CN104877984A

CN104877984A - 一种嗜氯节杆菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN104877984A
Application number: CN201510256646.0A
Authority: CN
Inventors: 江波; 沐万孟; 蔡雪; 张涛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-05-20
Filing date: 2015-05-20
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明公开一种嗜氯节杆菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用，属于基因工程和现代酶工程技术领域。该海藻糖合成酶的编码基因从嗜氯节杆菌（Arthrobacter Chlorophenolicus SK33.001）克隆得到，该海藻糖合成酶能一步转化麦芽糖生成海藻糖，酶的适合反应温度为20～40℃，酶的适合反应pH在6～7.5。在最适温度下，转化率可达到65%左右。该海藻糖合成酶能用于转化麦芽糖或麦芽糖浆制备海藻糖，为海藻糖的工业化生产提供了新的方法。

Description

一种嗜氯节杆菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明一种嗜氯节杆菌 (Arthrobacter Chlorophenolicus SK33.001) 的海藻糖合成酶及其编码基因和应用，属于基因工程和现代酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖是一种安全、稳定的非还原性二糖，在自然界中广泛存在，如百余种植物、藻类、真菌、酵母、细菌和无脊椎动物如虾、昆虫、线虫等中都含有一定量的海藻糖。特别是在酵母、霉菌等真菌中，含量可高达生物体干重的20%以上。海藻糖由两个吡喃环葡萄糖以α-1,1-糖苷键连结而成。海藻糖存在3种光学异构体，但α,α型是最为常见的海藻糖，其他两种α,β和β,β型在自然界中很少存在。α,α型海藻糖结构式如式(I)所示。

式（I）

海藻糖的化学性质稳定，α,α-1,1-糖苷键远低于其他糖苷键能量，高玻璃化温度，无美拉德反应，甜度仅为蔗糖的45%。海藻糖在生物体内表现出许多独特的功能，它可作为结构组分，又可为生物体提供能量，它还是许多生物的应急代谢物，具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒化合物等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。外源性的海藻糖对生物体和生物膜、蛋白质等大分子同样具有突出的保护作用，使得海藻糖可作为生物和医学领域的活性大分子的优良保护剂，代替过去常用的血浆白蛋白作为疫苗、蛋白质药物、活菌制剂、血液制品、淋巴细胞、活体组织等生物活性物质的稳定剂。海藻糖独特的功能特性还能在食品加工领域大显身手，如对酸和热的高度稳定性、防止淀粉老化和蛋白质变形、抑制脂肪酸败、矫味矫臭功能、低吸湿度、低甜度、非致龋性等。近年来还在动物实验中发现了海藻糖具有防治骨质疏松症、亨廷顿舞蹈症等作用，扩大了海藻糖的应用范围。

海藻糖的生产，由最初的天然微生物中提取，到酶法生产，价格从1000美元/kg降到现在10美元/kg以下。海藻糖价格的降低大大扩大了海藻糖的应用范围，可使其广泛应用于医药食品等行业，也加快了海藻糖的应用开发研究。目前海藻糖的酶法生产主要可分为五种途径。第一条途径是磷酸海藻糖合成酶/磷酸海藻糖磷酸酶途径（TPS/TPP Pathway），尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-磷酸葡萄糖（G6P）在 6-磷酸海藻糖合成酶（EC 2.4.1.15，Trehalose 6-Phosphate synthase，TPS）催化下合成 6-磷酸海藻糖（T6P），而后者在 6-磷酸海藻糖磷酸酶（EC3.1.3.12，Trehalose 6-Phosphate Phosphatase，TPP）作用下生成海藻糖。第二条途径是麦芽寡糖基海藻糖途径（TreY/TreZ Pathway），该途径是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶（EC5.4.99.15, Maltooligosyltrehalose synthase，MTSase，treY 基因编码）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（EC3.2.1.141, Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase，treZ 基因编码）催化完成。反应的主要过程是麦芽糊精还原端两个葡萄糖间的α,α-1,4 糖苷键在MTSase 的催化下转变成α,α-1,1糖苷键，成为麦芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)，然后在MTHase的催化下水解释放出一分子海藻糖，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的麦芽寡糖，并可作为新一轮反应的底物。第三条途径是海藻糖合成酶途径（TS Pathway）。该途径是由海藻糖合成酶（EC5.4.99.16, Trehalose synthase,TS 基因编码）催化完成的，反应通过分子内转糖苷作用，将α,α-1,4 键连接的麦芽糖转化为α,α-1,1 键连接的海藻糖，反应是可逆的，但倾向于生成海藻糖的方向进行。第四条途径是海藻糖磷酸化酶途径（TreP Pathway）。该途径由一种新的海藻糖合成酶(Trehalose synthase，TSase)催化 D-葡萄糖与 1-磷酸葡萄糖合成海藻糖。这种酶实际上是一种海藻糖磷酸化酶（EC2.4.1.64，trehalose phosphorylase，TreP），因为它也可以催化上述反应的逆反应，即通过磷酸化作用分解海藻糖。第五条途径是海藻糖转糖苷合成酶（TreT Pathway）。海藻糖转糖苷合成酶（Trehalose glycosyl- transferring synthase，TreT），它可以催化 ADP-葡萄糖和葡萄糖分子之间的转糖苷反应，从而生成 ADP 和海藻糖。该反应是可逆反应，但平衡倾向于海藻糖生成方向。

