CN101255436B

CN101255436B - 一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法及其专用载体

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Publication number: CN101255436B
Application number: CN2008100259985A
Authority: CN
Inventors: 朱倩婷; 赵士炜; 黄晓峰; 张文庆
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2008-01-24
Filing date: 2008-01-24
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2028-01-24
Also published as: CN101255436A

Abstract

本发明公开了一种超氧化物歧化酶基因食品级表达方法及其专用载体。该方法是构建含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母食品级表达载体，将构建的酿酒酵母食品级表达载体导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。本发明能直接表达出食品级的超氧化物歧化酶产物，弥补了传统SOD制备方法以及毕赤酵母和原核表达系统表达方式的表达产物需经复杂步骤纯化后才能用于食品生产中的不足；本发明还具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

Description

一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法及其专用载体

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法及其专用载体。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)广泛存在于各类生物体中，是机体内超氧阴离子自由基(O₂ ^-)的天然消除剂，对机体细胞起保护作用。因此，SOD在防御O₂ ^-的毒性、抗衰老以及预防肿瘤和抗炎等方面起着重要的生理作用，受到国内外医药日用化工、食品及生化界的极大关注。

根据SOD所含金属辅基的不同，一般可将其分为Cu，Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。

SOD在临床上有较广泛的应用，如用于骨关节炎、急肝与慢活肝的炎症反应，SOD可去除由炎症反应产生的大量的超氧化自由基，对消退炎症，恢复肝功能起到一定作用；用于治疗因超氧阴离子伤害引起的疾病，如心肌缺血与缺血再灌注综合症、类风湿关节炎、放射性膀胱炎、红斑狼疮等(Fattman CL，Enghild JJ，Crapo JD，et al.Purification and characterization of extracellularsuperoxide dismutase in mouse lung.Biochem Biophys Res Commun，2000，275：542-548；Huang P，Feng L，Oldham EA，et al.Superoxide dismutase as atarget for the selective killing of cancer.Nature，2000，407(6802)：390-395；贾宁人，王丽珠等.化学发光法测定超氧化物歧化酶.临床检验杂志，1996，14(2)：59-62)。

SOD在食品工业中主要应用四方面：1)作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，添加到各种食品中。2)制成多种剂型的SOD或复合型食品。3)用作食品的天然抗氧化剂。4)以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妆品中可起到防晒、防止脂褐素的形成、防治皮肤病以及防治瘢痕形成等作用(崔慧斐，张天民.超氧化物歧化酶在食品和化妆品中的应用及其发酵法生产进展.药物生物技术，2000，7(3)：187-189)。

超氧化物歧化酶SOD作为自由基清除剂，是一种可以增进人体健康的重要活性物质，我国自上世纪八十年代以来，对SOD的应用研究主要侧重于动植物SOD的提取和纯化，国内SOD产品大部分是从动物血液中制备的，但由于原材料有限及卫生安全性等原因，导致制品产量有限，特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口蹄疫等恶性传染病的不时报道，动物源血液制品的风险加大，纯度要求的增高也增加了产品的成本，特别是由于疯牛病的影响，欧盟规定从1997年1月起，禁止使用牛血SOD作为食品添加剂使用后，利用基因工程是广开SOD酶源、降低成本和获得具有天然活性的SOD的有效途径。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又名面包酵母，在酿酒业和面包业中的使用已有数千年的历史，被认为是GRAS生物(generally recognized as safe)，已被美国FDA认定为安全性的生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验(宋丽雅，于群，卜凤荣.几种主要的酵母表达系统研究进展.中国输血杂志，2003，16(3)：209-211)。酿酒酵母作为一种模式生物，是迄今了解最完全的真核生物，上千个基因已被分析，完整的基因组测序已于1996年完成。自1981年Hitzeman等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白。

酿酒酵母表达系统相比毕赤酵母等表达系统具有其自身表达量较低等的不足，但是，它却具有其它表达系统不能比拟的优点。作为酵母的一种，其培养条件普通，生长繁殖迅速；用于表达基因工程产品时，工艺简单，能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产，有效降低生产成本；作为一种GRAS生物，它已广泛用于酿酒和食品工业，不会产生毒素，安全可靠；作为单细胞真核生物，它表达外源基因时具有一定的翻译后加工能力，具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，有利于保持生物产品的活性和稳定性；作为一种模式生物，它的遗传背景清楚，容易进行遗传操作，可以利用基因表达调控机制进行高水平表达。

目前大量表达蛋白最常使用的表达系统是毕赤酵母表达系统，虽然它能进行高密度发酵表达，发酵过程简单，成本也较低廉。但由于毕赤酵母不是一种食品微生物，表达过程产生的物质不能完全确认安全；其常用的分泌型载体pPICZalpha A又含有Zeocin^r抗性基因，在筛选过程中必须添加高浓度抗生素来筛选高拷贝重组子；载体含目前已知毕赤酵母中的最强启动子AOX1，故发酵时需要添加甲醇诱导，所以毕赤酵母表达系统完全不符合食品级安全要求，要用它来生产药品或食品需要进行多步骤的后续加工，还没有被广泛接受。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法。

