TWI726287B - 促進木質纖維素水解之重組核酸分子、表現載體以及方法 - Google Patents

Abstract

本揭露係提供一種可促進木質纖維素水解之重組核酸分子，以及包含 該重組核酸分子之表現載體。本揭露亦提供一種利用上述重組核酸分子及/或表現載體以促進木質纖維素水解之方法。

Description

促進木質纖維素水解之重組核酸分子、表現載體以及方法

本揭露係關於一種重組核酸分子，尤其是關於一種能促進木質纖維素水解之重組核酸分子。

木質纖維素之主要組成為纖維素、半纖維素和木質素，為植物細胞壁之主要結構成分，也係地球上含量最多的有機化合物之一，其中纖維素之分子式為(C₆H₁₀O₅)_n，且係由數百個至數千個β(1→4)葡萄糖苷鍵連接D-葡萄糖單元而組成的長鏈聚合物，其鏈長大約有7,000個至15,000個葡萄糖單元體。木質纖維素具有排列穩定且緊密之結晶狀區域及較強的抗化學性，且不容易溶於水。除了少數微生物之外，許多生物並無法直接以木質纖維素做為能量的來源，因而成為環境廢棄物。目前已知木質纖維素至少需要內切型木質纖維素分解酶(endoglucanase)、外切型纖維素分解酶(exoglucanase或cellobiohydrolase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)及半纖維分解酵素(hemicellulase)等四種酵素之作用，方能將木質纖維素有效地水解成最終產物。β-葡萄糖苷酶係將木質纖維素有效地轉化為生物燃料所需之主要水解酶(Park et al.,2016)。此外，在釀造及食品工業上，β-1,4-葡萄糖苷酶亦可用於改善葡萄酒中的香氣及從果汁中 的無味糖苷中釋放芳香族化合物(Gueguen et al.,1996)。在食品工業上，β-1,4-葡萄糖苷酶可用於水解異黃酮糖苷，以增加其在人體小腸中的吸收(Kim et al.,2012)；此外，β-1,4-葡萄糖苷酶亦可用於木薯之解毒(Ahmed et al.,2017)。在資源回收產業上，β-1,4-葡萄糖苷酶可用於廢紙在回收過程中的脫墨(Ahmed et al.,2017)。在健康及製藥產業上，β-1,4-葡萄糖苷酶可用於寡糖和烷基糖苷的生物合成，該等化合物可應用於作為益生菌生長之促進劑(Díez-Municio et al.,2014)、抗微生物劑(Otto et al.,1998)、治療劑以及診斷工具(Perugino et al.,2004)。

目前產業上主要係以微生物發酵技術商業化生產β-1,4-葡萄糖苷酶，該發酵技術包括固態發酵及液態發酵，利用此二種發酵技術生產β-1,4-葡萄糖苷酶皆需要將發酵條件進行優化，其中優化參數包括微生物之接種量、培養基之碳源種類及其濃度、氮源種類及其濃度、鹽類種類及其濃度、pH值、溫度、氧氣濃度以及發酵時間等，該等優化的參數通常需要經驗豐富的技術人員耗費許多時間及勞力不斷地嘗試才能獲得，造成微生物發酵的技術門檻高，且需耗費許多人力(Ahmed et al.,2017)。此外，發酵的設備及培養基昂貴，且需要在無菌的環境下進行發酵，導致微生物發酵的成本高。再者，利用微生物發酵生產β-1,4-葡萄糖苷酶的產量都很低，通常僅有約10至90毫克/公升(Garvey et al.,2013及Ma et al.,2011)。

此外，目前生物燃料產業為提高木質纖維素之水解效率並降低生產成本，一般在處理程序上，會先將原料進行高溫或強酸之前處理，然後再加入內切型木質纖維素分解酶、外切型纖維素分解酶、β-葡萄糖苷酶及半纖維分解酵素等四種酵素，以水解木質纖維素。然而，前述高溫或強酸之前處理會使酵素降解，導致所加入之酵素無法有效地分解木質纖維素。

因此，如何發展出低成本、高產量且能生產出耐高溫及耐強酸之β-1,4-葡萄糖苷酶的表現系統係本領域亟待解決之問題。

本揭露提供一種重組核酸分子，係包含編碼信號分子之核苷酸序列以及編碼β-1,4-葡萄糖苷酶之核苷酸序列，其中，信號分子包含信號肽(signal peptide)或轉運肽(transit peptide)，以及β-1,4-葡萄糖苷酶係來自嗜熱古細菌Sulfolobus solfataricus，且具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。

在一具體實施例中，信號分子為信號肽，且信號肽具有如SEQ ID NO：7所示之核苷酸序列。在另一具體實施例中，重組核酸分子進一步包含編碼分選信號(sorting signal)或滯留信號(retention signal)之核苷酸序列，其中，分選信號具有如SEQ ID NO：8所示之核苷酸序列，以及滯留信號具有如SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列。在另一具體實施例中，信號分子為轉運肽，且轉運肽具有如SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列。