这五种途径中，第一、第四和第五种途径需要昂贵的底物来生产海藻糖，生产成本高；第二种途径和第三种途径虽然都是以廉价的麦芽糊精或麦芽糖为底物，但是第二种途径需要两种酶，需考虑到两种酶的生产设备和生产工艺，而第三种途径只需要一种酶，生产工艺简单，具有较强的市场竞争力。

目前，已有关于海藻糖合成相关基因的克隆和分离，这些基因来源都不同，或者合成路径不同，使得获得的酶的DNA和氨基酸序列相差甚远，酶的转化效率也不尽相同。已有酶转化时间长和酶活力较低，使得发酵成本很高，生产效率低下。所以构建发酵周期短，酶活力高的基因工程菌对于海藻糖生产具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海藻糖合成酶。

本发明的另一目的在于提供一种海藻糖合成酶的编码基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

本发明的又一目的在于提供上述海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种海藻糖合成酶及其编码基因在制备海藻糖中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种制备海藻糖的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的海藻糖合成酶，其氨基酸序列的编码基因克隆自嗜氯节杆菌 (Arthrobacter Chlorophenolicus SK33.001) ，命名为ACTS。具有下述核苷酸序列之一：

（1）序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

（2）编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的多核苷酸。

本发明是通过研究海藻糖合成酶相关基因的保守片段，然后设计相关的PCR引物从嗜氯节杆菌中克隆得到海藻糖合成酶的编码基因。所采用的实验方法包括聚合酶链式反应(PCR)技术；DNA的提取、酶切、连接等常规的分子生物学技术，以嗜氯节杆菌总DNA为模版，扩增出一段可能为海藻糖合成酶编码基因的DNA序列(ACTS), 把这一段DNA序列连接到表达载体如pET-28a等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定基因的功能和酶学性质。这一段DNA序列片段与前人所发现的海藻糖合成酶在基因来源、DNA和氨基酸序列大小、酶的分子大小、酶的最适反应温度和最适pH等方面都不同。目前尚无检索到公开的文献和专利等关于从嗜氯节杆菌克隆得到海藻糖合成酶基因的报道，或者是关于利用嗜氯节杆菌制备海藻糖的报道，因此可判断本发明属于一种新的发明。

从嗜氯节杆菌中得到的海藻糖合成酶具有以下特征：

1、该海藻糖合成酶的编码基因长度为1797bp，编码599个氨基酸，分子量约为66 kDa;

2、该海藻糖合成酶的最适反应温度为30℃，适合反应温度范围为 20～40 ℃；

3、该海藻糖合成酶的最适反应pH为7.5，适合反应pH为6.0～7.5；

4、二价金属离子的浓度在1mM时，Ca²⁺和Mg²⁺对酶活性有一定促进作用，而Al³⁺ 的存在严重抑制了酶的活性，其他金属离子Zn²⁺, Co²⁺, Ba²⁺, Ni²⁺和Fe²⁺对酶活性有微小的抑制作用。当金属离子的浓度为10mM时，几乎所有的金属离子对酶的活性都起到了极大的抑制作用。

