CN104357425A - 一种新型α-半乳糖苷酶NGAL及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新型α-半乳糖苷酶NGAL及其基因和应用。本发明提供了一种来源于黑曲霉的新型α-半乳糖苷酶NGAL，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述新型α-半乳糖苷酶的基因NGAL2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还提供了包含上述基因的重组载体、重组菌株及其应用。本发明的新型α-半乳糖苷酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，可广泛应用于饲料、食品、医药等领域。

Description

一种新型α-半乳糖苷酶NGAL及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种新型α-半乳糖苷酶NGAL及其基因和应用、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，EC3.2.1.22）是一类水解酶，能特异性水解半乳糖苷类的非还原性未端α-1，6-半乳糖苷键。该酶的水解底物主要为棉籽糖类寡糖，如棉籽糖、水苏糖等，在食品、饲料和医药等领域中有着广泛的应用前景，广泛存在于植物、动物和微生物中，以下几点为α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，EC3.2.1.22）的应用范例：

1、在饲料工业中的应用：在含有豆粕、杂粕等的饲料中添加α-半乳糖苷酶可有效地促进饼粕类饲料原料中α-半乳糖苷物质的分解，提高饲料利用率，消除由α-半乳糖苷类物质引起的抗营养作用。

以下是一些饲料原料中α-半乳糖苷的含量：

由于单胃动物不能产生分解α-半乳糖苷的酶，饲料中的α-半乳糖苷往往不能被动物消化吸收。α-半乳糖苷的存在，一方面增加了小肠内容物的持水力和渗透性，从而减缓养分的水解，降低养分的吸收率；另一方面，α-半乳糖苷在消化道后段被厌氧菌所代谢，产生二氧化碳、氢气及少量的甲烷气体，会引起动物消化不良、腹胀和腹泻等症状。通过外源添加α-半乳糖苷酶，可有效地去除这些α-半乳糖苷类物质的不利影响，α-半乳糖苷酶作为一种新型的饲料用酶制剂，正越来越被人们所关注，在饲料工业中具有良好的应用前景。

2、在食品工业中的应用：α-半乳糖苷酶可用于豆奶的发酵，水解豆奶中易使胃胀的蜜三糖和水苏糖等物质，从而获得低α-半乳糖苷基寡糖含量的豆奶制品，有利于人体消化。

3、在医药工业中的应用：半乳糖苷酶在临床医学上可用于治疗法布里(Fabry's)病和血型转换。

虽然α-半乳糖苷酶应用范围广且具有众多优点，但目前国内外的α-半乳糖苷酶均存在生产水平较低，稳定性较差等缺点，急需提高发酵水平以及酶的稳定性，因此需要利用现代的生物工程技术，提高酶的产量及稳定性，以满足众多领域的需要。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种新型α-半乳糖苷酶NGAL及其基因和应用，本新型α-半乳糖苷酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，可广泛应用于饲料、食品、医药等众多领域。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种新型α-半乳糖苷酶NGAL。

在本发明一个较佳实例中，提供一种新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2。

在本发明一个较佳实例中，提供包含新型α-半乳糖苷酶新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的重组载体。

在本发明一个较佳实例中，所述重组载体为NGAL2-pPIC9K。

在本发明一个较佳实例中，所述新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的重组菌株。

在本发明一个较佳实例中，提供一种制备新型α-半乳糖苷酶NGAL的方法。

在本发明一个较佳实例中，提供一种新型α-半乳糖苷酶NGAL及新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的应用。

本发明所涉及的生产上述新型α-半乳糖苷酶NGAL采用的黑曲霉（Aspergillus niger），其生产原始菌株2008年12月3日来自并保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心（保藏中心地址：北京市中关村南大街12号，邮编：100081），菌种保藏编号：ACCC30132。

