af pSAC3C1. Betegnelser er som for fig. 3, 20 fig. 9 er baseret på et fotografi visende væksten af haploide gærstammer, og det viser den fælles arv af URA3 og det bakterielle bla gen, og fig. 10 er en autoradiograf af den totale gær DNA prøvet med 32P-mærket pSAC3 DNA.

25

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

DK 176061 B1 14

Eksempel 1

Konstruktion af plasmider 5 Plasmid pSAC112 (fig. 2) blev konstrueret ved nedbrydning af plasmid pBA112 (fig. 1, Andrews et al., 1985) med restriktionsendonucleaserne BamHI og Hindlll samtidig. Lineær plasmid DNA blev behandlet med DNA polymerase I (Klenow) i nærværelse af 0,3 mM dNTP'er (dATP, dTTP, dCTP og dGTP) i 10 minutter ved 37 °C. DNA blev extraheret med phe-10 nolichloroform, ethanol-udfældet og inkuberet natten over ved 15 °C i nærværelse af T4 DNA ligase. Ligeret DNA blev transformeret i E. coli stamme MC1061 (Casadaban og Cohen, 1980), plasmid pSAC112 blev isoleret fra de resulterende transformanter efter identificering og karakterisering ved metoden af Birnboim og Doly (1980).

15

Plasmid pSAC3 (fig. 3) blev konstrueret ved følgende procedure. Gær 2 pm plasmid DNA blev isoleret fra stamme DRI9 som beksrevet af Guerineau et al., (1974). Renset 2 pm plasmid DNA blev delvist nedbrudt med restriktions-endonuclease Xbal som beskrevet af Maniatis et al., (1982) og ligeret med 20 Xbal kløvet pSAC112. Ligeret DNA blev transformeret i E. coli stamme AG1 (opnået fra NBL Enzymes Ltd., Cramlington, England.). De resulterende am-picillinresistente transformanter blev screenet for homologi til 2 pm plasmid DNA efter kolonihybridisering (Grunstein og Hogness, 1975) til 32P-mærket 2,2 kilobasepar EcoRI fragment fra plasmid pYF92 (Storms, R.K. et al., 25 1979). Kolonier visende homologi med den 2 pm specifikke DNA sonde blev isoleret, og deres plasmid DNA blev karakteriseret ved restriktionsendo-nucleasekortlægningsprocedurer. Plasmid pSAC3 blev således opnået.

Plasmider pSAC3U1 (fig. 4) og pSAC3U2 (fig. 5) blev konstrueret ved kløv-30 ning af plasmid pSAC3 med restriktionsendonucleasen Pstl. Enderne på lineær DNA blev bragt til at flugte ved behandling med T4 DNA polymerase i DK 176061 B1 15 nærværelse af 0,3 mM dNTP'er (dATP, dTTP, dCTP og dGTP i 10 min ved 37 °C. DNA blev extraheret med phenol:chloroform og ethanol-udfældet før ligering. Plasmid pJDB110 (Beggs, 1981) blev nedbrudt med restriktionsen-donucleasen Hindlll, og DNA fragmenterne blev underkastet agarosegel-5 elektroforese på en 1 %'s gel. Et 1,1 kilobasepar DNA-fragment husende URA3 gærgenet blev isoleret fra gelen (Manlatis et al., 1982) og behandlet med DNA polymerase I (Klenow) i nærværelse af 0,3 mM dNTP’er (dATP, dTTP, dCTP og dGTP). Det 1,1 kilobasepar store Hindlll fragment blev extraheret med phenolxhloroform, ethanol-udfældet og stumpendeligeret med 10 lineær pSAC3 DNA fremstillet som beskrevet i det foregående. Ligeret DNA blev transformeret i E. coli stamme AG1. De resulterende ampicillinresistente transformanter blev screenet for homologi med URA3 genet efter koloni-hybridisering (Grunstein og Hogness, 1975) til et 32P-mærket 1,1 kilobasepar Hind I Il-fragment renset fra plasmid pJDB110. Plasmider pSAC3U1 (fig. 4) og 15 pSAC3U2 (fig. 5) blev isoleret fra de kolonier, som udviste homologi til URA3 gensonden. Det 1,1 kilobasepar store Hindlll DNA fragment bærende URA3 genet blev også stumpendeligeret til de unikke Eagl og SnaBl steder af pSAC3 til opnåelse af plasmider betegnet pSAC300 (fig. 6) og pSAC310 (fig.

