CN105219791A - 高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的工程菌及其构建和应用 - Google Patents

高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的工程菌及其构建和应用 Download PDF

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李盛英
郑贤良
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Abstract

本发明属于生物技术和基因工程领域，涉及两株高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌及其构建方法。本发明将经过密码子优化及信号肽Kex2酶切位点优化的重组黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)基因工程菌中异源分泌表达，提高了α-半乳糖苷酶AGA的分泌表达量。一株菌QIBEBT-AGA-I，甲醇诱导发酵72h，胞外酶活可达1244U/mL；另一株菌QIBEBT-AGA-P，甲醇诱导发酵120h，胞外酶活可达1340U/mL。两株菌的胞外α-半乳糖苷酶产量均高于普通工程菌株产量。本发明有助于降低黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的工业化生产成本，因此具有大规模工业发酵，商业化生产α-半乳糖苷酶的潜力和价值。

Description

高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的工程菌及其构建和应用
技术领域
本发明涉及生物技术和基因工程领域，具体涉及高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的工程菌及其构建和应用。
背景技术
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)是一类外切糖苷酶酶，广泛存在于动植物及微生物中(Vianaetal.,2006)，能特异性水解半乳糖苷类的非还原性末端α-1,6-半乳糖苷键，如蜜二糖、棉籽糖、水苏糖等寡糖类(JaekooLee,2012)。基于以上特点，α-半乳糖苷酶在食品、饲料、化工、造纸、医药等方面都有很重要的应用价值。
在食品工业中，α-半乳糖苷酶可用于制糖工业中糖蜜的棉籽糖分解，提高产率和效率；也可以用于豆奶的发酵，水解豆奶中易造成胃胀的蜜三糖和水苏糖等多聚寡糖，从而获得低α-半乳糖苷基寡糖含量的豆奶制品，有利于人体消化(Patiletal.,2010)。
在饲料工业中，α-半乳糖苷酶可以作为一种特异性外源饲用酶，添加到含有豆类籽实和饼粕的饲料中，有效降解α-半乳糖苷类寡糖物质，提高饲料利用率，消除由α-半乳糖苷类物质引起的单胃动物肠道食糜滞留，导致肠道胀气，消化紊乱，下痢等抗营养作用(Ghazietal.,2003)。
在医药和化学工业中，α-半乳糖苷酶可以用于治疗法布里病(Fabry’s)(Rieraetal.,2015)和B→O血型转换(Zhangetal.,2007)；另外，α-半乳糖苷酶可以对环糊精改性，增加环糊精的亲水性，提高环糊精对化学分子的包埋及缓释效率。
在造纸工业中，α-半乳糖苷酶可以与甘露聚糖酶协同作用，提高纸浆的漂白效率(Puchartetal.,2000)。
虽然α-半乳糖苷酶应用范围广且具有众多优点，但目前国内外的α-半乳糖苷酶均存在生产水平较低，稳定性较差等缺点，急需提高酶发酵水平，因此需要利用现代生物工程技术，提高酶的分泌表达量，以满足众多领域的需要。
酵母表达系统具有生长快、操作简单，利于大规模发酵生产等优点，同时真核生物能对表达的外源蛋白质进行必要的翻译后修饰，使得表达的蛋白具有生物学活性等优点。研究发现，毕赤酵母遗传背景清晰，易于基因工程操作；与日常生活密切，安全，无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；发酵工艺简单，原料成本低廉，因此建立α-半乳糖苷酶高效分泌表达的毕赤酵母菌株具有良好的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的工程菌及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母密码子优化序列，毕赤酵母密码子优化序列reAGA为SEQIDNO:3所示。
一种高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌，其特征在于工程菌为携带SEQIDNO:3所示毕赤酵母密码子优化序列reAGA及Kex2蛋白酶切位点突变的毕赤酵母突变体。
所述携带Kex2蛋白酶切位点突变的突变体为Kex2蛋白酶切P1’位点的E86突变为I的有效突变体E86I，其DNA序列分别为SEQIDNO:6。
所述携带Kex2蛋白酶切位点突变的突变体为Kex2蛋白酶切P1’位点的E86突变为P的有效突变体E86P，其DNA序列分别为SEQIDNO:7。
其，DNA序列SEQIDNO:6对应的蛋白序列为SEQIDNO:8；DNA序列SEQIDNO:7对应的蛋白序列为SEQIDNO:9。
一种高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌的构建方法：
1)将经优化的黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA基因序列密码子reAGA克隆至载体，得含有SEQIDNO:4碱基序列的重组质粒pPICZαA-reAGA；
2)以上述获得重组质粒pPICZαA-reAGA为模板，Kex2P1’位点定点突变的引物对，进行全质粒PCR，获得重组质粒pPICZαAX-reAGA；
3)将上述获得重组质粒pPICZαAX-reAGA转化毕赤酵母细胞，即获得毕赤酵母工程菌。
所述Kex2P1’位点定点突变的引物对为：
F1(E86A)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGCTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F2(E86C)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCACATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F3(E86D)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCATCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F4(E86F)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAAATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F5(E86G)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGGTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCACCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F6(E86H)：GGTATCTCTCGAGAAAAGACATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCATGTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F7(E86I)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAATTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAATTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F8(E86K)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTTTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F9(E86L)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGACTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAAGTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F10(E86M)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAATGGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCCATTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F11(E86N)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAAACGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCGTTTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F12(E86P)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGACCAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTGGTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F13(E86Q)：GGTATCTCTCGAGAAAAGACAAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTTGTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F14(E86R)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAAGAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTCTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F15(E86S)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATCTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F16(E86T)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAACTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F17(E86V)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAACTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F18(E86W)：GGTATCTCTCGAGAAAAGATGGGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCCCATCTTTTCTCGAGAGATACC；
F19(E86Y)：GGTATCTCTCGAGAAAAGATATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCATATCTTTTCTCGAGAGATACC。
一种α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母密码子优化序列的应用，所述优化序列在高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA中的应用。
一种高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌的应用，所述工程菌在高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA中的应用。
本发明的有益效果在于：(1)通过毕赤酵母分泌表达系统获得重组黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA；2)密码子优化后，高效表达重组黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA，表达产物的酶学活性和商品α-半乳糖苷酶活性相当。3)本发明通过定点突变Kex2酶切位点，优化了重组α-半乳糖苷酶的分泌效率，提高了酵母表达体系中重组黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的表达量，从而具有降低工业生产α-半乳糖苷酶成本，大规模发酵，商业化生产重组黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的潜力和价值。
附图说明
图1A为本发明实施例提供的reAGA基因的PCR产物电泳图，
图1B为本发明实施例提供的reAGA基因的PCR产物的酶切电泳图，其中，泳道M为DNAMarker，图1A泳道1为reAGA的PCR产物；图1B泳道1，2为pPICZαA-reAGA的双酶切(EcoRI和NotI)产物。
图2为为本发明实施例提供的重组质粒pPICZαA-reAGA的构建过程示意图。
图3为为本发明实施例提供的pPICZαAX-reAGA转化子在高抗筛选平板上的生长情况图。
图4为为本发明实施例提供的pPICZαAX-reAGA重组转化子菌落PCR验证图。
图5为为本发明实施例提供的工程菌摇瓶发酵表达α-半乳糖苷酶后酶活性测定图。
图6为为本发明实施例提供的酶产量较高的毕赤酵母工程菌QIBEBT-AGA-I与QIBEBT-AGA-P表达上清与Kex2酶切位点未优化的原始菌株(NA)SDS-PAGE比较图。
图7为为本发明实施例提供的毕赤酵母工程菌QIBEBT-AGA-I，QIBEBT-AGA-P发酵罐(2L)发酵甲醇诱导120h后酶活柱状图。
具体实施方式
下面将结合实施例以及图1-图7所示，对本发明作进一步的阐述。但本发明并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、定点突变，凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW，JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所用毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71购自Invitrogen公司。黑曲霉菌株和pPICZαA表达载体(Invitrogen公司)为本实验室保存。
实施例1
1.黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA基因序列的获得(SEQIDNO:1)：
从NCBI网站上搜索黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA序列(GenBankAccessionNo.AJ251873.1)。
2.黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA部分密码子优化后序列reAGA的获得(SEQIDNO:3)：
1)分析SEQIDNO:1，将序列按照酵母密码子偏好性(http://www.kazusa.or.jp/codon)，进行密码子优化。同时在前面和后面加入EcoRI和NotI酶切位点，得到优化后reAGA序列(SEQIDNO:3)。合成上述基因片段，克隆到载体PUC57上，得PUC57-reAGA。
3.分泌表达型重组质粒pPICZαA-reAGA的构建
将pPICZαA和合成的PUC57-reAGA经EcoRI和NotI双酶切，产物经纯化，用T4DNA连接酶在25℃水浴中进行连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株。用通用引物5’AOX1和3’AOX1引物对转化菌落经菌落PCR鉴定后测序验证，从而得到重组质粒pPICZαA-reAGA(如图1和图2)。
4.分泌表达型重组质粒pPICZαAX-reAGA的构建
以上19对引物分别作为引物，以重组质粒pPICZαA-reAGA为模板，分别通过全质粒PCR，PCR条件为：98℃3min；98℃30s；65℃30s；68℃6min；循环36次；68℃15min。获得重组质粒pPICZαAX-reAGA，即将Kex2酶切位点突变为19种不同的氨基酸；PCR产物经过DpnI酶切，将模板DNA降解，然后分别转化大肠杆菌DH5α菌株。提质粒经过测序验证，从而获得Kex2酶切位点突变为19种不同的氨基酸的重组质粒pPICZαAX-reAGA。所述重组质粒pPICZαA-reAGA中包含酿酒酵母α因子分泌信号肽序列和kex2蛋白酶切位点，其C端融合了密码子优化后的基因序列reAGA，得到序列为SEQIDNO:4，其对应的蛋白序列如SEQIDNO:5所示。
所述19对引物为：
F1(E86A)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGCTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F2(E86C)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCACATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F3(E86D)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCATCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F4(E86F)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAAATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F5(E86G)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGGTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCACCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F6(E86H)：GGTATCTCTCGAGAAAAGACATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCATGTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F7(E86I)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAATTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAATTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F8(E86K)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTTTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F9(E86L)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGACTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAAGTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F