CN103113425A - 一种海藻糖和葡萄糖的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于制糖工业技术领域，公开了一种海藻糖和葡萄糖的分离方法。该方法利用纳米金作催化剂，海藻糖与葡萄糖混合液为底物,纳米金催化混合液中的葡萄糖生成葡萄糖酸，再通过色谱方法将葡萄糖酸与海藻糖分离开来。通过纳米金催化葡萄糖生成葡萄糖酸，将海藻糖与葡萄糖的糖糖分离转化为海藻糖与葡萄糖酸的糖酸分离，大大提高了分离效率，方法简单快捷，原料来源广泛且成本较低，是一种高效的海藻糖与葡萄糖分离新工艺。
Description
技术领域
本发明属于制糖工业技术领域，特别涉及一种海藻糖和葡萄糖的分离方法。
背景技术
海藻糖（Trehalose）是一种稳定的非还原性双糖,极易溶于水，甜度相当于蔗糖的45％。它由两个吡喃环葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键连结而成，由于两分子葡萄糖的还原基团被用于成键，同时该糖苷键的能量水平较高，因此异常稳定，在酸碱、氧化、高温以及在一般的酶（除少数特异海藻糖酶）作用下均不宜受到破坏。而其作为一种功能性糖类，以其独特的生物保护能力，在食品、生物医药、农业、保健品、化妆品等方面越来越受到人们的重视,具有广阔的市场前景。
目前正在研究和开发的海藻糖制备方法主要有微生物抽提法、发酵法、酶转化法。而从微生物中提取海藻糖成本高，提取源有限，很大程度制约着海藻糖大规模工业化生产。发酵法转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制困难，因而对降低生产成本、促进推广应用等方面很不利。酶转化法生产海藻糖的方法很多，其中方法最简便，最具有工业化前景的途径是海藻糖合成酶一步催化途径，由TreS基因编码的海藻糖合成酶通过分子内转糖基作用把α,α-1,4糖苷键连接的麦芽糖转化为α,α-1,1糖苷键连接的海藻糖。一般工业过程中,海藻糖合成酶反应液所含糖类除生成的海藻糖和未反应的麦芽糖外，还含有葡萄糖、麦芽糖三糖、四糖等杂糖，成分比较复杂，难以分离。因此，一般采用糖化酶处理海藻糖合成酶反应液，将其中的杂糖全部转化为葡萄糖，使最终反应液中只含葡萄糖和海藻糖，再对这两种糖进行分离纯化。
目前工业生产中海藻糖的分离工艺大都采用的是色谱分离技术，其主要步骤包括：海藻糖混合液经过活性炭连续脱色和用H-和OH+型离子交换树脂脱盐后，再通过结合利用两种或多种色谱方法，如离子交换柱色谱和用活性炭或硅胶的柱色谱相结合的柱色谱分级分离，最后利用结晶或重结晶将海藻糖分离结晶出来。
CN1548049A公开了海藻糖的制备及分离方法，具体步骤是：将得到的海藻糖酶反应液按常规方法用活性炭脱色，用离子交换树脂脱盐，并浓缩成含海藻糖29.5%d.s.b、浓度约为60%的溶液，将此溶液加到充填有“CG60000，Na-型”强酸型阳离子交换树脂的不锈钢柱中，在温度为60℃，SV（体积速度）0.4时分级，然后获得含海藻糖约90%d.s.b.的高海藻糖含量级分，再通过浓缩、结晶得到海藻糖晶体。而此法存在着分离效率低，海藻糖纯度不高等问题，难以满足市场需求。
也有根据海藻糖不带可游离的醛基，不具还原性，对酸和热都非常稳定，不被一般酶水解这一特性，利用糖化酶将海藻糖混合液中的其他杂糖水解成葡萄糖，然后利用其他一些手段再将海藻糖与葡萄糖分离开来，达到海藻糖与其他杂糖分离的目的。
CN200610016527.9公开了一种海藻糖的分离纯化方法，具体步骤是：向每克海藻糖酶反应液中加入0.14~0.28个糖化酶单位，在50~60℃、pH3.5~5.5条件下水解6~12h，再向糖化酶酶解液中接种3~10%重量的酿酒酵母，在25~30℃，pH5.5~7.5条件下培养6~16h，钝化后发酵液离心、超滤、离子交换、浓缩、结晶干燥得到海藻糖。但此法周期过长、海藻糖收率不高、后期发酵液中成分比较复杂，分离也有一定难度，不适合工业生产。
