CN102807958A

CN102807958A - 一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用

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Publication number: CN102807958A
Application number: CN2012102958196A
Authority: CN
Inventors: 杨忠华; 赵燕; 陈庚华; 周卫; 侯亚利
Original assignee: Wuhan University of Science and Technology WHUST
Current assignee: Wuhan University of Science and Technology WHUST
Priority date: 2012-08-16
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2032-08-16
Also published as: CN102807958B

Abstract

本发明公开了一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用，解决了现有产纤维素酶菌株酶活产量低的问题，提供一种可分泌纤维素酶的菌株，保藏名称为绿木霉ZY-01 (Trichoderma virens ZY-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2012205，该菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，并描述了上述菌株的分离方法及纤维素酶的产酶及纯化提取方法，以及用于甘蔗渣及秸秆的高效降解的应用方法。本发明菌株具有酶活高，反应适应的条件范围广，易于制备的优点，分泌的纤维素酶具有很高的纤维素降解活性。

Description

一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说是一种可分泌纤维素酶的菌株的分离方法、该菌株产纤维素酶及其提取方法及应用。

背景技术

纤维素是自然界中分布最广泛的多糖类物质。如能合理利用使其降解为可利用的糖类，可解决当前人类社会所面临的粮食与能源问题。纤维素酶是水解纤维素为可发酵性糖的关键酶，纤维素被水解后可得到还原性糖，从而通过发酵工艺进一步转化为生物能源等物质。在草料中添加纤维素酶，可增加饲料的利用率，提高饲养动物的产肉率。目前纤维素酶还被广泛用于多纺织、造纸等工业领域。

用于产纤维素酶的真菌多为里氏木霉。当前纤维素酶多由微生物发酵生产。但酶活产量低，成为纤维素酶工业化的最大阻力。寻找高效纤维素酶产生菌极为重要。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种可分泌酶活高、产量高的纤维素酶的产酶菌株。

本发明的另一目的还提供上述菌株的分离方法。

本发明的同时还提供一种上述菌株分泌的纤维素酶的提取方法及其应用。

本发明可分泌纤维素酶的菌株为绿木霉ZY-01，保藏名称为绿木霉(Trichoderma virens ZY-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No： M 2012205，保藏日期为2012年6月5日，该菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

Trichoderma virens ZY-01(CCTCC No： M 2012205)的具体特征如下：

(1)菌落形态

菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生孢子，而成绿色。菌落背面无色，或逐渐呈暗黄色。

(2)水解圈特性

在刚果红培养基上有较大明显水解圈。

(3)细胞形态

菌丝透明至浅绿色，壁光滑，分生孢子梗由菌丝侧面生出，基部通常不育，且不分枝，向顶分枝不规则，整体像树枝。厚垣孢子呈卵圆形，光滑，淡绿色。

18s rDNA序列分析表明该菌株(Trichoderma viride ZY-01)与模式菌株Trichoderma atroviride [M] 206040和Trichoderma virens Gv29-8的序列同源性为99 %，结合形态学特征和培养特征分析，该菌有绿木霉的特性，该菌归为木霉属(Trichoderma sp.)。

上述可分泌纤维素酶的菌株的分离方法，包括下述步骤：

1)从秸秆作物农田取得土壤，加水振荡后使土壤与无菌水充分混合散开，静置使其澄清，取上清液；土壤和无菌水的混合质量体积比优选为1：9。

2)将上清液滴加于刚果红选择培养基上，涂布均匀，30- 40 ℃恒温培养3- 5天；

所述刚果红选择培养基成分为：KH₂PO₄ 0.2- 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2- 0.5 g，琼脂10- 20 g，CMC∙Na 1- 5 g，刚果红0.20 g，2 %去氧胆酸钠溶液20 mL，3- 5 mL链霉素溶液，蒸馏水定容至1000 mL；