7).

20

Plasmid pSAC3C1 (fig. 8) blev konstrueret ved stumpendeligering af et 694 basepar stort Xbal-Kpnl DNA-fragment bærende CUPI genet fra plasmid pET13:1 (Henderson et al., 1985) ind i det unikke Pstl-sted i pSAC3.

25 Transformation af gær med plasmider PSAC3U1 og PSAC3U2 Sønderdelingsvektorerne pSAC3U1 (fig. 4) og pSAC3U2 (fig. 5) blev konstrueret, så at de hver indeholder det selekterbare gærgen, URA3, indsat i det unikke Pstl-sted på 2 pm B form. Desuden huser hvert plasmid DNA-30 sekvenser afledt fra det bakterielle plasmid pUC9 flankeret af to kopier af FLP-rekombinationsstedet lokaliseret i direkte orientering. Positionen af DK 176061 B1 16 pUC9 DNA er således, at FLP-medieret rekombination mellem disse to direkte orienterede FLP-rekombinationssteder resulterede i udskæringen af den bakterielle plasmid DNA efter transformation af gær. Cir+ og cir" derivater af den haploide gærstamme S150-2B (Cashmore et al., 1986) blev transfor-5 meret til uracil-prototrofi med plasmider pSAC3U1 og pSAC3U2, efter metoden af Ito (1983). URA transformanter blev screenet for medarven af det bakterielle bla gen, som koder for det β-lactam-specifikke enzym β-lactamase i gær, ved metoden af Chevalier og Aigle (1979). De i fig. 5 anførte resultater viser, at begge plasmider segregerer bla genet fra URA+ genet i alle transit) formanter i cir° stammen, hvilket indikerer udslettelse af de bakterielle DNA-sekvenser fra plasmiderne efter gærtransformation. Størstedelen af URA+ transformanteme af cir+ stammen blev imidlertid iagttaget at medarve bla genet (15 af 20 og 18 af 20 for henholdsvis pSAC3U1 og pSAC3U2). Disse data antyder, at effektiviteten af plasmidersønderdelingen, dvs. FLP-medieret 15 udskæring af de bakterielle plasmid DNA sekvenser, er større efter transformation af en cir° stamme end en cir+ stamme.

Molekularanalvse af transformanter

20 For at bestemme, hvorvidt URA+ transformanteme, som havde segregeret bla genet (dvs. β-lactamase-negative kloner, bla') faktisk havde tabt bla genet og nabostillede bakterielle plasmid DNA-sekvenser, blev gær DNA analyseret. De to URA+ bla' transformanter af cir+ og cir° stammerne transformeret med pSAC3U1 og pSAC3U2 blev dyrket på et selektivt minimalt medium 25 uden uracil, og total DNA blev extraheret ved følgende procedure. Aktivt groende celler blev høstet og resuspenderet i 5 ml 1 M sorbitol, 0,025 M ethy-lendiamin-tetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 og 8 mg/ml dithiothreitol ved 28 °C i 15 min. Celler blev høstet og gensuspenderet i 5 ml 1,2 M sorbitol, 0,1 M natriumcitrat, 0,01 M EDTA pH 5,8 og 0,025 μΙ/ml zymolyase (Kirin Brewery 30 Co. Ltd.) ved 28 °C, indtil der var opnået protoplaster. Protoplaster blev vasket tre gange i 1,2 M sorbitol før resuspendering i 1 ml 3 %’s sarkosyl, 0,5 M

DK 176061 B1 17 tris/HCI pH 7,5, 0,2 M EDTA og 100 μΙ/ml proteinase K ved 55 °C i 60 min.