纳米金即直径在纳米级（1~100nm）的金粒子，其基本单元都是微小尺寸的粒子，故具有很多宏观粒子所不具备的物理特性，如光学效应、小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应、介电限域效应、久保效应以及一些其他的特殊效应。这些效应使得纳米金粒子广泛应用于材料、医学检验、临床医学、食品、化工、陶瓷、染料等各领域。
长期以来，人们一直认为金是一种化学惰性的金属．因为块状金几乎不产生任何化学吸附而无催化作用。然而，当把它制备成纳米级的超微粒子时，化学惰性的金变成了高活性的催化剂，粒子表面的化学吸附及反应活性随结构明显地发生变化。这首先应归结于纳米结构的3大效应（即小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应）。其中前2种效应的影响是最为突出的，由于表面原子周围缺乏相邻的原子，使得颗粒出现大量的剩余悬键而具有不饱和的性质，即配位数不足，表面活性位增多，和迅速增加的表面能一起构成起催化作用的关键因素；再就是金的6S电子具有很高的稳定性，增加了范德华作用力和金表面的物理吸附能，也导致了纳米金粒子异常的催化性能。
纳米金作为催化剂在催化葡萄糖生成葡萄糖酸上应用，以其优良的选择性和良好的低温活性越来越受到人们的重视，例如CN201110145833.3公开了一种利用纳米金催化葡萄糖生成葡萄糖酸的方法，具体步骤是：将质量百分比浓度为5%的葡萄糖水溶液与纳米金催化剂进行反应，葡萄糖的用量与纳米金的尔比为1000：1~1000：8，反应温度为60℃，常压下，以39mL/min的速率通入氧气，加入0.5mol/L NaOH，使pH值恒定在9.5，转化率最高能达到100%，虽然转化率很高，但此方法的催化剂合成繁琐、反应条件较为苛刻，有待改进。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种廉价、高效的海藻糖和葡萄糖分离方法，以解决目前生产工艺中分离难，成本高等问题。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种海藻糖与葡萄糖的分离方法，以含海藻糖与葡萄糖的混合液为底物,利用纳米金为催化剂，催化所述的混合液中的葡萄糖生成葡萄糖酸，再通过色谱方法或适用于糖酸分离的其他分离手段将葡萄糖酸与海藻糖分离开来。
所述的纳米金的粒径优选13~25nm，进一步优选13~15nm，最优选13nm。
所述的纳米金优选由柠檬酸钠还原氯金酸法制得。
所述的含海藻糖与葡萄糖混合液是酶法转化法制备海藻糖所得到的反应液，或将所得的反应液再经过糖化酶进一步处理得到的催化液。所述的酶法转化法制备海藻糖的底物包括淀粉、淀粉水解物、麦芽糊精、麦芽糖等
其中所述的酶法转化法制备海藻糖所得到的反应液优选包括双酶法（麦芽寡糖基海藻糖合成酶[Maltooligosyl trehalose synthase,(EC.5.4.99.16)]、麦芽寡糖基海藻糖水解酶[Maltooligosyl trehalose synthase,(EC.3.2.1.141)]）催化淀粉生成海藻糖的反应液，或海藻糖合成酶[Trehalose synthase,(EC.5.4.99.15)]催化麦芽糖生成海藻糖的反应液，或其他酶转化法制备海藻糖所得到的反应液。
所述的糖化酶又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)]，它能把淀粉从非还原性未端水解α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，但对海藻糖无任何作用。因此，糖化酶处理后的反应液中只含海藻糖和葡萄糖。
本发明所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法中，纳米金催化剂催化葡萄糖的反应温度为30~70℃，纳米金催化葡萄糖的pH值为4.0~9.0，常压条件下，通气量在200~700mL/min，纳米金催化剂添加量为葡萄糖含量的2~6wt‰。
本发明所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法中，纳米金催化剂催化葡萄糖的反应温度为60~80℃；纳米金催化葡萄糖的pH值为pH6.0~9.0。
