CZ2000650A3 - Expresní vektor pro zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách - Google Patents
Expresní vektor pro zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000650A3 CZ2000650A3 CZ2000650A CZ2000650A CZ2000650A3 CZ 2000650 A3 CZ2000650 A3 CZ 2000650A3 CZ 2000650 A CZ2000650 A CZ 2000650A CZ 2000650 A CZ2000650 A CZ 2000650A CZ 2000650 A3 CZ2000650 A3 CZ 2000650A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- yeast
- vector
- fragment
- sod
- gene
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 214
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 37
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 197
- 101150017120 sod gene Proteins 0.000 claims description 75
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 67
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 12
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 claims description 10
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 claims description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 7
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 claims description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 43
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 42
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 6
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 101150005399 sod2 gene Proteins 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150103317 GAL80 gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 2
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150077230 GAL4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid boric acid Chemical compound OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 7h-purin-6-amine;sulfuric acid;dihydrate Chemical compound O.O.OS(O)(=O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100026277 Alpha-galactosidase A Human genes 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 102100029516 Basic salivary proline-rich protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101150004278 CYC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310593 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) SOD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060006006 Cytochrome-c peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 102100027186 Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] Human genes 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000718525 Homo sapiens Alpha-galactosidase A Proteins 0.000 description 1
- 101001125486 Homo sapiens Basic salivary proline-rich protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000836222 Homo sapiens Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 101100238610 Mus musculus Msh3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710130313 Protease B inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710111620 Protein C activator Proteins 0.000 description 1
- 241000235060 Scheffersomyces stipitis Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100032891 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060005989 Tryptase Proteins 0.000 description 1
- 102000001400 Tryptase Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 101100096123 Zantedeschia aethiopica SODCP gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000007323 disproportionation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 101150042777 flp gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150043924 metXA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 229940079877 pyrogallol Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108010045815 superoxide dismutase 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Expresní vektor pro výrobu polypeptidu v kvasinkách
obsahující kódující sekvenci polypeptidu ajiné sekvence
dovolující expresi polypeptidu pouze v kvasinkách, přičemž
postrádájakékolivjiné nekvasinkové sekvence. Kvasinkový
kmen obsahujícítakový vektor. Způsob výroby expresního
vektoru. Způsob výroby kvasinkového kmene zahrnující
transformaci kvasinkového kmene s novýmvektorem a způsob
výroby polypeptidu v takovémto transformovaném
kvasinkovém kmenu zahrnujícíjeho fermentaci a izolaci
polypeptidu.
Description
Expresní vektor pro zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách
Oblast techniky
Vynález se týká nového expresního vektoru pro výrobu polypeptidu v kvasinkách, kmenu kvasinek, který je transformován takovým vektorem, způsobů výroby vektoru, kmene kvasinek a polypeptidu.
Dosavadní stav techniky
V technikách genetického inženýrství pro expresi v kvasinkách jsou běžně používány „shuttle“ vektory (DNA vektory schopné replikace ve dvou různých organismech, také známé jako bifunkční vektory), což jsou nukleotidové sekvence kódující zejména polypeptid v kombinaci se sekvencemi nezbytnými pro expresi v kvasinkách, jako je kvasinkový promotor. Tyto „shuttle“ vektory obsahují také sekvence umožňující expresi v baktériích, například obvykle Escherichia coli nebo další mikroorganismy. Pro konstrukci vektorů jsou používány pouze tyto přídavné nekvasinkové sekvence. Avšak ty jsou pro expresi v kvasinkách nepotřebné. Naopak mohou bránit úěinné expresi polypeptidu v kvasinkách nebo zpomalovat replikaci organismu, protože nadbytečné nukleotidové sekvence musí být zdvojeny také, a replikace obecně je energeticky náročný proces.
Pro výrobu jak homologních, tak heterologních proteinů je obvykle používán jako vynikající mikroorganismus kvasinka Saccharomyces cerevisiae, protože je u ní velice dobře znám genetický systém, rychle se množí a manipulace s ní je technicky výhodná. Navíc, pokrok v DNA transformačních systémech pro zavádění klonovaného genu stejně jako levná a bezpečná nadprodukce tohoto organismu při jednoduchých fermentačních podmínkách, činí tuto kvasinku zvláště vhodnou pro průmyslové uplatnění ve velkých měřítcích.
Je známo množství kvasinkových polypeptidů, zvláštnímu zájmu se těší zejména superoxid dismutázy. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae obsahuje dvě formy superoxid dismutázy (EC 1.15.11), jednu formu obsahující měď a zinek (Cu/Zn SOD) a formu s manganem (Mn SOD). První forma (Cu/Zn SOD) je lokalizována v cytoplazmě, zatímco druhá forma s manganem je omezena pouze na mitochondriální matrix. U tohoto enzymu (SOD) se přepokládá ochranné působení proti volným toxickým radikálům uvolňovaným uvnitř buňky jako intermediát normálního metabolismu (Bilinski, T. a kol. Biochem. Biophys. Res. Commun. 130: 533-539 (1985), Van Loon A. P. G. M. a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:3820-3824 (1986), Lee F. J. a kol. J. Free Rad. Biol. Med. 1: 319-325 (1985), Galiazzo F. a kol. Biochim. Biophys. Acta 965: 46-51 (1988)). Proto se předpokládá, že by mohl být použit při prevenci nebo léčbě možných
• · poškození u lidí, zvláště u poškození spojených s buněčným stárnutím. (Rosen D. R. a kol. Nátuře 362, 59-62 (1993), McCord J. M. a Fridovich I. J. Biochem 244: 6049-6055 (1969), McCord J. M. a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 68:1024-1027 (1971), McCord J. Μ. N. Engl. J. Med. 312:159-163 (1985)).
Gen pro Cu/Zn SOD u kvasinky Saccharomyces cerevisiae byl klonován, sekvenován (Bermingham-McDonogh O. a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 4789-4793 (1988)) a struktura a mechanismus působení tohoto enzymu byl dobře popsán (Djinovic K. a kol. J. Mol. Biol. 225:791-809 (1992), 0‘Neill P. et al. Biochem. J. 251: 41-46 (1988)). Cu/Zn SOD je hojný metaloenzym přítomný vcytoplazmě většiny aerobních a mnoha anaerobních organismů, katalyzuje dismutaci superoxidového aniontu na kyslík a peroxid vodíku.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je zvýšit výtěžek polypeptidu ve fermentačním procesu kvasinek transformovaných expresním vektorem kódujícím tento polypeptid. Dále navrhuje takové nové vektory, které jsou schopny exprimovat požadovaný polypeptid ve vyšším množství ve srovnání s dosavadními vektory. Je zde prezentován nový kmen kvasinky, který je transformován takovým vektorem a který je lepší ve srovnání s divokým kmenem nebo kmenem transformovaným „shuttle“ vektorem.
Je připraven expresní vektor podle vynálezu, stejně jako kmen kvasinky, zvláště kmen Saccharomyces cerevisiae, transformovaný tímto vektorem, který produkuje větší množství kvasinkových nebo nekvasinkových polypeptidů, například enzymů, například Cu/Zn superoxid dismutázy, než divoký kmen nebo kmen transformovaný „shuttle“ vektorem. Jsou zde shrnuty způsoby přípravy a expresi vektoru, kmenů kvasinky a endogenních kvasinkových polypeptidů.
Odborníkům v této oblasti bude jasných mnoho aspektů a výhod vynálezu při zamyšlení nad detailním popisem a obrázky podle vynálezu, které jsou pouze ilustrativní.
Příklady provedení vynálezu
Ve vynálezu byly použity primery DNA s následujícími primárními sekvencemi, které jsou podrobně popsány v Seznamu sekvencí (bp regiony primerů byly převzaty z vektoru EMBL, Gene Bank accession No JO3279):
SEQ ID NO 1: externí primer SOD-3, region proti směru exprese genu 81-102 bp
SEQ ID NO 2: externí primer SOD-2, region po směru exprese genu 1018-1036 bp
SEQ ID NO 3: interní primer SOD-4, region 971-991 bp
Následují krátké popisy obrázků, které slouží k jednoduššímu pochopení vynálezu.
• · · • · φ
ΦΦΦ
Obr. 1 ukazuje část kódovaného regionu genu pro Cu/Zn SOD z kmenu kvasinky S288C s pozicí externích primerů SOD3 a SOD2 a interního primeru SOD4 navržených v regionech proti směru exprese apo směru exprese lokusu SOD genu.
Obr. 2 ukazuje nový molekulami plazmidový konstrukt p EMBL-SOD 374, což je plazmid pEMBLyex4 s 374 bp regionem proti směru exprese genu, kódující sekvence a region po směru exprese genu kvasinkové Cu/Zn SOD pod kontrolou kvasinkového promotoru GAL/CYC.
Obr. 3 ukazuje mapu konečného plazmidu pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli obsahující 374 bp region proti směru exprese genu, kódující sekvenci a region po směru exprese genu kvasinkové Cu/Zn SOD mezi restrikčními místy EcoRI a HindlI, pod kontrolou kvasinkového promotoru GAL/CYC, obsahuje pouze kvasinkové sekvence a replikuje se pouze v kvasince.
Vynález se zaměřuje zejména na první provedení nové exprese vektoru pro výrobu polypeptidu v kvasinkách obsahujících sekvenci kódující polypeptid a další sekvence umožňující expresi tohoto polypeptidu pouze v kvasinkách, tento vektor neobsahuje žádné nekvasinkové sekvence.