3)在刚果红选择培养基上培养3- 5 天后，观察水解圈情况，当菌落周围培养基相对无菌落部分的刚果红着色较浅或接近于无色时，则该水解圈指示得到可分泌纤维素酶的菌株。由于该菌株可分泌出胞外纤维素酶并水解菌落周围培养基中纤维素成分，致使菌落周围培养基相对无菌落部分的刚果红着色较浅或接近于无色，由该水解圈指示即说明已得到可分泌纤维素酶的菌株绿木霉ZY-01。

由纤维素酶的产酶及纯化提取方法包括下述步骤：

(1)发酵产酶：

将所述的菌株接种入发酵产酶培养基中发酵产酶，所述发酵产酶培养基成份为：羧甲基纤维素钠(CMC∙Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO₄∙7H₂O和K₂HPO₄，发酵温度为30- 40 ℃，发酵时间为3- 5天，得到发酵液；

(2)纤维素酶提取：

将发酵液离心分离得到上清液，对上清液进行乙醇(60- 85%)沉淀，再利用葡聚糖凝胶G-75层析，得到纯化后的纤维素酶。

所述步骤(１)中发酵培养基组成比例为：0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 g CMC∙Na，20- 30 g NaCl，0.3- 1 g K₂HPO₄，0.3- 1 g MgSO₄∙7H₂O，蒸馏水定容至1000 mL。将菌种接入该培养基30- 40 ℃培养3- 5天。

本发明纤维素酶由上述提取方法得到。

上述纤维素酶用于甘蔗渣、玉米秸秆及、稻草或小麦秸杆等高纤维素含量的生物质（以下简称生物质）的高效降解。所述降解方法为将生物质粉碎后用1 %- 3 % (w/v) NaOH预处理，其中固液质量体积比为1：20，随后每1 g预处理后的生物质中加入50-70 IU（国际酶活单位）的所述纤维素酶，加入缓冲液调节pH值到4.0- 6.0，40- 60℃恒温酶解20- 50 h。

所述预处理可采用机械粉碎后NaOH溶液浸泡的方法，其目的是为了破坏纤维素和半纤维素与木质素之间对碱不稳定的化学键，溶解半纤维素和一部分木质素，使纤维暴露易于分解。

所述缓冲液可以为常用的Tirs缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液或醋酸缓冲液等。

所述酵母抽提物（如OXOID^TM酵母抽提物）的提取方法为现有技术，不作详述。

所述甘蔗渣或、玉米秸秆粉碎后过40-80目，所述稻草、小麦秸秆粉碎至5 mm以下，优选为不大于3mm。

有益效果：

(1)本发明从秸秆作物农田（如玉米、水稻或小麦作物农田）的土壤中筛选得到一种可分泌纤维素酶的绿木霉ZY-01 (Trichoderma viride ZY-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2012205，)，该菌株的分离方法简单、来源广泛、可由秸秆作物农田中的土壤中分离获得。

(2)对由绿木霉的分泌物中提取的纤维素酶酶进行酶学研究得知，该酶在45- 55 ℃，pH 4.6- 5.6时酶活性最高，而其耐受范围为30- 80 ℃和pH 3.6- 7，其中30- 50 ℃和pH 5- 6时稳定性最高，具有酶活高，反应适应的条件范围广，易于制备的优点。

(3)本发明纤维素酶具有很高的纤维素降解活性，其中以该酶的内切葡聚糖酶(EG)活性最为显著。用其作为催化剂对甘蔗渣渣、玉米秸秆、稻草和小麦秸秆进行降解20- 40 h，产糖率分别高达质量百分数29.2 %、23.8 %、21.3 %和22.2 %，随着反应时间的延长，产糖率会进一步增加，具有广泛的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明绿木霉Trichoderma virens ZY-01的基因组DNA和18s rDNA琼脂糖凝胶电泳图，其中1为marker，2为18s rDNA，3基因组DNA。