本揭露亦提供一種表現載體，其包含前述之重組核酸分子、移轉DNA之左邊界序列，以及移轉DNA之右邊界序列，其中，重組核酸分子係位於移轉DNA之左邊界序列以及移轉DNA之右邊界序列之間。

在一具體實施例中，表現載體進一步包含控制重組核酸分子表現之啟動子序列。在一具體實施例中，啟動子序列係設置於重組核酸分子之5’端，且在移轉DNA之左邊界序列和移轉DNA之右邊界序列之間。在另一具體實施例中，啟動子包括，但不限於rbcS基因啟動子、CaMV 35S啟動子、肌動蛋白(actin)啟動子或泛蛋白(ubiquitin)啟動子。

在另一具體實施例中，在移轉DNA之左邊界序列以及移轉DNA之右邊界序列之間進一步包含選自由表位標籤(epitope tag)序列、報導基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、加強子序列、終止子序列、調節子序列以及其組合所組成群組之序列片段。

在一具體實施例中，該表位標籤包含c-Myc標籤(tag)、6-組胺酸(His6)標籤、血凝素(hemagglutinin)標籤、穀胱甘肽-硫-轉移酶(glutathione-S-transferase)標籤或具有DYKDDDDK胺基酸序列之FLAG標籤。

本揭露另提供一種生產木質纖維素水解酵素之方法，包含：將前述之表現載體轉形送入農桿菌中，以得到經轉形之農桿菌；將農桿菌感染植物細胞，以得到轉殖植株；以及自轉殖植株之葉片萃取蛋白質萃取液，以得到包含木質纖維素水解酵素的蛋白質粗萃液。

在一具體實施例中，木質纖維素水解酵素係β-1,4-葡萄糖苷酶。在一具體實施例中，植物細胞係菸草、水稻、阿拉伯芥、玉米、甘蔗或小麥之植物細胞。

在一具體實施例中，β-1,4-葡萄糖苷酶係累積於轉殖植株葉片之液泡、內質網及葉綠體之至少其中之一內。

藉由本揭露之表現載體，使來自嗜熱古細菌Sulfolobus solfataricus之β-1,4-葡萄糖苷酶表現並累積於植物之葉綠體、內質網或液泡內，可避免轉殖植物之細胞質內累積過量的外源性蛋白而影響轉殖植物的生長，同時，使所生成之β-1,4-葡萄糖苷酶含量佔轉殖植物之葉片內的總可溶性蛋白質約0.3%至1%。此外，藉由本揭露之生產木質纖維素水解酵素之方法所得到之蛋白質粗萃液內的β-1,4-葡萄糖苷酶，在80℃至90℃之間具有極佳的酵素活性，且相較於 微生物所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶，其在酸性的環境下，例如在pH值1至5之間、在pH值2至4之間或在pH值2至3之間，顯著具有較佳的酵素活性。因此，本揭露之重組核酸分子、包含該重組核酸分子之表現載體，以及生產木質纖維素水解酵素之方法，提供了低成本、高產量且具耐高溫及耐強酸特性之β-1,4-葡萄糖苷酶。

第1A至1C圖係分別用於農桿菌轉殖之植物表現雙偶載體pBin-Va、pBin-Er及pBin-Cp，其中，LB(left border)表示移轉DNA(transfer DNA，T-DNA)之左邊界；RB(right border)表示T-DNA之右邊界；P_nos表示nos基因之啟動子；NptII表示康黴素之抗性基因；T_nos表示nos基因之終止子；P_rbcS表示rbcS基因之啟動子；c-Myc表示c-Myc表位標籤(epitope tag)；S_p表示蛋白質經由分泌途徑(secretory pathway)進入內質網內腔之信號肽(signal peptide)；T_p表示葉綠體蛋白質之轉運肽(transit peptide)；sso3019表示來自Sulfolobus solfataricus之β-1,4-葡萄糖苷酶基因；AFVY表示液泡蛋白質之分選信號(sorting signal)；KDEL表示內質網蛋白質之滯留信號(retention signal)；以及，T_rbcS表示rbcS基因之終止子。

第2A圖係檢測pBin-Cp品系之轉殖菸草內的β-1,4-葡萄糖苷酶基因之瓊膠電泳圖，其中數字6至54係代表不同pBin-Cp品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖植株；第2B圖係檢測pBin-Er品系之轉殖菸草內的β-1,4-葡萄糖苷酶基因之瓊膠電泳圖，其中數字6至37係代表不同pBin-Er品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖植株；以及第2C圖係檢測pBin-Va品系之轉殖菸草內的β-1,4-葡萄糖苷酶基因之瓊 膠電泳圖，其中數字1至32係代表不同的pBin-Va品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖植株，且其中，M表示1Kb DNA標誌、WT表示做為陰性對照之野生型(即未經轉殖)之菸草植株，以及P表示做為陽性對照之含有β-1,4-葡萄糖苷酶基因之載體。