Termínem expresní vektor se míní vektor, zvláště DNA vektor, například plazmid, který obsahuje sekvenci kódující polypeptid, promotorovou sekvenci ve čtecím rámci škodující sekvencí, a případně další sekvence nezbytné pro účinnou výrobu nebo použití vektoru, například ori, vedoucí sekvence, terminační sekvence a sekvence kódující gen pro selekci vektoru s polypeptidem. Tyto sekvence jsou odvozeny pouze z kvasinek a jsou v oboru dobře známy.
Sekvence kódující uvedený polypeptid je kvasinková nebo nekvasinková sekvence Kvasinkové sekvence jsou například takové sekvence kódující kvasinkový polypeptid s enzymovou funkcí, například antioxidativní enzym, jako je superoxid dismutáza, thiol specifický antioxidant TSA nebo cytochrom c peroxidáza, proteázy, například prekursor cerevizinu PRB1, proteázové inhibitory, například inhibitor 2 proteázy B, cytokiny a podobně.
Sekvence kódující nekvasinkové polypeptidy jsou odvozeny od libovolného dalšího žijícího organismu, zvláště od lidí a zvířat. Tyto polypeptidy jsou výhodně využívané v medicíně a zahrnují lidský inzulín, aktivátor tkáňového plazminogenu, interferony, erytropoetin, růstové faktory, například keratinocytámí růstový faktor, enzymy, například tryptáza, aktivátor proteinu C, enzymové inhibitory, například tkáňové inhibitory metaloproteáz (TIMP), inhibitory elastázy a podobně. Sekvence kódující tyto užitečné polypeptidy jsou v oboru známy.
Všechny tyto sekvence jsou pod kontrolou kvasinkového promotoru. Využitelné kvasinkové promotory jsou v oboru dobře známy a zahrnují například GAL/CYC promotor.
• · · ·
Konečný vektor podle vynálezu je aplikovatelný pouze v kvasinkách. S výjimkou nekvasinkových sekvencí, kódující nějaký požadovaný nekvasinkový polypeptid, chybí jakékoliv nekvasinkové sekvence.
Výhodný vektor sestrojený podle vynálezu je kvasinkový plazmid obsahující gen pro Cu/Zn SOD, který je pod kontrolou GAL/CYC promotoru, a nachází se zvláště v plazmidu pEMBL-SOD, w/oMCS,w/oColi.
Tento plazmid může být využitý jako startovní plazmid pro konstrukci expresního vektoru, kde gen pro Cu/Zn SOD je vyměněn za sekvenci kódující jakýkoliv jiný polypeptid.
V dalším provedení podle vynálezu je způsob výroby nového expresního vektoru popsaného výše. Způsob výroby nového expresního vektoru podle vynálezu je charakterizován tím, že z „shuttle“ vektoru schopného exprese polypeptidů u kmene kvasinky jsou všechny nekvasinkové sekvence odstraněny a případně sekvence kódující daný polypeptid je nahrazena sekvencí kódující jiný polypeptid.
Nové expresní vektory jsou získány konvečním způsobem ze známých „shuttle vektorů, například kvasinkový integrační plazmid Yip, kvasinkový replikaění plazmid Yrp, kvasinkový centromerický plazmid Ycp nebo kvasinkový episomální plazmid Yep, které jsou konstruovány tak, aby obsahovaly polypeptidový gen a neobsahovaly nekvasinkové DNA sekvence.
Výchozí shuttle vektory mohou obvykle zahrnovat sekvence kódující požadovaný polypeptid pod kontrolou kvasinkového promotoru, například GAL/CYC promotoru. Příkladem tohoto vektoru je plazmid pEMBL-SOD 374 nebo pEMBL-SOD ATG. Tyto plazmidy jsou použity jako intermediáty pro výrobu konečného vektoru podle vynálezu. Pokud dosud není dostupný gen, konstrukce začíná izolací genu kódujícího požadovaný polypeptid z jeho známého zdroje, například z člověka, zvířete nebo divokého kmene mikroorganismu. Gen je multiplikován všeobecně známou polymerázovou reakcí PCR metodou pomocí syntetických primerů, a vložen do vektoru, obvykle do shuttle vektoru. Z intermediátního vektoru jsou odstraněny všechny nekvasinkové sekvence, například bakteriální sekvence zahrnující násobná klonovací místa (multiple cloning sites), například replikony ORI bakteriálního původu, selektující značky, replikony původem z filamentózního bakteriofága fl, geny způsobující rezistenci vůči ampicilinu a podobně, využívány jsou běžné restrikční enzymy.
Následuje detailnější diskuse o použitých metodách. Exprese genu vyžaduje umístění genu, což je DNA sekvence kódující požadovaný polypeptid, pod kontrolu silného kvasinkového promotoru, který bude přímo řídit syntézu odpovídající mediátorové RNA. DNA regulační části nutné pro expresi jsou neseny kvasinkovým vektorem.
• · · ·· ···· ·· · · • · · · · · ···· · ·· · • · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ··
Shuttle vektory jsou takové vektory, které mohou být exprimovány v kvasinkách stejně jako baktérii v Escherichia coli za účelem pohodlné manipulace a přípravy různých intermediátních plazmidů ve velkém množství.
Bylo vyvinuto mnoho různých kvasinkových integrujících (Yip), replikujících (Yrp), centromerních (Ycp) a episomálních (Yep) plazmidových vektorů (Rose A. B., Broch J. R. Methods in Enzymology, 185:234-279 (1990), Schneider J. C., and Guarente L. Methods in Enzymology, 194: 373-388 (1991)).
Plazmid, který byl vybrán pro expresi genu pro Cu/Zn SOD je specifický Yep (kvasinkový episomální plazmid) shuttle vektor pEMBLyex4 velký 8 800 bp (Cesarani a Murray, v Setlow
J. K. (ed) Genetic Engineering: Principle and Methods, Volume 9, Plenům Press, NY 134-135 (1987)).
Tento vektor nese dvoumikronový kvasinkový episom (malý dvoušroubovicový DNA plazmid přítomný v jádře většiny kmenů Saccharomyces cerevisiae), který zajišťuje velkou mitotickou stabilitu a schopnost autozomální replikace (Murray J. A. H., Mol. Microbiol., 1:1-4 (1987), Hartley and Donelson, Nátuře, 286:860-864 (1980), Clark-Walker G. D. and Miklos G. L. G., Eur. J. Biochem., 41:359-365 (1974), Fuchter A. B., and Cox B. S. J., Bacteríol., 157: 283-290 (1984)).
Perzistence plazmidu je způsobena přítomností lokusu REP 3 (zodpovědný za rozdělení plazmidu během buněčného dělení) a sekvence ARS (počátek replikace) v dvoumikronové částici.
Plazmid pEMBLyex4 nese selektující značky LEU 2 a URA 3, které obě jsou velice výhodné při selekci výchozích kvasinkových transformovaných buněk, a zajišťují stálý selekční tlak pro udržení plazmidu v buňce kvasinky (Alani E. et al., Genetics., 116:541 (1987), Gritz. and Davies J., Gene, 25: 179(1983), Kaster K. R. et al., Curr. Genet., 8:353 (1984), Řine J. et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 80:6750 (1983)).
Nicméně ale tyto druhy plazmidů vykazují obecně dobré uchovávání v buňce, i když chybí pozitivní selekce. V takových neselekčních podmínkách buňka může ztrácet plazmid rychlostí 4 procenta na generaci. Plazmid pEMBLyex4 tvoří část speciální třídy dvoumikronových vektorů s vysokým počtem kopií (přibližně 100 až 200 kopu na buňku).
Navíc k propagaci plazmidu byl použit kvasinkový kmen, který postrádá dvoumikronový episom (cir°). Je známo, že stabilita pEMBLyex4 je u takových kmenů velice vysoká a to dokonce bez dalšího selekčního tlaku.
Plazmid pEMBLyex4 zahrnuje úplnou kvasinkovou hybridní kazetu UAS Gal/CYC. Kazetový promotor obsahuje aktivační místo proti směru exprese genu (UAS sekvence) a • ·· Μ · · 0 · 0 0 ··
0 0 0 0 0 0 00·· • · 0 · · 000 · 0 · 0 promotorovou oblast (TATA box) jednak kvůli vysoké úrovni transkripce po směru genu a jednak kvůli regulaci exprese, dále obsahuje násobné klonovací místo (MCS) pro vložení genu a terminační část (Guarente L. et al., Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 79:7410-7414 (1982)). Hybridní kazeta UAS gal/CYC nese ve směru od 5‘ k 3‘ konci následující oblasti:
fragment 365 bp (Sau3 A-Xhol) z aktivační sekvence proti směru exprese genu v oblasti mezi kvasinkovými geny GAL4 a GAL10, které obsahují vazebnou oblast pro produkt genu GAL4;
region 250bp (Xhol-Sstl), který obsahuje promotor kvasinkového genu CYC1 s TATA boxem a startovním místem pro mRNA, ale bez ATG regionu;
polylinker 95 bp (Sstl-HindlII) se specifickými místy pro restrikční enzymy;
region 250 bp (v HindlII-SnaBI fragmentu) nesoucí polyadenylační a terminační transkripční signál, z genu2-mikron FLP.
Expresní systém je regulován produkty genů GAL4 a GAL80. Protein GALA je transkripční aktivátor, který se váže na sekvence UAS gal. Aktivita GAL 4 proteinu je inhibována vazbou proteinu GAL80 na jeho C-terminální oblast. Systém je deprimován glukózou která inhibuje vazbu proteinu GAL4 na UASgal, a je indukován galaktózou, která způsobuje disociaci proteinu GAL80 z proteinu GAL4.
V dalším provedení vynález zajišťuje nový kvasinkový kmen transformovaný expresním vektorem podle vynálezu.