本发明的另一目的在于提供上述食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，包括如下步骤：首先，超氧化物歧化酶基因插入酿酒酵母表达载体的多克隆位点处后，构建含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母表达载体，通过限制性内切酶Nco I和ApaL I双酶切该表达载体，完全去除Ampicillin^R抗生素筛选标志，同时切去了URA3基因片段的部分片段；然后，将被酶切去除的URA3片段部分重新与含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母表达载体连接，得到含有超氧化物歧化酶基因、GAL1启动子和终止子序列、多克隆位点、URA3片段以及不含有Ampicillin^R抗生素筛选标志的食品级酿酒酵母表达载体即食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体，将改造好的酿酒酵母食品级表达载体导入酿酒酵母中，筛选获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。

一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，包括如下步骤：

(1)选定中国拟青霉(Paecilomyces sinensis)Cu，Zn-SOD(简写为psSOD)基因mRNA全长序列，进行全基因合成，psSOD基因mRNA全长序列如下：

Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgattcctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgccgacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtgacaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa；

(2)设计并合成一对基因特异引物：pYESpsSODf正向引物和pYESpsSODr反向引物，其序列为如下：

pYESpsSODf：5’-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3’；

pYESpsSODr：5’-ACCTCTAGATFAGTTGGCGACGCCAATG-3’。

以步骤(1)得到的含psSOD基因片段的质粒为模板，pYESpsSOD(f+r)为引物，进行PCR扩增psSOD，并使克隆的psSOD两端分别加上了Hind III和XbaI酶切位点(恰为多克隆位点两端酶切位点)；得到的基因片段与pMD18-T载体连接，命名为pMD18-T-psSOD质粒，经测序与上述mRNA全长序列相符。

(3)用限制性内切酶Hind III和XbaI双酶切酿酒酵母表达载体pYES2/CT及上述pMD18-T-psSOD质粒，得到双酶切载体与目的基因纯化液；将回收纯化的双酶切载体与目的基因纯化液以T4 DNA连接酶进行连接，得到的重组载体命名为pYES-psSOD。

(4)上述构建的重组载体pYES-psSOD通过ApaLI和NcoI双酶切，去除Amp^r抗性基因即Ampicillin^R抗生素筛选标志，同时切去了Amp^r抗性基因下游URA3基因片段的部分片段，把被酶切去除的URA3基因片段部分重新与pYES-psSOD重组载体连接。

根据酿酒酵母表达载体pYES2/CT载体的序列，设计上下游引物ura2和ura3，以扩增载体2823～3513bp之间片段，并在片段的一端(即载体第2823bp端)引入ApaLI酶切位点：

所述ura2：5’-GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3’；

所述ura3：5’-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3’；

以pYES2/CT质粒为模板，ura2、ura3为引物进行PCR扩增，回收目的片段URA3后，将目的片段URA3与pMD18-T连接，重组质粒命名为pMD18-T-ura，所述URA3片段序列为如下：

Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg；

(5)将已经构建好的酿酒酵母重组表达载体pYES-psSOD及pMD18-T-ura重组质粒，用ApaLI和NcoI进行双酶切，分别回收纯化pYES-psSOD的5103bp大片段及pMD18-T-ura的700bp大小片段；

将回收纯化的双酶切pYES-psSOD载体的5103bp大片段与pMD18-T-ura的700bp大小片段以T4 DNA连接酶连接，重组质粒命名为pYES-psSOD-F，即为食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体。

(6)将上述的食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体pYES-psSOD-F导入酿酒酵母中，筛选获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。

所述酿酒酵母表达载体pYES2/CT载体，它采用GAL1启动子，可以以食品级的诱导物半乳糖启动目的基因的表达；其上的URA3片段，与酵母宿主菌株上ura3-1互补，利用营养缺陷型，达到筛选目的，是食品级的选择标记；因此，通过改造去除Ampicillin^R抗生素筛选标记后的pYES2/CT载体为最优选的酿酒酵母食品级表达载体。

步骤(6)中，所述的酿酒酵母为ura3-1基因突变型的酿酒酵母，可通过尿嘧啶营养缺乏培养基筛选重组酵母。

所述将食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体pYES-psSOD-F导入酿酒酵母中的优选方法为氯化锂化学转化法，也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如电激转化法等。

所述筛选获得重组酿酒酵母的方法为涂布尿嘧啶营养缺乏培养基。

所述诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达时需加入半乳糖，半乳糖诱导浓度为2％(m/v)，诱导时间为48～96小时。