10(E86M)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAATGGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCCATTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F11(E86N)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAAACGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCGTTTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F12(E86P)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGACCAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTGGTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F13(E86Q)：GGTATCTCTCGAGAAAAGACAAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTTGTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F14(E86R)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAAGAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCTCTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F15(E86S)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATCTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F16(E86T)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAACTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F17(E86V)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCAACTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F18(E86W)：GGTATCTCTCGAGAAAAGATGGGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCCCATCTTTTCTCGAGAGATACC；
F19(E86Y)：GGTATCTCTCGAGAAAAGATATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，GTGCGAATTCAGCTTCAGCATATCTTTTCTCGAGAGATACC。
5.19种突变获得重组质粒pPICZαAX-reAGA分别转化毕赤酵母KM71
(1)制备毕赤酵母KM71感受态细胞
①接种毕赤酵母KM71单菌落至2mlYPD液体培养基中，30℃、250rpm，摇瓶培养约10h。
②转接50μL活化的毕赤酵母KM71菌液到50mLYPD液体培养基中，30℃、250rpm，摇瓶培养至OD600为1.3-1.5左右，将菌液收集在提前4℃预冷的50mL离心管中。
③4℃、5000rpm、3min，离心收集菌体细胞，用40mL预冷的无菌水轻轻吹吸悬浮细胞。
④4℃、5000rpm、3min，离心收集菌体细胞，用10-20mL预冷的无菌水悬浮细胞。
⑤4℃、5000rpm、3min，离心收集菌体细胞，用10-20mL预冷的1M山梨醇轻轻吹吸悬浮细胞。
⑥4℃、5000rpm、3min，离心收集菌体细胞，用200μL预冷的1M山梨醇悬浮细胞，分装到EP管中，每管100μL。
(2)转化pPICZαAX-reAGA质粒到毕赤酵母KM71感受态细胞中
①用SacⅠ限制性内切酶对10μgpPICZαAX-reAGA质粒进行线性化，然后用纯化回收试剂盒Wizard对线性化片段进行回收，并溶于10μL水中。
②把10μL线性化片段加入到100μL毕赤酵母KM71感受态细胞中，混合均匀，加至预冷的电击杯中，冰上放置5min。
③根据电击仪推荐的酵母参数设置，1500v,200Ω,25Fu，进行电击。
④立即向电击杯中加入1mL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，转移到1.5mL离心管，30℃静置培养1h，250rpm，摇床培养1h。
⑤全部吸出均匀涂于含有Zeocin(100ug/mL)的YPDS平板。
⑥置于30℃恒温培养箱中，直至长出单克隆。
(3)菌落PCR反应筛选阳性菌落。从YPDS平板上把单菌落做编号标记，用枪头挑取少量菌体溶于20μL水中，然后-80℃冻5min，沸水煮5min，反复3次，最后取1μL作为模板进行PCR反应，PCR反应条件：94℃5min，(94℃30s，60℃30s，72℃1.5min)30个循环，72℃10min。1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，如图4所示，筛选出阳性菌落，并对阳性菌落进行划线纯化培养。
(4)高表达转化子的筛选。将划线纯化培养的单菌落做编号标记，用枪头挑取少量菌体转接到高抗Zeocin(2000ug/mL)的YPDS平板上进行多拷贝高表达转化子的筛选，(一般拷贝数越多，菌落在高抗板上长得越快，菌落越大，如图3所示)。
6.重组黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA在毕赤酵母工程菌中的表达，具体步骤如下：
(1)将19株Kex2酶切位点突变的重组转化子AGA-X和未突变的重组转化子AGA-NA单菌落，接种到含25mlBMGY(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，1.34％YNB，1％甘油，4*10-5生物素)培养基的250ml三角瓶中，在28℃、250rpm的条件下培养至OD600＝2-6；
(2)在1500-3000g的条件下，离心5min收集菌体，置于100mlBMMY(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，1.34％YNB，0.5％甲醇，4*10-5生物素)培养基的500ml三角瓶中，在28℃、250rpm的条件下进行甲醇诱导表达；每间隔24h，向培养基中添加0.5-1ml的甲醇，使其终浓度为0.5-1％。
(3)在定时取样测酶活。
酶活力单位(U)定义：在40℃，pH5.5的条件下,每分钟从底物溶液(p-NPG)中释放1μmol对硝基苯酚(p-NP)需要的酶量为一个酶活力单位，简称为U。
取200uL底物(10mmol/LpNPG)、700uLpH5.5缓冲液，于40℃保温10min后，加入100uL适当稀释的发酵液，于40℃精确保温10min后立即加入1mL0.5mol/L的碳酸钠溶液终止反应并显色，在波长405nm处测定吸光值。空白先加碳酸钠再加酶液。
如图5所示，经过酶活检测，得到了两株表达量较高的毕赤酵母工程菌株QIBEBT-AGA-I含有SEQIDNO:6所示碱基序列和QIBEBT-AGA-P含有SEQIDNO:7所示碱基序列。
(4)SDS-PAGE电泳
采用发酵获得的酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳，其分子量约为110kDa左右，电泳结果见图6。
7.重组黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA毕赤酵母工程菌株AGA-I，AGA-P高密度液体发酵培养，具体步骤如下：
配制1.2L基础盐培养基(4％甘油，1.65％硫酸钾，1.35％硫酸镁，1.5％磷酸二氢铵，0.46％磷酸二氢钾，0.09％硫酸钙，0.136％氢氧化钾，12mL/LPTM1)在2L液体发酵罐中高温灭菌后，冷却至29℃。用氨水调节发酵液的pH值为5.0，接入100mL种子液QIBEBT-AGA-I，QIBEBT-AGA-P和AGA-NA。发酵温度设定为29℃，调节转速和空气流量控制整个发酵过程中溶氧维持在20％-30％。
整个发酵过程分3个阶段：
第一阶段为菌体培养阶段，搅拌速度：200-800rpm、培养温度：28-30℃、通风量：1:1.2，pH4.9-5.0(用氨水调节)，罐压0.05MPa；
第二阶段为碳源饲喂阶段，当罐内碳源耗尽后，溶氧上升、pH上升，补50％的甘油，溶氧维持在20％-30％；
第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在160小时左右。
在发酵过程中的定时取样测定菌体OD600及酶活，发酵过程中毕赤酵母Kex2酶切位点突变重组毕赤酵母转化子QIBEBT-AGA-I，QIBEBT-AGA-P和对照组的未突变重组转化子AGA-NA诱导120h后胞外酶活如图7所示，重组菌株QIBEBT-AGA-I和QIBEBT-AGA-P发酵诱导120h发酵液酶活分别为1360U/mL和1370U/mL，其中重组菌株QIBEBT-AGA-I在甲醇诱导72h后其胞外酶活即可达1244U/mL，该产酶速度及产量高于一般工业用工程菌。
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Zhang,Y.P.,Gong,F.,Bao,G.Q.,Gao,H.W.,Ji,S.P.,Tan,Y.X.,Li,S.B.,Li,L.L.,Wang,Y.L.,Xu,H.,Xu,L.J.,Tian,S.G.,Zhang,Z.X.,Lu,Q.S.,Qiu,Y.,Bai,J.S.,Chen,J.T.2007.BtoOerythrocyteconversionbytherecombinantalpha-galactosidase.ChineseMedicalJournal,120(13),1145-1150.
