CN112708609A

CN112708609A - 壳聚糖酶OUC-CsnPa及其应用

Info

Publication number: CN112708609A
Application number: CN202110196686.6A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 孙建安; 苏海鹏; 刘振; 黄海燕
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2041-02-22
Also published as: CN112708609B

Abstract

本发明公开了壳聚糖酶OUC‑CsnPa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码壳聚糖酶OUC‑CsnPa的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述壳聚糖酶OUC‑CsnPa在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。一种包含壳聚糖酶OUC‑CsnPa的酶制剂。本发明的壳聚糖酶OUC‑CsnPa，作用高乙酰度壳聚糖底物时，可产生更多的带乙酰基壳寡糖，对乙酰基的A单元也展现了相比于一般壳聚糖酶更优的偏好性。本发明的壳聚糖酶OUC‑CsnPa具有优良的酶学性质和特异性，在酶法制备乙酰壳寡糖中具有重要的工业应用价值以及经济价值。

Description

壳聚糖酶OUC-CsnPa及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异性壳聚糖酶OUC-CsnPa，及其在降解壳聚糖、制备壳寡糖中的应用，属于功能酶技术领域。

背景技术

壳聚糖是由β-1，4糖苷键连接的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和氨基葡糖糖(GlcN)的线性聚合物。其中A和D分别代表乙酰化GlcNAc和脱乙酰化GlcN残基。壳寡糖是壳聚糖降解的产物,能被广泛应用于食品、农业、医药、化妆品、保健品等领域。因为其分子质量低,水溶性好,具有许多生理活性,如抗氧化、抗肿瘤、降胆固醇、降血压、降血脂、抗炎、免疫-刺激性以及抑菌等。有研究表明壳寡糖的这些生理活性主要与其聚合度相关，但越来越多的研究显示部分乙酰化的壳寡糖(paCOS)的生物学活性也依赖于A单元的丰度(DA)。而壳聚糖酶对不同乙酰化度的壳聚糖具有不同的偏好性，这就决定了不同壳聚糖酶可生产相比于物理和化学法生产的可定义明确的paCOS混合物。确定的paCOS混合物的生产对于研究结构-功能关系，以及开发合适的高值化产品具有重要意义。因此，通过壳聚糖酶的酶促重复水解制备可控制的和确定组成的paCOS越来越受到关注。

发明内容

针对上述现有技术，为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种乙酰产物定义明确的新型壳聚糖酶——壳聚糖酶OUC-CsnPa。

本发明是通过以下技术方案实现的：

壳聚糖酶OUC-CsnPa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MILLSFTVIA SFSSLSGPSP AKAFAEENGT TVQETVDLNE GDNSNEASTE SLSLTNEEATSQAAVTATDH DANFSPSTLQ FLKANTGLDG EQWDNIMKLV NKPEQDSLKW TEFYGYAEDI GDNRGYTIGIFGATTGGSND TGPDGPDLFK AFDAASGASS PSIAGGLTRA GLKGKMSGSI LKLSDSDSVI KKKIKALQNNEAWREAMWRT FYDTYIKYSV QQAQKRGFNT ALTIGSFVDT ALNQGATGDS GSLEGILSRS GSSTNEKTFMTNFYAKRTLI VDTNDYNQPP NGKNRVKQWS SLLASGETDL KNADAAVIKV TNWEMK。

一种编码上述壳聚糖酶OUC-CsnPa的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

5’-ATGATCCTGCTGAGCTTTACCGTTATTGCAAGTTTTAGTAGCCTGAGTGGTCCGAGTCCGGCCAAAGCATTTGCCGAAGAAAATGGTACAACCGTTCAGGAAACCGTTGATCTGAATGAAGGCGATAATAGCAATGAAGCAAGCACCGAAAGCCTGAGTCTGACCAATGAAGAAGCAACCAGTCAGGCCGCAGTGACCGCCACCGATCATGATGCAAATTTTAGCCCGAGCACCCTGCAGTTTCTGAAAGCCAATACCGGCCTGGATGGTGAACAGTGGGATAATATTATGAAACTGGTTAATAAGCCGGAACAGGATAGCCTGAAATGGACCGAATTTTATGGTTATGCCGAAGATATTGGTGACAATCGCGGTTATACCATTGGCATTTTTGGCGCCACCACCGGCGGTAGTAATGATACCGGCCCGGATGGCCCGGATCTGTTTAAAGCATTTGATGCCGCAAGTGGCGCCAGCAGTCCGAGTATTGCAGGTGGTCTGACCCGTGCCGGTCTGAAAGGTAAAATGAGCGGTAGCATTCTGAAACTGAGCGATAGCGATAGCGTGATTAAGAAAAAGATTAAGGCACTGCAGAATAATGAAGCCTGGCGTGAAGCCATGTGGCGCACCTTTTATGATACCTATATTAAGTATAGCGTGCAGCAGGCCCAGAAACGTGGCTTTAATACCGCACTGACCATTGGTAGTTTTGTTGATACCGCACTGAATCAGGGCGCCACCGGTGACAGCGGTAGCCTGGAAGGTATTCTGAGTCGTAGTGGCAGCAGTACCAATGAAAAAACCTTTATGACCAATTTCTACGCCAAACGTACCCTGATTGTGGATACCAATGATTATAATCAGCCGCCGAATGGCAAAAATCGCGTTAAACAGTGGAGTAGTCTGCTGGCCAGCGGTGAAACCGATCTGAAAAATGCAGATGCAGCCGTGATTAAGGTTACCAATTGGGAAATGAAA-3’。