本发明所提供的超氧化物歧化酶基因的食品级表达的方法，是构建含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母表达载体，对重组载体进行食品级改造，将改造好的酿酒酵母食品级表达载体导入酿酒酵母中，筛选获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。

所述的食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体，是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1启动子和终止子序列、多克隆位点、URA3片段以及不含有Ampicillin^R抗生素筛选标志的酿酒酵母表达载体。

所述超氧化物歧化酶基因位于酿酒酵母表达载体的多克隆位点的Hind III和Xba I限制性内切酶酶切位点之间。

所述超氧化物歧化酶基因可为任意一种超氧化物歧化酶基因，包括Cu，Zn-SOD、Mn-SOD或Fe-SOD。

本发明采用了食品级基因表达系统，其必须具备以下要求：(1)食品级宿主菌：在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株；(2)食品级载体：不得含有非食品级功能性DNA片段；(3)食品级选择标记：不能选用可能会引起抗性基因在物种间的水平转移，对生物安全性有潜在的危险的抗生素抗性基因作为选择标记；(4)食品级诱导物，诱导物必须选用可食用的物质。

本发明对现有的酿酒酵母表达载体pYES2/CT载体进行了改造，去除了含有抗性基因的Amp^r片段即Ampicillin^R抗生素筛选标记，但保留了URA3基因，构建了食品级载体；选用的酿酒酵母表达载体pYES2/CT上的URA3片段，与酵母宿主菌株上ura3-1互补，利用尿嘧啶营养缺陷型，达到筛选目的，是食品级的选择标记，不必加入抗生素；pYES2/CT载体采用启动子GAL1，以可食用的半乳糖启动目的基因的表达，是食品级的诱导物。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：本发明所提供的超氧化物歧化酶基因在酿酒酵母中的食品级表达方法，能直接表达出食品级的超氧化物歧化酶产物，弥补了传统SOD制备方法以及毕赤酵母和原核表达系统表达方式的表达产物需经复杂步骤纯化后才能用于食品生产中的不足；若将本发明应用于工业化SOD生产，产物可不经过传统的纯化工艺而直接应用于食品、保健品及化妆品等领域，也可直接用于食品发酵，用以生产功能食品。此外，本发明还具有原料生物体生长周期短，生产规模大，成本低廉的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

附图说明

图1为酿酒酵母表达载体pYES2/CT图谱。

图2为psSOD的PCR扩增结果图。

其中，M：DL2000，1：psSOD扩增片段。

图3为pYES-psSOD转化子的菌落PCR鉴定图。

其中，M1：Marker III；M2：DL2000；1、2：pYES2/CT菌落PCR产物；

3、4：pYES-psSOD菌落PCR产物。

图4为pYES-psSOD载体的食品级改造流程图。

图5为pYES-psSOD和pMD18-T-ura的双酶切(ApaLI/NcoI)结果图。

其中，M1：Marker III；M2：DL2000；1：pYES2/CT(ApaLI/NcoI)；2～4：pYES-psSOD(ApaLI/Nco I)；5：pMD18-T-ura(ApaLI/NcoI)。

图6为w303-pYES-psSOD-F转化子的菌落PCR鉴定图。

其中，M：DL2000；1～8：w303-pYES2/CT菌落PCR产物；9～12：w303-pYES-psSOD-F菌落PCR产物。

图7为w303-pYES-psSOD-F表达产物破壁液的SDS-PAGE分析图。

其中，M：蛋白质分子量标准；1：阴性对照；2：w303-pYES-psSOD-F诱导24h菌体破壁液；3：诱导48h菌体破壁液；4：诱导72h菌体破壁液；5：诱导96h菌体破壁液。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 中国拟青霉Cu，Zn-SOD在酿酒酵母中的食品级表达方法

1、中国拟青霉Cu，Zn-SOD基因片段的获得

1)基因合成

从GenBank中找到冬虫夏草无性型中国拟青霉(Paecilomyces sinensis)的Cu，Zn-SOD基因mRNA全长序列(GenBank登陆号为：AY438328)，进行全基因合成，基因CDS全长为465bp。

其序列为如下：

Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgattcctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgccgacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtgacaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa。

2)引物设计

根据中国拟青霉Cu，Zn-SOD基因mRNA序列设计上下游引物pYESpsSOD(f+r)，通过引物在psSOD基因两端分别加入HindIII和XbaI酶切位点：

pYESpsSODf：5’-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3’；

pYESpsSODr：5’-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3’。

3)PCR扩增

以步骤1)合成的含psSOD基因的质粒为模板，pYESpsSOD(f+r)为引物，进行PCR扩增psSOD，并使克隆的psSOD两端分别加上了Hind III和Xba I酶切位点。将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图2所示，PCR扩增体系如下：