图2为纤维素葡聚糖G-75凝胶层析图。

图3为图2中峰2的葡聚糖G-75凝胶层析图。

具体实施方式

实施例中所涉及的培养基为：

[1]刚果红选择培养基：KH₂PO₄ 0.2- 1.0 g，MgSO₄∙7H₂O 0.2- 0.5 g，琼脂10- 20 g，CMC∙Na 1- 5 g，刚果红0.20 g，2 %去氧胆酸钠溶液20 mL，3- 5 mL链霉素溶液、蒸馏水定容至1000 mL；

[2]发酵培养基：0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 g CMC∙Na，20- 30 g NaCl，0.3- 1 g K₂HPO₄，0.3- 1 g MgSO₄∙7H₂O，蒸馏水定容至1000 mL。

实施例１：菌株的筛选

本发明的绿木霉(Trichoderma virens ZY-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No： M 2012205，保藏日期为2012年6月5日)是一种属于真菌类的菌株，该菌株从土壤中分离，经过以底物羧甲基纤维素钠(CMC∙Na)为唯一碳源从土壤样品中富集筛选的方法获得。

筛选产高效纤维素酶菌株的方法为：

(1)称取10 g土壤样品(本实施例中土壤取自于玉米秸秆作物农田)，加入90 mL无菌水，振荡均匀呈悬浮液。静置为上清液澄清，备用；

(2)取1 mL静置后的上清液，在无菌条件下接种于刚果红选择培养基中30- 40 ℃℃培养3-5 d；

(3)培养3-5 d后，该菌株可分泌出胞外纤维素酶并水解菌落周围培养基中纤维素成分，致使菌落周围培养基相对无菌落部分的刚果红着色较浅或接近于无色，由该水解圈指示得到可降解纤维素的菌株——绿木霉(Trichoderma virens ZY-01)。

实施例2：菌株鉴定

(1)实施例1中所分离菌株采用CTAB法提取其基因组DNA：

取10 mL菌液于离心管4 ℃，10000 r/min离心10 min，得到菌丝；菌丝加入4 mL CTAB和0.8 mL巯基乙醇混合均匀，并分装与1.5 mL离心管中水浴保持30 min；加入等体积酚/氯仿异戊醇(其中氯仿/异戊醇体积比例为24：1)，震荡摇匀，4 ℃，12000 r/min离心10 min；上清液中加入2 μL RNA酶，混匀后37 ℃水浴保持20- 30 min；水浴后将混合液分装至1.5 mL离心管中，每管约400 μL；再加入2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAC溶液，沉淀；沉淀彻底后离心弃上清，75 %乙醇洗涤2- 3次；晾干加入TE缓冲液溶解，-20 ℃保存。

(2)菌株18s rDNA序列分析

对菌株18s rDNA基因克隆和序列分析；其中使用真菌18s rDNA通用引物，其上游引物为NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC（如序列表SEQ ID NO.2所示），下游引物为NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA（如序列表SEQ ID NO.3所示）。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s； 52 ℃退火45 s； 72 ℃延伸90 s；重复2- 4步30个循环，72 ℃保持10 min。

以基因组为模板进行并使用通用引物对其18s rDNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，见图1。扩增产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，18s rDNA序列见SEQ ID NO.1，并在NCBI（美国国立生物技术信息中心）上进行比对。

实施例3-5：菌株发酵产酶

将实施例1中得到的菌株转入发酵培养基中进行发酵产酶，得到粗酶液。实施例中所述菌种的发酵培养基成分主要涉及碳源、氮源、无机盐。其发酵培养基成分中碳源为羧甲基纤维素钠(CMC∙Na)，氮源为酵母抽提物（英国OXOID公司），无机盐为NaCl、MgSO₄∙7H₂O和K₂HPO₄。具体步骤如表1所示：

实施例6：纤维素酶的分离提纯

将发酵液离心分离得到上清液，对上清液进行乙醇沉淀，再利用葡聚糖凝胶G-75层析，得到纯化后的纤维素酶。

[1]乙醇沉淀法初步纯化纤维素酶

将实施例5得到的粗酶液与无水乙醇(冰)分别按照1：4体积比混合，待沉淀彻底之后8000 rpm离心10 min，弃上清。每管沉淀分别复溶于2 mL Tris (20 mmol/L，pH8.6)缓冲液中。离心出去不溶的沉淀，得到69 IU/mL酶活的纤维素酶液。