第3A至3C圖係分別檢測pBin-Cp、pBin-Er以及pBin-Va品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草的酵素活性分析結果圖，其中，Cp01至Cp54表示pBin-Cp品系之不同轉殖植株；Er02至Er42表示pBin-Er品系之不同轉殖植株；Va01至Va32表示pBin-Va品系之不同轉殖植株；pBin表示僅轉殖載體pBINPLUS之轉殖植株；Cp21表示做為陽性對照之pBin-Cp品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草；以及WT表示做為陰性對照之野生型菸草。

第4圖係分別檢測pBin-Cp、pBin-Er以及pBin-Va品系之轉殖菸草中β-1,4-葡萄糖苷酶含量之蛋白質電泳圖，其中，M代表蛋白質標誌；WT代表做為陰性對照之野生型菸草；pBin-Cp42及pBin-Cp54係pBin-Cp品系之轉殖菸草；pBin-Er32係pBin-Er品系之轉殖菸草；pBin-Va11係pBin-Va品系之轉殖菸草；以及，箭頭所指處為轉殖菸草或細菌所表現β-1,4-葡萄糖苷酶之蛋白質，其預測之大小約為59kDa。

第5圖係檢測pBin-Cp54品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草中，不同發育時期之葉片內β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性及蛋白質含量分析結果圖，編號1至12係分別表示依序自pBin-Cp54品系之轉殖菸草頂端取下之第3至14片葉子，各葉片之β-1,4-葡萄糖苷酶的酵素活性分析進行三重覆。

第6圖係檢測pBin-Cp35品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶，分別在20℃至100℃等不同溫度下的酵素活性分析結果圖，其中β-1,4-葡萄糖苷酶之各反應溫度的酵素活性分析進行三重覆。

第7圖係檢測pBin-Cp34品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶，在不同pH值及緩衝液下的酵素活性分析結果圖，其中，pH 1和2係使用氯化氫-氯化鉀(hydrochloric acid-potassium chloride)緩衝液；pH 3至6係使用檸檬酸鈉(sodium citrate)緩衝液；pH 4至5.5係使用醋酸鈉(sodium acetate)緩衝液；pH 6至8係使用磷酸鉀(potassium phosphate)緩衝液；以及pH 9和10係使用四硼酸鈉(sodium tetraborate)緩衝液，其中β-1,4-葡萄糖苷酶於各不同pH值的酵素活性分析進行三重覆。

第8圖係檢測pBin-Cp35品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草與細菌所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶，在不同pH值及緩衝液下的酵素活性分析結果圖，其中，pH 1和2係使用氯化氫-氯化鉀緩衝液；pH 3係使用氯化氫-甘胺酸緩衝液；pH 4和5係使用醋酸緩衝液，且其中β-1,4-葡萄糖苷酶於各不同pH值的酵素活性分析進行三重覆。

第9圖係檢測pBin-Cp54品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶，於70℃、80℃或90℃下各別加熱30、60、90和120分鐘後的酵素活性分析結果圖，其中β-1,4-葡萄糖苷酶於各加熱時間的酵素活性分析進行三重覆。

第10圖係檢測pBin-Cp34品系之β-1,4-葡萄糖苷酶轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶，分別儲存於-80℃、-20℃、4℃或室溫下，0、3、5、7、10、14、 21、25及30天後的酵素活性分析結果圖，其中β-1,4-葡萄糖苷酶於各溫度之儲存時間的酵素活性分析進行三重覆。

以下係藉由特定的具體實施例說明本揭露之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容瞭解本揭露之其他優點與功效。本揭露也可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點與應用，在不悖離本揭露之精神下進行各種修飾與變更。

除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一」及「該」包括複數個體。

除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「或」包括「及/或」之含義。

本揭露之實施例所使用引子對之序列如下表1所示：

實施例1 建構含有c-Myc標籤之β-1,4-葡萄糖苷酶基因片段的載體

(1)自Sulfolobus solfataricus P2菌株選殖β-1,4-葡萄糖苷酶基因

自生物資源保存及研究中心(新竹，台灣)購買Sulfolobus solfataricus P2菌株(編號為BCRC 17226)，利用修改自Hoffman及Winston之基因體萃取法(Hoffman and Winston,1987)，以萃取Sulfolobus solfataricus P2菌株之基因體DNA，並儲存於-20℃備用。將萃取出之基因體DNA的濃度稀釋至每微升(μL)含有300ng至400ng之基因體DNA，以做為聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)之模板DNA。