上游引物(10μM) 1μl

下游引物(10μM) 1μl

exTaq DNA聚合酶 0.5μl

10×PCR Buffer 2.5μl

dNTP(2.5mM each) 2μl

模板DNA 0.5μl

ddH₂O 17.5μl

Total 25μl

热循环仪加热盖，94℃4min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，30个循环；接着72℃8min，扩增完毕后置4℃终止反应，得到的片段大小接近500bp，与预期大小约480bp相符。将目标条带割胶回收后，与pMD18-T载体连接，经转化及转化子的筛选鉴定、序列测定分析后，得到含正确的psSOD基因序列的质粒，命名为pMD18-T-psSOD。

2、重组表达载体pYES-psSOD的构建

1)目的片段和载体的双酶切

用限制性内切酶HindIII和XbaI双酶切37℃6h酿酒酵母表达载体pYES2/CT及鉴定过的上述pMD18-T-psSOD质粒，得到双酶切载体与目的基因纯化液。

2)载体与目的片段的体外连接

将回收纯化的双酶切载体与目的基因纯化液以T4 DNA连接酶进行连接，得到的重组质粒命名为pYES-psSOD。

3)连接产物的转化

将重组质粒pYES-psSOD用热激法转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用含有100μg/mLAmp的LB平板37℃培养12小时进行筛选。

4)转化子的筛选鉴定

根据酿酒酵母表达载体pYES2/CT载体序列(见图1)，设计pYES2/CT载体的测序引物pYEStest(f+r)，上下游引物分别位于其多克隆位点(见图1)上下游，由广州英骏生物技术有限公司合成。引物序列为：

pYEStestf：5’-AATATACCTCTATACTTTAACGTC-3’；

pYEStestr：5’-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3’。

用无菌牙签挑取在Amp平板上长出的DH5α单菌落于1ml LB(Amp⁺)培养基，30℃250rpm过夜培养。

用上述菌液作模板，以pYEStest(f+r)为引物，进行菌落PCR。PCR扩增体系同psSOD扩增，热循环仪加热盖，94℃预变性10min，94℃40sec，55℃40sec，72℃40sec，30个循环后，72℃10min，扩增完毕后置4℃终止反应。反应结束后，取反应液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，pYES2/CT空载体和pYES-psSOD的转化子菌落PCR产物理论上应有223bp和609bp条带，结果如图3所示，转化子PCR扩增时，能得到约600bp大小的片段，初步说明目的片段已与载体连接。

5)序列测定与分析

把经菌落PCR鉴定的阳性克隆进行序列测定与分析，得到含正确psSOD基因的pYES-psSOD重组载体。

3、食品级重组表达载体pYES-psSOD-F的构建

根据图4进行pYES-psSOD载体的改造。

构建好的酿酒酵母重组表达载体pYES-psSOD上，带有Amp^r抗性基因，不符合食品级的要求，根据pYES2/CT载体的序列可知，其Amp^r抗性基因位于1963～2823bp，而ApaL I酶切位点有两个，分别位于1458bp和2704bp处，通过ApaLI酶切可去除Amp^r抗性基因的绝大部分片断；而在Amp^r抗性基因下游URA3基因中有NcoI酶切位点，通过ApaLI和NcoI双酶切，可以完全去除Amp^r抗性基因，达到防止抗性基因在物种水平间迁移的目的。但同时切去了Amp^r抗性基因下游URA3基因片段的一部分，而由于URA3基因是重组表达载体在酿酒酵母中筛选所需的，因此必须把被酶切去除的URA3基因片段的一部分(即载体上2823～3513bp片段)重新与载体连接。所述URA3片段序列为如下：

Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg。

1)载体补充片段(ura)的获得

根据酿酒酵母表达载体pYES2/CT载体的序列，设计上下游引物ura2和ura3，以扩增载体2823～3513bp之间片段，并在片段的一端(载体第2823bp端)引入ApaLI酶切位点：

ura2：5’-GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3’

ura3：5’-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3’

以pYES2/CT质粒为模板，ura2、ura3为引物进行PCR扩增，扩增条件同psSOD扩增。割胶回收目的片段后，将目的片段URA3与pMD18-T连接，进行转化及转化子的筛选鉴定、序列测定分析。重组质粒命名为pMD18-T-ura。

2)pMD18-T-ura和pYES-psSOD的双酶切

取已经构建好的酿酒酵母重组表达载体pYES2-psSOD及鉴定过的pMD18-T-ura重组质粒，用ApaLI和NcoI进行双酶切，反应结束后，酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。pMD18-T-ura经ApaLI和NcoI双酶切后，所得片段(ura)大小约为700bp；pYES2/CT载体经相同双酶切后，所得为一个大片段约4294bp和两个分别为1246bp和809bp的小片段；pYES-psSOD产生的大片段为5103bp，电泳结果与此相符，如图5所示。分别回收pYES2/CT和pYES-psSOD酶切后的大片段及pMD18-T-ura的700bp片段，用于下一步连接反应。

