CN102533801A

CN102533801A - 一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用

Info

Publication number: CN102533801A
Application number: CN2012100086910A
Authority: CN
Inventors: 韦宇拓; 梁甲元; 杜丽琴; 黄英
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2012-07-04

Abstract

一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，该基因克隆自灰色链霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)，它表达的海藻糖合成酶能将麦芽糖转化为海藻糖，该基因的最大特点是转化效率高，反应速度快，在本发明所述的反应条件下转化麦芽糖生成海藻糖的反应产物中海藻糖含量可以达到87％，并且只产生仅为3.8％的葡萄糖，有利于提高底物的转化率，降低生产成本，应用该基因生产的重组海藻糖合成酶能够用市场销售的麦芽糖浆或者淀粉制备的麦芽糖浆为原料来制备海藻糖，这种海藻糖可应用于食品工业、美容化妆品、医药生物制品等领域。

Description

一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体涉及一种来灰色链霉菌的海藻糖合成酶基因，该基因表达的海藻糖合成酶可以用于生产海藻糖。

背景技术

海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1，1糖苷键相连而成的非还原性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化(如脱水、高渗)变化后造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，因此被誉为“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，过去主要是从干酵母中提取，由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用，随着人类社会的发展和进步，希望能将海藻糖应用于日常生活所常用各类食品的鲜味保持与质地改善，更好提高人们的生活和健康水平，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。

目前已经在多种微生物中分离到多种不同类型的海藻糖合成酶及其相关的基因，目前发现的海藻糖合成相关酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途径可以分为三种途径，第一种途径是海藻糖磷酸化酶合成途径，主要由径6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphatesynthase)和6-磷酸海藻糖酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase)组成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脱磷酸后得到海藻糖；第二种途径是麦芽寡糖基海藻糖合成酶合成途径，主要是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen，MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase)组成，先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶以麦芽糊精(Maltodextrin)为底物，通过分子内转糖基作用把麦芽糊精末端的两个葡萄糖分子间的α，α-1，4糖苷键转变成α，α-1，1糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麦芽寡糖基海藻糖在麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下从麦芽寡糖基海藻糖分子上水解下一个海藻糖分子，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的新寡糖，并可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复就可以将麦芽糊精转化成海藻糖；第三种途径是海藻糖合成酶途径，与其它海藻糖合成途径不同是这种途径只有一种酶即海藻糖合成酶(Trehalosesynthase，Tre S)组成，它作用的底物是麦芽糖(Maltose)，通过催化麦芽糖分子内转糖基，将α，α-1，4糖苷键连接的麦芽糖转化为α，α-1，1糖苷键，麦芽糖转变成海藻糖。第一种途径需要用到价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖为底物来生产海藻糖，在生产成本很难产生竞争优势，第二种和第三种途径是以淀粉的水解产物麦芽糊精或者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有很强的竞争优势，第三种途径和第二种途径相比，第三种途径只需要一种酶，因此在利用基因工程菌生产酶时不需构建两种工程菌，在生产过程设备的占用率会更低，而且不需要考虑两种酶的反应条件是否一致，这样可以使生产工艺上会更简单，因而具有更强的竞争优势。

目前已有不少文献和专利报道了海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因的相关酶用于制备海藻糖，但这些海藻糖合成相关酶的合成途径不同，或者菌种来源不同，导致了DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量、酶学特性以及酶对底物的转化率，而且目前都还没有得到工业规模化的应用。

发明内容

本发明目的是提供一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，在转化麦芽糖生成海藻糖时能产生较高的海藻糖及产生较少的葡萄糖，并能避免生产过程中水和原料中金属离子对酶活力的抑制，有利于提高生产工艺的稳定性。

