CN101906405A - 一种菊糖果糖转移酶的克隆及其高效表达 - Google Patents
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Abstract
一种菊糖果糖转移酶的克隆及其高效表达，属于生物工程技术领域。本发明公开了一种菊糖果糖转移酶(IFTase)基因、其高表达重组大肠杆菌BL21-IFT的构建及诱导高效表达的方法。以产IFTase的金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001的DNA为模板，经PCR扩增获得编码IFTase的基因ift。采用特定核苷酸序列的引物进行扩增，获得重组DNA片段，经鉴定、酶切、连接，转化入宿主细胞，构建成IFTase高表达重组大肠杆菌BL21-IFT。将此阳性克隆子在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至OD600为0.4-1.2时，加入诱导剂、表面活性剂诱导表达，IFTase得到了高效表达。
Description
技术领域
本发明涉及源自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001的一种菊糖果糖转移酶及其编码的基因序列，菊糖果糖转移酶工程菌的构建，以及菊糖果糖转移酶高效表达的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
双果糖酐III(Difructose anhydride)是一种新型的非还原性双糖，在自然界中少量存在于菊苣、菊芋等植物中，少量出现于蜂蜜、咖啡等的加工过程中。其相对甜度为蔗糖的52％，而热量值却只有蔗糖的1/15(0.263kcal/g)；性质十分稳定，74％相对湿度下不吸湿，比蔗糖更难吸湿；双果糖酐III对热和酸十分稳定，在一般食品加工条件下，几乎不会出现褐变或分解现象，能耐硬糖生产时的高温熬煮而不褐变。同时双果糖酐III还具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不产生能量，可作为一个甜味剂被用作减肥辅助治疗；作为一种增歧因子，可促进肠道微生物的生长，明显改善排便、利尿功能；作为促进矿物质元素吸收的功能性糖，可使得Ca、Mg、Zn、Cu等矿物质元素被人体吸收利用的程度大大提高，增进骨骼生长；在抗龋齿方面，其性质可与木糖醇、山梨醇相媲美，不被诱发蛀牙的口腔链球菌利用，不产酸。这些优点使其在食品工业中的应用有广阔的前景。
由于双果糖酐III在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化大生产的要求，而化学催化法有许多不利的因素，例如形成许多副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使纯化步骤变得复杂。而生物法制备双果糖酐III的原料是菊糖，其来源广泛，价格低廉，转化率高，可达75％以上，属于天然产品，符合消费者追求天然产品的消费心理，因此采用生物转化技术生产成为双果糖酐III制备研究的热点。
用生物转化法制备双果糖酐III的研究已经有30余年的历史，1973年Uchiyama T.首次从产脲节杆菌中发现了一种新型菊糖酶(inulase II)，它将菊糖降解为双果糖酐III和少量的低聚果糖，由于此酶具有分子内转果糖基反应，因而将其命名为菊糖果糖转移酶(inulin ftructotransferase，IFTase，EC 2.4.1.93)。迄今为止，已发现十余种微生物可以产生此酶，主要集中在节杆菌属，包括Arthrobacter ureafaciens 7116、Arthrobacter ilicis OKU17B、Arthrobacterglobiformis C11-1、Arthrobacter sp.H65-7、Arthrobacter sp.A-6、Arthrobacterpascens T13-2、Arthrobacter sp.Bu0141、Arthrobacter sp.L68-1，另外在三种其它菌属中也发现了此酶，如Flavobacterium sp.LC-413、Bacillus sp.snu-7、Leifsonia sp.T88-4。
关于菊糖果糖转移酶的分子生物学研究始于1997年，Sakurai等人将Arthrobacter sp.H65-7的菊糖果糖转移酶基因转入大肠杆菌中，得到了首个菊糖果糖转移酶基因开放阅读框，且将其酶活由初始野生菌的胞外80U/mL提高到胞内酶活170U/mL。随后Arthrobacter sp.A-6、Arthrobacter globiformis C11-1、Arthrobacter sp.Buo141、Bacillus sp.snu-7的菊糖果糖转移酶基因也在大肠杆菌中克隆表达，其中Arthrobacter sp.Buo141菊糖果糖转移酶基因ORF长1434bp，编码477AA，1-59AA为信号肽，成熟酶胞内表达，酶活提高到320U/mL。
本发明将具有较高酶活的金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001的菊糖果糖转移酶基因在大肠杆菌中胞外表达，酶活较高，具有较好的工业应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种菊糖果糖转移酶及其编码的基因序列，菊糖果糖转移酶工程菌的构建及诱导表达的方法。该菊糖果糖转移酶在较高温度下具有较好的活性和稳定性，对于新型功能性甜味剂双果糖酐III的工业化生产具有广泛的应用前景和经济意义。
本发明的技术方案：一种来源于金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK8.001的菊糖果糖转移酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001在中国专利200810196709.8“一株产菊糖果糖转移酶的菌株和用该酶生产双果糖酐III的方法”中进行了保藏和公开，保藏编号为CCTCC NO：M 208120。
所述的菊糖果糖转移酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
用所述的菊糖果糖转移酶基因序列SEQ ID NO：1，进行克隆，构建高表达重组大肠杆菌BL21-IFT的方法，由产菊糖果糖转移酶活性高的菌种SK8.001的DNA为模板，采用
引物P1：CGCGCATATGGGAATTGATAAGACGCT
和引物P2：GATAAAGCTTGGGCGTGGGCCGAATGG
经PCR扩增，得到完整的菊糖果糖转移酶基因的DNA片段；该基因DNA片段与pET22b(+)质粒，分别都用Nde I和Hind III酶切；再将酶切的pET22b(+)质粒和菊糖果糖转移酶基因DNA片段，用T4 DNA连接酶连接获得重组质粒pET22b(+)-ift，再转化至感受态大肠杆菌BL21中，构建得高表达的重组大肠杆菌BL21-IFT。
所述菊糖果糖转移酶的诱导表达方法，步骤如下：
利用所获得的重组大肠杆菌BL21-IFT在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD600为0.4-1.2时，加入诱导剂、表面活性剂诱导表达数小时；
所述诱导剂其中至少一种选自异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG、半乳糖、乳糖；其中IPTG诱导浓度0.1-5.0mM，乳糖诱导浓度0.1-100g/L，半乳糖诱导浓度0.1-100g/L；
所述表面活性剂其中至少一种选自Tween 80、Triton X-100、十六烷基三甲基溴化胺CTAB、十二烷基硫酸钠SDS，其诱导浓度均为0.1-100mM；
诱导表达温度为20-40℃。
本发明的有益效果：本发明提供了一种菊糖果糖转移酶及其编码基因序列，菊糖果糖转移酶工程菌的构建及高效表达方法。该菊糖果糖转移酶在较高温度下具有较好的活性和稳定性，对于新型功能性甜味剂双果糖酐III的工业化生产具有广泛的应用前景和经济意义。
附图说明
图1重组质粒pET22b(+)-ift的构建示意图。
具体实施方式
实施例1金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001总DNA的提取
取金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001湿菌体20g，悬于10mL 50mM Tris-HCl缓冲液中(pH 8.0)。
加入少量溶菌酶和8mL 0.25mM乙二胺四乙酸EDTA(pH 8.0)，混匀后37℃静置20min。
再加入2mL 10％十二烷基磺酸钠(SDS)，55℃静置5min。
分别依次用等体积酚、氯仿各抽提一次。
取最后一次的上清，加入2倍体积的乙醇，回收DNA。
用70％乙醇、无水乙醇分别依次洗涤沉淀。
沉淀溶于0.5mL TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)，加入3μL10mg/mL RNase，37℃保温1h。
分别依次用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清加入2倍体积的乙醇，回收DNA。
用70％乙醇、无水乙醇分别依次洗涤沉淀。
沉淀溶于0.5mL TE缓冲液(10mMTris，1mM EDTA，pH 8.0)，-20保存备用。
实施例2 菊糖果糖转移酶基因的克隆
1、取金黄节杆菌SK8.001总DNA溶液3μL作为模板，以包含Nde I和HindIII的酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，经PCR扩增得到所要的DNA片段：
上游引物P1：CGCGCATATGGGAATTGATAAGACGCT
下游引物P2：GATAAAGCTTGGGCGTGGGCCGAATGG
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90s，进行35个循环；最后72℃延伸10min。
2、回收PCR产物，经限制性内切酶Nde I和Hind III进行双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET22b(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET22b(+)-ift。
3、将该重组质粒pET22b(+)-ift转化至宿主细胞中：将重组质粒pET22b(+)-ift转化至感受态大肠杆菌BL21中，涂布含有50μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上，37℃培养18-24h得到初步阳性克隆。
4、经抗性培养基筛选得到阳性克隆：分别挑取初步阳性克隆于5mL含50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶Nde I和HindIII酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET22b(+)-ift，具有该质粒的菌落为阳性克隆，命名为重组大肠杆菌BL21-IFT。
5、对重组质粒pET22b(+)-ift进行测序，结果表明插入片段为一个含有1353bp，编码由450个氨基酸组成的蛋白质。
实施例3发酵时间对重组大肠杆菌BL21-IFT发酵生产IFTase的影响
重组大肠杆菌BL21-IFT接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜，以2％(体积分数)的接种量接种于新鲜的LB培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导表达。在不同发酵时间产IFTase的检测，发现发酵20h IFTase酶活最高，随着发酵时间延长，IFTase酶活稍有下降，故确定发酵时间为20h。发酵时间对产菊糖果糖转移酶的影响如表1所示。
表1 发酵时间对产IFTase的影响
| 时间(h) | 8 | 12 | 16 | 20 | 24 | 30 | 36 |
| IFTase(U/mL) | 0.7 | 23 | 59 | 83 | 80 | 75 | 74 |
实施例4 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导浓度对重组大肠杆菌BL21-IFT发酵生产IFTase的影响
重组大肠杆菌BL21-IFT接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜，以2％(体积分数)的接种量接种于新鲜的LB培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，分为六份，每份分别加入终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mM的IPTG，25℃诱导表达20小时。结果发现加入IPTG 0.4mM时酶活诱导最高，高浓度的IPTG对细胞有害。
表2 IPTG诱导浓度对产IFTase的影响
| IPTG浓度(mM) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 |
| IFTase(U/mL) | 32 | 66 | 93 | 86 | 80 | 47 |
实施例5 温度对重组大肠杆菌BL21-IFT发酵生产IFTase的影响
重组大肠杆菌BL21-IFT接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜，以2％(体积分数)的接种量接种于新鲜的LB培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，分为五份，每份分别加入终浓度为0.4mM的IPTG，分别在20、25、30、35、40℃诱导表达20小时。结果发现25℃诱导产酶酶活最高。
表3 温度对产IFTase的影响
| 温度(℃) | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 |
| IFTase(U/mL) | 63 | 94 | 85 | 66 | 5 |
实施例6 Tween 80添加量对重组大肠杆菌BL21-IFT发酵生产IFTase的影响。
重组大肠杆菌BL21-IFT接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜，以2％(体积分数)的接种量接种于新鲜的LB培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，分为六份，每份分别加入终浓度为0.4mM的IPTG，25℃诱导表达4h后加入0、1、2、3、4、5mM的Tween 80，16h后测定发酵液酶活。结果发现添加不同浓度的Tween 80均可加速重组蛋白向培养基中的分泌，其中Tween 80添加量为1mM时，酶活最高。
表4 Tween 80添加量对产IFTase的影响
| Tween 80(mM) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| IFTase(U/mL) | 96 | 110 | 105 | 107 | 103 | 109 |
Claims (4)
1.一种来源于金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001的菊糖果糖转移酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述的菊糖果糖转移酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
3.权利要求1所述的菊糖果糖转移酶基因序列，进行克隆，构建高表达重组大肠杆菌BL21-IFT的方法，其特征在于：由产菊糖果糖转移酶活性高的菌种SK8.001的DNA为模板，采用
引物P1：CGCGCATATGGGAATTGATAAGACGCT
和引物P2：GATAAAGCTTGGGCGTGGGCCGAATGG
经PCR扩增，得到完整的菊糖果糖转移酶基因的DNA片段；该基因DNA片段与pET22b(+)质粒，分别都用Nde I和Hind III酶切；再将酶切的pET22b(+)质粒和菊糖果糖转移酶基因DNA片段，用T4DNA连接酶连接获得重组质粒pET22b(+)-ift，再转化至感受态大肠杆菌BL21中，构建得高表达的重组大肠杆菌BL21-IFT。
4.权利要求2所述菊糖果糖转移酶的诱导表达方法，其特征在于步骤如下：
利用权利要求3所获得的重组大肠杆菌BL21-IFT在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD600为0.4-1.2时，加入诱导剂、表面活性剂诱导表达数小时；
所述诱导剂其中至少一种选自异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG、半乳糖、乳糖；其中IPTG诱导浓度0.1-5.0mM，乳糖诱导浓度0.1-100g/L，半乳糖诱导浓度0.1-100g/L；
所述表面活性剂其中至少一种选自Tween 80、Triton X-100、十六烷基三甲基溴化胺CTAB、十二烷基硫酸钠SDS，其诱导浓度均为0.1-100mM；
诱导表达温度为20-40℃。
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