自美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)之GenBank資料庫下載取得Sulfolobus solfataricus P2菌株之基因體序列(GenBank Accession Number：AE006641.1)，並針對如SEQ ID NO：1所 示序列之sso3019基因(即β-1,4-葡萄糖苷酶基因)，設計包含如SEQ ID NO：2所示序列之正向引子，以及如SEQ ID NO：3所示序列之反向引子之第一引子對，其中，該正向引子(SEQ ID NO：2)之5’端具有如SEQ ID NO：4所示之c-Myc標籤，且其中，SEQ ID NO：4所示序列係依菸草之密碼子使用最佳化(codon usage optimization)而修飾。在PCR反應管中，加入1微升的模板DNA、1微升的正向引子(10μM)、1微升的反向引子(10μM)、4微升的dNTP(2.5μM)、5微升含有MgCl₂之10倍PCR緩衝液、1微升的EX Taq DNA聚合酶(購自TAKARA公司)，再補充37微升的無菌二次水至總體積為50微升，最終形成反應液。將混合均勻之反應液置入聚合酶連鎖反應儀(T100^TM Thermal Cycler，購自於美國Bio-Rad公司)，聚合酶連鎖反應之反應條件如下所示：94℃變性5分鐘，一個循環；接下來重複28個至35個於94℃變性30秒、63℃黏合40秒及72℃擴增2分鐘之循環；最後於72℃反應10分鐘，以生成含有c-Myc標籤之1,517bp的sso3019基因片段，並將其保存於4℃。

(2)建構含有c-Myc標籤之sso3019基因片段之載體pBglb

將含有c-Myc標籤之sso3019基因片段以T-A選殖(T-A cloning)方式送入T&A選殖載體(Real Biotech Corporation)，並轉形至勝任細胞(competent cell；Yeastern Biotech)中，經篩選後得到帶有c-Myc標籤及sso3019基因片段之載體pBglb，並經定序確認之。

實施例2 建構植物細胞之核轉殖的表現載體

(1)建構具有液泡分選信號之植物表現載體pBin-Va

為建構可使外源的sso3019基因於植物細胞內表現並將表現出的蛋白質累積於液泡之表現載體，將載體pBglb利用NcoI及NotI限制酵素進行切割，以得到線性的c-Myc-sso3019基因片段(1,517bp)。其次，將如SEQ ID NO：5所 示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：6所示序列之反向引子之第二引子對進行黏著(annealing)，以得到AFVY胺基酸序列所對應之核苷酸序列片段。之後，透過T4連接酶將AFVY之核苷酸序列片段與該線性c-Myc-sso3019基因片段進行接合，以得到線性c-Myc-sso3019-AFVY之核苷酸序列片段。之後，同樣再利用T4連接酶將其接合至ImpactVector^TM 1.2載體之NcoI及SacI限制酵素切位，以得到帶有P _rbcS -S_p-c-Myc-sso3019-AFVY-T _rbcS 之載體pIV-Va，其中，P _rbcS 和T _rbcS 分別表示rbcS基因之啟動子(promoter)和終止子(terminator)，而S_p表示蛋白質經由分泌途徑(secretory pathway)進入內質網內腔之信號肽(signal peptide)，且具有如SEQ ID NO：7所示之核苷酸序列，以及AFVY表示液泡蛋白質之分選信號(sorting signal)，且具有如SEQ ID NO：8所示之核苷酸序列。最後，利用AscI及PacI限制酵素切割載體pIV-Va，並將切下之3.5kb的P _rbcS -S_p-c-Myc-sso3019-AFVY-T _rbcS 基因片段置入同樣以AscI及PacI限制酵素切割之載體pBINPLUS中，以獲得如第1A圖所示具有液泡分選信號之植物表現載體pBin-Va。

(2)建構具有內質網滯留信號之植物表現載體pBin-Er

為建構可使外源的sso3019基因於植物細胞內表現並將表現出的蛋白質累積於內質網之表現載體，將載體pBglb及ImpactVector^TM1.3分別利用NotI及NcoI限制酵素進行切割，以分別得到1,517bp之c-Myc-sso3019基因片段及4,729bp之ImpactVector^TM 1.3線性片段，隨後將此二個核苷酸片段利用T4連接酶進行接合，並經轉形至大腸桿菌後，以胺芐青黴素(Ampicillin)篩選得到帶有P _rbcS -S_p-c-Myc-sso3019-KDEL-T _rbcS 之載體pIV-Er，其中，KDEL表示內質網蛋白質之滯留信號(retention signal)，且具有如SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列。最後，利用AscI及PacI限制酵素切割載體pIV-Er，並將切下之3.5kb的P _rbcS -S_p-c-Myc-sso3019-KDEL-T _rbcS 基因片段，再放入載體pBINPLUS中，以獲得如第1B圖所示具有內質網滯留信號之植物表現載體pBin-Er。