[2]葡聚糖G-75凝胶进一步纯化纤维素酶

取5 mL乙醇纯化后的纤维素酶液采用葡聚糖凝胶G-75柱层析分离。凝胶柱规格为1.6*50 cm，采用BL-1流动泵和自动部分收集装置，以Tris (20 mmol/L，pH8.6)缓冲液为洗脱液，8- 10 min收集一管，每管5- 7 mL，于280 nm下测其吸光值，将在280 nm处有吸收值的收集液用DNS法测量其酶活，结果见图2和图3，最终得到纯化后的纤维素酶。

实施例7-13：纤维素酶降解高纤维素含量生物质的应用

将甘蔗渣、玉米秸秆、稻草与小麦秸杆分别粉碎后用2 % (w/v)浓度NaOH于100 ℃预处理（浸泡）60 min，其中固液质量体积比为1：20，随后用蒸馏水冲洗至中性，烘干备用，如下表所述得到实施例7-13的7份样品。

分别取预处理后的7份样品1g，加入 Trichoderma virens ZY-01纤维素酶（实施例6得到的纤维素酶），通过缓冲液调节pH到4.0-6.0混匀，酶解实施例如表2：

Figure 2012102958196100002DEST_PATH_IMAGE001

上述实验实验的结果表明，本发明所述纤维素酶产生菌Trichoderma virens ZY-01分泌的纤维素酶具有适应范围广，实用性强等特点。

<110> 武汉科技大学

<120> 一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用

<160> 3

<210> 1

<211> 1714

<212> DNA

<213> 绿木霉（Trichodermasp.）

<220>

<400> 1

taactggtca tgtccttagt ataagcatta taccgcgaaa ctgcgaatgg ctcattatat 60

aagttatcgt ttatttgata atactttact acttggataa ccgtggtaat tctagagcta 120

atacatgcta aaaatcccga cttcggaagg gttgtattta ttagattaaa aaccaatgcc 180

cctcggggct ctctggtgaa tcataataac tagtcgaatc gacaggcctt gtgccggcga 240

tggctcattc aaatttcttc cctatcaact ttcgatgttt gggtcttgtc caaacatggt 300

ggcaacgggt aacggagggt tagggctcga ccccggagaa ggagcctgag aaacggctac 360

tacatccaag gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ccgacacggg gaggtagtga 420

caataaatac tgatacaggg ctcttttggg tcttgtaatc ggaatgagta caatttaaat 480

cccttaacga ggaacaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct 540

ccaatagcgt atattaaagt tgttgtggtt aaaaagctcg tagttgaacc ttgggcctgg 600

ctggccggtc cgcctcaccg cgtgcactgg tccggccggg cctttccctc tgcggaaccc 660

catgcccttc actgggtgtg gcggggaaac aggactttta ctttgaaaaa attagagtgc 720

tcaaggcagg cctatgctcg aatacattag catggaataa tagaatagga cgtgtggttc 780

tattttgttg gttctaggac cgccgtaatg attaataggg acagtcgggg gcatcagtat 840

tcaattgtca gaggtgaaat tcttggattt attgaagact aactactgcg aaagcatttg 900

ccaaggatgt tttcattaat caggaacgaa agttagggga tcgaagacga tcagataccg 960

tcgtagtctt aaccataaac tatgccgact agggatcgga cgatgttaca tttttgacgc 1020

gttcggcacc ttacgagaaa tcaaagtgct tgggctccag ggggagtatg gtcgcaaggc 1080

tgaaacttaa agaaattgac ggaagggcac caccaggggt ggagcctgcg gcttaatttg 1140

actcaacacg gggaaactca ccaggtccag acacaatgag gattgacaga ttgagagctc 1200

tttcttgatt ttgtgggtgg tggtgcatgg ccgttcttag ttggtggagt gatttgtctg 1260

cttaattgcg ataacgaacg agaccttaac ctgctaaata gcccgtattg ctttggcagt 1320

acgccggctt cttagaggga ctatcggctc aagccgatgg aagtttgagg caataacagg 1380

tctgtgatgc ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacgga gccagcgagt 1440