3)重新连接表达载体

将回收纯化的双酶切pYES-psSOD载体的5103bp大片段与pMD18-T-ura的700bp片段以T4 DNA连接酶连接，重组质粒命名为pYES-psSOD-F。该载体是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1启动子和终止子序列、多克隆位点、完整URA3片段以及不含有Ampicillin^R抗生素筛选标志的食品级酿酒酵母表达载体。

4)重组表达载体pYES-psSOD-F的食品级鉴定

把连接好的食品级载体pYES-psSOD-F转化大肠杆菌DH5α中(同时做pYES2/CT空载体转化为对照)，转化后取200μl菌液涂布于含有Amp(100μg/mL)的LB平板上，37℃倒置培养16h后pYES2/CT长出转化子，而pYES-psSOD-F在37℃培养72h后仍没有转化子长出，说明Amp^r抗性基因已失效，不存在抗生素抗性基因在物种水平间迁移的危险，达到食品级的要求。

4、psSOD在酿酒酵母中食品级表达

菌株：酿酒酵母w303-1A由中山大学生命科学学院微生物实验室提供，基因型为(MATa，ura3-1，leu2-3-112，trp1-1，his3-11，ade2-1，can1-100)。

YPD培养基：称取蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖20g，加ddH₂O定容至1L，高压灭菌，4℃保存。

缺乏脲嘧啶的氨基酸营养缺陷混合物(drop-out mix)组成：每升溶液加入以下固体，过滤除菌。

类别	含量	类别	含量	类别	含量
						腺嘌呤	0.2g	谷氨酸	0.5g	苯丙氨酸	0.5g
甘氨酸	0.5g	谷氨酰胺	0.5g	脯氨酸	0.5g
						精氨酸	0.5g	组氨酸	0.5g	丝氨酸	0.5g
天冬酰胺	0.5g	异亮氨酸	0.5g	苏氨酸	0.5g
						天冬氨酸	0.5g	亮氨酸	0.5g	色氨酸	0.5g
半胱氨酸	0.5g	赖氨酸	0.5g	缬氨酸	0.5g
						丙氨酸	0.5g	甲硫氨酸	0.5g	肌醇	0.2g

液体选择培养基：200ml营养缺陷混合物(drop-out mix)，100ml 20％葡萄糖，100ml 6.7％YNB(过滤除菌)，加灭菌ddH₂O到1000ml。

固体选择培养基：600mL ddH₂O中加入琼脂粉20g，高压灭菌后冷却至60℃，加入200ml drop-out mix，100ml 20％葡萄糖，100ml 6.7％YNB(过滤除菌)。

选择诱导培养基：在选择培养基的基础上，20％葡萄糖换成20％半乳糖。

1)酿酒酵母感受态细胞的制备及化学转化

(1)挑取酿酒酵母w303-1A单菌落接种至3mL液体YPD，30℃下振荡培养过夜；

(2)测定过夜培养物OD₆₀₀，计算菌体密度(1OD＝10⁷cells/ml)；

(3)以YPD培养液将酵母密度稀释至5×10⁶cells/ml，置30℃，250r/min振荡培养至菌体密度达2×10⁷cells/ml(约3～4h)；

(4)用10ml无菌离心管以4,000rpm离心3min，收集细胞，每5ml菌液细胞集于1管。

(5)把细胞重新悬浮在500μl无菌水中，并将重悬液转移到1.5ml离心管中，13,000rpm离心12sec；

(6)弃上清，把细胞重悬于200μl的0.1mol/L醋酸锂(LiAc)中，30℃温浴15min，每5min轻轻振摇一次；

(7)准备转化混合液，在离心管中小心加入：5μl Carrier DNA(鲑鱼精10mg/mL)、45μl ddH₂O，混合后煮沸8-10min，然后加入36μl 1mol/L LiAc和24μl 10×TE。

(8)将温浴产物13,000rpm离心12sec，弃上清后加入240μl 40％PEG-3350、110μl转化混合液和5μl pYES-psSOD-F质粒(同时转化pYES2/CT空载体做对照)；震荡混匀后25℃温浴30min；

(9)加入40μL DMSO(对酵母细胞有毒害作用，加入后迅速混匀)；

(10)42℃水浴热激18min；

(11)热激完毕后取出置冰上1min，13,000rpm离心15sec弃上清，收集菌体；

(12)以100～200μl ddH₂O重悬菌体，取100μl菌液涂布Ura-选择培养基平板，30℃静置约30～60min，待液体全部吸收后，倒置培养2～3天。将重组酵母命名为w303-pYES-psSOD-F。