SEQIDNO:1：
GCACCCGCAATTGGGGCTTCGAATTCACAGACGATCGTTACGAATGGCACTAGTTTCGCATTGAACGGCGACAATGTCTCATATCGATTCCATGTCAACAGTAGCACCGGCGACTTGATTTCTGATCATTTTGGTGGTGTCGTCTCCGGCACAATCCCTTCGCCAGTGGAACCTGCTGTCAACGGCTGGGTCGGCATGCCTGGTCGAATCCGCCGGGAGTTCCCCGACCAAGGCCGTGGGGATTTCCGCATTCCCGCCGTTCGTATTCGGGAATCGGCAGGTTATACTGTTAGCGATCTCCAATATGTGTCGCACGAGGTGATCGAAGGTAAATATGCTTTGCCTGGCCTGCCTGCCACATTTGGCGATGCGCAGGACGCCACCACTTTGGTAGTCCATCTGTATGACAACTATAGCTCCGTCGCGGCCGACTTGTCATACTCCATATTTCCGAAATATGATGCGATCGTGAGGAGTGTCAATGTGACCAACCAGGGCCCAGGTAATATCACTATCGAGGCCCTTGCAAGCATAAGTATCGATTTCCCCTATGAAGACCTCGACATGGTCAGCCTCCGAGGCGACTGGGCCAGAGAGGCAAATGTTCAGAGAAGCAAAGTGCAGTATGGCGTCCAGGGATTTGGAAGCAGTACTGGATATTCCTCTCACCTTCATAATCCCTTCCTTGCCATAGTAGATCCAGCTACTACCGAATCGCAAGGCGAGGCATGGGGTTTCAACCTTGTATATACCGGCTCTTTCTCGGCGCAAGTAGAGAAAGGATCGCAAGGTTTCACCCGGGCGCTGCTCGGCTTCAACCCGGACCAATTATCGTGGAACCTTGGCCCTGGCGAGACTTTAACCTCCCCCGAGTGTGTTGCAGTCTACTCGGACAAAGGCCTTGGCTCAGTGTCTCGCAAATTCCACCGGCTATATCGCAACCACCTCATGAAGAGCAAGTTCGCCACGTCCGACCGGCCGGTTCTGCTGAATAGCTGGGAAGGTGTTTATTTCGACTACAATCAAAGCAGCATCGAAACTCTTGCCGAAGAGTCCGCTGCCCTGGGTGTCCACCTCTTTGTCATGGACGACGGCTGGTTTGGGGACAAGTACCCTCGAGTGTCCGATAACGCCGGACTGGGCGACTGGATGCCCAATCCAGCGCGCTTCCCGGACGGGTTGACCCCGGTCGTGCAAGACATCACAAATCTCACCGTCAATGGCACAGAGTCCACAAAACTTCGCTTTGGTATTTGGGTGGAGCCCGAGATGGTCAACCCCAATTCCACTCTCTACCACGAACACCCGGAGTGGGCGCTTCATGCCGGGCCTTACCCCCGTACCGAGCGTCGGAACCAGCTCGTCCTCAACCTGGCGCTTCCGGCTGTGCAGGACTTCATCATAGACTTCATGACGAACCTGTTACAAGATACCGGCATTTCCTACGTCAAATGGGACAACAACCGGGGGATACACGAGACGCCCTCTCCGTCGACTGACCATCAGTACATGCTTGGCCTCTACCGGGTGTTCGACACACTGACCACCCGTTTTCCGGATGTCCTGTGGGAAGGATGTGCCTCGGGCGGCGGCCGCTTTGATGCTGGCATGCTGCAGTATGTCCCCCAGATCTGGACTTCCGACAACACCGACGCCATCGACCGAATCACCATCCAATTTGGGACCTCGCTTGCCTACCCGCCATCAGCAATGGGAGCCCACCTCTCCGCGGTCCCTAATGCACAGACCGGTCGCACTGTGCCCTTTACTTTCCGCGCACACGTTGCTATGATGGGTGGTTCTTTCGGCTTGGAGCTGGATCCGGCGACGGTGGAAGGGGACGAAATAGTTCCCGAGCTCCTTGCGCTGGCGGAAAAGGTGAACCCTATCATTTTGAACGGAGATCTGTATCGGCTACGCCTACCTCAAGACTCCCAGTGGCCTGCCGCACTCTTTGTGTCTCAGGATGGCGCACAGGCTGTTCTGTTCTACTTCCAGGTCCAGCCGAATGTCAACCATGCCGTGCCGTGGGTCAGGCTGCAGGGGTTGGACCCTAAGGCGGACTATACCGTCGATGGGGATCAGACGTATTCTGGAGCAACACTAATGAATCTGGGGTTGCAGTATAGTTTTGACACCGAGTATGGAAGCAAGGTAGTTTTCCTGGAGAGGCAATGA
(a)序列特征：
●长度：2178bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：AGA
SEQIDNO:2：
APAIGASNSQTIVTNGTSFALNGDNVSYRFHVNSTTGDLISDHFGGVVSGTIPSPVEPAVNGWVGMPGRIRREFPDQGRGDFRIPAVRIRESAGYTVSDLQYVSHEVIEGKNALPGLPATFGDAQDVTTLVVHLYDNYSSVAADLSYSIFPKYDAIVRSVNVTNQGPGNITIEALASISIDFPYEDLDVVSLRGDWAREANVQRSKVQYGVQGFGSSTGYSSHLHNPFLAIVDPATTESQGEAWGFNLVYTGSFSAQVEKGSQGFTRALLGFNPDQLSWNLGPGETLTSPECVAVYSDKGLGSVSRKFHRLYRNHLMKSKFATSDRPVLLNSWEGVYFDYNQSSIETLAEESAALGVHLFVMDDGWFGDKYPRVSDNAGLGDWMPNPARFPDGLTPVVQDITNLTVNGTESTKLRFGIWVEPEMVNPNSTLYHEHPEWVLHAGPYPRTERRNQLVLNLALPAVQDFIIDFMTNLLQDTGISYVKWDNNRGIHETPSPSTDHQYMLGLYRVFDTLTTRFPDVLWEGCASGGGRFDAGMLQYVPQIWTSDNTDAIDRITIQFGTSLAYPPSAMGAHLSAVPNAQTGRTVPFTFRAHVAMMGGSFGLELDPATVEGDEIVPELLALAEKVNPIILNGDMYRLRLPQDSQWPAALFVSQDGAQAVLFYFQVQPNVNHAVPWVRLQGLDPKADYTVDGDQTYSGATLMNLGLQYSFDTEYGSKVVFLERQ
(a)序列特征：
●长度：725AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：proteinAGA
SEQIDNO:3：
GCACCCGCAATTGGGGCTTCTAATTCACAGACGATCGTTACGAATGGCACTAGTTTCGCATTGAACGGCGACAATGTCTCATATCGATTCCATGTCAACAGTACCACCGGCGACTTGATTTCTGATCATTTTGGTGGTGTCGTCTCCGGCACAATCCCTTCGCCAGTGGAACCTGCTGTCAACGGCTGGGTCGGCATGCCTGGTCGAATCCGCCGGGAGTTCCCCGACCAAGGCCGTGGGGATTTCCGCATCCCCGCCGTTCGTATTCGGGAATCGGCAGGTTATACTGTTAGCGATCTCCAATATGTGTCGCACGAGGTGATCGAAGGTAAAAATGCTTTGCCTGGCCTGCCTGCCACATTTGGCGATGCGCAGGATGTCACAACTTTGGTAGTCCATCTGTATGACAACTATAGCTCCGTCGCGGCCGACTTGTCATACTCCATATTTCCGAAGTATGATGCGATCGTGAGGAGTGTCAATGTGACCAACCAGGGCCCGGGTAATATCACTATCGAGGCCCTTGCAAGCATTAGCATCGATTTCCCCTACGAAGACCTCGACGTGGTCAGCCTCCGAGGCGACTGGGCCAGAGAGGCAAATGTTCAGAGAAGCAAAGTGCAGTATGGCGTCCAGGGATTTGGAAGCAGTACTGGATATTCCTCTCACCTTCACAATCCCTTCCTTGCCATAGTAGATCCAGCTACTACCGAGTCGCAAGGCGAGGCATGGGGTTTCAACCTTGTATATACCGGCTCTTTCTCAGCCCAAGTAGAGAAAGGATCGCAAGGTTTCACCCGGGCGCTGCTCGGCTTCAACCCGGACCAATTATCGTGGAACCTTGGCCCTGGCGAGACTTTAACCTCCCCTGAGTGTGTTGCAGTCTACTCGGACAAAGGCCTTGGCTCAGTGTCTCGCAAATTCCACCGGCTATATCGTAACCACCTCATGAAGAGCAAGTTCGCCACGTCCGACCGGCCGGTTCTGCTTAATAGCTGGGAAGGAGTTTATTTCGACTACAATCAAAGCAGCATCGAAACTCTTGCCGAAGAGTCCGCTGCCCTGGGTGTCCACCTCTTTGTCATGGACGACGGCTGGTTTGGGGACAAGTACCCCCGAGTGTCCGATAACGCCGGACTGGGCGACTGGATGCCCAATCCAGCGCGCTTCCCGGACGGGTTGACCCCGGTCGTGCAAGACATCACAAATCTCACCGTCAATGGCACAGAGTCCACAAAACTTCGCTTTGGTATTTGGGTGGAGCCCGAGATGGTCAACCCCAATTCCACTCTCTACCACGAACACCCGGAGTGGGTGCTTCATGCCGGGCCTTACCCCCGTACCGAGCGTCGGAACCAGCTCGTCCTCAACCTGGCGCTTCCGGCTGTGCAGGACTTCATCATAGACTTCATGACGAACCTGTTACAAGATACCGGCATTTCCTACGTCAAATGGGACAACAACCGGGGGATACACGAGACGCCCTCTCCGTCCACTGACCATCAGTACATGCTTGGCCTCTACCGGGTGTTCGACACACTGACCACCCGTTTTCCGGATGTCCTGTGGGAAGGATGTGCCTCGGGCGGTGGTAGATTTGATGCTGGCATGCTGCAGTATGTCCCCCAGATCTGGACTTCCGACAACACCGACGCCATCGACCGAATCACCATCCAATTTGGGACCTCGCTTGCCTACCCGCCATCAGCAATGGGAGCCCACCTCTCCGCGGTTCCTAATGCACAGACCGGTCGCACTGTGCCCTTTACTTTCCGCGCACACGTTGCTATGATGGGTGGTTCTTTCGGCTTGGAGTTGGACCCAGCGACGGTGGAAGGGGACGAAATAGTTCCCGAGTTGCTTGCGCTGGCGGAAAAAGTGAACCCTATCATTTTGAACGGAGATATGTATCGGCTACGCCTACCTCAAGACTCCCAGTGGCCTGCCGCACTCTTTGTGTCCCAGGATGGCGCACAGGCTGTTCTGTTCTACTTCCAGGTCCAGCCGAATGTCAACCATGCCGTGCCGTGGGTCAGGCTGCAGGGGTTGGACCCTAAGGCGGACTATACCGTTGATGGAGATCAGACGTATTCCGGGGCAACACTGATGAATCTGGGGTTGCAGTATAGTTTTGACACCGAGTATGGTAGCAAGGTAGTTTTCCTGGAGAGGCAATGA
(a)序列特征：
●长度：2178bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：reAGA
SEQIDNO:4：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCGCACCCGCAATTGGGGCTTCTAATTCACAGACGATCGTTACGAATGGCACTAGTTTCGCATTGAACGGCGACAATGTCTCATATCGATTCCATGTCAACAGTACCACCGGCGACTTGATTTCTGATCATTTTGGTGGTGTCGTCTCCGGCACAATCCCTTCGCCAGTGGAACCTGCTGTCAACGGCTGGGTCGGCATGCCTGGTCGAATCCGCCGGGAGTTCCCCGACCAAGGCCGTGGGGATTTCCGCATCCCCGCCGTTCGTATTCGGGAATCGGCAGGTTATACTGTTAGCGATCTCCAATATGTGTCGCACGAGGTGATCGAAGGTAAAAATGCTTTGCCTGGCCTGCCTGCCACATTTGGCGATGCGCAGGATGTCACAACTTTGGTAGTCCATCTGTATGACAACTATAGCTCCGTCGCGGCCGACTTGTCATACTCCATATTTCCGAAGTATGATGCGATCGTGAGGAGTGTCAATGTGACCAACCAGGGCCCGGGTAATATCACTATCGAGGCCCTTGCAAGCATTAGCATCGATTTCCCCTACGAAGACCTCGACGTGGTCAGCCTCCGAGGCGACTGGGCCAGAGAGGCAAATGTTCAGAGAAGCAAAGTGCAGTATGGCGTCCAGGGATTTGGAAGCAGTACTGGATATTCCTCTCACCTTCACAATCCCTTCCTTGCCATAGTAGATCCAGCTACTACCGAGTCGCAAGGCGAGGCATGGGGTTTCAACCTTGTATATACCGGCTCTTTCTCAGCCCAAGTAGAGAAAGGATCGCAAGGTTTCACCCGGGCGCTGCTCGGCTTCAACCCGGACCAATTATCGTGGAACCTTGGCCCTGGCGAGACTTTAACCTCCCCTGAGTGTGTTGCAGTCTACTCGGACAAAGGCCTTGGCTCAGTGTCTCGCAAATTCCACCGGCTATATCGTAACCACCTCATGAAGAGCAAGTTCGCCACGTCCGACCGGCCGGTTCTGCTTAATAGCTGGGAAGGAGTTTATTTCGACTACAATCAAAGCAGCATCGAAACTCTTGCCGAAGAGTCCGCTGCCCTGGGTGTCCACCTCTTTGTCATGGACGACGGCTGGTTTGGGGACAAGTACCCCCGAGTGTCCGATAACGCCGGACTGGGCGACTGGATGCCCAATCCAGCGCGCTTCCCGGACGGGTTGACCCCGGTCGTGCAAGACATCACAAATCTCACCGTCAATGGCACAGAGTCCACAAAACTTCGCTTTGGTATTTGGGTGGAGCCCGAGATGGTCAACCCCAATTCCACTCTCTACCACGAACACCCGGAGTGGGTGCTTCATGCCGGGCCTTACCCCCGTACCGAGCGTCGGAACCAGCTCGTCCTCAACCTGGCGCTTCCGGCTGTGCAGGACTTCATCATAGACTTCATGACGAACCTGTTACAAGATACCGGCATTTCCTACGTCAAATGGGACAACAACCGGGGGATACACGAGACGCCCTCTCCGTCCACTGACCATCAGTACATGCTTGGCCTCTACCGGGTGTTCGACACACTGACCACCCGTTTTCCGGATGTCCTGTGGGAAGGATGTGCCTCGGGCGGTGGTAGATTTGATGCTGGCATGCTGCAGTATGTCCCCCAGATCTGGACTTCCGACAACACCGACGCCATCGACCGAATCACCATCCAATTTGGGACCTCGCTTGCCTACCCGCCATCAGCAATGGGAGCCCACCTCTCCGCGGTTCCTAATGCACAGACCGGTCGCACTGTGCCCTTTACTTTCCGCGCACACGTTGCTATGATGGGTGGTTCTTTCGGCTTGGAGTTGGACCCAGCGACGGTGGAAGGGGACGAAATAGTTCCCGAGTTGCTTGCGCTGGCGGAAAAAGTGAACCCTATCATTTTGAACGGAGATATGTATCGGCTACGCCTACCTCAAGACTCCCAGTGGCCTGCCGCACTCTTTGTGTCCCAGGATGGCGCACAGGCTGTTCTGTTCTACTTCCAGGTCCAGCCGAATGTCAACCATGCCGTGCCGTGGGTCAGGCTGCAGGGGTTGGACCCTAAGGCGGACTATACCGTTGATGGAGATCAGACGTATTCCGGGGCAACACTGATGAATCTGGGGTTGCAGTATAGTTTTGACACCGAGTATGGTAGCAAGGTAGTTTTCCTGGAGAGGCAATGA