(3)建構具有葉綠體轉運肽之植物表現載體pBin-Cp

為建構可使外源的sso3019基因於植物細胞內表現並將表現出的蛋白質累積於葉綠體之表現載體，將載體pBglb及ImpactVector^TM 1.4分別利用NotI及NcoI限制酵素進行切割，以分別得到1,517bp之c-Myc-sso3019基因片段及4,902bp之ImpactVector^TM 1.4線性核苷酸片段，隨後將此二個核苷酸片段利用T4連接酶進行接合，並經轉形至大腸桿菌後，以胺芐青黴素篩選得到帶有P _rbcS -T_p-c-Myc-sso3019-T _rbcS 之載體pIV-Cp，其中，T_p表示葉綠體蛋白質之轉運肽(transit peptide)，且具有如SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列。最後，利用AscI及PacI限制酵素切割載體pIV-Cp，並將切下之3.7kb的P _rbcS -T_p-c-Myc-sso3019-T _rbcS 基因片段，再放入載體pBINPLUS中，以獲得如第1C圖所示具有葉綠體轉運肽之植物表現載體pBin-Cp。

實施例3 將植物表現載體轉形至農桿菌

將上述建構之三個表現載體pBin-Cp、pBin-Er及pBin-Va，分別利用電穿孔法，以2,500V、100Ω及50μF之條件進行電擊(儀器為BTX ECM630 Electroporation Generator,USA)，轉形到於10%甘油之農桿菌中，經適當的康黴素(kanamycin)、立汎黴素(rifampicin)及健他黴素(gentamycin)抗生素篩選後，分別得到經轉形且含有載體pBin-Cp、pBin-Er及pBin-Va的農桿菌。

實施例4 製備β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草

(1)以農桿菌進行菸草基因轉殖

將含有載體pBin-Cp、pBin-Er及pBin-Va之農桿菌分別進行菸草之基因轉殖。首先，將各農桿菌置入於含抗生素之5mL LB(Luria-Bertani broth)培養液中，置於28℃或室溫下，以轉速150rpm旋轉培養約18至24小時。隔天取出1mL的農桿菌液，並補充含有適當量抗生素之LB培養液至5mL，並加入100μL的 500mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)，以及0.5μL的0.2M乙醯丁香酮(acetosyringone)，於28℃或於室溫下以轉速150rpm旋轉培養約18至24小時。次日，將菌液以轉速1,700g離心10分鐘，去除上清液，並加入2mL含有10μM MES及10μL的1M MgCl₂的滲入溶液(infiltration solution)，震盪並混合均勻，再次離心，並重複此步驟兩次。以全波長分光儀偵測OD₆₀₀值，並以滲入溶液調整菌液濃度至OD₆₀₀值約為0.4。之後，加入適當的0.2M乙醯丁香酮溶液並混合均勻，於室溫下以150rpm旋轉培養3至4小時進行活化。接著，使用約一個月大的菸草植株葉片，於其背面以無菌針頭輕刮，使葉片產生傷口，再以針筒吸取0.3至0.4mL的菌液，將針筒對準葉片之傷口處，另一手以指腹抵住葉片進行注射。注射完畢後，將注射區域予以標記，並將菸草植株置於暗處避光，且於25℃培養3天。最後，將植株置於室溫或25℃下，以16小時光照培養2天。

(2)β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草之篩選及再生

將培養後之菸草植株中經農桿菌之菌液滲入的葉片切下，加入含有2% NaClO及0.1% Tween-20之消毒液，翻轉搖晃10分鐘後去除消毒液，再加入30mL無菌水翻轉並搖晃15秒後去除溶液，重複3至5次直至無泡沫出現。最後，將葉片切成約0.5平方公分之尺寸，並將葉背朝上置放於含有康黴素之TSM(tobacco shooting medium)培養基(即每公升水中含有4.4g Murashige及Skoog(MS)的基本培養基(包含有維生素)、30g蔗糖、0.1mg 1-萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid，NAA)、1mg 6-苄腺嘌呤(6-benzylaminopurine，BA)、pH 5.7及3g的植物凝膠Phytagel^TM)上進行分蘗培養。當植物之癒傷組織生長出適當大小之葉上部組織後，便可將該癒傷組織移植至含有適當抗生素之TRM培養 基中進行發根培養。當菸草轉殖植物生長出根部並經馴化後，將轉殖植物移至土壤中繼續生長。