2)重组酵母的菌落PCR鉴定

w303-1A菌株是尿嘧啶URA营养缺陷型，选择培养基同样是尿嘧啶缺失，因此理论上只有pYES载体上的URA3序列与宿主菌的ura3-1互补后才能在选择培养基中长出。

用灭菌牙签挑取上述转化后长出的w303-1A单菌落于10μl ddH₂O中，沸水浴10min后作为模板，以pYEStest(f+r)为引物进行菌落。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，理论上，w303-pYES2/CT空载体转化子菌落PCR产物应有223bp条带，w303-pYES-psSOD-F重组转化子则有约609bp的条带，实验结果如图6所示，挑取的转化子条带与目标相符，可初步断定为重组转化子。

3)重组酵母的诱导表达

pYES系列载体是GAL1启动子，葡萄糖可抑制其转录开始(West et al.，1984)，半乳糖诱导其转录开始(Giniger et al.，1985)。

(1)挑取经鉴定的w303-pYES-ps-SOD-F单菌落至15ml w303-1A选择培养基(含2％葡萄糖)，30℃下250rpm振荡培养过夜；

(2)测定过夜培养物OD₆₀₀，根据公式计算稀释至50ml OD₆₀₀＝0.4时所需要的培养液数量。例如OD₆₀₀测定后为3，则所需要的培养液为50ml*0.4OD/3OD＝6.67ml。

(3)取出所需数量培养液，1,500g离心5min收集菌体；

(4)以50ml选择诱导培养基(含2％半乳糖)重悬菌体，30℃250rpm培养；

(5)在24h、48h、72h、96h分别取样5ml。

4)重组酵母表达产物的鉴定

玻璃珠法破碎重组酵母细胞所用溶液Breaking Buffer：10mM磷酸钠，1mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH7.8。

邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力所用Buffer：

Buffer A：100mM Tris-HCl缓冲液；

Buffer B：2mM DTPA；

Buffer C：BufferA与Buffer B按体积比1∶1混合，调至pH8.2；

Buffer D：10mM HCl，将36％HCl 1ml溶于116ml ddH₂O；

Buffer E：20mM邻苯三酚(100×，以Buffer D溶解)避光放置。Bradford蛋白质浓度测定法所用溶液：

考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入100ml 85％的磷酸，用水稀释至1升，滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中；

标准蛋白质溶液：用牛血清清蛋白(BSA)配制成0.5mg/ml的标准蛋白质溶液，室温稳定2小时。

5)重组酵母的破壁检测

以玻璃珠法进行酿酒酵母细胞的破壁处理：

A、根据菌液OD₆₀₀值计算其菌体密度(1OD＝10⁷cells/ml)，取出含10×10⁷cells的菌液，同时记录所取用的菌液体积，作后续酶活力的换算使用；

①1,500g，4℃离心5min弃上清，收集细胞；

②加入500μl ddH₂O重悬菌体，转移至1.5mL无菌离心管，以最大转速离心30sec，弃上清，收集细胞；

③加入500μl Breaking buffer重悬菌体，1,500g，4℃离心5min弃上清，收集细胞；

④加入200μl Breaking buffer重悬菌体；

⑤加入等体积酸洗玻璃珠；

⑥涡旋振荡30sec后，马上置于冰上30sec，重复10次；

⑦以最高转速(约12,000～13,000g)离心10min，将上清转移到新EP管，上清液即为酵母破壁液。

B、破壁液的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测

取诱导表达24h、48h、72h、96h各时间段样品的破壁液20μl，加入20μl2×上样缓冲液，沸水煮5分钟，离心后取上清进行SDS-PAGE电泳。每孔点样15 μl。采用不连续体系，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为15％。

以半乳糖诱导w303-pYES-psSOD-F重组菌，对经诱导的重组酿酒酵母细胞进行破壁处理后，以破壁液进行SDS-PAGE电泳，同时用空载体pYES2/CT转化的宿主菌的破壁液作空白对照。SDS-PAGE电泳结果如图7显示，从48h开始，出现一条约21kDa的蛋白条带(箭头所示处)，应为psSOD蛋白，此psSOD的表观分子量稍大于其16kDa的理论分子质量，这一点与相关文献报道的相同(Yoo HY，Kim SS，Rho HM.Overexpression and simple purification ofhuman SOD in yeast and its resistance to oxidative stress.J Biotechnol，1999，68(1)：29-35；何炜，袁汉英，高卜渝，陈向岭，李育阳.超氧化物歧化酶在酿酒酵母系统中的高效表达.复旦学报(自然科学版)，2004，43(2)：156-162；李雪莲，马一君，武峰，史兆兴，王恒梁，黄留玉.人铜锌超氧化物歧化酶真核表达载体的构建及其在酿酒酵母中的分泌表达.郑州大学学报(医学版)，2007，42(1)：127-130)。