(a)序列特征：
●长度：2451bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：rreAGA
SEQIDNO:5：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEFAPAIGASNSQTIVTNGTSFALNGDNVSYRFHVNSTTGDLISDHFGGVVSGTIPSPVEPAVNGWVGMPGRIRREFPDQGRGDFRIPAVRIRESAGYTVSDLQYVSHEVIEGKNALPGLPATFGDAQDVTTLVVHLYDNYSSVAADLSYSIFPKYDAIVRSVNVTNQGPGNITIEALASISIDFPYEDLDVVSLRGDWAREANVQRSKVQYGVQGFGSSTGYSSHLHNPFLAIVDPATTESQGEAWGFNLVYTGSFSAQVEKGSQGFTRALLGFNPDQLSWNLGPGETLTSPECVAVYSDKGLGSVSRKFHRLYRNHLMKSKFATSDRPVLLNSWEGVYFDYNQSSIETLAEESAALGVHLFVMDDGWFGDKYPRVSDNAGLGDWMPNPARFPDGLTPVVQDITNLTVNGTESTKLRFGIWVEPEMVNPNSTLYHEHPEWVLHAGPYPRTERRNQLVLNLALPAVQDFIIDFMTNLLQDTGISYVKWDNNRGIHETPSPSTDHQYMLGLYRVFDTLTTRFPDVLWEGCASGGGRFDAGMLQYVPQIWTSDNTDAIDRITIQFGTSLAYPPSAMGAHLSAVPNAQTGRTVPFTFRAHVAMMGGSFGLELDPATVEGDEIVPELLALAEKVNPIILNGDMYRLRLPQDSQWPAALFVSQDGAQAVLFYFQVQPNVNHAVPWVRLQGLDPKADYTVDGDQTYSGATLMNLGLQYSFDTEYGSKVVFLERQ
(a)序列特征：
●长度：816AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：proteinrreAGA
SEQIDNO:6：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAATTGCTGAAGCTGAATTCGCACCCGCAATTGGGGCTTCTAATTCACAGACGATCGTTACGAATGGCACTAGTTTCGCATTGAACGGCGACAATGTCTCATATCGATTCCATGTCAACAGTACCACCGGCGACTTGATTTCTGATCATTTTGGTGGTGTCGTCTCCGGCACAATCCCTTCGCCAGTGGAACCTGCTGTCAACGGCTGGGTCGGCATGCCTGGTCGAATCCGCCGGGAGTTCCCCGACCAAGGCCGTGGGGATTTCCGCATCCCCGCCGTTCGTATTCGGGAATCGGCAGGTTATACTGTTAGCGATCTCCAATATGTGTCGCACGAGGTGATCGAAGGTAAAAATGCTTTGCCTGGCCTGCCTGCCACATTTGGCGATGCGCAGGATGTCACAACTTTGGTAGTCCATCTGTATGACAACTATAGCTCCGTCGCGGCCGACTTGTCATACTCCATATTTCCGAAGTATGATGCGATCGTGAGGAGTGTCAATGTGACCAACCAGGGCCCGGGTAATATCACTATCGAGGCCCTTGCAAGCATTAGCATCGATTTCCCCTACGAAGACCTCGACGTGGTCAGCCTCCGAGGCGACTGGGCCAGAGAGGCAAATGTTCAGAGAAGCAAAGTGCAGTATGGCGTCCAGGGATTTGGAAGCAGTACTGGATATTCCTCTCACCTTCACAATCCCTTCCTTGCCATAGTAGATCCAGCTACTACCGAGTCGCAAGGCGAGGCATGGGGTTTCAACCTTGTATATACCGGCTCTTTCTCAGCCCAAGTAGAGAAAGGATCGCAAGGTTTCACCCGGGCGCTGCTCGGCTTCAACCCGGACCAATTATCGTGGAACCTTGGCCCTGGCGAGACTTTAACCTCCCCTGAGTGTGTTGCAGTCTACTCGGACAAAGGCCTTGGCTCAGTGTCTCGCAAATTCCACCGGCTATATCGTAACCACCTCATGAAGAGCAAGTTCGCCACGTCCGACCGGCCGGTTCTGCTTAATAGCTGGGAAGGAGTTTATTTCGACTACAATCAAAGCAGCATCGAAACTCTTGCCGAAGAGTCCGCTGCCCTGGGTGTCCACCTCTTTGTCATGGACGACGGCTGGTTTGGGGACAAGTACCCCCGAGTGTCCGATAACGCCGGACTGGGCGACTGGATGCCCAATCCAGCGCGCTTCCCGGACGGGTTGACCCCGGTCGTGCAAGACATCACAAATCTCACCGTCAATGGCACAGAGTCCACAAAACTTCGCTTTGGTATTTGGGTGGAGCCCGAGATGGTCAACCCCAATTCCACTCTCTACCACGAACACCCGGAGTGGGTGCTTCATGCCGGGCCTTACCCCCGTACCGAGCGTCGGAACCAGCTCGTCCTCAACCTGGCGCTTCCGGCTGTGCAGGACTTCATCATAGACTTCATGACGAACCTGTTACAAGATACCGGCATTTCCTACGTCAAATGGGACAACAACCGGGGGATACACGAGACGCCCTCTCCGTCCACTGACCATCAGTACATGCTTGGCCTCTACCGGGTGTTCGACACACTGACCACCCGTTTTCCGGATGTCCTGTGGGAAGGATGTGCCTCGGGCGGTGGTAGATTTGATGCTGGCATGCTGCAGTATGTCCCCCAGATCTGGACTTCCGACAACACCGACGCCATCGACCGAATCACCATCCAATTTGGGACCTCGCTTGCCTACCCGCCATCAGCAATGGGAGCCCACCTCTCCGCGGTTCCTAATGCACAGACCGGTCGCACTGTGCCCTTTACTTTCCGCGCACACGTTGCTATGATGGGTGGTTCTTTCGGCTTGGAGTTGGACCCAGCGACGGTGGAAGGGGACGAAATAGTTCCCGAGTTGCTTGCGCTGGCGGAAAAAGTGAACCCTATCATTTTGAACGGAGATATGTATCGGCTACGCCTACCTCAAGACTCCCAGTGGCCTGCCGCACTCTTTGTGTCCCAGGATGGCGCACAGGCTGTTCTGTTCTACTTCCAGGTCCAGCCGAATGTCAACCATGCCGTGCCGTGGGTCAGGCTGCAGGGGTTGGACCCTAAGGCGGACTATACCGTTGATGGAGATCAGACGTATTCCGGGGCAACACTGATGAATCTGGGGTTGCAGTATAGTTTTGACACCGAGTATGGTAGCAAGGTAGTTTTCCTGGAGAGGCAATGA
(a)序列特征：
●长度：2451bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：AGA-I
SEQIDNO:7：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRIAEAEFAPAIGASNSQTIVTNGTSFALNGDNVSYRFHVNSTTGDLISDHFGGVVSGTIPSPVEPAVNGWVGMPGRIRREFPDQGRGDFRIPAVRIRESAGYTVSDLQYVSHEVIEGKNALPGLPATFGDAQDVTTLVVHLYDNYSSVAADLSYSIFPKYDAIVRSVNVTNQGPGNITIEALASISIDFPYEDLDVVSLRGDWAREANVQRSKVQYGVQGFGSSTGYSSHLHNPFLAIVDPATTESQGEAWGFNLVYTGSFSAQVEKGSQGFTRALLGFNPDQLSWNLGPGETLTSPECVAVYSDKGLGSVSRKFHRLYRNHLMKSKFATSDRPVLLNSWEGVYFDYNQSSIETLAEESAALGVHLFVMDDGWFGDKYPRVSDNAGLGDWMPNPARFPDGLTPVVQDITNLTVNGTESTKLRFGIWVEPEMVNPNSTLYHEHPEWVLHAGPYPRTERRNQLVLNLALPAVQDFIIDFMTNLLQDTGISYVKWDNNRGIHETPSPSTDHQYMLGLYRVFDTLTTRFPDVLWEGCASGGGRFDAGMLQYVPQIWTSDNTDAIDRITIQFGTSLAYPPSAMGAHLSAVPNAQTGRTVPFTFRAHVAMMGGSFGLELDPATVEGDEIVPELLALAEKVNPIILNGDMYRLRLPQDSQWPAALFVSQDGAQAVLFYFQVQPNVNHAVPWVRLQGLDPKADYTVDGDQTYSGATLMNLGLQYSFDTEYGSKVVFLERQ