DNA præparater blev extraheret med chloroform:isopropanol, phenol, chloroform og ether før dialyse mod 10 mM tris/HCI og 1 mM EDTA pH 8. Total gær DNA blev nedbrudt med restriktionsendonucleaserne EcoRI, Xbal og 5 Pstl, og DNA-fragmenter blev adskilt ved agaroseelektroforese. Efter

Southern-overføring (Maniatis et al., 1982) blev total gær DNA hybridiseret til 32P-mærket pSAC3 DNA. Resultaterne er angivet i fig. 10, som er en autora-diograf af totalt gær DNA afprøvet med 32P-mærket pSAC3 DNA. DNA blev isoleret fra S150-2B cir+ stammer transformeret med plasmider pSAC3U1 og 10 pSAC3U2. To uafhængige transformanter af hver stamme/plasmid- kombination betegnet A og B blev analyseret. DNA blev nedbrudt med restri ktionsendonuclease som følger: Xbal, bane 1-4 og 21-24, Pstl, bane 5-12,

EcoRI, bane 13-20.

15 Bane Plasmid CirVcir0 Isolat (fiJB)

6, 14,22 PSAC3U1 cir+ A

8,16,24 PSAC3U1 cir+ B

20 5, 13,21 pSAC3U1 cir° A

7,15,23 pSAC3U1 cir° B

2, 10, 18 pSAC3U2 cir+ A

4,12,20 pSAC3U2 cir+ B

25

1,9,17 pSAC3U2 cir° A

3,11,19 pSAC3U2 cir° B

Baseret på de kendte restriktionssteder til stede i det endogene 2 pm plas-30 mid af gær (Hartley og Donelson, 1980) og rekombinant plasmider pSAC3U1 DK 176061 B1 18 pSAC3U1 og pSAC3U2, kan man forudsige hybridiseringsmønstret for plasmid pSAC3. Det forudsagte hybridiseringsmønster er vist i tabel 1.

Tabel 1 5

Forventet hybridiseringsmønster for S150-2B cir+ og cir° derivater, transformeret med pSAC3U1 og pSAC3U2 til pSAC3.

Plasmid DNA Restriktionsendonucleasefraqmenter 10 (kilobasepar)

EcoRI Xbal Pstl 2 pm (endogen) 4,1 3,2 6,3 3,9 3,1 15 2,4 2,2 PSAC3U1 og 5,3 4,3 10,2 PSAC3U2 (intakt) 4,1 3,2 20 0,72 2,8 pSAC3U1 og (5,0) 4,3 7,4 pSAC3U2 (sønderdelt) 4,1 3,2 3,3 25 (2,4)

Tallene i parentes vil opnås, hvis de sønderdelte plasmider har undergået FLP-medieret interkonversion.

30 Hvis man sammenligner resultaterne fra hybridiseringen (fig. 10) med de forventede resultater (Tabel 1) vil det ses, at i hver transformant har det rekom- DK 176061 B1 19 binante plasmid undergået en udsletning i overensstemmelse med udskæringen af de bakterielle plasmid DNA-sekvenser indeholdt i de direkte orienterede FLP-rekombinationssteder. I tilfælde af transformanter betegnet pSAC3U2/B er det endogene 2 pm plasmid af stamme S150-2B desuden 5 ikke længere til stede. Dette indebærer, at transformation af en cir+ stamme med plasmid pSAC3U2 resulterer i hærdning af det endogene 2 pm plasmid.