本发明人利用生物信息手段对GenBank中庞大的DNA序列和氨基酸序列资源进行同源性检索分析，对已经完成序列分析的上千种微生物的DNA序列进行大量核酸序列进行分析和对比，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或“推测是某功能蛋白质”的极为有用基因，推测该序列的功能，然后找到候选基因序列然后进行实验的功能鉴定，最终确定基因的功能和性质，其中包括至今为止人们并未发现的海藻糖合成酶基因(treS)，并用这种合成酶基因经过克隆和进行重组表达，再利用重组表达的海藻糖合成酶用于转化麦芽糖生产海藻糖。

本发明人在研究海藻糖合成酶的过程中，对灰色链霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)基因组序列进行同源检索分析，发现这一段尚未有文献报道其功能的DNA序列，这段DNA序列在Genbank中被注释为“假定的海藻糖合成酶基因”(putative trehalosesynthase)。经过分析这段DNA与已经有文献报道的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有较高的同源性，同源性达到75％以上，而其编码的假定的蛋白质的氨基酸序列与已发表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸也有较高同源性，氨基酸同源性达到80％以上，所以很难通过氨基酸序列的对比分析确定其为何种酶，必须要经过具体实验来验证这段基因的功能是属于何种酶。

本发明所述的海藻糖合成酶基因克隆自灰色链霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)，菌株编号为4.1419，该菌种可以从中国微生物保藏中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。

灰色链霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征：

1、分子量约为：66.1kD

2、等电点约为：PI＝4.80

3、酶的最适反应温度为25～35℃

4、酶的反应的pH在6.5～7.5，优选pH为7.0～7.5

5、二价金属离子的浓度在5m mol/L时，除了Cu²⁺对酶活有明显的抑制作用和Zn²⁺有轻微的抑制作用以外，而其它Fe³⁺、K¹⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Ba²⁺对酶活没有抑制作用。

6、在pH7.5和25℃最佳的反应条件下，反应1.5h后产物中海藻糖含量达到最大87.14％，葡萄糖3.84％，麦芽糖8.99％，随着反应时间的增加海藻糖和麦芽糖的含量都会减少，而葡萄糖的含量会增加，但在5个小时变化不大。

本发明人所采用的实验方法，包括众所周知的聚合酶链式反应(PCR)技术；DNA的提取、酶切、连接等DNA分子操作技术，把这一段标记为假定的海藻糖合成酶基因的DNA序列连接到表达载体上，如pET5a、pSE380等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，经过细胞破碎，例如利用溶菌酶、超声波或机械碾磨法等破碎细胞后，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定其功能和酶学特性，证实了这一段“假定蛋白质”编码的是一种特性特征与前人发现的完全不同的海藻糖合成酶。这些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最适反应温度最适pH不同，反应条件的不同以及酶对底物麦芽糖转化为海藻糖比例的差异等特性，因此判定是一种新的发现。

本发明所述的海藻糖合成酶的基因是克隆灰色链霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)，该酶在天然的灰色链霉菌中是一种胞内酶，需要用细胞破碎的方法才能检查到；而且在天然菌中该酶的含量也非常低，需要将培养液浓缩1000倍浓缩以上才能检验到海藻糖合成酶的活力。应用基因工程菌来表达本发明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高数千倍，可以用于海藻糖的生产。

编码本发明所述的海藻糖合成酶的基因(treS)是一段未确定功能的DNA片段，长度为1698个碱基对，编码569个氨基酸，GC含量为65.85％。

本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势：

1.同样具有转化麦芽糖生成海藻糖的功能，但具有较小的分子量只有568个氨基酸，与日本林原研究所专利报道的来自Pimerlobacter sp.R48的海藻糖合成酶的625个氨基酸相比，本发明的海藻糖合成酶的氨基酸个数少了57个，比同样是林原研究所报道的来自水栖嗜热菌Thermus aquaticus的海藻糖合酶的964少了395个氨基酸，与中国专利ZL204410013007.3报道的Thermobifida fusca海藻糖合成酶的611个氨基酸相比少了43个氨基酸，小分子的蛋白质酶更容易地通过基因重组与表达技术来进行工业化生产重组酶，因而更有市场竞争力。