(a)序列特征：
●长度：816AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：proteinAGA-I
SEQIDNO:8：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACCAGCTGAAGCTGAATTCGCACCCGCAATTGGGGCTTCTAATTCACAGACGATCGTTACGAATGGCACTAGTTTCGCATTGAACGGCGACAATGTCTCATATCGATTCCATGTCAACAGTACCACCGGCGACTTGATTTCTGATCATTTTGGTGGTGTCGTCTCCGGCACAATCCCTTCGCCAGTGGAACCTGCTGTCAACGGCTGGGTCGGCATGCCTGGTCGAATCCGCCGGGAGTTCCCCGACCAAGGCCGTGGGGATTTCCGCATCCCCGCCGTTCGTATTCGGGAATCGGCAGGTTATACTGTTAGCGATCTCCAATATGTGTCGCACGAGGTGATCGAAGGTAAAAATGCTTTGCCTGGCCTGCCTGCCACATTTGGCGATGCGCAGGATGTCACAACTTTGGTAGTCCATCTGTATGACAACTATAGCTCCGTCGCGGCCGACTTGTCATACTCCATATTTCCGAAGTATGATGCGATCGTGAGGAGTGTCAATGTGACCAACCAGGGCCCGGGTAATATCACTATCGAGGCCCTTGCAAGCATTAGCATCGATTTCCCCTACGAAGACCTCGACGTGGTCAGCCTCCGAGGCGACTGGGCCAGAGAGGCAAATGTTCAGAGAAGCAAAGTGCAGTATGGCGTCCAGGGATTTGGAAGCAGTACTGGATATTCCTCTCACCTTCACAATCCCTTCCTTGCCATAGTAGATCCAGCTACTACCGAGTCGCAAGGCGAGGCATGGGGTTTCAACCTTGTATATACCGGCTCTTTCTCAGCCCAAGTAGAGAAAGGATCGCAAGGTTTCACCCGGGCGCTGCTCGGCTTCAACCCGGACCAATTATCGTGGAACCTTGGCCCTGGCGAGACTTTAACCTCCCCTGAGTGTGTTGCAGTCTACTCGGACAAAGGCCTTGGCTCAGTGTCTCGCAAATTCCACCGGCTATATCGTAACCACCTCATGAAGAGCAAGTTCGCCACGTCCGACCGGCCGGTTCTGCTTAATAGCTGGGAAGGAGTTTATTTCGACTACAATCAAAGCAGCATCGAAACTCTTGCCGAAGAGTCCGCTGCCCTGGGTGTCCACCTCTTTGTCATGGACGACGGCTGGTTTGGGGACAAGTACCCCCGAGTGTCCGATAACGCCGGACTGGGCGACTGGATGCCCAATCCAGCGCGCTTCCCGGACGGGTTGACCCCGGTCGTGCAAGACATCACAAATCTCACCGTCAATGGCACAGAGTCCACAAAACTTCGCTTTGGTATTTGGGTGGAGCCCGAGATGGTCAACCCCAATTCCACTCTCTACCACGAACACCCGGAGTGGGTGCTTCATGCCGGGCCTTACCCCCGTACCGAGCGTCGGAACCAGCTCGTCCTCAACCTGGCGCTTCCGGCTGTGCAGGACTTCATCATAGACTTCATGACGAACCTGTTACAAGATACCGGCATTTCCTACGTCAAATGGGACAACAACCGGGGGATACACGAGACGCCCTCTCCGTCCACTGACCATCAGTACATGCTTGGCCTCTACCGGGTGTTCGACACACTGACCACCCGTTTTCCGGATGTCCTGTGGGAAGGATGTGCCTCGGGCGGTGGTAGATTTGATGCTGGCATGCTGCAGTATGTCCCCCAGATCTGGACTTCCGACAACACCGACGCCATCGACCGAATCACCATCCAATTTGGGACCTCGCTTGCCTACCCGCCATCAGCAATGGGAGCCCACCTCTCCGCGGTTCCTAATGCACAGACCGGTCGCACTGTGCCCTTTACTTTCCGCGCACACGTTGCTATGATGGGTGGTTCTTTCGGCTTGGAGTTGGACCCAGCGACGGTGGAAGGGGACGAAATAGTTCCCGAGTTGCTTGCGCTGGCGGAAAAAGTGAACCCTATCATTTTGAACGGAGATATGTATCGGCTACGCCTACCTCAAGACTCCCAGTGGCCTGCCGCACTCTTTGTGTCCCAGGATGGCGCACAGGCTGTTCTGTTCTACTTCCAGGTCCAGCCGAATGTCAACCATGCCGTGCCGTGGGTCAGGCTGCAGGGGTTGGACCCTAAGGCGGACTATACCGTTGATGGAGATCAGACGTATTCCGGGGCAACACTGATGAATCTGGGGTTGCAGTATAGTTTTGACACCGAGTATGGTAGCAAGGTAGTTTTCCTGGAGAGGCAATGA
(a)序列特征：
●长度：2451bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：AGA-P
SEQIDNO:9：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRPAEAEFAPAIGASNSQTIVTNGTSFALNGDNVSYRFHVNSTTGDLISDHFGGVVSGTIPSPVEPAVNGWVGMPGRIRREFPDQGRGDFRIPAVRIRESAGYTVSDLQYVSHEVIEGKNALPGLPATFGDAQDVTTLVVHLYDNYSSVAADLSYSIFPKYDAIVRSVNVTNQGPGNITIEALASISIDFPYEDLDVVSLRGDWAREANVQRSKVQYGVQGFGSSTGYSSHLHNPFLAIVDPATTESQGEAWGFNLVYTGSFSAQVEKGSQGFTRALLGFNPDQLSWNLGPGETLTSPECVAVYSDKGLGSVSRKFHRLYRNHLMKSKFATSDRPVLLNSWEGVYFDYNQSSIETLAEESAALGVHLFVMDDGWFGDKYPRVSDNAGLGDWMPNPARFPDGLTPVVQDITNLTVNGTESTKLRFGIWVEPEMVNPNSTLYHEHPEWVLHAGPYPRTERRNQLVLNLALPAVQDFIIDFMTNLLQDTGISYVKWDNNRGIHETPSPSTDHQYMLGLYRVFDTLTTRFPDVLWEGCASGGGRFDAGMLQYVPQIWTSDNTDAIDRITIQFGTSLAYPPSAMGAHLSAVPNAQTGRTVPFTFRAHVAMMGGSFGLELDPATVEGDEIVPELLALAEKVNPIILNGDMYRLRLPQDSQWPAALFVSQDGAQAVLFYFQVQPNVNHAVPWVRLQGLDPKADYTVDGDQTYSGATLMNLGLQYSFDTEYGSKVVFLERQ
(a)序列特征：
●长度：816AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：黑曲霉Aspergillusniger
(f)特异性名称：proteinAGA-P

Claims (8)

1.一种α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母密码子优化序列，其特征在于：毕赤酵母密码子优化序列reAGA为SEQIDNO:1所示。