上述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。所述的重组表达载体为将上述的海藻糖合成酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达海藻糖合成酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-28a载体。所述的转基因重组菌是将上述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达海藻糖合成酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述的海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。

上述的海藻糖合成酶及其编码基因在制备海藻糖中的应用。

一种表达海藻糖合成酶的方法，是培养上述的转基因重组菌得到海藻糖合成酶。

一种制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用上述的海藻糖合成酶进行催化反应，得到海藻糖；所述的最适温度为30℃，最适pH为7.5，反应底物浓度为100mM（30g／100mL）。

本发明的有益效果：本发明所述的海藻糖合成酶是以麦芽糖为底物，用海藻糖合成酶转化麦芽糖生成海藻糖，反应速度快，以最优选浓度为100mM的麦芽糖为反应底物，在最佳的反应条件下反应6个小时就可以使底物转化率达到60%，反应速度快，从而可以减少设备的占用率和提高生产效率，有利于降低生产成本。

本发明所述的海藻糖合成酶在天然的嗜氯节杆菌中含量非常低，很难检测到酶的活力，无法直接用天然的嗜氯节杆菌得到的海藻糖合成酶来进行海藻糖的生产，应用基因工程菌来表达本发明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力提高数千倍，有助于应用于海藻糖的生产。

附图说明

图1是重组菌BL21(DE3)诱导表达海藻糖合成酶(ACTS)的SDS-PAGE电泳图。1、ACTS片段大小；M、DNA marker。

图2是pH对酶活力的影响曲线图。

图3是温度对酶活力的影响曲线图。

图4是反应时间对产物中各种糖含量影响曲线图。

图5是金属离子对酶活力的影响曲线图。

具体实施方法

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1: 嗜氯节杆菌的培养

将嗜氯节杆菌(Arthrobacter Chlorophenolicus SK33.001, 菌株编号：M 2013387, 中国微生物菌种保藏中心，CCTCC) 接种于以下液体培养基(g/L)：蛋白胨(peptone) 10，牛肉浸取物(beef extract) 3，氯化钠(NaCl) 5，琼脂15，蒸馏水1L，pH7.0，然后在30℃ 200rpm恒温摇床上振荡24h，于6000rpm离心2min收集菌体用于总DNA的提取。

实施例2: 嗜氯节杆菌海藻糖合成酶基因的克隆与表达载体构建

根据嗜氯节杆菌可能存在的海藻糖合成酶基因(ACTS)核苷酸序列，设计相应引物扩增该ACTS基因并连接到表达载体pET-28a上，然后导入大肠杆菌进行表达。

设计引物如下：

上游引物：5’-GGAATTCCATATGATTTTCA ATCCGCAAAG TTCCGGCC-3’

下游引物：5’-CCGGAATTCT TAATTCTCTA TCGACAGGAT GGGCAGT-3’

上下游引物的5’端分别设计了NdeI 及EcoRI（下划线标出）酶切位点用于连接到表达载体pET-28a，用设计好的引物扩增可能为海藻糖合成酶基因的DNA序列ACTS（将PCR扩增产物进行电泳检测，电泳结果如图1，第1泳道所示）, 扩增产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，然后利用NdeI 和EcoRI进行双酶切，与同样利用NdeI和EcoRI进行双酶切的表达载体pET-28a进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选验证得到表达重组质粒pET-28a-ACTS。同时，将重组质粒送到上海生物工程技术服务有限公司进行测序分析，经测序结果为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

实施例3：ACTS在大肠杆菌中表达及粗酶的制备

把构建的表达重组质粒pET-28a-ACTS转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞中，挑取转化子于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃200rpm摇床中培养，当OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG使其终浓度达到1mM，在20℃下继续培养12h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用细胞悬浮缓冲液洗涤菌体两次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破壁，破壁至菌液澄清，10,000 r/min离心15min收集上清，所收集的上清液即为海藻糖合成酶的粗酶液，对海藻糖合成酶的粗酶液进行SDS-PAGE分析，可用于转化麦芽糖的实验。