本发明所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法中，所述的色谱方法包括离子交换柱色谱或结合模拟移动床的更高效的色谱分离方法，具体操作流程如CN102413890A所述。
有益效果：
本发明中利用纳米金催化剂将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，使海藻糖与葡萄糖的糖糖分离转变成海藻糖与葡萄糖酸的糖酸分离，有利于提高后续的色谱分离效率；本发明制备的纳米金，制备方法简单快捷、原料来源广泛且成本较低、并可重复使用；纳米金催化葡萄糖产葡萄糖酸的催化效率与传统葡萄糖氧化酶催化效率相当，且纳米金与传统葡萄糖氧化酶相比，具有很高的稳定性，对温度和pH没有特殊要求等优点。
附图说明
图1本发明反应原理示意图；
图2本发明中温度对纳米金催化氧化葡萄糖的影响；
图3本发明中pH对纳米金催化氧化葡萄糖的影响；
图4本发明中纳米金催化剂添加量对纳米金催化氧化葡萄糖的影响；
图5本发明中通气量对纳米金催化氧化葡萄糖的影响。
具体实施方式：
实施例1
(1)海藻糖与葡萄糖混合液的制备
以20%麦芽糖为底物，海藻糖合成酶在25℃，pH7.0条件下，催化麦芽糖制备海藻糖与葡萄糖的混合液，海藻糖合成酶酶加量为麦芽糖底物质量的10%，混合液中残留有30%的麦芽糖；再以糖化酶处理上述所得的混合液，糖化酶酶加量为剩余麦芽糖质量的5‰，60℃，pH控制在4.0~5.0，反应5小时后能将其余杂糖全部水解成葡萄糖，使上述混合液中只含有海藻糖和葡萄糖，此时反应液中含75%的海藻糖和25%的葡萄糖。。
(2)纳米金的制备
纳米金采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得。首先，所有玻璃仪器都需要使用王水浸泡以除去玻璃容器中残留的还原性物质。准确称取HAuCl4·4H2O0.0123g于250mL三口烧瓶中，然后三口烧瓶中加入100mL水。剧烈搅拌，加热沸腾回流。准确称取C6H5Na3O7·2H2O0.2849g于25mL容量瓶中。取一定量的柠檬酸钠溶液，水浴加热到50°C后快速加入烧瓶。15min后溶液从无色到浅蓝色再到紫色最后到酒红色，继续加热10min后停止加热，继续搅拌10min后冷却到室温。所得纳米金的粒径为13nm。
(3)葡萄糖酸检测方法：葡萄糖是一种还原糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖的含量。反应液中葡萄糖酸的生产量可以用葡萄糖的减少量表示，进而得出葡萄糖酸的转化率。
(4)纳米金催化反应条件
a.反应温度：
以上述制备的13nm的纳米金催化剂，以步骤(1)所得海藻糖与葡萄糖混合液为底物，反应pH7.0，纳米金催化剂添加量为葡萄糖含量的5‰，常压条件下，通气量为600mL/min，催化温度30~70℃，催化2小时。
温度对纳米金催化氧化葡萄糖的影响见图2，由图2可以发现，纳米金的催化活性随温度的升高而逐渐升高，对温度没有特殊要求，在30~70℃都能催化葡萄糖氧化，其中温度优选60~80℃。
b.反应pH：
以上述制备的13nm的纳米金催化剂，以步骤(1)所得海藻糖与葡萄糖混合液为底物，催化温度70℃，纳米金催化剂添加量为葡萄糖含量的5‰，常压条件下，通气量为600mL/min，反应pH4.0~9.0，催化2小时。
pH对纳米金催化氧化葡萄糖的影响见图3，由图3可以发现，纳米金在不同的pH条件下都能正常反应，说明纳米金催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸对pH没有特殊要求，能在较宽的pH（4.0~9.0）下反应，其中优选pH=6.0~9.0。
c.催化剂添加量：
以上述制备的13nm的纳米金催化剂，以步骤(1)所得海藻糖与葡萄糖混合液为底物，催化温度70℃，反应pH7.0，常压条件下，通气量为600mL/min，纳米金催化剂添加量为葡萄糖含量的2~6wt‰，催化2小时