Druh kvasinky je jakýkoliv známý druh využitelný pro expresi kvasinkových nebo nekvasinkových polypeptidů, například Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces occidentalis, nebo kvasinky jiné než Saccharomyces například Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Sckwanniomyces occidentalis and Pichia stipitis.
Výhodný nový kmen je například Saccharomyces cerevisiae se zvýšenou schopností syntetizovat enzym Cu/Zn SOD díky inserci relativně homogenního kmene do intracelulámflio kompartmentu.
Výhodné intermediátní kvasinkové kmeny podle vynálezu jsou například GRF 18 transformovaný plazmidem pEMBL-SOD 374 nebo plazmidem pEMBL-SOD ATG, které jsou vyrobeny, izolovány a charakterizovány.
Další část vynálezu je způsob výroby kvasinkového kmene transformovaného expresním vektorem kódujícím endogenní kvasinkový polypeptid, bez jakékoliv nekvasinkové sekvence a schopným produkovat nadbytek daného kvasinkového polypeptidů vdaném kmenu kvasinky charakterizovaného jako kvasinkový kmen transformovaný novým vektorem popsaným zde.
···· ·· ·· • · · · · · ftft·· · · · ·
Transformace je prováděna metodami běžnými v oboru, jako je například LiCl metoda popsaná v práci Ito a kol., e. g. modifikovaná podle R. H. Schiestl a kol. (1989), Current Genetics. 16, 339-346, nebo metoda podle práce Hinnen a kol., (1978), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933.
V dalším provedení vynález zabezpečuje způsoby výroby poiypeptidu v kvasinkovém kmeni, to zahrnuje fermentací kmene kvasinky transformovaného expresním vektorem podle vynálezu.
Fermentace je prováděna metodami běžnými v oboru, jako je chemostatová metoda s kontrolovaným přísunem glukózy během růstové fáze a indukce exprese přídavkem galaktózy uprostřed růstové fáze podle práce Alberghina, Lilia, a kol., (1991), Biotech. and Appl. Biochem. 14,82-92.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci vynálezu a jsou zamýšleny jako postupy prováděné za účelem izolace a charakterizace genu kvasinkového enzymu, například Cu/Zn SOD genu, z tradičního kmene Saccharomyces cerevisiae, jako postupy prováděné za účelem exprese genu kvasinkového enzymu v kmenu kvasinky pod kontrolou silného kvasinkového promotoru a jako vývoj a charakterizace kmene kvasinky schopného produkovat vysoké koncentrace enzymu, jako například SOD protein.
V rámci vynálezu jsou použity následující zkratky:
| ARS | autonomní replikovaná sekvence |
| EDTA | ethylendiamintetraoctová kyselina |
| EMBL | Evropská laboratoř molekulární biologie |
| LB | médium Luria Bertani |
| MCS | násobné klonovací místo |
| PCR | polymerázová řetězcová reakce |
| PIU | pyrogalolová inhibiční jednotka |
| REP | replikon ( krátká sekvence DNA, která slouží v buňce jako předloha při DNA replikaci) |
| SDS | dodecyl sulfát sodný |
| SOD | superoxid dismutáza |
| TBE | pufr tris-borát-EDTA |
| TE | pufr tris-EDTA |
| w/oColi | bez sekvencí Escherichia coli |
| w/oMCS | bez míst násobného klonování |
• · · 4 4 4 4 4· · 4 ·· • ••4 · 4 4 4 ···
4 4 4 4 ·*4 · · · ·
444 ·· · ···
444 44 44 444 ·4 *·
| Ycp | kvasinkový centromerní plazmid |
| Yep | kvasinkový episomální plazmid |
| YEPD | médium kvasinkový extrakt-pepton-dextróza |
| YIp | kvasinkový integrační plazmid |
| Yrp | kvasinkový replikaění plazmid |
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad se vztahuje k extrakci a purifikaci kvasinkové genomové DNA, která je dále využívána jako zdroj pro izolaci kvasinkového genu pro Cu/Zn SOD.
Zdroj DNA za účelem izolace Cu/Zn SOD genu může být jakýkoliv divoký kmen kvasinky. V tomto specifickém případě byla DNA extrahována z kmene Saccharomyces cerevisiae S288C, divoký typ, gal2 a W309, divoký typ.
Podobná extrakce DNA může být prováděna s využitím jiných divokých typů kvasinkových kmenů, například W303, jako zdroj DNA.
Haploidní kmen S288C je typický kmen kvasinek, který je běžně využíván ve většině laboratoří molekulární biologie ve světě pro izolaci kvasinkových genů a genetické a biochemické studie. (Mortimer R. K. and Johnson J. R., Genetics, 113:13 (1986)).
Kmen W309 je považován za potenciální náhradní zdroj. Oba kmeny jsou známé jako přenašeče kopie divokého typu genu Cu/Zn SOD v jejich genomu. Tyto kmeny byly poskytnuty pracovištěm Departement of Physiology and General Biochemistry, University of Milan.
Postup, který byl použit pro izolaci celkové kvasinkové genomové DNA byl sestaven na základě metod v práci Cryer, Ecclesial and Marmur, Methods Cell Biology, 12:39-44 (1975) následovně:
Buňky kvasinek z petriho misek s YEPD mediem byly použity jako inokulum do 200 ml kompletního média YEPD (1% Bacto-yest extrakt, 2% Bacto-pepton, 2% dextróza). Kultivace probíhala v 1 litrových baňkách při teplotě 30°C přes noc za stálého míchání až do pozdní exponenciální fáze (přibližně 8x107 buněk/ml).
Všechny buňky (8x108) byly využity pro extrakci DNA. 10 ml buněk bylo zakoncentrováno centrifugací v polypropylenové zkumavce, pelet byl převeden do mikrozkumavky 1,5 ml. Do této mikrozkumavky bylo přidáno 300 mikro litrů lyžujícího pufru • ·· · • · · (0,15 M NaCl, 0,1 Μ EDTA, pH 8, SDS 1%) a 300 mikrolitrů skleněných kuliček (průměr 0,5 mm). Buňky byly vortexovány pětkrát za chlazení ledem, s přestávkami 1 minuta:
Buněčná suspenze byla homogenizována vortexováním s 600 mikrolitry roztoku fenolchloroform-TE a centrifugována 2 minuty. Horní vodná fáze byla převedena do nové mikrozkumavky, bylo přidáno 600 mikrolitrů roztoku chloroform-isoamylalkohohol (24:1) a obsah zkumavky byl dobře promíchán.
Horní fáze byla převedena do nové mikrozkumavky a inkubována při teplotě 37°C po dobu 30 minut s RNAzou v konečné koncentraci 1 mg/ml. Po vysrážení etanolem byl pelet znovu rozsuspenzován v TE pufru (10 mM Tris, lmM EDTA, pH 8).
Touto metodou bylo připraveno 100 mg kvasinkové genomové DNA v koncentraci 1 mg/ml, dostatečné množství pro mnoho experimentů.
Příklad 2
Izolace chromozomálního regionu s genem pro Cu/Zn SOD
K izolaci chromozomálního regionu s genem pro Cu/Zn SOD byla použita polymerázová řetězcová reakce (PCR).
Gen pro Cu/Zn SOD je uložen na pravém raménku chromozómu X u Saccharomyces cerevisiae mezi klastrem cycl-rad6-SUP4-cdc8 a regionem cdcll (Chang a kol. J. Biol. Chem. 266: 4417-4424 (1991). Neobsahuje žádné introny ve své kódující sekvenci, proto je možné izolovat úplný translační region přímo z genomové DNA pomocí PCR. Navíc u tohoto genu jsou známy jak region 5‘ proti směru translace genu, tak region 3‘ po směru translace genu.
K přípravě PCR reakce je nezbytný pár primerů (syntetických oligonukleotidů, které vymezují SOD gen mezi oblastmi ve směru a proti směru exprese genu.
Tyto primery byly navrženy s využitím analytického software OLIGO primer, Version 4.0 ( National Biosciences lne. Plymouth) tak, aby pokryly oblast publikované genové sekvence Cu/Zn SOD v délce 1037 bp ( Bermingham-McDonogh O., Gralla E., Valentine J. PNAS. 85, p,4789 (1988) (EMBL/Gene Bank, accesion n°J03279).
Primery byly syntetizovány na syntetizátoru Applied Biosystem 392 Nucleic Acid ( Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA) a přečištěny pomocí gelové filtrace na koloně Sephadex G-25 DNA grade NAP-25 (Pharmacia P-L Biochemicals lne; Milwaukee, Wisconsin).
V souladu s obecnou strategií usilující o zvýšení šance izolovat gen pro Cu/Zn SOD z kvasinkového genomu byla použita tzv. „semi-nested PCR“. Tato strategie využívá dvoukrokový postup, které vyžadují tři různé primery (obr. 1).
4444 44 44 • 4 4 4 · 4 4 • ···· · 4 4 «
444
4 4 4 4 4 4 • 4 ·«· 44 44
První krok, který využívá dva primery (jeden ve směru a jeden proti směru exprese genu, například SOD-3 a SOD-2), umožňuje amplifikaci velké oblasti genomu. Tento krok je následován druhou amplifikaci, která používá nový vnitřní primer (SOD-4) a jeden z předchozích dvou primerů (SOD-3), které konečně umožňují izolaci a znovuzískání genu pro SOD.