Yderligere sandsynlighed for, at plasmider pSAC3U1 og pSAC3U2 undergår en udskæring af det bakterielle plasmid DNA efter transformation af gær blev 10 opnået ved hybridisering af førnævnte DNA præparater til 32P-mærket pUC9 DNA (Vieira og Messing, 1982) URA+ bla' transformanter hybridiserede ikke til denne DNA-probe.

Plasmider pSAC300. PSAC310 oq pSAC3C1 sønderdeler efter gærtransfor-15 mation URA+ plasmideme pSAC300 og pSAC310 blev anvendt til at transformere cir+ og cir° derivaterne af S150-2B, og URA og bla fænotyperne af de resulterende transformanter blev bestemt. I alle tilfælde blev den sønderdelte fæno-20 type iagttaget; således er pSAC300 og pSAC310 i stand til at udskære den bakterielle vektor DNA efter gærtransformation. I denne henseende blev det iagttaget, at plasmid pSAC300 var årsag til en signifikant højere andel af bla‘ transformanterne af cir+ derivatet af S150-2B. Forklaringen på dette er ukendt. Det er imidlertid muligt, at afbrydelsen af Eagl-stedet ved indsætnin-25 gen af URA3 genet i pSAC300 kan have samvirket med udtrykkeisen af det nabostillede FLP-gen resulterende i overudtrykkelse af FLP-rekombinase.

Plasmid pSAC3C1 blev konstrueret til anvendelse ved transformation af kobberfølsom industrigær og specielt bryggerigær. pSAC3C1 blev således trans-30 formeret i en beskyttet stamme af Bass-pilsnergær betegnet BB11.0 som beskrevet af Hinchliffe og Daubney (1986). Kobberresistente transformanter DK 176061 B1 20 blev derpå checket for tilstedeværelsen af bla fænotypen ved β-lactamasepladerprøven. Ca. 18 % af de afprøvede transformanter var bla' kobberresistente, hvilket indikerede in vivo sønderdelingen af plasmid pSAC3C1 i bryggerigærværten.

5

In vivo sønderdelingen af plasmider pSAC300, pSAC310 og pSAC3C1 blev derefter bekræftet efter en fuldstændig molekylekarakterisering af de tilsvarende værtsstammer med den sønderdelte fænotype. Når således total gær DNA blev hybridiseret til 32P-pUC9 DNA som beskrevet i det foregående, 10 kunne der ikke iagttages nogen homologi i bla' derivaterne.

Plasmidstabilitet af de sønderdelte transformanter

Den arvelige stabilitet af URA+ fænotypen i cir+ og cir° stammerne af S150-15 2B husende de sønderdelte derivater af pSAC3U1 og pSAC3U2, pSAC300 og pSAC310 blev bestemt ved dyrkning af gæren ikke-selektivt i YPD indeholdende 2 % glucose efter vægt/volumen, udstrygning på plader af samme medium og replika-pladedannelse til minimalt medium uden uracil. Det procentvise plasmidtab pr. generation blev beregnet og fremgår af tabel 2.

20

Tabel 2

Plasmidtab i % pr. generation 25 Plasmidderivat Plasmidtab i % pr, generation

(Sønderdelt vektor) S150-2B S150-2B

cir+ cir° pSAC3U1 0,22 0,19 pSAC3U2 0,31 0,14 30 pSAC300 2,5 pSAC310 0 0,89 DK 176061 B1 21

Det fremgår af det i Tabel 2 viste resultat, at alle de sønderdelte derivater er ustabile i såvel cir+ som cir° derivater af S150-2B. Graden af ustabilitet iagttaget for pSAC3U1, pSAC3U2 og pSAC310 især er mindst en størrelsesorden lavere end den, der iagttages for andre URA+ 2 pm baserede rekombi-5 nantvektorer i S150-2B (Cashmore et al., 1986).