本實施例總共獲得54株pBin-Cp品系的菸草T₀轉殖植株(以下簡稱T₀轉殖株)、44株pBin-Er品系的T₀轉殖株及32株pBin-Va品系的T₀轉殖株。各品系之T₀轉殖株經自花授粉後，得到T₁子代。將T₁子代分別播種於含有適當抗生素之1/2 MS培養基進行篩選，並觀察植物外表性狀。經觀察後發現，β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草之外表性狀與野生型菸草並無顯著差異。由此顯見，表現外源之sso3019基因並不會影響菸草植物的生長。

實施例5 檢測轉殖菸草中β-1,4-葡萄糖苷酶基因的存在

自各別的pBin-Cp、pBin-Er及pBin-Va品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草中，隨機挑選不同的基因轉殖植株，並萃取各基因轉殖菸草的基因體DNA，併同野生型菸草基因體DNA的萃取，利用包含如SEQ ID NO：11所示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：12所示序列之反向引子之第三引子對進行聚合酶連鎖反應，以擴增放大預期PCR產物長度為749bp之β-1,4-葡萄糖苷酶基因片段，將PCR產物以1%瓊膠電泳進行分離，並經溴化乙錠(ethidium bromide，EtBr)染色後照相，藉以檢測外源β-1,4-葡萄糖苷酶基因是否插入菸草的基因體中。如第2A至2C圖的結果所示，在不同的pBin-Cp、pBin-Er及pBin-Va品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草中，大部分的轉殖植株皆可檢測到β-1,4-葡萄糖苷酶基因的存在。

實施例6 檢測轉殖菸草中β-1,4-葡萄糖苷酶的酵素活性及特性分析

(1)分析轉殖菸草中β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性

將各轉殖植株之T₁種子播種於含有康黴素之1/2 MS培養基，培養約21天後，隨機剪取約150mg植物葉片組織並以液態氮研磨成粉末，隨後加入300μL蛋白質萃取緩衝液、1% β-巰乙醇及0.1%蛋白酶抑制劑，並混合均勻。將混合液移入微量離心管中，經震盪後，置於冰上10分鐘。之後，於4℃下，以12,500rpm轉速離心10分鐘，去除沉澱物，再將上清液於4℃下以12,500rpm轉速離心15分鐘，將上清液移入新的微量離心管中，以獲得蛋白質萃取液。利用Bradford蛋白質定量試劑(Bio-Rad,USA)以及BSA(bovine serum albumin)標準品檢測蛋白質萃取液之濃度，以獲得各轉殖植株所生成β-1,4-葡萄糖苷酶之含量。

將蛋白質萃取液於65℃下加熱30分鐘，再以12,500rpm轉速離心20分鐘，去除沉澱物後，取10μL上清液進行β-1,4-葡萄糖苷酶之活性測試。以50mM磷酸鈉緩衝液配置濃度為5mM的對-硝基苯基-β-D-葡萄哌喃糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)(Alta Aesar，USA)，以作為β-1,4-葡萄糖苷酶之反應受質。將10μL蛋白質萃取液與140μL 5mM pNPG混合，並於65℃反應30分鐘；之後，再加入150μL的0.4M甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液，以終止反應，最後利用酵素連結免疫分析讀數器(Bio-Rad，USA)測定OD₄₀₅數值，並以不同濃度之p-硝苯酚做為標準品。

如第3A圖所示之結果，顯示在pBin-Cp品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草中，有49個轉殖植株(pBin-Cp01至pBin-Cp06、pBin-Cp08至pBin-Cp17、pBin-Cp19至pBin-Cp22、pBin-Cp24至pBin-Cp29、pBin-Cp32至pBin-Cp54)可測得β-1,4-葡萄糖苷酶的活性，其中更以pBin-Cp34、pBin-Cp35、pBin-Cp37、pBin-Cp42及pBin-Cp54轉植株之β-1,4-葡萄糖苷酶的活性較高。

如第3B圖所示之結果，顯示在pBin-Er品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草中，有12個轉殖植株(pBin-Er06、pBin-Er09、pBin-Er12、pBin-Er15、pBin-Er19、pBin-Er21、pBin-Er27、pBin-Er32至pBin-Er34、pBin-Er37及pBin-Er42)可測得β-1,4-葡萄糖苷酶活性，其中更以pBin-Er09、pBin-Er21、pBin-Er32及pBin-Er34轉植株之β-1,4-葡萄糖苷酶的活性較高。

如第3C圖所示之結果，顯示在pBin-Va品系之β-1,4-葡萄糖苷酶基因轉殖菸草中，有20個轉殖植株(pBin-Va01、pBin-Va02、pBin-Va06至pBin-Va11、pBin-Va16至pBin-Va19、pBin-Va21至pBin-Va27及pBin-Va32)可測得β-1,4-葡萄糖苷酶的活性，其中更以pBin-Va01、pBin-Va11、pBin-Va18及pBin-Va23轉植株之β-1,4-葡萄糖苷酶的活性較高。