První část PCR amplifikace byla prováděna s následujícími primery:
SOD-3 (primer proti směru exprese genu, region 81-102 ze sekvence uložené v EMBL/Gene Bank, Accession No J03279):
SEQ ID No 1: 5‘-GGA CGT AAG CAT CTC TGA AGT G-3‘ (22 bp, (tm = 66°C)
SOD-2 (primer po směru exprese genu, region 1018-1036 ze sekvence uložené v EMBL/Gene Bank, Accession N° J03279):
SEQ ID No 2: 5‘-GCC GTC GAC GGA CCC CTC AAG ACC CCT C-3‘ (28 bp, tm = 64°C)
SOD-2 primer obsahuje specifický region o délce 19 bp (tm = 64°C) a 5‘-nespecifický region, který nese restrikční místo BamHI.
DNA amplifikace byla prováděna v 100 ml reakční směsi 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 500 mM koncentrace každého deoxynukleotidu (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,5 mM koncentraci každého primerů, 50 nebo 100 ng genomové DNA a 2,5 jednotek Taq DNA polymerázy (Perkin-Elmer Corp.). Čas a teplota v každém amplifikačním kroku byly následující: 1 minuta při teplotě 94°C pro denaturaci, 1,5 minut při 63°C pro nasednutí primerů a 2 minuty pro syntézu řetězce.
PCR reakce dala vzniknout DNA fragmentu o délce 965 bp, stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu. Tento fragment může zahrnovat úplnou kódující sekvenci genu pro SOD o délce 462 bp, sekvenci proti směru exprese genu o délce 331 bp a sekvenci ve směru exprese genu o délce 172 bp.
Další krok dvoukrokové PCR (semi-nested) byla prováděna s využití primerů SOD-3 a třetího vnitřního primerů SOD-4, který nasedá na region 971-991 sekvence uložené v EMBL/Gene Bank, accession N°J03279 a má následující sekvenci:
SEQ ID NO 3: 5'-GCC GTC GAC ACA CTT GGT GAA TGA TCA AGG-3' • *« 44 »»·> 44 «» · t · 4 4 4 4 « 4
4 · 4 «44» φ « ·· «·· 4 4 4 4 4 4 4 • · · · 4 · · * 4 *
444 44 »4 44« 44 44
Primer SOD-4 obsahuje specifický region o délce 21 bází (Tm = 60°C) a 5'-nespecifický region, který kóduje restrikční místo Sáli.
Dvoukroková PCR , prováděná za výše uvedených podmínek s výjimkou teploty kroku nasedání primerů, která byla 60°C, dala vzniknout kratšímu fragmentu DNA o délce 920 bp. Tento fragment může obsahovat úplnou kódující sekvenci genu pro SOD o délce 462 bp, sekvenci proti směru exprese genu o délce 331 bp a sekvenci ve směru exprese genu o délce 127 bp.
Příklad 3
Subklonování genu pro Cu/Zn SOD do plazmidového vektoru pCRII
Tento příklad popisuje subklonování genu pro Cu/Zn SOD do plazmidového vektoru pCRII.
Po amplifikaci byl produkt reakce nanesen na 1,2% agarózový gel s nízkou teplotou tání a byl podroben elektroforéze (miniSubgel DNA cell, BIO-RAD Laboratories, lne. Hercules, CA USA). Odpovídající úsek DNA byl poté izolován z agarózového gelu standardními metodami a přečištěn fenolovou extrakcí (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T. Molecular Cloning. A manual laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 1989).
Purifikovaný fragment byl nakonec vložen ligací do místa násobného klonování (MCS) linearizovaného plazmidu pCRII o délce 3932 bp pomocí enzymu T4 DNA ligázy (12°C, 16 hodin) a za využití TA Cloning System (Invitrogen Corp. San Diego, CA).
Vektor pCRII je klonovací vektor, který obsahuje jednoduchý 3' deoxythymidylátový přesah, což dovoluje přímou ligaci PCR produktů a genů kódujících resistenci nositele vektoru vůči ampicilinu a kanamycinu pro jeho selekci v buňkách E. coli.
Konstrukt (například plazmid pCRII a insert) byl potom transfektován a replikován v buňkách E. coli HB 101.
Konečně, plazmidová DNA byla z bakteriálních buněk extrahována metodou alkalické lyže podle práce Birnboim a Doly ( Birnboim H. C., J. Doly. 1979 Nucleic Acid Research. 7:1513) a přečištěn na koloně Nucleobond AX-100 (Macherey-Nagel GmbH, Duřen, Germany).
Příklad 4
Konstrukce plazmidu pEMBL-SOD 374
Konstrukt byl připraven pomocí plazmidu pEMBLyex4 jako vektoru, ve kterém byl klonován předem izolovaný lokus obsahující gen pro SOD, region proti směru exprese genu a modifikovaný region po směru expresu genu.
Konstrukt byl pojmenován pEMBL-SOD 374 a je ukázán na obr. 2. Je to konstrukt, ve kterém je subklonovaný fragment nesoucí kódující region genu pro SOD (462 bp) a region proti směru exprese genu o délce 374 bp.
Fragment nesoucí gen pro Cu/Zn SOD, předtím subklonovaný do plazmidu pCRII byl k přípravě konstruktu přímo vyštěpen restrikčními enzymy BamHI a Sáli.
Výše zmíněné enzymatické štěpení dalo vzniknout fragmentu Bam HI-SalI o délce 963 bp, který byl přečištěn do homogenity gelovou elektroforézou a subklonován do místa BamHI-SalI vektoru pEMBLyex4.
Příklad 5
Příprava kvasinkového kmene X4004 a GRF18 transformovaného pEMBL-SOD 374
Exprese kvasinkového genu pro Cu/Zn-SOD z plazmidu pEMBL-SOD 374 byla testována po jeho zavedení do dvou různých kmenů Saccharomyces cerevisiae, které jsou obvykle často používány pro expresi homologních nebo heterologních genů v kvasinkách (Martegani a kol., Appl. Microbiol. Biotechnology. 37: 604-608 (1992), Alberghina L. a kol., Biotechnology and Applied Biochemistry. 14:82-92 (1991), Pradyumna K. a kol., Bitoechnology and Bioeng. 40:235-246 (1992), Yong Soo Park a kol., Biotechnology and Bioeng. 41:801-810 (1993), JihHan Hsieh a kol., Biotechnology and Bioeng. 32: 334-340 (1988)).
Byly použity následující haploidní kmeny:
-X4004, s genotypem: MATa/lys5/ura3/met2/trpl a
-GRF18 s genotypem MATa/leu2-3,112/His3-l 1,15.
Tyto kmeny mohou být fermentovány s vysokým výtěžkem biomasy v selektivních nebo semisyntetických médiích díky znakům přítomným na plazmidovém vektoru pEMBLyex4 (LEU2-d a URA3), které doplňují leucinovou auxotrofii u kmene Ieu2-GRF18 (kmen GRF18 nese dvojitou mutaci čtecího rámce leu 2-3,112, která se ztrácí s extrémně nízkou frekvencí) a uracilovou auxotrofii kmenu ura3-X4004.
Přirozeně, po inzerci plazmidu, nový kmen ztratil tyto specifické auxotrofie. GRF18, nesoucí nový plazmid, zůstal stále ještě auxotrofiií vůči histidinu, zatímco X4004, nesoucí nový plazmid, zůstal auxotrofiií vůči methioninu a tryptofanu.
Transformace kvasinek plazmidovým konstruktem byla provedena následujícím způsobem.
Před transformací:
-zaočkovat kvasinky kmene (X4004 nebo GRF18) na petriho misky na agarózovém médiu,
-rozsuspendovat buňky nabrané smyčkou z misky do sterilizované destilované vody o objemu 10 ml,
-sonikovat 5 minut a spočítat pomocí přístroje Coulter Counter (A6Oo menší než 0,1),
-inokulovat celkové množství 4x107 buněk (2-3x105 buněk /ml, A^oo okolo 0,6) do 200 ml YEPD média (v baňce o objemu 11),
-nechat růst 16 hodin při teplotě 30°C za mírného třepání ( okolo 6 generací) do koncentrace lxlO7 buněk /ml (Aóoo = 2-3)
YEPD kompletní médium pro rutinní pěstování buněk před transformací bylo připraveno následujícím způsobem:
1% kvasinkový extrakt, 2% pepton, 2% glukóza, 2% Bacto agar ( pro kultivaci na pevném médiu) a destilovaná voda. Všechny komponenty byly autoklávovány 20 minut při teplotě 120°C.
Transformace byla prováděna následujícím způsobem:
Na jeden běh transformace (transformace kmene s 1 mg DNA plazmidu) bylo použito celkové množství buněk 2xl08, na pět paralelních transformací bylo použito celkově lxlO9 buněk (100 ml buněčné suspenze obsahovalo lxlO7 buněk/ml). Transformace byla prováděna Itovou metodou s chloridem litným modifikovanou podle Schiestla a Gietze (R. H. schiestli, R.
D. Gietz, High efficiency transformation of intact yest cells using single stranded nucleic acid as a carier, (1989), Current Geneteics. 16:339-346). Transformace byla prováděna na agarových miskách (syntetické minimální médium) bez leucinu ( za účelem selekce buněk GRF18 obsahujících plazmid) nebo bez uracilu (za účelem selekce buněk X4004 obsahujících plazmid), kultivace probíhala při teplotě 30°C. Jednotlivé kolonie byly uchovány buď při teplotě 4°C zaočkováním na čerstvé selektující misky nebo při teplotě -80°C v 15% glycerolu.
Všechny transformace byly provedeny dvakrát na základě následujícího schématu:
plazmid DNA (1 mg) pEMBL-SOD374 pEMBLyex4 pEMBL-SOD374 pEMBLyex4 kmen kvasinky (2x108 buněk)
X4004
X4004 (negativní kontrola) GRF18
GRF18 (negativní kontrola)
Kmen GRF18 byl kultivován na syntetickém médiu bez aminokyseliny leucin za účelem selekce kmenů obsahujících plazmid, v případě kmene X4004, bylo použito syntetické médium bez uracilu.