actcccttgg ccggaaggcc tgggtaatct tgttaaactc cgtcgtgctg gggatagagc 1500

attgcaatta ttgctcttca acgaggaatc cctagtaagc gcaagtcatc agcttgcgtt 1560

gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga atggctcagt 1620

gaggcgtccg gactggccca gagaggtggg caactaccac tcagggccgg aaagctctcc 1680

aaactcggtc attagaggaa gaaaaagtaa accc 1714

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 2

GTAGTCATAT GCTTGTCTC 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 3

TCCGCAGGTT CACCTACGGA 20

Claims

1.一种可分泌纤维素酶的菌株，保藏名称为绿木霉ZY-01 (Trichoderma virens ZY-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No： M 2012205，该菌株18s rDNA序列如序列表SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的可分泌纤维素酶的菌株的分离和鉴定方法，其特征在于：

1)从秸秆作物农田取得土壤，加水振荡后使土壤与无菌水充分混合散开，静置使其澄清，取上清液；

2)取上清液滴加于刚果红选择培养基上，涂布均匀，30- 40 ℃恒温培养3- 5天；

所述刚果红选择培养基成分为：KH₂PO₄ 0.2- 1.0 g，MgSO₄∙7H₂O 0.2- 0.5 g，琼脂10- 20 g，CMC∙Na 1-5 g，刚果红0.20g，2 %去氧胆酸钠溶液20 mL，3- 5 mL链霉素溶液，蒸馏水定容至1000 mL；

3)在刚果红选择培养基上培养3- 5 天后，观察水解圈情况，当菌落周围培养基相对无菌落部分的刚果红着色较浅或接近于无色时，则该水解圈指示得到可分泌纤维素酶的菌株。

3.一种由纤维素酶的产酶及纯化提取方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)发酵产酶：

将权利要求1所述的菌株接种入发酵产酶培养基中发酵产酶，所述发酵产酶培养基主要成份包括：羧甲基纤维素钠(CMC∙Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO₄∙7H₂O和K₂HPO₄，发酵温度为30- 40 ℃，发酵时间为3- 5天，得到发酵液；

(2)纤维素酶纯化提取：

将发酵液离心分离得到上清液，对上清液采用乙醇沉淀法及葡聚糖凝胶G-75层析法纯化，得到纯化后的纤维素酶。

4.如权利要求３所述的由绿木霉生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述步骤(１)的发酵产酶培养基成分比例为：0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 g羧甲基纤维素钠（CMC∙Na），20- 30 g NaCl，0.3-1 g K₂HPO₄，0.3- 1 g MgSO₄∙7H₂O，蒸馏水定容至1000 mL。

5.一种纤维素酶，由权利要求３或4所述的提取及纯化方法得到。

6.权利要求５所述纤维素酶的应用，所述纤维素酶用于高纤维素含量的生物质的高效降解。

7.如权利要求6所述的纤维素酶的应用，所述高纤维素含量的生物质为甘蔗渣、玉米秸秆、稻草或小麦秸杆。

8.如权利要求6或7所述的纤维素酶的应用，其特征在于，所述降解方法为将高纤维素含量的生物质粉碎后用1 %- 3 % (w/v) NaOH预处理，其中固液质量体积比为1：20，随后每1 g预处理后的高纤维素含量的生物质中加入50-70 IU的权利要求5所述的纤维素酶，加入缓冲液调节pH值到4.0- 6.0，40- 60℃恒温酶解20- 50 h。

9.如权利要求8所述的纤维素酶的应用，其特征在于，所述粉碎步骤中，甘蔗渣或玉米秸秆粉碎后过40- 80目，稻草或小麦秸杆粉碎至5 mm以下。