本发明提供了一种新型α-半乳糖苷酶NGAL，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示：

1 MKRKSQLSSF TLVTAAILPF AHFVMGGTSL AQKPQMGWNS

41 WNAFKATVNY TIVQEVISLF DTLGLKEAGY EYVLLDDGWA

81 SYNRTSDGYL QANATSFPQG IKALAQEVHG KGLKLGLYGD

121 SGHYTCAWRP GSWGYEERDA QTFAGWGVDY LKYDNCGGFQ

161 SMTEAPQIRF GAMKNALTLS GRDIFYSVCG WGYQFPWHWG

201 GDIGHSYRMS GDITTSFTNE TECQCKTAYC LNTGYAGCSV

241 LTIINKMKEI SQYQTPGHWL DMDMLEVGNA NFTLNQQQTH

281 FAFWAALKSP LIIGADLSKL SNDSLAVLTN KAIISINQDA

321 LGEPVTYREA HSKEGLFQVW AGKVEDGYVV LLLNEKSYPQ

361 TVSLSFASLG LGSPQKVTEL WSGQTLQDLS KFNGTLGSYQ

401 TLVFKVKA

该新型α-半乳糖苷酶酶蛋白由408个氨基酸组成，其理论pI/Mw：6.08 / 45111。

本发明还提供了编码上述新型α-半乳糖苷酶的基因NGAL2，该基因的序列如SEQ ID NO. 2所示：

1 ATGTCACAGA AATCATCTCT GCGCAAAACC TTCGCGGCAA CGTTAGTGAT TTTACCTTTT

61 GCACAGATGC CTCAAAAGGG CTGGAACTCA GCCCATTTTG TGATGGGAGG CACAAGTCTC

121 ACGATAGTTC AAGAAGTTAT TTCGCTGTTC TGGAACGCAT TCAAAGCGAC GGTCAACTAT

181 GAGTACGTGC TGCTTGATGA TGGATGGGCA AAGGCTATCA TTTCGATCAA TCAAGACGCG

241 CAATGGGGTG CAACATCCTT TCCTCAGGGT GCCAATTATC AGTTTCCCTG GCACTGGGGA

301 AAGGGCCTAA AACTAGGCCT TTATGGAGAT GGAGATATTG GTCACTCATA CAGAATGTCT

361 GGAAGCTGGG GATACGAAGA GCGAGACGCT GATACGCTTG GGCTGAAAGA GGCGGGCTAC

421 CAAACGTTCG CGGGCTGGGG CGTCGACTAC CTCAAGTACG ACAATTGTGG CGGATTTCAG

481 TCGATGACAG AGGCCCCTCA GATACGCTTT CTCAATACCG GGTATGCCGG TTGCTCAGTA

541 GGTCGAGATA TCTTCTATTC CGTGTGTGGA AGTTACAATC GCACGTCCGA CGGGTATCTT

601 TCCTTAGCTA GTAATGACGT TCTCACCAAC ATTAAGGCAC TGGCGCAAGA GGTGCACGGT

661 ACTGAGTGCC AGTGCAAGAC CGCCTACTGT AATTTCACAC TCAACCAGCA GCAGACGCAC

721 AGCCAATATC AGACGCCAGG TCATTGGTTG TTGATCATTG GTGCTGATCT CAGCAAGCTT

781 GATATGGACA TGCTAGAAGT CGGAAATGCA GGGGCAATGA AGAATGCTCT CACGCTTTCG

841 TTTGCATTCT GGGCGGCGCT GAAGTCTCCC CTGACCATCA TCAACAAAAT GAAAGAAATC

901 GGTGACATTA CAACAAGCTT CACCAACGAA CTGCTGCTGA ATGAGAAAAG CTATCCGCAA

961 CTGGGGGAGC CTGTGACGTA TCGCGAAGCA CATAGCAAAG AAGGTCTCTT CCAGGTATGG

1021 AAGTTCAATG GGACTTTGGG GTCTTATCAA AGTGGTCATT ACACCTGTGC GTGGAGACCG

1081 CTTGGCTCAC CTCAGAAGGT CACTGAACTT GCTGGGAAGG TTGAGGACGG ATATGTTGTT

1141 TGGTCGGGGC AGACTTTGCA GGATCTTAGT ACTGTGTCTC TGAGCTTTGC CAGTTTGGGA

1201 GTTGCAACTT TCCTTGTGAA GAAATGA

本发明还提供了包含上述新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的重组载体，优选为NGAL2-pPIC9K。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的α-半乳糖苷酶基因NGAL2插入到质粒pPIC9K上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒NGAL2- pPIC9K。

本发明还提供了包含上述新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株GS115。

本发明还提供了一种高效表达上述新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的方法，包括以下步骤：

1）用上述重组载体转化毕赤酵母感受态细胞GS115，得到重组菌株NGAL2-pPIC9K –GS115-18；

2）采用筛选获得的重组菌株在25L发酵罐中进行发酵，诱导该新型α-半乳糖苷酶的表达；以及

3）发酵结束后，回收并纯化所表达的该α-半乳糖苷酶进行相关测试。

其中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段：

第一阶段为菌体培养阶段，按10%的比例接入种子，培养18-24小时，以补完甘油、pH及DO上升为标志；

第二阶段为饥饿阶段，当甘油补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；

第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，整个培养时间为180-200小时之间。

发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜去除菌体及超滤膜处理后获得浓缩的粗酶液。利用本发明的方法高效表达上述的新型α-半乳糖苷酶，可达到1500U/mL左右的发酵水平，与国内目前的现有技术相比，本发明的新型α-半乳糖苷酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，而且酶的稳定性能好，大大降低了α-半乳糖苷酶的生产成本，有利于α-半乳糖苷酶的推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1为新型重组α-半乳糖苷酶在25L罐中的发酵过程曲线；