Indukce exprese v obou případech byla provedena převedením buněk z minimálního média obsahujícího glukózu do média obsahujícího galaktózu jako zdroj uhlíku a to následujícím způsobem:
Transformované buňky vyrostlé na agarových miskách byly použity k zaočkování 50 ml syntetického minimálního média ( bez leucinu pro transformovaný kmen GRF18 nebo bez uracilu pro transformovaný kmen X4004) obsahujícího 2% glukózu, kultivace probíhala při teplotě 30°C po dobu 12-14 hodin za mírného protřepávání a aeraci až do koncentrace buněk 2,5-3 xlO7 na mililitr (A6Oo — 4-5). 50 ml selektujícího syntetického média obsahujícího 2% galaktózu bylo inokulováno celkovým množstvím buněk 5x107 (2 ml vyrostlé buněčné suspenze), do konečné koncentrace buněk lxl O6 na mililitr. Kultivace probíhala 17-18 hodin (přibližně 7 generací ) při 30°C za mírného protřepávání až do koncentrace buněk 2-3x107 na jeden mililitr (A^oo ~ 4-5). 2x108 buněk celkově bylo odděleno (asi 10 ml kultury) a použito pro extrakci proteinu.
Médium pro růst transformovaných buněk bylo připraveno následujícím způsobem:
Syntetické selektivní médium (pro růst transformovaných buněk kmene X4004): 2% zdroj uhlíku ( glukóza nebo galaktóza), 2% Bacto agar ( pro kultivaci na petriho miskách), 50 mg/1 hydrochloridů L-lysinu, 50 mg/1 L-methioninu a destilovaná voda. Komponenty byly autoklávovány 20 minut při teplotě 120°C, přidal se zdroj kvasinkové dusíkaté báze (YNB) bez aminokyselin (přefiltrovaný koncentrovaný zásobní roztok 10x(67 g/litr)), 50 mg/ml Ltryptofanu (přefiltrovaný koncentrovaný zásobní roztok;
Syntetické selektivní médium (pro růst transformovaných buněk kmene GRF18): 2% zdroj uhlíku (glukóza nebo galaktóza), 2% Bacto agar (pro kultivaci na petriho miskách), 50 mg/litr Lhistidinu, destilovaná voda. Komponenty byly 20 minut autoklávovány při teplotě 120°C, přidal se zdroj kvasinkové dusíkaté báze (YNB) bez aminokyselin (přefiltrovaný koncentrovaný zásobní roztok 10 x (67 g/litr)).
Schopnost mikrobiálního kmene produkovat daný polypeptid byla testována následujícím způsobem.
Na počátku je vhodné ohodnotit produktivitu jednoduchého polypeptidového řetězce. První otázka, kterou je nutné zodpovědět je ta, jestli proces exprese v nové buňce je efektivní ve vztahu k biosyntéze požadované chemické jednotky. V prvním kroku byl celkový proteinový extrakt podroben elektroforéze na polyakrylamidovém gelu v denaturujícím prostředí SDS, kde se rozdělil podle molekulové hmotnosti polypeptidových řetězců, tak se testovala přítomnost velkého množství chemické jednotky, například polypeptid v buněčném extraktu. Navíc, jelikož mohl být k dispozici isogenní kvasinkový kmen (negativní kontrola), který neobsahuje expresní
• *
• 0 ·· • ♦ · · • · · 0 • · · 0 » · · · plazmid s genem pro SOD, mohl být srovnán elektroforetický profil buněčného extraktu z kmene obsahujícího plazmid s buněčným extraktem získaným z tradičního kmene. Protože je známa molekulová hmotnost SOD (polypeptidový řetězec SOD je složen ze 154 aminokyselin s odpovídající molekulovou hmotností 15 700 Daltonů), byly tyto dva profily srovnávány v oblasti gelu svýše uvedenou molekulovou hmotností odpovídající SOD. Vizualizace byla provedena nespecificky pomocí Coomassie-blue.
Analytické metody použité k určení produktivity klonu byly, SDS-polyakrylamidová elektroforéza, byla provedena podle následujícího postupu:
Extrakce kvasinkového proteinu:
Postup, který byl použit pro přípravu celkových proteinových extraktů z kvasnic, je částečně modifikovaná metoda podle Jazwinského ( S. Michail Jazwinski, 1990, Methods in Enzymology, vol. 182 p. 154) a to následovně:
-2x108 buněk bylo zahuštěno (ve zkumavce 15 ml) centrifugací (4000 otáček za minutu při teplotě 4°C, 5 minut),
-pelet byl promyt sterilní vodou při teplotě 4°C ( převeden do mikrozkumavek),
-pelet byl resuspendován ve 400 mikrolitrech IX PBS pufru,
-bylo přidáno 400 mikrolitrů skleněných kuliček (předchlazené na teplotu -20°C),
-byly přidány 4 mikrolitry (1 mg/ml) pepstatinu (inhibitor proteáz),
-směs byla vortexována 3 minuty (dvakrát, chlazeno ledem),
-při teplotě -20°C bylo uchováno 10 mikrolitrů supernatantu na proteinovou zkoušku.
Obarvení gelu Coomassie blue ukázalo ve vzorcích (GRF 18 buňky transformované plazmidem pEMBL-SOD 374) elektroforetický proužek odpovídající molekulové hmotnosti kvasinkového proteinu Cu/Zn SOD nanesenému na stejný gel.
Tyto proužky nebyly pozorovány u negativní kontroly ( GRF 18 buňky transformované plazmidem pEMBLyex4, který neobsahoval gen pro SOD a buňky X4004 transformované plazmidem pEMBLyex4, který neobsahoval gen pro SOD). Na polyakrylamidový gel bylo naneseno přibližně stejné nmožství proteinového extraktu v každém vzorku (asi 1 mg).
Stanovení aktivity SOD pomocí PIU testu
Exprese homologních a heterologních enzymů může být určena vhodným aktivitním testem. Proto ohodnocení exprese kvasinkovými buňkami transformovanými dvěmi molekulárními konstrukty bylo provedeno ohodnocením jejich SOD aktivity po indukci kultur. Růst kultur byl sledován pomocí stanovování počtu buněk čítačem buněk (Coulter counter ZBI) (Lotti a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 28: 160-165 (1988)) nebo pomocí stanovování • ·· · absorbance pří vlnové délce 600 nm. Proteinové extrakty byly připraveny podle bodu „příprava kvasinkového extraktu“.
Přítomnost Cu/Zn SOD aktivity v celkovém extraktu kvasinkových buněk byla detekována metodou podle Marklunda a Marklunda, založenou na schopnosti enzymu inhibovat auto oxidaci pyrogallolu (Marklund S. and Marklund G., Eur. J. Biochem. 47:469-474 (1974)).
Expresní experimenty byly prováděny ve formě reaktorové fermentace v kompletním syntetickém médiu:
Kompletní syntetické médium (Sherman F„ Methods in Enzymology. Vol 194, Academie Press) bez a s přítomností mědi (0,0025 g/litr) a zinku (0,05 g/litr) bylo připraveno následovně ( v gramech na litr): Bacto yest Nitrogen base s nebo bez aminokyselin ( Difco Laboratories, Detroit, MI), 6,7; zdroj uhlíku (glukóza nebo galaktóza), 20; adenin sulfát 50; uráčil,50; Ltryptofan, 50; L-histidin, 50; L-arginin-HCl, 50; L-methionin, 50; L-tyrosin, 50; L-isoleucin, 50; L-lysin-HCl, 50; L-fenylalanin, 50; L-glutamová kyselina, 50; L-asparagová kyselina, 50; Lvalin, 50; L-threonin, 50; L-serin, 50.
Tabulka 1 ukazuje naměřené aktivity ( u kmene GRF 18) v závislosti na expresi genu pro SOD před delecí MCS a bakteriálních sekvencí ve třech paralelních experimentech s uvedenou střední hodnotou:
Tabulka 1
| Transformant | 1. PlU/ml | 2. PlU/ml | 3. PlU/ml | střední hodnota |
| PEMBL-SOD 74 (v GRF 18) | 575 | 168 | 180 | 301 |
| PEMBLyex4(v GRF18) | 18 | 10 | 12 | 13 |
| Získané vinné kvasinky | 22 | - | - | 22 |
Průměr expresních hodnot je 301 PlU/ml pro vektor pEMBL-SOD 374 a 13 PlU/ml pro vektor pEMBLyex4 (bez insertu). Tyto hodnoty jsou důležité k posouzení specifické exprese cílového genu. Je stanovován ve standardních podmínkách laboratorní reaktorové fermentace. Tento výsledek ukazuje na přibližně 23 krát zvýšenou úroveň exprese ve srovnání s původním kmene (GRF18 splazmidem bez insertu). Ve srovnání se získaným kmenem vinných kvasinek („Seccoferm“) byla pozorována 22 krát větší exprese v podmínkách laboratorní fermentace. Je patrné, že ekonomičnost v provozních podmínkách je vysoce zvýšena v závislosti na použití nových konstruktů.
·· ·· • ♦ · · • * · · • · · · · • · · · ·· ··
Příklad 6
Příprava vektoru pEMBL-SOD 374 w/o MCS
Na základě experimentů v příkladu 5 je možné učinit závěr, že výkonnost kvasinkového kmene GRF18, který obsahuje molekulární konstrukt pEMBL-SOD 374, je velice vysoká. Jako kontrola sloužil ten stejný kmen, který neobsahoval žádný konstrukt. Tento molekulární konstrukt pEMBL-SOD 374 byl použit pro výstavbu konečného expresního systému bez jakýchkoliv nekvasinkových sekvencí.