实施例4：嗜氯节杆菌海藻糖合成酶转化麦芽糖产物的分析

利用高效液相色谱仪（HPLC）来进行海藻糖合成酶转化麦芽糖后的产物分析，色谱柱为Spherisorb NH₂，5 μm, 4.6×250 mm，Waters，USA；流动相为76%乙腈，24%水。

（1）最适反应pH分析：

分别用pH为4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9的缓冲液（pH 4-5.5为醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 6-8为磷酸缓冲液，pH8.5-9为甘氨酸缓冲液）配置100 mM的麦芽糖溶液，然后分别取100μL加入10μL的实施例3中制备的粗酶液，分别在30℃反应1h，然后用HPLC分析反应的产物组分，以生成海藻糖的含量来表示酶活力的大小，结果见图2。结果表明海藻糖合成酶的适于反应的pH为 6-7.5，海藻糖合成酶在pH 5-7.5之间都表现出较高的稳定性，在pH为7.5时具有最高酶活。

（2）最适反应温度：

取100μL，pH 7.5的100mM麦芽糖底物加入10μL酶液，然后分别在10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃和70℃不同的反应温度下反应1h，然后用HPLC分析反应的产物组分，以生成海藻糖的含量来表示酶活力的大小，结果见图3。结果表明海藻糖合成酶的适于反应的温度范围为20～40℃，在10～40℃之间海藻糖合成酶表现出较高的热稳定性，在30℃时海藻糖合成酶具有最高酶活。

（3）不同反应时间，产物中各种糖含量变化：

取100μL，pH 7.5的100mM麦芽糖底物加入10μL酶液，在pH 7.5和最适温度30℃的条件下反应，测定反应体系中各种糖的含量，结果如图4。结果表明在反应6h后，海藻糖含量达到最大值。继续延长反应时间，海藻糖含量并未继续增加或增加量甚微，而副产物葡萄糖含量明显升高，所以最适的反应时间在6h左右。

（4）金属离子对酶活的影响

取100μL，pH 7.5的100mM麦芽糖底物加入10μL酶液再加入10μL金属离子，使金属离子在反应液的终浓度达到1mM或10mM，在30℃下反应1h，然后测定反应体系中海藻糖的含量来反映酶活力的变化；取100μL，pH 7.5的100mM麦芽糖底物加入10μL酶液再加入10 μL pH7.5 的磷酸盐缓冲液作为空白对照，以空白对照的酶活力为100%，结果见图5。表明二价金属离子的浓度在1mM时，Ca²⁺和Mg²⁺对酶活性有一定促进作用，而Al³⁺ 的存在严重抑制了酶的活性，其他金属离子Zn²⁺, Co²⁺, Ba²⁺, Ni²⁺和Fe²⁺对酶活性有微小的抑制作用。当金属离子的浓度为10mM时，几乎所有的金属离子对酶的活性都起到了极大的抑制作用。

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 1797

<212> DNA

<213> 嗜氯节杆菌 (ArthrobacterChlorophenolicusSK33.001)