2.转化麦芽糖生成海藻糖时能产生较高的海藻糖及产生较少的葡萄糖，目前报道的海藻合成酶基因在转化麦芽糖，随着反应温度的提高，会产生较多葡萄糖副产物，大多会产生10-30％的葡萄糖，反应产物海藻糖糖的含量一般在65％左右，而本发明的海藻糖合成酶与已经报道的海藻糖合成酶相比具有反应产物中海藻糖含量高和较低葡萄糖副产物的特点，反应速度快，在25℃的反应温度时，反应1.5个小时海藻糖含量可以达到87.14％以上，而葡萄糖含量约为3.84％，麦芽糖为8.99％，这是目前文献公开报道海藻产量最高的海藻糖合成酶，这就有利于提干底物的转化效率获得更高的海藻糖，从而可以降低生产成本，更具有市场竞争力。

3.本发明的海藻糖合成酶除了Cu²⁺对酶活力有明显的抑制作用外，而其它金属离子Zn²⁺、Fe³⁺、K¹⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Ba²⁺对酶活都没有明显的抑制作用，这可以降低酶在生产中对水和淀粉麦芽糖糖浆纯度的要求，避免生产过程中水和原料中金属离子对酶活力的抑制，有利于提高生产工艺的稳定性。

附图说明

图1是pH对酶活力的影响曲线图。

图2是温度对酶活力的影响曲线图。

图3是金属离子对酶活力的影响曲线图。

图4是反应1.5h的HPLC分析结果图。

图5为不同时间对产物中各种糖含量的影响曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容，有些对本领域专业人员来说显而易见的扩展内容虽然并未在本说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。

1.灰色链霉菌的培养

灰色链霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)菌株编号为4.1419，从中国微生物保藏中心购买，接种于以下培养基(克/升)：葡萄糖4.0克，酵母提取物10克，麦芽提取物10克L，用KOH调pH至7.2，然后在25～30℃恒温摇床上振荡48小时，用于总DNA的提取。

2.灰色链霉菌海藻糖合成酶基因(treS)的克隆、表达及粗酶的制备

根据Genbank中公布的灰色链霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)基因序列中注释为可能为海藻糖合成酶基因的序列，命名为Sgu，设计相应引物扩增该基因并连接到表达载体上然后导入大肠杆菌进行表达，设计引物如下：

上游引物(Sense primer)：5′-CTCCATGGTCGTCAATGAGCCTGCAC-3′

下游引物(Antisense Primer)：5′-TCAAGCTTTCAGGCGGGCGGCGCGTC-3′

上下游引物的5′端分别设计了的Nco1和Hind III酶切位点用于连接到表达载体pSE380上，用设计好的引物扩增可能为海藻糖合成酶基因的序列的DNA序列Sgu，扩增产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，然后利用Nco1和Hind III进行双酶切，与同样利用Nco1和Hind III进行双酶切的表达载体pSE380进行连接，然后经过筛选验证得到Sgu基因的表达重组质粒pSE380-Sgu。

把重组的表达质粒pSE380-Sgu转化到大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞中，挑取转化子于LB液体培养基中，在37℃摇床中培养，当OD600达到0.8左右时，加入IPTG使其终浓度达到0.5mmol/L，继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为粗酶液，可用于转化麦芽糖的试验。

3.灰色链霉菌海藻糖合成酶转化麦芽糖产物的分析

利用高效液相色谱仪(HPLC)来进行海藻糖合成酶转化麦芽糖后的产物分析，分析条件，色谱柱：Alltima Amino 100A 5u柱(4.6mm×250mm)；检测器：Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器；流动相：70％乙腈/30％H₂O；流速：1mL/min，柱温：35℃。

(1)最适反应pH值的分析

分别取96μL用分别取96μL分别用pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的磷酸盐缓冲液配制10％的麦芽糖底物加4μL的酶液(32ug)，分别在25℃反应1h，然后用HPLC分析反应的产物组分，结果见图1。结果表明海藻糖酶的活力在pH6～8.5都能维持较高的活力，其中在pH7.5时活力最高。