2.一种高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌，其特征在于：工程菌为携带SEQIDNO:1所示毕赤酵母密码子优化序列reAGA及Kex2蛋白酶切位点突变的毕赤酵母突变体。
3.按权利要求2所述的高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述携带Kex2蛋白酶切位点突变的突变体为Kex2蛋白酶切P1’位点的E86突变为I的有效突变体E86I。
4.按权利要求2所述的高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述携带Kex2蛋白酶切位点突变的突变体为Kex2蛋白酶切P1’位点的E86突变为P的有效突变体E86P。
5.一种权利要求2所述的高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：
1)将经优化的黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA基因序列密码子reAGA克隆至载体，得重组质粒pPICZαA-reAGA；
2)以上述获得重组质粒pPICZαA-reAGA为模板，Kex2P1’位点定点突变的引物对，进行全质粒PCR，获得重组质粒pPICZαAX-reAGA；
3)将上述获得重组质粒pPICZαAX-reAGA转化毕赤酵母细胞，即获得毕赤酵母工程菌。
6.按权利要求5所述的高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述Kex2P1’位点定点突变的引物对为：
F1(E86A)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGCTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F2(E86C)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCACATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F3(E86D)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCATCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F4(E86F)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCAAATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F5(E86G)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGGTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCACCTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F6(E86H)：GGTATCTCTCGAGAAAAGACATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCATGTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F7(E86I)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAATTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCAATTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F8(E86K)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCTTTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F9(E86L)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGACTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCAAGTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F10(E86M)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAATGGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCCATTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F11(E86N)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAAACGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCGTTTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F12(E86P)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGACCAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCTGGTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F13(E86Q)：GGTATCTCTCGAGAAAAGACAAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCTTGTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F14(E86R)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAAGAGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCTCTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F15(E86S)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGATCTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGATCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F16(E86T)：GGGTATCTCTCGAGAAAAGAACTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCAGTTCTTTTCTCGAGAGATACCC；
F17(E86V)：GGTATCTCTCGAGAAAAGAGTTGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCAACTCTTTTCTCGAGAGATACC；
F18(E86W)：GGTATCTCTCGAGAAAAGATGGGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCCCATCTTTTCTCGAGAGATACC；
F19(E86Y)：GGTATCTCTCGAGAAAAGATATGCTGAAGCTGAATTCGCAC，
GTGCGAATTCAGCTTCAGCATATCTTTTCTCGAGAGATACC。
7.一种权利要求1所述的α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母密码子优化序列的应用，其特征在于：所述优化序列在高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA中的应用。
8.一种权利要求2所述的高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的毕赤酵母工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA中的应用。
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