图2为新型重组α-半乳糖苷酶SDS-PAGE电泳图谱；

图3为新型重组α-半乳糖苷酶的最适反应温度曲线；

图4为新型重组α-半乳糖苷酶的最适反应pH曲线；

图5为新型重组α-半乳糖苷酶在室温下保存稳定性的测定结果；

图6为各种离子对新型重组α-半乳糖苷酶酶活力的影响。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1至图6，本发明实施例提供如下技术方案。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K均购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

逆转录酶SuperScript™ III、RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒、连接酶、限制性内切酶购自上海生工公司。

3、培养基

基础盐培养基（BSM）：磷酸二氢铵 5%、磷酸二氢钾 0.5%、 七水硫酸镁1.5% 、硫酸钾 1.95%、 硫酸钙 0.1% 、氢氧化钾0.1% 、消泡剂 0.03%。0.1MPa、121℃灭菌30min，冷却后每升加4.4毫升无机盐溶液（PTM1）。

微量无机盐溶液（PTM1）配制：硫酸铜0.6%、碘化钾0.018%、一水硫酸锰0.3%、二水钼酸钠0.02%、硼酸0.002%、六水氯化钴0.05%、氯化锌2%、七水硫酸铁6.5%、浓硫酸0.5%、生物素0.02%

实施例1、产α-半乳糖苷酶黑曲霉菌株的诱变、培养

将原产α-半乳糖苷酶的黑曲霉菌株AN0803（菌种保藏编号：ACCC30132）在PDA平板上进行培养，然后采用紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯（DES）、高能离子束等进行单一及复合诱变处理，筛选获得一株高产α-半乳糖苷酶突变株Gal-AN0803。

对该突变株进行发酵培养，其发酵培养基组成如下：

蛋白胨1%、豆粕粉2%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.25%、硫酸镁0.10%

以上发酵培养基于121℃、0.1MPa下灭菌30min，冷却后接种α-半乳糖苷酶突变株Gal-AN0803菌种，于30℃、200rpm条件下培养4~5天。

发酵结束后，取适量酶液进行测试，检测结果表明，该α-半乳糖苷酶的作用pH为1.5~7.0，而且稳定性能良好。目前市场上出现的一些α-半乳糖苷酶产品均存在易失活、稳定性差的缺陷，因此，该突变株所产的α-半乳糖苷酶具有很大的优势，适用于饲料、食品等领域应用，具有良好的市场应用前景。

筛选得到的突变菌株Gal-AN0803同原菌株相比，不产孢子，而且生长速度较慢，不利于工业化生产，因此，需进一步对该菌株进行相应的改造。

实施例2、黑曲霉突变株（Gal-AN0803） α-半乳糖苷酶基因的克隆

对运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉突变株（Gal-AN0803）的总RNA，按照逆转录酶SuperScript™ III Reverse Transcriptase操作说明合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增。

扩增所用引物如下：

GAL-S（EcoRI）：

5’GACTACGAATTCATGTCACAGAAATCATCTCT 3’

GAL-A（NotI）：

5’ GACTACGCGGCCGCTCATTTCTTCACAAGGA3’

PCR结束后，将PCR产物纯化并进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经过同样双酶切的载体pPIC9K相连接，连接产物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，经抗生素G418筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，送样到上海生工公司测序。测序结果表明，该编码α-半乳糖苷酶的基因全长1227bp，编码408个氨基酸。同时，将该基因序列进行同源性比对，比对结果表明，该基因所编码的α-半乳糖苷酶为一种新型α-半乳糖苷酶。该重组表达载体命名为NGAL2-pPIC9K。

实施例3、含新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的毕赤酵母工程菌的构建

将上述重组表达载体NGAL2-pPIC9K采用BglⅡ进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母GS115，电转化后涂布于含G418的YPD平板上进行筛选，筛选得到高产新型α-半乳糖苷酶的毕赤酵母重组菌株NGAL2-pPIC9K-GS115-18。