C、破壁液的SOD酶活力检测

采用邻苯三酚自氧化法进行破壁液的SOD酶活力的测定。

①溶液体系

按照以下配方混合溶液：

试剂	空白	自氧化对照	样品
				Buffer C(μl)Buffer D(μl)Buffer E(μl)表达上清(μl)	44109000	44100900	4310090100
总体积(μl)	4500	4500	4500

②标准曲线制定

首先测定邻苯三酚自氧化速率，取反应体系所需各种溶液，分别置于25±0.5℃水浴下预热20min，然后迅速混合，振荡混匀，以空白为对照测定OD₄₂₀，每间隔0.5min记录一次读数，连续记录3min。描绘自氧化速率标准曲线。

③破壁液SOD酶活力测定

同上述流程，通过调节表达上清浓度，每0.5min记录一次OD₄₂₀，描绘SOD抑制自氧化速率曲线图，控制氧化速率在为邻苯三酚自氧化的50％左右。

④破壁液浓度测定

利用Bradford法测定表达上清的蛋白浓度，方法如下：

a.制作标准曲线

	1	2	3	4	5	6	7	8
									0.5mg/ml BSA(μl)	0	0	5	10	15	20	25	30

0.15mMNaCl(μl)

100

95

90

85

80

75

70

按上表中数量混合溶液，然后各试管中分别加入1ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。加完试剂2min后，测定各样品在595nm处的光吸收值A₅₉₅，空白对照为第1号试管，以蛋白浓度和光吸收作标准曲线。

b.样品测定

把待测样品稀释至10-100μg/ml的浓度，取100μl样品稀释液加入1ml考马斯亮蓝，后续步骤同上。测得A₅₉₅值后在标准曲线上找出相应浓度。

⑤结果计算

酶活力单位的定义：在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时的酶量定义为一个酶活力单位。酶活力单位计算公式如下：

A₀--邻苯三酚自氧化速率；A₁--SOD抑制邻苯三酚自氧化速率；N--样品测定前稀释倍数；V₀--反应液总体积(4.5ml)；V₁--加入的SOD溶液体积(0.1ml)。

首先测定破壁液的SOD酶活力(U/ml)；通过已知的各样品每200μl破壁液对应的发酵液体积，计算每ml发酵液的酶活力；然后利用Bradford法测定破壁液中的蛋白浓度，并通过微机扫描分析目标表达蛋白表达量占菌体可溶性蛋白的百分比，从而计算每毫克psSOD蛋白的SOD酶活力(U/mg)：半乳糖诱导48小时、72小时和96小时后，表达产物蛋白的SOD酶活力分别为789.48、1320.28和1158.33U/mg。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>中山大学