所述壳聚糖酶OUC-CsnPa在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用；在制备降解壳聚糖/制备壳寡糖的酶制剂中的应用。

进一步地，在降解高乙酰度壳聚糖时，生成更多的带乙酰基壳寡糖。

一种酶制剂，包含有上述壳聚糖酶OUC-CsnPa。该酶制剂在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。

一种降解壳聚糖/制备壳寡糖的方法，采用上述壳聚糖酶OUC-CsnPa降解壳聚糖。优选的，降解条件为：温度50℃，pH＝7。

一种重组工程菌，其基因组中插入有上述编码壳聚糖酶OUC-CsnPa的基因，其能表达壳聚糖酶OUC-CsnPa。该工程菌在制备壳聚糖酶OUC-CsnPa中的应用。

本发明的壳聚糖酶OUC-CsnPa，是一种能够专一性降解不同脱乙酰度壳聚糖生成特定壳寡糖组成的壳聚糖酶，属于GH46家族，在50℃和pH＝7条件下其比酶活达539.95U/mg。可作用乙酰度较高的壳聚糖底物，终产物壳寡糖GlcN-(GlcN)₃聚合度为1-3，作用不同乙酰度的底物，明确定义了乙酰产物的组成。该酶作用高乙酰度壳聚糖底物时，可产生更多的带乙酰基壳寡糖，对乙酰基的A单元也展现了相比于一般壳聚糖酶更优的偏好性。本发明的壳聚糖酶OUC-CsnPa具有优良的酶学性质和特异性，在酶法制备乙酰壳寡糖中具有重要的工业应用价值以及经济价值。目前还未有公开的专利针对壳聚糖酶的产物乙酰组成。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：本发明的壳聚糖酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为粗酶蛋白；2为纯化后的壳聚糖酶蛋白。

图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。

图3：本发明的壳聚糖酶，pH变化对相对酶活的影响示意图。

图4：本发明的壳聚糖酶酶解产物的TLC图。

图5：壳聚糖酶OUC-CsnPa与不同脱乙酰度(DDA 95％、90％、85％、75％)的胶体壳聚糖反应后的ESI-MS检测结果示意图，其中，A、B、C、D分别表示DDA 95％、90％、85％、75％。

图6：本发明的壳聚糖酶酶解乙酰产物的组成。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1 壳聚糖酶基因OUC-CsnPa的克隆

本发明的壳聚糖酶OUC-CsnPa的产酶基因为人工合成序列。发明人挖掘到中国农业大学测序芽孢杆菌Paenibacillus sp.1-18(ID：2579778840)的壳聚糖酶片段，发明人将该基因序列根据宿主大肠杆菌的密码子偏好性，进行了密码子优化，用于在大肠杆菌中进行高效表达。本发明的壳聚糖酶OUC-CsnPa基因包含有978个碱基序列，如SEQ ID NO.2所示，编码326个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。根据进化树比对，发现该壳聚糖酶属于多糖水解酶第46家族(GH46)。

以合成的片段为模板，在壳聚糖酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增OUC-CsnPa基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-GAGTGCGGCCGCAAGCTTTTTCATTTCCCAATTGGTAACC-3’，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：5’-CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCCTGCTGAGCTTTAC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50ul。

PCR的反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸60s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳后回收1000Kb的PCR产物片段。

实施例2 含壳聚糖酶基因的表达载体构建

基因片段与pET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于LB培养基固体平板(含有50μg/mL卡那霉素)上,37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆至含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，在转速为220rpm的37℃摇床培养过夜。将单克隆进行阳性验证后测序，并命名为pET28a-OUC-CsnPa。质粒保存在-20℃备用。

实施例3 含壳聚糖酶基因的重组质粒及工程菌的构建

将实施例2中抽提的质粒转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出，得到重组表达菌株。

实施例4 利用大肠杆菌工程菌制备重组壳聚糖酶

大肠杆菌重组菌株经在5ml LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)中活化后，按1％的接种量接入含有硫酸卡那霉的ZYP-5052自诱导培养基，20℃，200rpm培养48h，表达壳聚糖酶。