纳米金催化剂添加量对纳米金催化氧化葡萄糖的影响见图4，由图4可以发现，随着纳米金催化剂添加量的增加，葡萄糖酸的转化率也在不断增加，在纳米金添加量达到5‰以上时，葡萄糖酸转化率逐渐趋于平稳，从节省成本角度考虑，纳米金催化剂添加量优选为5‰。
d.通气量：
以上述制备的13nm的纳米金催化剂，以步骤(1)所得海藻糖与葡萄糖混合液为底物，催化温度70℃，反应pH7.0，纳米金催化剂添加量为5‰，常压条件下，通气量为200~700mL/min，催化2小时。
通气量对纳米金催化氧化葡萄糖的影响见图5，由图5可以发现，纳米金催化剂催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸的转化率随通气量的不断增加而变大，这说明空气流通的增加，提高了氧气含量，而氧气利用率也是有限的，在通气量达到600mL/min时，转化率趋于平稳。因此，通气量优选为600mL/min。
Claims (9)
1.一种海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于以含海藻糖与葡萄糖的混合液为底物,利用纳米金为催化剂，催化所述的混合液中的葡萄糖生成葡萄糖酸，再通过色谱方法或适用于糖酸分离的其他分离手段将葡萄糖酸与海藻糖分离开来。
2.根据权利要求1所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于所述的纳米金的粒径为10~25nm，优选13~15nm。
3.根据权利要求2所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于所述的纳米金由柠檬酸钠还原氯金酸法制得。
4.根据权利要求1所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于所述的含海藻糖与葡萄糖混合液是酶法转化法制备海藻糖所得到的反应液，或将所得的反应液再经过糖化酶进一步处理得到的催化液。
5.根据权利要求4所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于所述的酶法转化法制备海藻糖所得到的反应液包括双酶法催化淀粉生成海藻糖的反应液，或海藻糖合成酶催化麦芽糖生成海藻糖的反应液，或其他酶转化法制备海藻糖所得到的反应液。
6.根据权利要求4所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于所述的糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非还原性未端水解α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，但对海藻糖无任何作用。
7.根据权利要求1所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于纳米金催化剂催化葡萄糖的反应温度为30~70℃，纳米金催化葡萄糖的pH值为4.0~9.0，常压条件下，通气量在200~700mL/min，纳米金催化剂添加量为葡萄糖质量含量的2~6wt‰。
8.根据权利要求1所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于纳米金催化剂催化葡萄糖的反应温度为60~80℃；纳米金催化葡萄糖的pH值为pH6.0~9.0；纳米金催化剂的添加量为5‰；纳米金催化葡萄糖的通气量为600mL/min。
9.根据权利要求1所述的海藻糖与葡萄糖的分离方法，其特征在于所述的色谱方法包括离子交换柱色谱或结合模拟移动床的更高效的色谱分离方法。
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| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
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