Syntetická sekvence násobného klonovacího místa (MCS) byla zcela odstraněna dvojím odřezáním na obou koncích polylinkeru pomocí enzymů Sst I a Hind III. Tato operace umožňuje vyštěpení celkově 95 bp ze zbytkové sekvence molekulárního konstruktu pEMBL-SOD 374 a dovoluje vložit kompletní kvasinkový gen pro Cu/Zn SOD mezi přirozené zbylé konce.
Detailní provedení:
1) Klon pEMBL-SOD 374 byl štěpen enzymy Hind III (New England Biolabs lne., USA) a Sac I (New England Biolabs lne., USA), aby se ze zbytku vektoru vyštěpil polylinker. Enzym Hind III rozpoznává jedinečnou sekvenci „A/AGCTT“ na jednom konci MCS, zatímco enzym Ssal rozpoznává jedinečnou sekvenci „GAGCT/C“ na drahém konci MCS.
Po tomto dvojím štěpení byl fragment Hind III-Sac o délce 8 705 bp nesoucí všechny kvasinkové a bakteriální sekvence vektoru pEMBL bez polylinkeru izolován z agarózového gelu po elektroforéze elektroelucí.
Tento fragment 8 705 bp byl nakonec přečištěn systémem fenol-chloroform a zakoncentrován etanolovou precipitací.
2) Konce fragmentu Hind III-Sac I o délce 8 705 bp byly vystaveny působení enzymu polymeráza I “Klenow fragment“ za vzniku kompatibilních konců fragmentu pro další manipulace. Toto působení zarovnalo oba konce fragmentu nastavením Hind III konce (který tvoří vyčnívající 5‘ konec) a odštěpením nukleotidů z Sací konce (který tvoří vyčnívající 3‘ konec).
Fragment s ošetřenými konci byl nakonec přečištěn pomocí systému fenol-chloroform a vysrážen etanolovou precipitací.
3) DNA fragment nesoucí kvasinkový gen pro Cu/Zn SOD a který je přítomný v klonu pEMBL-SOD 374 byl štěpen enzymy Eco RI (New England Biolabs lne., USA) a Sal I New England Biolabs lne., USA), které rozpoznávají sekvenci „G/AATTC“, respektive „G/TCGAC“. Toto dvojí štěpení umožnilo izolovat fragment o velikosti 916 bp, který nese kvasinkovou sekvenci proti směru exprese genu 342 bp, úplný otevřený čtecí rámec kvasinkového genu
Cu/Zn SOD o velikosti 462 bp a kvasinkovou sekvenci po směru exprese genu o velikosti 112 bp. Tento 916 bp fragment, který neobsahuje další bakteriální nebo zbytkové sekvence, byl izolován zagarózového gelu po elektroforéze elektroelucí, přečištěn pomocí systému fenolchloroform a vysrážen etanolovou precipitaci.
4) Po přečištění byl fragment Eco Rl-Sal I vystaven působení enzymu polymeráza 1 “Klenow fragment“, který prodloužil Eco RI a Sal I konce fragmentu (které oba tvoří 5‘ vyčnívající konec), a tyto konce se tak staly kompatibilní ke koncům přečištěného pEMBL vektoru s odstraněným polylinkerem, což umožňuje jeho subklonování. Fragment s tupými konci byl přečištěn pomocí systému fenol-chloroform a vysrážen etanolovou precipitaci.
5) Fragment 916 bp se tupými konci nesoucí gen pro Cu/Zn SOD byl nakonec subklonován do fragmentu 8 705 bp pEMBL vektoru s tupými konci ligací pomocí enzymu T4 DNA polymerázy (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim). Ligace byla prováděna 20 hodin při teplotě 16°C.
6) Po transformaci ligační směsi (fragmenty 916 bp a fragment 8 705 bp s tupými konci) v bakteriálních buňkách E. coli (kmen XLl-Blue) byl proveden náhodný screening za účelem izolace klonu, který nese správnou sekvenci. Množství bakteriálních klonů po transformaci bylo kultivováno přes noc při teplotě 37°C na LB médiu a metodou „mini preps“ („Wizard“ minipreps DNA purification systém, Promega Corp., USA) byl z každého klonu extrahován DNA plazmid.
Na ověření přítomnosti a správného umístění fragmentu kvasinkového genu pro Cu/Zn SOD v klonu byla použita PCR amplifikace a DNA sekvenace.
Správnost byla potvrzena sekvenací a elektroforézou na agarózovém gelu.
Příklad 7
Příprava konečného vektoru pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli
Klon „pEMBL-SOD 374 w/o MCS“ získaný v příkladu 6 obsahuje pouze kvasinkové sekvence (kvasinkové funkční sekvence a kvasinkový gen pro Cu/Zn SOD) a bakteriální sekvence. Nekvasinková část klonu „pEMBL-SOD 374 w/o MCS“ obsahuje sekvence původem z bakteriální replikace v Escherichia coli, bakteriální selektující gen rezistence vůči ampicilinu a sekvence původem z bakteriálního filamentózního bakteriofága fl.
Tato oblast představuje úsek o délce více než 4000 bp a musí být vyštěpen enzymatickým působením za účelem získání konečného vektoru, který obsahuje pouze kvasinkové sekvence. Konečný vektor bude po této manipulaci schopný replikace pouze v kvasinkových kmenech. Jediné sekvence obsažené v konečném vektoru jsou:
·· fefe • ♦ · fe • fefe · « · · · · • fefe fe • ♦ fefe ♦ · ·· fefefefe • · · · · • * · · · · ♦ • fe ♦ · · · • · · · fe • · fefe · · ·
Leu 2-d kvasinkový selektující gen využitelný pro selekci transformovaných kvasinkových buněk, sekvence původem z 2-mikronového kvasinkového episómu, který způsobuje vysokou mitotickou stabilitu a replikaci plazmidu, úplný kvasinkový expresní hybridní systém UAS GAL/CYC, který zajišťuje transkripci genu pod svojí kontrolou, kvasinkový gen pro SOD (s funkčními kvasinkovými sekvencemi po směru a proti směru replikace genu), který produkuje enzym Cu/Zn superoxid dismutázu.
Detailní postup při přípravě vektoru:
1) Klon „pEMBL-SOD 374 w/o MCS“, minulými postupy zbavený násobného klonovacího místa byl štěpen za vzniku tupých konců endonukleázami Stu I / v pozici 5942 původního pEMBLyex4 vektoru) a Nru I (v pozici 1791 původního pEMBLyex4 vektoru). Enzym Stu I (Pharmacia, Uppsala) rozpoznává specifickou tupou sekvenci „AGG/CCT“ a enzym Nru I (Pharmacia, Uppsala) rozpoznává specifickou tupou sekvenci „TCG/CGA“. Vzniklý fragment Stul-Nru I o velikosti 4689 bp nesoucí všechny bakteriální sekvence byl odseparován od zbytku vektoru pEMBL gelovou elektroforézou. Dvojité štěpení odstranilo také část kvasinkového selektujícího genu LEU-2d, který může být využit pro selekci klonů během dalších manipulací.
2) Fragment vektoru pEMBL obsahující pouze kvasinkové sekvence a kvasinkový gen pro Cu/Zn SOD byl izolován z agarózového gelu elektroelucí, přečištěn systémem fenol-chloroform a etanolovou precipitací.
3) Konce purifikovaného pEMBL vektoru (oba konce jsou tupé) byly znovu spojeny působením enzymu T4 DNA ligáza (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) a ligační směs byla použita k transformaci kvasinkového kmene GRF18.
4) Klony po transformaci byly kultivovány na agarových miskách se syntetickým minimálním médiem bez leucinu za účelem selekce (pomocí selektujícího genu Leu 2-d) buněk GRF18, které obsahují částečně vy štěpený plazmid.
5) Množství kvasinkových kolonií získaných po transformaci bylo testováno jak na přítomnost kvasinkového fragmentu obsahujícího kvasinkový gen pro Cu/Zn SOD, tak na nepřítomnost jakékoliv bakteriální sekvence mezi místy pro enzymatické štěpení enzymy Stu I a Nru I, k testování byla použita metoda PCR. Na potvrzení přítomnosti kvasinkového fragmentu konečného konstruktu „pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli, byla provedena PCR amplifikace se dvěma ohraničujícími primery SOD proA a SOD proB. Elektroforetický proužek o délce 1133 • · · 0
0 · 0 · bp potvrzoval přítomnost fragmentu obsahujícího kvasinkový gen pro Cu/Zn SOD v šesti kvasinkových klonech.
Správnost byla potvrzena sekvenováním a elektroforézou na agarózovém gelu.
Konečný vektor „pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli“ po všech provedených manipulacích neobsahoval jakékoliv bakteriální nebo zbytkové sekvence a byl schopný replikace pouze v kvasinkových kmenech, díky přítomnosti pouze kvasinkových sekvencí. Konečný vektor je ukázán na restrikční mapě na obrázku 3.
Příklad 8
Hodnocení exprese kvasinkového genu pro Cu/Zn SOD v novém kvasinkovém kmenu
Tento příklad zahrnuje ohodnocení exprese kvasinkového genu Cu/Zn SOD v nových kvasinkových kmenech jak je uvedeno v příkladech 6 a 7. Všechny experimenty byly prováděny stejně jako v příkladu 5 s rostoucími kvasinkovými buňkami v kompletním syntetickém médiu.