Det er interessant at bemærke, at indsætningen af URA3 genet i det unikke Eagl-sted i 2 pm delen af pSAC3 resulterer i et sønderdelt derivat, som er betragteligt mindre stabilt end de sønderdelte derivater afledt fra pSAC3U1, 10 pSAC3U2 og pSAC310. Det er tilsyneladende derfor, at indsætningsstedet for den selekterbare markør kan have en kraftig virkning på stabiliteten af det resulterende sønderdelte derivat. I denne henseende er det klart, at de unikke SnaBa og Pstl-steder af 2 pm danner egnede loci for indføringen af re-kombinante gener, da plasmidstabilitet ikke påvirkes uhensigtsmæssigt af så-15 danne indsætninger.

Plasmidstabilitet af sønderdelte transformanter af bryqqeriqær Sønderdelte derivater af pSAC3C1 transformanter af BB11,0 blev også ana-20 lyseret for stabiliteten af den kobberresistente fænotype. Plasmidstabilitets-forsøg blev foretaget som beskrevet i det foregående og resulterede i et skøn på 0,014 % plasmidtab pr. generation under ikke-selektive vækstbetingelser.

Det fremgår af dette resultat, at de sønderdelte derivater af pSAC3C1 er yderst stabile i bryggerigærstammen BB11.0, har en grad af stabilitet, der 25 ikke hidtil er iagttaget for en rekombinant 2 pm-baseret gærvektor.

Sønderdelinqsvektorer kan anvendes til stabilt at opretholde gener af interesse i gær 30 Plasmid pSAC3 bærer et unikt Pstl-sted og et unikt SnaBI-sted, i hver af hvilke DNA-sekvenser kan indsættes som beskrevet i det foregående uden på DK 176061 B1 22 uheldig måde at påvirke fænotypestabiliteten for det resulterende sønderdelte derivat af plasmidet i gær. Disse steder kan anvendes som loci for indføringen af gener af interesse, f.eks. DEX-1 genet af S. diastaticus og det humane serum-albumingen udtrykt fra en gærpromotor. Under anvendelse af 5 kendte metoder er det muligt at indsætte sådanne gener i disse unikke loci sammen med en passende selekterbar markør for gærtransformation. Alternativt kan plasmider pSAC3U1, pSAC3U2, pSAC310 og pSAC3C1 anvendes som modtagere for indsætning af et passende gen af interesse. I denne henseende huser pSAC3U1, pSAC3U2 og pSAC310 et unikt Smal-sted lokalise-10 ret i den 3’ ikke-translaterede region af URA3-genet (Rose et al., 1984). Dette Smal-sted kan anvendes som locus for indsætningen af et passende gen af interesse.

Ønskeligheden af at anvende SnaBI-stedet til at indsætte et gen af interesse 15 enten direkte eller indirekte (f.eks. når URA3-genet indsættes og derpå et gen af interesse indsættes i dets Smal-sted) afhænger af sønderdelingen af vektoren, dvs. tabet af de bakterielle DNA-sekvenser, og udgør et andet aspekt for opfindelsen. Generelt kan man sige, at man ville ønske at forhindre transkription i at fortsætte fra det eller de indsatte gener i de endogene 2 20 pm regioner, især i den såkaldte STB-region, som er på den side af SnaBI-stedet, der er fjernest fra gæroriginen for replikation (ori). Den indsatte sekvens omfatter således foretrukkent (a) et gen af interesse, (b) en promotor derfor på den side deraf, der er nabostillet ori og (c) en 3’ transkriptionstermi-nator efter genet af interesse og mellem dette gen og STB-regionen.

DK 176061 B1 23

Referencer

Aigle et al., (1984), Journal of the American Society of Brewing Chemists, 42, 1.

5

Andrews et al., (1985) Cell, 40, 795.

Beggs, (1978), Nature, 275. 104.

10 Beggs (1981), i "Molecular Genetics in Yeast” Alfred Benzon Symposium nr.

16, Munksgaard, København.

Bimboim & Doly, (1980), Nucleic Acids Research, 7,1513.