发酵结束后，8000g离心10分钟收集菌体后，细胞重悬于50mM pH 8.0的Tirs-HCl缓冲液中，然后于冰水浴中超声破碎30min(200W,3s开，3s关)后8000g再次离心15min收集上清液即为粗酶液。基于His标签融合的蛋白，粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，使用低浓度的10mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)平衡柱子，然后用50mM咪唑溶液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱结合力弱的杂蛋白，80mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，收集此部分的缓冲液洗脱成分,得到纯化的重组壳聚糖酶的溶液。经SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量(图1)，使用Bradford法测定蛋白浓度。结果显示重组蛋白经亲和柱纯化可得电泳纯蛋白,分子量大小约为48KDa。

实施例5 重组壳聚糖酶比酶活测定

壳聚糖酶OUC-CsnPa活性的标准测定方法为：1ml的反应体系中，包含10μL酶液、800μL pH 8的Tris-HCl和190ul的2％的胶体壳聚糖(醋酸溶解)，在50℃下反应15min，取200ul反应样与300μL的DNS试剂混合，并在沸水浴中煮沸10min进行显色，在OD540下检测其吸光度。酶活力定义为在标准条件下每min产生1μM还原糖所需要的酶量。经测定，纯化后的壳聚糖酶活力可达539.95U/mg。

实施例6 测定重组壳聚糖酶的最适反应条件

将实施例4中得到的纯化壳聚糖酶在不同温度和pH下反应，测定温度和pH对酶活力的影响。选取30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的温度，按照实施例5重组壳聚糖酶比酶活测定方法反应15min测定最适温度。在50℃下，选用pH为3.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据壳聚糖酶的酶活力，确定壳聚糖酶的最适pH。以最高酶活力为100％，计算在不同条件下的相对酶活力，结果如图2，图3所示，重组壳聚糖酶的最适反应温度为50℃，最适pH为7。

实施例7 测定重组壳聚糖酶的降解产物

将实施例4中纯化所得壳聚糖酶OUC-CsnPa与0.5％的胶体壳聚糖在50℃下分别孵育不同时间，然后在高效薄层层析板上检测产物。具体为：将样品点在距层析板下沿1cm处，置于展开剂(正丙醇:氨水＝2:1)中展开两次，经显色剂(0.5％茚三酮乙醇溶液)在110℃中显色10min。如图4所示，壳聚糖酶OUC-CsnPa酶解产物为壳单糖(DP1)到壳三糖(DP3)。

实施例8 定义重组壳聚糖酶产物乙酰度组成

将实施例4中纯化所得壳聚糖酶OUC-CsnPa与0.5％的不同脱乙酰度(DDA 95％、90％、85％、75％)的胶体壳聚糖在50℃下反应至完全转化，然后通过ESI-MS检测产物。如图5所示，壳聚糖酶OUC-CsnPa酶解乙酰度更高的底物时，产生更多的乙酰产物。尤其是作用75％脱乙酰度的壳聚糖，有部分甲壳二糖的产生，而已报道的壳聚糖酶(如：CN 111154788A)作用低脱乙酰度底物产生的产物完全没有乙酰寡糖的产生。明确了壳聚糖酶的产物组成(其他壳聚糖酶降解壳聚糖产物组成只明确聚合度，很少有明确产物乙酰度的，因为本壳聚糖酶能够专一降解不同脱乙酰度的底物，所以可以为不同脱乙酰度壳聚糖的降解提供了一种工具，进而明确了作用不同脱乙酰度底物的产物组成)，通过壳聚糖酶OUC-CsnPa作用不同脱乙酰度的底物生产确定组成的产物(图6)。本发明的壳聚糖酶能够专一降解不同脱乙酰度壳聚糖，为不同脱乙酰度壳聚糖的降解提供了一种工具。

实施例9 利用重组壳聚糖酶制备酶制剂

利用实施例4制备的重组壳聚糖酶制备酶制剂：将发酵破碎后的溶液纯化后，用缓冲液置换咪唑，冻干后保存酶粉。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 壳聚糖酶OUC-CsnPa及其应用

<141> 2021-02-22

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 326

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ile Leu Leu Ser Phe Thr Val Ile Ala Ser Phe Ser Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Pro Ser Pro Ala Lys Ala Phe Ala Glu Glu Asn Gly Thr Thr Val

20 25 30

Gln Glu Thr Val Asp Leu Asn Glu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Ala Ser

35 40 45

Thr Glu Ser Leu Ser Leu Thr Asn Glu Glu Ala Thr Ser Gln Ala Ala

50 55 60

Val Thr Ala Thr Asp His Asp Ala Asn Phe Ser Pro Ser Thr Leu Gln

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ala Asn Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gln Trp Asp Asn Ile

85 90 95

Met Lys Leu Val Asn Lys Pro Glu Gln Asp Ser Leu Lys Trp Thr Glu

100 105 110

Phe Tyr Gly Tyr Ala Glu Asp Ile Gly Asp Asn Arg Gly Tyr Thr Ile

115 120 125

Gly Ile Phe Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ser Asn Asp Thr Gly Pro Asp

130 135 140

Gly Pro Asp Leu Phe Lys Ala Phe Asp Ala Ala Ser Gly Ala Ser Ser

145 150 155 160

Pro Ser Ile Ala Gly Gly Leu Thr Arg Ala Gly Leu Lys Gly Lys Met

165 170 175

Ser Gly Ser Ile Leu Lys Leu Ser Asp Ser Asp Ser Val Ile Lys Lys

180 185 190

Lys Ile Lys Ala Leu Gln Asn Asn Glu Ala Trp Arg Glu Ala Met Trp

195 200 205

Arg Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ile Lys Tyr Ser Val Gln Gln Ala Gln

210 215 220

Lys Arg Gly Phe Asn Thr Ala Leu Thr Ile Gly Ser Phe Val Asp Thr

225 230 235 240

Ala Leu Asn Gln Gly Ala Thr Gly Asp Ser Gly Ser Leu Glu Gly Ile

245 250 255

Leu Ser Arg Ser Gly Ser Ser Thr Asn Glu Lys Thr Phe Met Thr Asn

260 265 270

Phe Tyr Ala Lys Arg Thr Leu Ile Val Asp Thr Asn Asp Tyr Asn Gln

275 280 285

Pro Pro Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp Ser Ser Leu Leu Ala

290 295 300

Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Asn Ala Asp Ala Ala Val Ile Lys Val

305 310 315 320

Thr Asn Trp Glu Met Lys

325

<210> 2

<211> 978

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgatcctgc tgagctttac cgttattgca agttttagta gcctgagtgg tccgagtccg 60

gccaaagcat ttgccgaaga aaatggtaca accgttcagg aaaccgttga tctgaatgaa 120

ggcgataata gcaatgaagc aagcaccgaa agcctgagtc tgaccaatga agaagcaacc 180

agtcaggccg cagtgaccgc caccgatcat gatgcaaatt ttagcccgag caccctgcag 240

tttctgaaag ccaataccgg cctggatggt gaacagtggg ataatattat gaaactggtt 300

aataagccgg aacaggatag cctgaaatgg accgaatttt atggttatgc cgaagatatt 360

ggtgacaatc gcggttatac cattggcatt tttggcgcca ccaccggcgg tagtaatgat 420

accggcccgg atggcccgga tctgtttaaa gcatttgatg ccgcaagtgg cgccagcagt 480

ccgagtattg caggtggtct gacccgtgcc ggtctgaaag gtaaaatgag cggtagcatt 540

ctgaaactga gcgatagcga tagcgtgatt aagaaaaaga ttaaggcact gcagaataat 600

gaagcctggc gtgaagccat gtggcgcacc ttttatgata cctatattaa gtatagcgtg 660

cagcaggccc agaaacgtgg ctttaatacc gcactgacca ttggtagttt tgttgatacc 720

gcactgaatc agggcgccac cggtgacagc ggtagcctgg aaggtattct gagtcgtagt 780

ggcagcagta ccaatgaaaa aacctttatg accaatttct acgccaaacg taccctgatt 840

gtggatacca atgattataa tcagccgccg aatggcaaaa atcgcgttaa acagtggagt 900

agtctgctgg ccagcggtga aaccgatctg aaaaatgcag atgcagccgt gattaaggtt 960

accaattggg aaatgaaa 978

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gagtgcggcc gcaagctttt tcatttccca attggtaacc 40

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

caaatgggtc gcggatccat gatcctgctg agctttac 38

Claims

1.壳聚糖酶OUC-CsnPa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-CsnPa的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-CsnPa在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用；在制备降解壳聚糖/制备壳寡糖的酶制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在降解高乙酰度壳聚糖时，生成更多的带乙酰基壳寡糖。

5.一种酶制剂，其特征在于：包含有权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-CsnPa。

6.权利要求5所述的酶制剂在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。

7.一种降解壳聚糖/制备壳寡糖的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-CsnPa降解壳聚糖。

8.根据权利要求7所述的降解壳聚糖/制备壳寡糖的方法，其特征在于：降解条件为：温度50℃，pH＝7。

9.一种重组工程菌，其特征在于：其基因组中插入有权利要求2所述的编码壳聚糖酶OUC-CsnPa的基因，其能表达权利要求1所述的壳聚糖酶OUC-CsnPa。

10.权利要求9所述的重组工程菌在制备壳聚糖酶OUC-CsnPa中的应用。