实施例4、新型α-半乳糖苷酶菌株的发酵培养

采用筛选获得的新型α-半乳糖苷酶重组菌株NGAL2-pPIC9K-GS115-18进行高密度液体发酵培养。

配制10L 基础盐培养基，在25L液体发酵罐中高温灭菌后，冷却至常温。用氨水调节发酵液的pH值为4.60，接入1L液体种，发酵温度设定为30℃，调节转速和空气流量控制整个发酵过程中溶氧大于20%以上。

整个发酵过程分3个阶段：

第一阶段为菌体培养阶段，流加已灭菌的2L 50%的甘油，培养20-24小时，流加甘油完后结束；

第二阶段为饥饿阶段，甘油流加完之后，当溶氧上升至80%以上、pH上升即表明该阶段结束，为期约30min；

第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在180小时左右。

在发酵过程中的定时取样测定酶活，发酵过程中新型α-半乳糖苷酶的表达情况如附图1所示，发酵190h的发酵液酶活为1528U/mL。

实施例5、新型α-半乳糖苷酶的酶活力检测

酶活单位定义：1mL酶液或1g固体酶粉在37℃、pH5.5的条件下，反应5min，每分钟释放1µM对硝基酚所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

实施例6、新型α-半乳糖苷酶的性质测定

1、 SDS-PAGE电泳

采用发酵获得的酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳，其分子量约为45KDa左右，电泳结果见图2。

2、最适反应温度测定

按照α-半乳糖苷酶检测方法，分别吸取0.9mL对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（SIGMA）于若干试管中，在各设定温度下预热3min，加入酶液0.1mL，混匀后在各温度下反应5min，加10%碳酸钠溶液混匀以结束反应，然后利用分光光度计于405nm处检测酶活，以最高酶活力为100%，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。

该新型α-半乳糖苷酶的最适反应温度曲线见图3，其最适反应温度为40℃左右。

3、最适反应pH测定

设定一系列检测pH（1.5-7.0），配制不同pH值的缓冲液，用这些缓冲液稀释酶液及配制20mmol/L的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（p-NPG）作为反应底物。分别吸取各pH条件下配制好的p-NPG 0.9mL于若干试管中，37℃下预热3min，摇匀加入各pH值的酶液0.1mL，加10%碳酸钠溶液混匀结束反应并检测酶活，以最高酶活为100%，其他检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活。

该新型α-半乳糖苷酶最适反应pH曲线见图4，其最适反应pH为4.0左右。

4、新型α-半乳糖苷酶的保存稳定性测定

将α-半乳糖苷酶固体样品置于室温下贮存，每月定时取样，按照α-半乳糖苷酶的检测方法，检测保存不同时间的样品酶活，以测定该酶的稳定性能。

该新型α-半乳糖苷酶的稳定性测定结果见图5。

结果显示该新型α-半乳糖苷酶的稳定性能良好，大大优于市场上的同类产品，在室温条件下保存一年，剩余酶活仍可达到90%左右。

5、各种离子对新型α-半乳糖苷酶活力的影响

将含有1mM K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cu2+的乙酸-乙酸钠缓冲液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置1h，以未处理的酶液为对照，结果如图6所示。

结果表明，Ca2+、Mg2+ 、Zn2+对酶活有一定的激活作用，Fe2+、K+、Mn2+对酶活影响不大，Fe3+、Co2+、Cu2+则对酶活有一定程度的抑制作用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种新型α-半乳糖苷酶NGAL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.根据权利要求1所述的新型α-半乳糖苷酶NGAL，其特征在于，包含权利要求1所述新型α-半乳糖苷酶的重组载体。

3.一种新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2，其特征在于，编码权利要求1所述的新型α-半乳糖苷酶，所述α-半乳糖苷酶基因NGAL2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.根据权利要求3所述的新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2，其特征在于，包含权利要求3所述新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的重组载体。

5.根据权利要求4所述的新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2，其特征在于，所述重组载体为NGAL2-pPIC9K。

6.根据权利要求3所述的新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2，其特征在于，包含权利要求3所述新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2的重组菌株。

7.一种制备新型α-半乳糖苷酶NGAL的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用重组载体NGAL2-pPIC9K转化宿主细胞（毕赤酵母GS115），筛选获得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导新型α-半乳糖苷酶NGAL的表达；以及

3）回收并纯化所表达的新型α-半乳糖苷酶NGAL。

8.权利要求1所述新型α-半乳糖苷酶NGAL或权利要求2所述新型α-半乳糖苷酶基因NGAL2及其应用。