(2)最适反应温度测定：

取96μL pH7.0的10％麦芽糖底物+4μL酶液(32ug)，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃不同的反应温下保温反应1小时，然后用HPLC分析反应的产物组分，结果见图2。结果表明反应温度在25～35℃反应产物中的海藻糖含量在70％以上，在25℃的反应温度时反应产物中的海藻糖含量最高可达80％以上，但是在40℃酶活迅速失活。

(3)金属离子对酶活的影响：

取96μL pH7.0的10％麦芽糖底物+酶液4μL(32ug)+10μL金属离子，使金属离子终浓度为5mmol/L，在25℃下反应1h，按底物的消耗量来反映酶活的变化，以加磷酸盐缓冲液的酶活力为100％，结果见图3。结果表明除了Cu²⁺对酶活有明显的抑制作用和Zn²⁺有轻微的抑制作用以外，而其它Fe³⁺、K¹⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Ba²⁺对酶活没有抑制作用。

(4)不同反应时间，产物中各种糖含量变化：

取96μL pH7.0的10％麦芽糖底物+4ul酶液(32ug)，在pH7.0和25℃的条件下反应不同的时间，然后测定反应中各种糖的含量，结果表明反应1.5h后海藻糖含量最大87.14％，葡萄糖含量很低仅为3.87％，麦芽糖8.99％，HPLC分析见图4。随着反应时间的增加海藻糖和麦芽糖的含量都会减少，而葡萄糖的含量会增加，但在5个小时变化不大，反应产物各种糖含量随着时间的变化结果见图5。

4.从麦芽糖浆制备海藻糖

取市售以淀粉制备麦芽糖含量为70％的麦芽糖浆，用5mol/L，pH为7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液配制成含30％麦芽糖的反应底物，取100升配制好的反应底物放置于不锈钢反应罐中，取上述第2步方法制得的海藻糖合成酶粗酶液10升，加入到100升含30％麦芽糖的反应底物中，然后在25℃条件下反应24小时，然后用HPLC测定反应产物海藻糖的含量。

反应24小时后HPLC分析反应产物的海藻糖含量为21.3％，这表明在110升的总反应体积中共形成了约110升×21.3％＝23.43千克的海藻糖，麦芽糖的转化率为23.43千克/30千克＝78.10％，也就是说100升含30千克麦芽糖的麦芽糖浆经过酶的转化可以制备23.43千克的海藻糖，海藻糖得率为78.1％。

5.从淀粉制备海藻糖

将市场销售干物质含量为80％的商品淀粉40千克用5mmol/L的pH为7.0磷酸盐缓冲液调成100升的淀粉乳，加入耐高温α-淀粉保持温度90℃，液化至达到碘色后，再保温0.5～1小时至DE值为10～12％，在110℃保温15分钟灭活淀粉酶活力，然后立即冷却至50℃后加入适量的β-淀粉酶和普鲁兰酶，在50℃保温24个小时后测定糖化产物的麦芽糖含量不再增加时，立即冷却至25℃加入制得的海藻糖合成酶粗酶液10升，在25℃保温24个小时后测定用HPLC分析反应产物的海藻糖的含量。

反应24小时后HPLC分析反应产物的海藻糖含量为20.70％，结果表明海藻糖的产量110升×20.70％＝22.77千克，从淀粉制备海藻糖的得率为27.77千克/40千克＝56.9％，也就是40千克干物质含量为80％的商品淀粉经过酶解可以制备22.7千克的海藻糖，淀粉制备海藻糖得率为56.9％，按干物质计算得率为71.16％。

Claims

1.一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因所编码的海藻糖合成酶，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求2所述的海藻糖合成酶在从麦芽糖制备海藻糖中的应用，其特征在于，1)将海藻糖合成酶基因构建基因工程菌进行藻糖合成酶的高效表达；2)收集制备重组海藻糖合成酶；3)以麦芽糖或者淀粉制备的麦芽糖浆为原料用海藻糖合成酶制造海藻糖。