上述結果顯見，pBin-Cp品系所測得β-1,4-葡萄糖苷酶之平均活性顯著高於pBin-Va或pBin-Er品系所測得β-1,4-葡萄糖苷酶之平均活性。

(2)分析轉殖菸草中β-1,4-葡萄糖苷酶之蛋白質含量

將經由細菌表現並純化之β-1,4-葡萄糖苷酶稀釋為250ng、500ng、750ng及1500ng等含量作為標準品，以檢測轉殖菸草所合成之β-1,4-葡萄糖苷酶的含量。將經由細菌表現且純化具有不同含量的β-1,4-葡萄糖苷酶與110μg轉殖菸草(pBin-Cp42、pBin-Cp54、pBin-Er32及pBin-Va01轉植株)之蛋白質萃取液進行10% SDS-PAGE蛋白質電泳，經考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色，再退染照相後，藉由Image J進行定量，並將經由細菌表現之β-1,4-葡萄糖苷酶之濃度做成迴歸曲線，以計算轉殖菸草中所表現的β-1,4-葡萄糖苷酶之含量。結果如第4圖所示，箭頭所指處為細菌或轉殖菸草所表現之預測大小約為59kDa的β-1,4-葡萄糖苷酶蛋白。定量結果顯示，pBin-Cp品系之轉殖菸草具有較高 的β-1,4-葡萄糖苷酶之表現量，且β-1,4-葡萄糖苷酶之表現量佔葉片之總可溶性蛋白質可達約0.7至1%之間，而在pBin-Er及pBin-Va品系之轉殖菸草中，β-1,4-葡萄糖苷酶表現量分別約佔葉片之總可溶性蛋白質的0.5%及0.3%。

(3)分析不同生長發育時期轉殖菸草葉片內β-1,4-葡萄糖苷酶的酵素活性及蛋白質含量

依序自pBin-Cp54品系之轉殖菸草頂端取下第3至14片葉子，利用直徑1cm的鑽孔器，於各葉片中間且靠近葉脈中間兩處鑽出各兩個，共四個總重量約為60mg的葉圓盤，依據實施例6所述之方法，自各葉片萃取蛋白質萃取液，並檢測β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性及蛋白質含量。結果如第5圖所示，不同發育時期之葉片內的β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性具有約2至4倍的顯著差異。此外，雖然新生葉片(即第3至5片葉子)具有較高的總可溶性蛋白質含量，然而，新生葉片內之β-1,4-葡萄糖苷酶的酵素活性較低。再者，雖然衰老葉片(即第11至14片葉子)具有較低的總可溶性蛋白質含量，然而，其中第11至13片之衰老葉片內的β-1,4-葡萄糖苷酶的酵素活性相較於新生葉片為高。由此顯見，轉殖菸草之不同發育時期的葉片內之總可溶性蛋白質的含量與酵素活性並非呈正相關。明顯地，在發育中的葉片(即第6至10片葉子)，尤其是在第6和7片葉子內具有較高的β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性，且在第11至13片葉子之衰老葉片內仍維持有高的酵素活性。

(4)分析轉殖菸草葉片內β-1,4-葡萄糖苷酶的最佳作用溫度

自pBin-Cp35品系之轉殖菸草取下約150mg的葉片，並依據實施例6所述之方法，萃取出蛋白質萃取液。將10μL的蛋白質萃取液與140μL、5mM的pNPG受質混合，並於20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100 ℃反應10分鐘；之後，再加入150μL的0.4M甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液，以終止反應，並檢測β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性。結果如第6圖所示，轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶在80℃至90℃之間具有更佳的酵素活性。

(5)轉殖菸草葉片所表現β-1,4-葡萄糖苷酶的作用pH值

自pBin-Cp34品系之轉殖菸草取下約150mg的葉片，並依據實施例6所述之方法，萃取出蛋白質萃取液。將定量1μg的蛋白質萃取液與pNPG受質於不同pH值之50mM氯化氫-氯化鉀、50mM醋酸鈉、50mM檸檬酸鈉、50mM磷酸鉀及50mM四硼酸鈉緩衝液中混合，並於80℃反應10分鐘之後，再終止反應，並檢測β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性。結果如第7圖所示，反應之pH值及緩衝液的種類皆會影響β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性。此外，β-1,4-葡萄糖苷酶在pH值5至7之間具有最佳之活性效果。

(6)比較細菌及轉殖菸草葉片所表現β-1,4-葡萄糖苷酶在pH 1至5之間的酵素活性

自pBin-Cp35品系之轉殖菸草取下約150mg的葉片，並依據實施例6所述之方法，萃取出蛋白質萃取液。將0.1μg經由轉殖菸草或細菌所表現並純化之β-1,4-葡萄糖苷酶，與pNPG受質於pH 1或2之50mM氯化氫-氯化鉀、pH 3之50mM甘胺酸-氯化氫、pH 4或5之50mM醋酸鈉緩衝液中混合，並於65℃反應30分鐘之後，再終止反應，並檢測β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性。結果如第8圖所示，相較於細菌所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶，轉殖菸草葉片所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶在pH 2至4的環境下顯著具有更佳的酵素活性。

(7)分析轉殖菸草葉片內β-1,4-葡萄糖苷酶的熱穩定性

自pBin-Cp54品系之轉殖菸草取下約150mg的葉片，並依據實施例6所述之方法，萃取出蛋白質萃取液。將10μL的蛋白質萃取液於70℃、80℃或90℃下各別加熱30、60、90和120分鐘，之後再與140μL、5mM的pNPG受質混合，並於65℃反應10分鐘，隨後再加入150μL的0.4M甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液，以終止反應，並檢測β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性。結果如第9圖所示，轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶在70℃下加熱處理2小時後，酵素活性仍有起始活性的100%。在80℃下加熱處理1小時後，酵素活性為起始活性的86%，而加熱處理2小時之後，酵素活性約為起始活性的70%。在90℃下分別加熱處理30、60、90和120分鐘後，酵素活性分別降至起始活性的52%、36%、20%和16%。結果顯示轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶具有良好的熱穩定性。

(8)分析轉殖菸草葉片內β-1,4-葡萄糖苷酶的儲存穩定性

自pBin-Cp34品系之轉殖菸草取下約150mg的葉片，並依據實施例6所述之方法，萃取出蛋白質萃取液。將蛋白質萃取液於-80℃、-20℃、4℃或室溫下儲存0、3、5、7、10、14、21、25及30天，之後各取10μL的蛋白質萃取液與140μL、5mM的pNPG受質混合，並於65℃反應10分鐘，然後再加入150μL的0.4M甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液，以終止反應，並檢測β-1,4-葡萄糖苷酶之酵素活性。結果如第10圖所示，轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶在-80℃下靜置30天後，酵素活性仍然大於初始活性的90%以上，而在-20℃、4℃及室溫下靜置30天後，酵素活性分別約為初始活性的78%、64%及55%，結果顯示轉殖菸草所表現之β-1,4-葡萄糖苷酶具有良好的儲存穩定性。

以上為描述本揭露之例示性實施例，應理解的，本揭露之範圍不限於所揭露的實施例；反之，其應涵蓋各種修改及類似的重新組合。因此，申請專利範圍應賦予最廣泛的解釋，以涵蓋所有此種修改及類似的組合。

以下所列的參考文獻皆以引用的方式併入本文。

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<110> 國立成功大學

<120> 促進木質纖維素水解之重組核酸分子、表現載體以及方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> Sulfolobus solfataricus P2菌株

<400> 1

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 96

<212> DNA

<213> 植物

<400> 7

<210> 8

<211> 12

<212> DNA

<213> 植物

<400> 8

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> 植物

<400> 9

<210> 10

<211> 288

<212> DNA

<213> 植物

<400> 10

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 11

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 12

Claims (6)

1. 一種生產木質纖維素水解酵素之方法，包含：製作重組核酸分子，其中，該重組核酸分子包含編碼信號分子之核苷酸序列以及編碼β-1,4-葡萄糖苷酶之核苷酸序列，其中，該信號分子包含轉運肽，該轉運肽具有如SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列，以及該β-1,4-葡萄糖苷酶係來自嗜熱古細菌Sulfolobus solfataricus，且具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列；將包含該重組核酸分子之表現載體轉形送入農桿菌中，以得到經轉形之農桿菌；將該經轉形之農桿菌感染菸草植物細胞，以得到菸草轉殖植株；以及自該菸草轉殖植株之葉片萃取蛋白質萃取液，以得到包含該木質纖維素水解酵素的蛋白質粗萃液。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該表現載體進一步包含移轉DNA之左邊界序列，以及移轉DNA之右邊界序列，其中，該重組核酸分子係位於該移轉DNA之左邊界序列以及該移轉DNA之右邊界序列之間。
3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該表現載體進一步包含控制該重組核酸分子之表現的啟動子序列，其中，該啟動子序列係位於該重組核酸分子之5’端，以及該移轉DNA之左邊界序列和該移轉DNA之右邊界序列之間。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，該啟動子係rbcS基因啟動子、CaMV 35S啟動子、肌動蛋白啟動子或泛蛋白啟動子。
5. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該表現載體在該移轉DNA之左邊界序列以及該移轉DNA之右邊界序列之間進一步包含選自由表位標籤序列、報導基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、加強子序列、終止子序列調節子序列以及其組合所組成群組之序列片段。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該表現載體之該表位標籤序列包含c-Myc、6-組胺酸、血凝素、穀胱甘肽-硫-轉移酶或FLAG。

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