15 Bolivar, (1978), Gene, 4,121.

Botstein & Davis, (1982), i "The Molecular Biology of the Yeast, Saccharo-myces: Metabolism and Gene Expression", udg. Strathem et al., Cold Spring Harbour Laboratory, New York.

20

Broach & Hicks, (1980), Cell, 21, 501.

Casadaban & Cohen, (1980), Journal of Molecular Biology, 138.179.

25 Cashmore et al., (1986), Molecular and General Genetics, 203. 154.

Chevallier & Aigle, (1979), FEBS Letters, 108.179.

Chevallier et al., (1980), Gene, H, 11.

Clarke & Carbon, (1980), Nature, 287. 504.

30 DK 176061 B1 24

Clark-Walker & Miklos (1974), European Journal of Biochemistry, 41, 359.

Cohen et al., (1980), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 1078.

5

Falco & Dumas, (1985), Genetics, 109. 21.

Futcher, (1986), Journal of Theoretical Biology, 119.197.

10 Futcher & Cox, (1983), Journal of Bacteriology, 154. 612.

Gerbaud et al., (1979), Gene 5, 233.

Gritz et al., (1983), Gene, 25,178.

15

Grunstein & Hogness, (1975), Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 72, 3961.

Guerineau et al., (1974), Biochemical Biophysics Research Communications, 20 61462.

Hadfield et al., (1986), Gene, 45, 149.

Harford & Gathoye, (1985), DNA4, 80.

25

Harford & Peters, (1987), Current Genetics, H, 315.

Hartley & Donelson, (1980), Nature, 286. 280.

30 Henderson et al., (1985), Current Genetics, 9, 113.

i 25 DK 176061 B1

Hicks et al., (1979), Cold Spring Harbour Symposium Quantitative Biology, 43,1305.

Hinchliffe & Box (1985), Proceedings of the European Brewery Convention 5 Congress, 20., Helsinki, 267.

Hinchliffe & Daubney (1986), Journal of the American Society of Brewing Chemists, 44, 98.

10 Hinnen et al., (1978), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 75, 1929.

Ito et al., (1983), Journal of Bacteriology, 153,163.

15 Hyman et al., (1982), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 1578.

Jayaram et al., (1983), Cell, 34, 95.

20 Jiminez et al., (1980), Nature, 287. 869.

Kikuchi, (1983), Cell, 35, 487.

Kingsman et al., (1985), Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 3, 25 377.

Livingston, (1977), Genetics, 86, 73.

Livingston & Hahne, (1979), Proceedings of the National Academy of Sci-30 ences, USA, 76, 3727.

DK 176061 B1 26

Maniatis et al., (1982), i "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbour, New York.

Murray et al., (1987), The EMBO Journal 6,4205.

5

Nelson & Fangman, (1979), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 6515.

Newlon et al., (1981), ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Bio-10 logy, 22, 501.

Orr-Weaver et al., (1981), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 6354.

15 Orr-Weaver et al., (1983), i "Methods in Enzymology", udg. Wu et al., 101.

228, Academic Press, New York.

Rine et al., (1983), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80, 6750.

20

Rose et al., (1984), Gene 29,133.

Rothstein (1983), i "Methods in Enzymology", udg. Wu et al., 101, 202, Academic Press, New York.

25

Seligy et al., (1980), Nucleic Acids Research, 8, 3371.

Sigurdson et al., (1981), Molecular and General Genetics, 183. 59.

30 Som et al., (1988), Cell, 52, 27.

DK 176061 B1 27

Storms et al., (1979), Journal of Bacteriology, 140. 73.

Struhl et al., (1979), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 1035.

5

Taketo et al., (1980), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 3144.

Tubb, (1980), Journal of the Institute of Brewing, 86, 78.

10

Vierra & Messing, (1982), Gene, 19, 259.

Volkert & Broach, (1986), Cell, 46, 541.