Tabulka 2 ukazuje přítomnost SOD aktivity v celkovém buněčném extraktu z kvasinek v závislosti na expresi genu pro SOD po deleci MCS a bakteriálních sekvencí u GRF 18-pEMBL SOD374 v kompletním syntetickém médiu:
Tabulka 2.
| Transformant | PlU/ml |
| PEMBL-SOD 374 (v GRF18) | 138 |
| PEMBLyex4 (v GRF 18) | 17 |
| PEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli (v GRF 18) | 141 |
Výsledky testu ukazují, že vektor exprese pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli kvasinkového genu pro Cu/Zn SOD dává větší výtěžnost ve srovnání s vektorem pEMBLyex4 (v GRF 18).
Příklad 9
Izolace a purifikace kvasinkové Cu/Zn SOD
Výroba konečného polypeptídu, například kvasinkové superoxid dismutázy, probíhá za aerobních podmínek ve fermentoru řízeném počítačem, například podle způsobu Alberghina. Sledované parametry fermentace jsou teplota, nasycení kyslíkem, pH a koncentrace etanolu.
Purifikace polypeptídu obsahuje následující kroky:
Kvasinkové buňky ve fermentačním médiu jsou přímo lyžovány homogenizací homogenizátorem, například APV Gaulin, při teplotě mezi 20 a 30°C, tlaku mezi 60 a 80 MPa ···· • · • ··· * ♦ 4 4
4 9 9 • 4 4 4 4
4 4 4
4 4 4 třemi cykly, nebo pomocí balotinového mlýnku, například Dyno Milí Model KDL naplněný skleněnými kuličkami promytými kyselinou o průměru 0,3 mm a recirkulací suspenze mlýnkem rychlostí 160 ml/min po dobu 1 - 2 min při pokojové teplotě.
Separace zbytků buněčných stěn a proteinů byla provedena centrifugací, například centrifuga Beckman J2-21 s fixním úhlovým rotorem JA-10 po dobu 60 minut při rychlosti 14 000 g, mikro filtrací, například tangenitální průtoková filtrace s Minitanem (Milipore Corp., Bedford) přes membránu 0,45 mikrometrů.
Zakoncentrování a převedení do jiného pufru ultrafiltrací a diafiltrací: podmínky: tangenitální průtoková filtrace s Minitanem (Milipore Corp., Bedford) přes celulózovou membránu (PLGCOMP 04 membrána) do 10 000 Daltonů. Pufr: 20 mM ris-HCl pH 8,0.
Purifikace kationtovou výměnnou chromatografií, například na DEAE-Sepharose. Podmínky: Nanášecí pufr: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, eluční pufr: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1M NaCl.
Zakoncentrování a převedení do jiného pufru ultrafiltrací a diafiltrací za zisku konečného pufrovaného roztoku SOD. Podmínky: tangenitální průtoková filtrace s Minitanem (Milipore Corp., Bedford) přes celulózo vou membránu (PLGCOMP 04 membrána) do 10 000 Daltonů. Pufr: 20 mM ris-HCl pH 8,0.
Na konci fermentace je aktivita minimálně 5000 PlU/ml. Získatelný výtěžek pomocí nového kmene podle vynálezu je minimálně 10 krát vyšší ve srovnání se získatelným výtěžkem ze získaných pekařských kvasnic. Z 1 g pekařských kvasnic může být izolováno 5 000 PIU, zatímco z 1 gkvasinek pEMBL-SOD 374 GRF 18 může být izolováno minimálně 40 000 PIU.
♦ * ···· • · · • 4 · · · • · 4 * •4 · • * · · ·
44
4 4
4 4
4 4
4 4 ♦ · 44
Seznam sekvencí
1) Obecné informace:
A. Přihlašovatel:
a) Jméno: PentapharmAG
b) Ulice: Engelgasse 109
c) Město: Basel
d) Stát: BS
e) Země: Švýcarsko
f) Poštovní kód (ZIP): CH-4002
g) Telefon: xx41-61-7064848
h) telefax: xx41-61-3199619
B. Název vynálezu: Zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách
C. Počet sekvencí: 3
D. Počítačem snímatelné uspořádání:
a) Typ média: Floppy disk
b) Počítač: IBM PC kompatibilní
c) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS
d) Software: Patentln Release #1.0, Verze # 1.30 (EPO)
2) Informace o sekvenci číslo: 1:
A. Sekvenční charakteristiky:
a) Délka: 22 páru baží
b) Typ: nukleová kyselina
c) Řetězení: jednoduché
d) Topologie: lineární
B. Typ molekuly: DNA (genomová)
C. Hypotetický: žádný
D. Pozitivní DNA řetězec: žádné
E. Typ fragmentu: interní
F. Původní zdroj
a) Organismus: Saccharomyces cerevisiae
b) Kmen: S288C «·
G. Bezprostřední zdroj:
a) knihovna: EMBL No J03279
H. Pozice v genomu:
b) Pozice v mapě: 81-102
c) Jednotky: bp
I. Znaky:
a) Jméno/klíč: miscfeature
b) Lokalizace: 1..22
J. Znaky:
a) Jméno/klíč: primerbind
b) Lokalizace: 1..22
K. Popis sekvence: SEQ ID No: 1:
GGACGTAAGC ATCTCTGAAG TG 22
2) Informace o sekvenci číslo: 2:
A. Sekvenční charakteristiky:
a) Délka: 28 páru baží
b) Typ: nukleová kyselina
c) Řetězení: jednoduché
d) Topologie: lineární
B. Typ molekuly: DNA (genomová)
C. Hypotetický: žádný
D. Pozitivní DNA řetězec: ano
E. Typ fragmentu: interní
F. Původní zdroj
a) Organismus: Saccharomyces cerevisiae
b) Kmen: S288C
G. Bezprostřední zdroj:
a) knihovna: EMBL No J03279
H. Pozice v genomu:
b) Pozice v mapě: 1018-1036
c) Jednotky: bp
I. Znaky:
• φφ ·« ·** • φφφ • · φ φφφ φφφ · • φ φ « φ φ φ φ φ φ φ φ
a) Jméno/klíč: miscfeature
b) Lokalizace: 1..28
J. Znaky:
a) Jméno/klíč: primer_bind
b) Lokalizace: 1..28
K. Popis sekvence: SEQ ID No: 2:
GCCGTCGACG GACCCCTCAA GACCCCTC 2) Informace o sekvenci číslo: 3:
A. Sekvenční charakteristiky:
a) Délka: 30 páru baží
b) Typ: nukleová kyselina
c) Řetězení: jednoduché
d) Topologie: lineární
B. Typ molekuly: DNA (genomová)
C. Hypotetický: žádný
D. Pozitivní DNA řetězec: ano
E. Typ fragmentu: interní
F. Původní zdroj
a) Organismus: Saccharomyces cerevisiae
b) Kmen: S288C
G. Pozice v genomu:
c) Jednotky: bp
H. Znaky:
a) Jméno/klíč: misc feature
b) Lokalizace: 1..30
J. Znaky:
a) Jméno/klíč: primerbind
b) Lokalizace: 1..30
K. Popis sekvence: SEQ ID No: 3:
GCCGTCGACA CACTTGGTGA ATGATCAAGG
• ♦ ···· * · • · · · · · · • · ··· · · · · ··· ·♦ ·· pravené patentovéjiároky určené k úplnému průzkum»)
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Expresní vektor pro výrobu kvasinkového nebo nekvasinkového polypeptidů v kvasinkách obsahující kódující sekvenci polypeptidů a sekvence dovolující expresi polypeptidů v kvasinkách, kde s výhradou jakékoliv sekvence kódující nekvasinkový polypeptid, vektor postrádá jakékoliv sekvence, zde nazvané jako nekvasinkové, umožňující expresi v bakteriích nebo mikroorganismech jiných než kvasinkách.
- 2. Vektor podle nároku 1, kde kódující sekvence polypeptidů je kvasinková sekvence pod kontrolou kvasinkového promotoru.
- 3. Vektor podle nároku 1, obsahující sekvenci kódující kvasinkový enzym pod kontrolou kvasinkového promotoru.
- 4. Vektor podle nároku 1, kterým je plazmid sestávající v podstatě ze sekvence kódující polypeptid, promotoru ve čtecím rámci s kódující sekvencí a jakékoliv nezbytné funkční sekvence vybrané z ORI, vedoucí sekvence, terminátoru a sekvence kódující polypeptid pro selekci vektoru.
- 5. Vektor podle nároku 1 nebo nároku 4, kterým je kvasinkový plazmid obsahující gen pro Cu/Zn SOD, který je pod kontrolou GAL/CYC promotoru.
- 6. Vektor podle nároku 1, sestávající v podstatě z následujících sekvencí:Leu 2-d kvasinkový volitelný markér, počátek replikace dvoumikronového kvasinkového episomu, celý kvasinkový hybridní UAS GAL/CYC systém exprese a • · * · 9 • ♦·· · • · · 99 · 9 • · · kvasinkový SOD gen, s funkčními kvasinkovými sekvencemi proti a po směru exprese genu, který dá vzniku enzymu Cu/Zn superoxiddizmutázy.
- 7. Vektor podle nároku 6, kde jsou sekvence v podstatě uspořádány tak, jak je to ukázáno na obrázku 3.