<400> 1

Gtgattttca atccgcaaag ttccggccag catttcacgc ccaaaagcac gtttgagctg 60

aatgctccgg gtctccagca cgatccgctg tggtaccgga aagccgtttt ctacgaggtg 120

ctggtacggg cctttgcgga tgccaacggt gacgggtccg gggatttctc cggcctcatc 180

gacaggctgg actatctcca gtggctgggc gtggattgcc tgtggttgcc gccgttcttc 240

cagtcacccc tgcgggacgg cggctacgac atctcggact acaactccgt cctggacgag 300

ttcgggacca tcagcgactt caagcggctg gtggccgagg cacatgcccg gggagtgcgg 360

gtgattatcg acctgccgct gaaccacacc tcggaccagc atccgtggtt ccaggaatca 420

cgcaaggatc ccgacgggcc ctacggcgat ttctacgtct ggagcgacac cgacgaaaag 480

taccaggatg cccgcatcat cttcgttgac accgaggagt caaactggac gttcgatccc 540

atccgccggc aattcttttg gcaccgtttc ttcagccacc agccggacct gaactttgag 600

aatcccaagg tcatcgaggc gctctttgac gtagtgcggt tctggttgga ccagggcatc 660

gacgggttcc gcgctgacgc catcccctac ctgttcgaag aggaagggac caactgcgaa 720

aaccttccgg ccacccatga tttcctgcgg aagctgcgcg ccatggtgga cgaaagctac 780

cccggccgcg tcatcatcgc cgaggcaaac cagccgccca acgaggtcgt ggagtacttc 840

ggaaccgagg aggaaccgga gtgccacatg gcattccact tcccgatcat gccgcggctc 900

tactatgcgc tccgggacca gaaggccgcg cccatcatcg agaccatgcg cgacaccccg 960

gacattccgg acggagccca gtggggcact ttcctgcgca accacgatga actgacgctc 1020

gaaatggtca ccgctgacga acgcgccgcg atgctcggct ggtatgcccc ggacccgcgc 1080

atgcgggcca acatcggtat ccgccgccgg ctggctccgt tgctggacaa ctcacgggct 1140

gagattgagc tgatcaacgc cctgctgctg tccctgccgg gcagcccgtt cctgtactac 1200

ggggacgaaa tcggcatggg ggacaacatc tggctcgagg accgtgacgc agtccgcaca 1260

ccgatgcaat ggaaccctga ccgcaacgcg ggcttctcgc acgcggaccc gggaaagctc 1320

tacctgccgc ccatccagtc gctggtctac aactacagca tggccaacgt ggaggccgag 1380

tccgcacact ccggatcgct gcttcgctgg acccgccaga tcctcagcgt ccgaaggaac 1440

cacccggcat ttggccttgg cgccttcaaa cacgtcgaag ccgaccacga cgccgtcctg 1500

gcctacctcc gggaactgcc ggagggtaat tccgcaggat tgaacggcga aacggtcctc 1560

tgcgctttca acctctcgca gcatcccgtg gccgcgacgc tgcgggttcc cgaatacgcc 1620

ggccggggac tgcgtgatgt cttcggtggc caggtcttcc cggggatcaa cgacgacggt 1680

acgttgacgc tgactctcgg cagccacgat ttcttctggc tccggctccg gtcggcgacg 1740

tccaatccgt cgtcgcccta tacacaggca ctgcccatcc tgtcgataga gaattga 1797

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 598

<212> PRT

<213> 海藻糖合成酶

<400> 2

Val Ile Phe Asn Pro Gln Ser Ser Gly Gln His Phe Thr Pro Lys

5 10 15

Ser Thr Phe Glu Leu Asn Ala Pro Gly Leu Gln His Asp Pro Leu

20 25 30

Trp Tyr Arg Lys Ala Val Phe Tyr Glu Val Leu Val Arg Ala Phe

35 40 45

Ala Asp Ala Asn Gly Asp Gly Ser Gly Asp Phe Ser Gly Leu Ile

50 55 60

Asp Arg Leu Asp Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Val Asp Cys Leu Trp

65 70 75

Leu Pro Pro Phe Phe Gln Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp

80 85 90

Ile Ser Asp Tyr Asn Ser Val Leu Asp Glu Phe Gly Thr Ile Ser

95 100 105

Asp Phe Lys Arg Leu Val Ala Glu Ala His Ala Arg Gly Val Arg

110 115 120

Val Ile Ile Asp Leu Pro Leu Asn His Thr Ser Asp Gln His Pro

125 130 135

Trp Phe Gln Glu Ser Arg Lys Asp Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Asp

140 145 150

Phe Tyr Val Trp Ser Asp Thr Asp Glu Lys Tyr Gln Asp Ala Arg

155 160 165

Ile Ile Phe Val Asp Thr Glu Glu Ser Asn Trp Thr Phe Asp Pro

170 175 180

Ile Arg Arg Gln Phe Phe Trp His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro

185 190 195

Asp Leu Asn Phe Glu Asn Pro Lys Val Ile Glu Ala Leu Phe Asp

200 205 210

Val Val Arg Phe Trp Leu Asp Gln Gly Ile Asp Gly Phe Arg Ala

215 220 225

Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Phe Glu Glu Glu Gly Thr Asn Cys Glu

230 235 240

Asn Leu Pro Ala Thr His Asp Phe Leu Arg Lys Leu Arg Ala Met

245 250 255

Val Asp Glu Ser Tyr Pro Gly Arg Val Ile Ile Ala Glu Ala Asn

260 265 270

Gln Pro Pro Asn Glu Val Val Glu Tyr Phe Gly Thr Glu Glu Glu

275 280 285

Pro Glu Cys His Met Ala Phe His Phe Pro Ile Met Pro Arg Leu

290 295 300

Tyr Tyr Ala Leu Arg Asp Gln Lys Ala Ala Pro Ile Ile Glu Thr

305 310 315

Met Arg Asp Thr Pro Asp Ile Pro Asp Gly Ala Gln Trp Gly Thr

320 325 330

Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Thr Ala

335 340 345

Asp Glu Arg Ala Ala Met Leu Gly Trp Tyr Ala Pro Asp Pro Arg

350 355 360

Met Arg Ala Asn Ile Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu

365 370 375

Asp Asn Ser Arg Ala Glu Ile Glu Leu Ile Asn Ala Leu Leu Leu

380 385 390

Ser Leu Pro Gly Ser Pro Phe Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly

395 400 405

Met Gly Asp Asn Ile Trp Leu Glu Asp Arg Asp Ala Val Arg Thr

410 415 420

Pro Met Gln Trp Asn Pro Asp Arg Asn Ala Gly Phe Ser His Ala

425 430 435

Asp Pro Gly Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Ile Gln Ser Leu Val Tyr

440 445 450

Asn Tyr Ser Met Ala Asn Val Glu Ala Glu Ser Ala His Ser Gly

455 460 465

Ser Leu Leu Arg Trp Thr Arg Gln Ile Leu Ser Val Arg Arg Asn

470 475 480

His Pro Ala Phe Gly Leu Gly Ala Phe Lys His Val Glu Ala Asp

485 490 495

His Asp Ala Val Leu Ala Tyr Leu Arg Glu Leu Pro Glu Gly Asn

500 505 510

Ser Ala Gly Leu Asn Gly Glu Thr Val Leu Cys Ala Phe Asn Leu

515 520 525

Ser Gln His Pro Val Ala Ala Thr Leu Arg Val Pro Glu Tyr Ala

530 535 540

Gly Arg Gly Leu Arg Asp Val Phe Gly Gly Gln Val Phe Pro Gly

545 550 555

Ile Asn Asp Asp Gly Thr Leu Thr Leu Thr Leu Gly Ser His Asp

560 565 570

Phe Phe Trp Leu Arg Leu Arg Ser Ala Thr Ser Asn Pro Ser Ser

575 580 585

Pro Tyr Thr Gln Ala Leu Pro Ile Leu Ser Ile Glu Asn

590 595 598

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

Ggaattccat atgattttca atccgcaaag ttccggcc 38

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

Ccggaattct taattctcta tcgacaggat gggcagt 37

Claims

1.一种海藻糖合成酶，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的海藻糖合成酶的编码基因，其特征在于：所述的海藻糖合成酶的编码基因从嗜氯节杆菌（Arthrobacter Chlorophenolicus SK33.001）克隆得到，具有下述核苷酸序列之一：

（1）序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

（2）编码序列表中SEQ ID NO.2 氨基酸序列的多核苷酸。

3.含有权利要求2所述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体为将权利要求2所述的海藻糖合成酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达海藻糖合成酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-28a载体。

5.根据权利要求3所述的转基因重组菌，其特征在于所述的转基因重组菌是将权利要求4所述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达海藻糖合成酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.权利要求2说述的海藻糖合成酶编码基因的应用，其特征在于在表达海藻糖合成酶中的应用。

7.权利要求1所述的海藻糖合成酶的应用，其特征在于在制备海藻糖中的应用。

8.一种表达权利要求1所述的海藻糖合成酶的方法，其特征在于是培养权利要求3或5所述的转基因重组菌得到海藻糖合成酶。

9.一种制备海藻糖的方法，其特征在于是以麦芽糖为底物，用权利要求1所述的海藻糖合成酶进行催化反应，得到海藻糖；反应底物麦芽糖浓度为100mM，适合反应温度20～40℃，适合反应pH在6～7.5。

10.根据权利要求9所述的制备海藻糖的方法，其特征在于酶反应的最适反应温度为30℃；最适反应pH为7.5。