<120>一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法及其专用载体

<130>42

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>465

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>psSOD基因mRNA全长序列

<400>1

atggtcaaag cagtttgcgt ccttcgcggc gactccaaga tcaccgggat cgtcaatttt 60

gagcaggagt ccgattcctc gcccaccacc atctcctggg agatctctaa ccacgatgcc 120

gacgccaagc gtggcttcca catcacaccc tttggtgaca ataccaacgg ctgcacctct 180

gctggcccgc actttaaccc tcacggcaag actcacggca acgtgaccga cgaaaaccga 240

cacgttggcg acatgggcaa catcgagacc gattgcgacg gcaactccaa gggatccata 300

aaggacaagc tcatcaagct cattggcccc cacagtgtca ttggccgcac cgttgtcatt 360

cacgccggca ctgatgacct aggcaagggt ggcaacgacg agtcactcaa gaccggcaat 420

gctggccccc gtcctgcttg cggtgtcatt ggcgtcgcca actaa 465

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>pYESpsSODf正向引物

<400>2

atcaagctta tggtcaaagc agtttgc 27

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>pYESpsSODr反向引物

<400>3

acctctagat tagttggcga cgccaatg 28

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>引物ura2

<400>4

gaaggatccc catggagggc acagtt 26

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>引物ura3

<400>5

gccaagcttg tgcacactct tcctttttc 29

<210>6

<211>700

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>URA3片段序列

<400>6

gtgcacactc ttcctttttc aatgggtaat aactgatata attaaattga agctctaatt 60

tgtgagttta gtatacatgc atttacttat aatacagttt tttagttttg ctggccgcat 120

cttctcaaat atgcttccca gcctgctttt ctgtaacgtt caccctctac cttagcatcc 180

cttccctttg caaatagtcc tcttccaaca ataataatgt cagatcctgt agagaccaca 240

tcatccacgg ttctatactg ttgacccaat gcgtctccct tgtcatctaa acccacaccg 300

ggtgtcataa tcaaccaatc gtaaccttca tctcttccac ccatgtctct ttgagcaata 360

aagccgataa caaaatcttt gtcgctcttc gcaatgtcaa cagtaccctt agtatattct 420

ccagtagata gggagccctt gcatgacaat tctgctaaca tcaaaaggcc tctaggttcc 480

tttgttactt cttctgccgc ctgcttcaaa ccgctaacaa tacctgggcc caccacaccg 540

tgtgcattcg taatgtctgc ccattctgct attctgtata cacccgcaga gtactgcaat 600

ttgactgtat taccaatgtc agcaaatttt ctgtcttcga agagtaaaaa attgtacttg 660

gcggataatg cctttagcgg cttaactgtg ccctccatgg 700

Claims

1.一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，其特征在于包括如下步骤：首先，超氧化物歧化酶基因插入酿酒酵母表达载体的多克隆位点处后，构建含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母表达载体，通过限制性内切酶Nco I和ApaL I双酶切该表达载体，完全去除Ampicillin^R抗生素筛选标志，同时切去了URA3基因片段的部分片段；然后，将被酶切去除的URA3片段重新与含有超氧化物歧化酶基因的酿酒酵母表达载体连接，得到含有超氧化物歧化酶基因、GAL1启动子和终止子序列、多克隆位点、URA3片段以及不含有Ampicillin^R抗生素筛选标志的食品级酿酒酵母表达载体即食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体；将改造好的酿酒酵母食品级表达载体导入酿酒酵母中，筛选获得重组酿酒酵母，诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达，具体包括如下步骤：

(1)将中国拟青霉Cu，Zn-SOD即psSOD基因mRNA全长序列，进行全基因合成，所述psSOD基因mRNA全长序列如下：

Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgatt

cctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgccgacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtg

acaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaa

ccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcat

caagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggca

acgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa；

pYESpsSODf：5’-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3’；

pYESpsSODr：5’-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3’；

以步骤(1)得到的含psSOD基因片段的质粒为模板，pYESpsSOD(f+r)为引物，进行PCR扩增psSOD，并使克隆的psSOD两端分别加上了Hind III和Xba I酶切位点；得到的基因片段psSOD与pMD18-T载体连接，命名为pMD18-T-psSOD质粒，经测序与上述mRNA全长序列相符；

(3)用限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切酿酒酵母表达载体pYES2/CT及上述pMD18-T-psSOD质粒，分别得到双酶切载体与目的基因纯化液；将回收纯化的双酶切载体与目的基因纯化液以T4DNA连接酶进行连接，得到的重组载体命名为pYES-psSOD；

(4)根据酿酒酵母表达载体pYES2/CT载体的序列，设计上下游引物ura2和ura3，以扩增载体2823～3513bp之间片段，并在片段的一端即载体第2823bp端引入ApaL I酶切位点：

所述ura2：5’-GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3’；

所述ura3：5’-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3’；

以酿酒酵母表达载体pYES2/CT质粒为模板，ura2、ura3为引物进行PCR扩增，回收目的片段URA3后，将目的片段URA3与pMD18-T连接，重组质粒命名为pMD18-T-ura，所述URA3片段序列如下：

Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatt

tacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctacct

tagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctata

ctgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacc

catgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagta

gatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaac

cgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtac

tgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcgg

cttaactgtgccctccatgg；

(5)将已经构建好的酿酒酵母重组表达载体pYES-psSOD及pMD18-T-ura重组质粒，用ApaL I和Nco I进行双酶切，分别回收纯化pYES-psSOD的5103bp大片段及pMD18-T-ura的700bp片段；

将回收纯化的双酶切pYES-psSOD载体的5103bp大片段与pMD18-T-ura的700bp片段以T4DNA连接酶连接，重组质粒命名为pYES-psSOD-F，即为食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体；

2.根据权利要求1所述的一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，其特征在于：步骤(6)中，所述的酿酒酵母为ura3-1基因突变型的酿酒酵母。

3.根据权利要求1所述的一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，其特征在于：步骤(6)中，所述将食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体导入酿酒酵母中的方法为氯化锂化学转化法或电激转化法。

4.根据权利要求1所述的一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，其特征在于：步骤(6)中，所述筛选获得重组酿酒酵母的方法为涂布尿嘧啶营养缺乏培养基。

5.根据权利要求1所述的一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法，其特征在于：步骤(6)中，所述诱导重组酿酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达时需加入半乳糖，半乳糖诱导浓度为2％，诱导时间为48～96小时。

6.用于权利要求1所述的一种超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法的食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体，其特征在于：所述食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1启动子和终止子序列、多克隆位点、URA3片段以及不含有Ampicillin^R抗生素筛选标志的酿酒酵母表达载体。

7.根据权利要求6所述的用于超氧化物歧化酶基因的食品级表达方法的食品级表达超氧化物歧化酶基因的专用载体，其特征在于：所述超氧化物歧化酶基因位于酿酒酵母表达载体的多克隆位点的HindIII和Xba I限制性内切酶酶切位点之间。