15 Volkert & Broach (1987), In Press.

Walmsley et al., (1983), Molecular and General Genetics, 192. 361.

Webster & Dickson, (1983), Gene, 26, 243.

20

Winston et al., (1983), i "Methods in Enzymology", udg. Wu et al., 101.211.

Wu et al., (1986), i "UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology:

Yeast Cell Biology", udg. Hicks, 323.

25

Yocum, (1985), europæisk patentpublikation nr. 163 491.

Claims (6)

11. Fremgangsmåde til fremstilling af en 2 pm plasmidvektor ifølge et vilkårligt af de foregående krav omfattende indsætning i et komplet 2 pm plasmid indeholdende en replikationsorigin (ori) og et STB gen af (i) en DNA-sekvens til udvælgelse af gærtransformanter, (ii) en DNA-sekvens, der koder for et 5 peptid eller protein af interesse, og (iii) en indsats omfattende (a) bakteriel plasmid DNA for at tillade propagering af vektoren i bakterier og (b) elementerne for et FLP-rekombinationssted, så at et ekstra FLP-rekombinationssted dannes i vektoren, og den bakterielle DNA sandwichlægges mellem to FLP-rekombinationssteder med fælles direkte orientering, hvilken DNA-sekvens, 10 der koder for et protein eller peptid af interesse, er indsat mellem ori og STB-genet i det 2 pm plasmid-afledte DNA, så at transkription af DNA-sekvensen ikke fortsætter gennem ori eller STB.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, hvori indsatsen er indsat ved det eneste 15 Xbal-sted af et endogent FLP-rekombinationssted, idet den ene ende af indsatsen bærer en del af en 2 pm gentagelsessekvens, og den anden ende af indsatsen bærer resten af 2 pm gentagelsessekvensen.

13. Gærcelle indeholdende et 2 pm plasmid med en replikationsorigin (ori) 20 og et STB-gen og omfattende en ikke-bakteriel DNA-sekvens kodende for et protein eller peptid af interesse, som er heterologt til gær, hvilket plasmid ikke omfatter bakteriel DNA, der er blevet transformeret ind i cellen, hvilken DNA-sekvens, der koder for proteinet eller peptidet af interesse, er lokaliseret mellem ori og STB-genet, så at transkription af DNA-sekvensen ikke fortsætter 25 gennem ori eller STB.

14. Gærcelle afledt fra en celle ifølge krav 13 ved reproduktion af denne celle og ved reproduktion af dens afkom, og indeholdende et plasmid omfattende en DNA-sekvens kodende for et protein eller peptid af interesse, som er 30 heterologt til gær, hvilket plasmid ikke omfatter bakteriel DNA. DK 176061 B1 31

15. Bryggerigær eller laboratoriegær transformeret med en 2 μιη plasmid-vektor ifølge et vilkårligt af kravene 1-10 og 14.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein eller peptid af interesse, om-5 fattende fermentering af en gær ifølge krav 13, 14 eller 15 og separation af proteinet eller peptidet af interesse. 17. 2 pm gær-plasmidvektor bærende et gen af interesse indsat direkte eller indirekte ved SnaBI-stedet. 10 18. 2 pm plasmidvektor omfattende en bakteriel DNA-sekvens, tre FLP-rekombinationssteder, af hvilke et par af stederne er i direkte orientering, og de øvrige to par er i indirekte orientering, og en DNA-sekvens kodende for et protein eller peptid af interesse, hvilken bakterielle sekvens er lokaliseret 15 mellem de steder, der er i direkte orientering, så at når gær transformeres med denne vektor, elimineres den bakterielle sekvens, og den DNA-sekvens, der koder for et protein eller peptid af interesse, der ikke er lokaliseret mellem de steder, der er i direkte orientering, hvilken vektor bærer et gen af interesse indsat direkte eller indirekte ved SnaBl stedet. 20