- 8. Vektor podle nároku 1, který je dostupný způsobem sestávajícím z:izolace kvasinkové genomové DNA z kmene Saccharomyces cerevisiae, izolace chromozomálního fragmentu nesoucího Cu/Zn SOD gen a oblasti proti a po směru exprese genu, subklonování purifikovaného fragmentu do plazmidového vektoru pCRII a extrakce plazmidové DNA, excize fragmentu nesoucího Cu/Zn SOD gen použitím restrikčních enzymů BamHI a Sáli a purifikace fragmentu podrobeného excizi, subklonování purifikovaného fragmentu do míst BamHI - Sáli vektoru pEMBLyex4 za vzniku vektoru pEMBL-SOD 374, nesoucího Cu/Zn SOD gen a oblasti proti a po směru exprese genu, delece násobného klonovacího místa polylinkeru z prvního vzorku pEMBL-SOD 374 vektoru dvojnásobným štěpením obou konců polylinkeru enzymy Sst I a Hind III, izolace Hind III - Sac I fragmentu nesoucí kvasinkové a bakteriální sekvence vektoru pEMBL bez elektroeluce polylinkeru na agarózovém gelu při elektroforéze, purifikace a koncentrace Hind III - Sac I fragmentu, dvojnásobné štěpení DNA fragmentu z druhého vzorku klonu pEMBL-SOD 374 nesoucího Cu/Zn SOD gen enzymy Eco RI a Sal I k izolaci fragmentu nesoucího celý, otevřený čtecí rámec Cu/Zn SOD genu spolu se sekvencemi proti a po směru exprese genu odvozenými z kvasinek, zarovnání konců a purifikace Eco RI - Sal I fragmentu, subklonování Eco RI - Sal I fragmentu do Hind III - Sac I fragmentu s tupými konci pomocí enzymové ligace, izolace klonů se správnými sekvencemi z ligaění směsi náhodným screeningem a verifikací pomocí PCR amplifikace a sekvenování DNA, přičemž se získá vektor pEMBL-SOD w/o MCS,0 0 0 0 0000 0 0 00 000 0 0 0 • · 0 0000 0 00 štěpení klonu pEMBL-SOD w/o MCS za vzniku tupých konců endonukleázami Stu I a Nru I a oddělení výsledného Stu I - Nru I fragmentu nesoucího všechny bakteriální sekvence gelovou elektroforézou, izolace zbývajícího fragmentu s tupými konci nesoucího pouze kvasinkové sekvence elektroelucí na agorózovém gelu a purifikace fragmentu, opětovné spojení konců fragmentu enzymovou ligaci za vzniku pEMBL-SOD w/o MCS Coli.
- 9. Vektor podle nároku 1, 4 nebo 6, kde sekvence kódující polypeptid je nekvasinková sekvence pod kontrolou kvasinkového promotoru.
- 10. Vektor podle nároku 1, 4 nebo 6, kde kódující polypeptid je lidská nebo zvířecí sekvence pod kontrolou kvasinkového promotoru.
- 11. Kvasinkový kmen transformovaný vektorem podle nároků 1, 4 nebo 6.
- 12. Kvasinkový kmen transformovaný vektorem podle nároku 7 nebo nároku 8.
- 13. Kvasinkový kmen, kterým jeGRF 18 transformovaný vektorem jak je definováno v nároku 8.
- 14. Způsob výroby expresního vektoru podle nároku 1 nebo 4, vyznačující se tím, že z shuttle vektoru schopného exprimovat polypeptid v kvasinkovém kmenu jsou odstraněny jakékoliv nekvasinkové sekvence a případně je sekvence kódující polypeptid nahrazena sekvencí kódující jiný polypeptid.
- 15. Způsob výroby expresního vektoru podle nároku 6 sestávajícího se z kroků:izolace kvasinkové genomové DNA z kmene Saccharomyces cerevisiae, izolace chromozomálního fragmentu nesoucího Cu/Zn SOD gen a oblasti proti a po směru exprese genu, subklonování purifikovaného fragmentu do plazmidového vektoru pCRII a extrakce plazmidové DNA, excize fragmentu nesoucího Cu/Zn SOD gen použitím restrikěních enzymů BamHI a Sáli a purifikace fragmentu podrobeného excizi, subklonování purifikovaného fragmentu do míst BamHI - Sáli vektoru pEMBLyex4 za vzniku vektoru pEMBL-SOD 374, nesoucího Cu/Zn SOD gen a oblasti proti a po směru exprese genu, delece násobného klonovacího místa polylinkeru z prvního vzorku pEMBL-SOD 374 vektoru dvojnásobným štěpením obou konců polylinkeru enzymy Sst I a Hind III, izolace Hind III - Sac I fragmentu nesoucího kvasinkové a bakteriální sekvence vektoru pEMBL bez elektroeluce polylinkeru na agarózovém gelu při elektroforéze, purifikace a koncentrace Hind III - Sac I fragmentu, dvojnásobné štěpení DNA fragmentu z druhého vzorku klonu pEMBL-SOD 374 nesoucího Cu/Zn SOD gen enzymy Eco RI a Sal I k izolaci fragmentu nesoucího celý, otevřený čtecí rámec Cu/Zn SOD genu spolu se sekvencemi proti a po směru exprese genu odvozenými z kvasinek, zarovnání konců a purifikace Eco RI - Sal I fragmentu, subklonování Eco RI - Sal I fragmentu do Hind III - Sac I fragmentu s tupými konci pomocí enzymové ligace, izolace klonů se správnými sekvencemi z ligační směsi náhodným screeningem a verifikací pomocí PCR amplifikace a sekvenování DNA, přičemž se získá vektor pEMBL-SOD w/o MCS, štěpení klonu pEMBL-SOD w/o MCS za vzniku tupých konců endonukleázami Stu I a Nru I a oddělení výsledného Stu I - Nru I fragmentu nesoucího všechny bakteriální sekvence gelovou elektroforézou, izolace zbývajícího fragmentu s tupými konci nesoucího pouze kvasinkové sekvence elektroelucí na agorózovém gelu a purifikace fragmentu, ft ft • · · « ftft • · ftft • ftft opětovné spojení konců fragmentu enzymovou ligaci za vzniku pEMBL-SOD w/o MCSColi.-Μ· • · · · • · ft ftftft • · · ftft
- 16. Způsob výroby kmene kvasinek, vyznačující se tím, že se v kvasinkovém kmeni transformuje vektor podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 nebo 6.
- 17. Způsob výroby kmene kvasinek, vyznačující se tím, že vyrobí vektor způsobem podle nároku 15 a transformuje se kmen Saccharomyces cerevisiae tímto vektorem.
- 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tůn, že kmenem je GRF 18.
- 19. Způsob výroby poiypeptidu v kmeni kvasinek, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen kvasinek obsahující vektor podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 nebo 6 ve vhodném médiu a poté se polypeptid vyizoluje.
- 20. Způsob výroby enzymu Cu/Zn superoxiddismutáza v kmeni kvasinek, vyznačující se tím, že se připraví kmen kvasinky způsobem podle nároku 14, 15 nebo 18, přičemž roste ve vhodném médiu a následuje izolace enzymu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000650A CZ2000650A3 (cs) | 1997-09-05 | 1997-09-05 | Expresní vektor pro zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000650A CZ2000650A3 (cs) | 1997-09-05 | 1997-09-05 | Expresní vektor pro zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000650A3 true CZ2000650A3 (cs) | 2000-08-16 |
Family
ID=5469702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000650A CZ2000650A3 (cs) | 1997-09-05 | 1997-09-05 | Expresní vektor pro zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2000650A3 (cs) |
-
1997
- 1997-09-05 CZ CZ2000650A patent/CZ2000650A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cregg et al. | Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris | |
| Pompon et al. | [6] Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments | |
| Rachidi et al. | Saccharomyces cerevisiae PAU genes are induced by anaerobiosis | |
| Butt et al. | Yeast metallothionein and applications in biotechnology | |
| CN1922325B (zh) | 基因表达技术 | |
| KR101298157B1 (ko) | 2-미크론 패밀리 플라스미드 및 이의 용도 | |
| FI95285C (fi) | 2 m-plasmidivektori, menetelmä sen valmistamiseksi sekä sen käyttö | |
| US4882279A (en) | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia | |
| Lodi et al. | Isolation of the DLD gene of Saccharomyces cerevisiae encoding the mitochondrial enzyme D-lactate ferricytochrome c oxidoreductase | |
| Thorvaldsen et al. | Regulation of metallothionein genes by the ACE1 and AMT1 transcription factors | |
| JP2000500014A (ja) | ピヒア・メタノリカ中で異種ポリペプチドを生産するための組成物と方法 | |
| CN1238806A (zh) | 甲醇毕赤酵母营养突变体的制备 | |
| Xiao et al. | A common element involved in transcriptional regulation of two DNA alkylation repair genes (MAG and MGT1) of Saccharomyces cerevisiae | |
| Kurtz et al. | Isolation of hem3 mutants from Candida albicans by sequential gene disruption | |
| Oechsner et al. | A nuclear yeast gene (GCY) encodes a polypeptide with high homology to a vertebrate eye lens protein | |
| US5135868A (en) | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification | |
| Amillet et al. | Positive and negative elements involved in the differential regulation by heme and oxygen of the HEM13 gene (coproporphyrinogen oxidase) in Saccharomyces cerevisiae | |
| AU748759B2 (en) | Expression vector for improved production of polypeptides in yeast | |
| Bonnefoy et al. | Cloning by functional complementation, and inactivation, of the Schizosaccharomyces pombe homologue of the Saccharomyces cerevisiae gene ABC1 | |
| Juan Francisco et al. | Disruption of gene YlODC reveals absolute requirement of polyamines for mycelial development in Yarrowia lipolytica | |
| JP2001513989A (ja) | 酵母における調節した遺伝子発現 | |
| CZ2000650A3 (cs) | Expresní vektor pro zlepšení výroby polypeptidů v kvasinkách | |
| CN102212546A (zh) | 一种整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统及其应用 | |
| Klein et al. | Transformation and cloning systems in non-Saccharomyces yeasts | |
| US5674721A (en) | Process for making yeast cells resistant to extreme high pressure |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |