CN101100658B - 一种海藻糖合成酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海藻糖合成酶及其应用。该海藻糖合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该海藻糖合成酶可用于催化麦芽糖制备海藻糖。

Description

一种海藻糖合成酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种海藻糖合成酶及其应用。
背景技术
海藻糖(Trehalose)分子是由两个吡喃环葡萄糖以1，1-糖苷键连结而成，分子内不存在游离的半缩羟基，是一种稳定的非还原性二糖。海藻糖有3种光学异构体，其中αβ型(Neotrehalose，新海藻糖)和ββ型(Isotrehalose，异海藻糖)在自然界中很少存在，αα型则是最常见的海藻糖(又称蘑菇糖)，广泛存在于细菌、真菌、藻类、低等植物及昆虫体内。
海藻糖无色无嗅，具有很强的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性，对蛋白质、核酸、细胞膜等活体成分有很强的稳定作用，通常在环境胁迫条件下海藻糖作为一种相容性介质对生物大分子乃至生物体起保护作用。研究表明海藻糖是一种有效的保护剂，可以保护酶、活性蛋白、生物膜、医药产品甚至待移植的器官，因此在生物制品、食品、药品、作物育种及精细化工等领域有着广泛的应用前景。早期的商品化海藻糖主要是从酵母细胞中提取，收率低且成本高，限制了海藻糖的广泛应用。近年来在许多微生物中发现了海藻糖的合成酶系，酶法合成海藻糖正逐步成为海藻糖工业化生产的新途径。
在微生物中海藻糖主要有三种合成途径：
1)OtsA-OtsB途径
该途径以6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为底物，经6-磷酸海藻糖合成酶(OtsA)和6-磷酸海藻糖酯酶(OtsB)两步催化生成海藻糖。
2)TreY-TreZ途径
首先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(TreY)作用于麦芽糊精末端，催化分子内的转糖基化，形成麦芽寡糖基海藻糖。然后在麦芽寡糖基海藻糖水解酶(TreZ)作用下断裂麦芽寡糖和海藻糖间的α-1，4-糖苷键，释放出海藻糖。
3)TreS途径
海藻糖合成酶(TreS)作用于底物麦芽糖，通过分子内转糖基作用，把α，α-1，4糖苷键连接的麦芽糖转化为α，α-1，1糖苷键连接的海藻糖。
在上述三种途径中，TreS途径既不消耗高能物质，也不依赖磷酸，而且底物麦芽糖目前生产技术成熟，价格低廉，与成品海藻糖相比有较大的价格空间。因此，利用海藻糖合成酶以麦芽糖为原料生产海藻糖是一条极有工业化前景的途径。
关于海藻糖合成酶已有专利和文献报道。中国专利200410013006.9公开了一种海藻糖合成酶，在40L发酵罐水平上表达的该酶，以27.27％的麦芽糖为底物，转化时间32h，转化率70％。台湾National Chung Hsing大学Jei-Fu Shaw等报道的一种海藻糖合成酶，目的蛋白占细胞总蛋白的28％，转化率71％，转化时间长达72h。这些文献报道的海藻糖合成酶存在表达量低、催化时间长、底物浓度高等缺点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种海藻糖合成酶及其编码基因。
本发明所提供的海藻糖合成酶，来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，名称为CG-TreS，是如下的蛋白质：
(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
序列表中序列2由598个氨基酸残基组成。
为了使(a)中的CG-TreS便于纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
  标签   残基   序列
  Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR
  Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH
  FLAG   8   DYKDDDDK
  Strep-tagII   8   WSHPQFEK
  c-myc   11   EQKLISEEDL
上述(b)中的CG-TreS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的CG-TreS的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №：1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述海藻糖合成酶的编码基因(CG-TreS)也属于本发明的保护范围。
所述海藻糖合成酶的编码基因，是如下1)或2)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述海藻糖合成酶的DNA分子。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
含有上述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体或转基因细胞系或转基因重细菌均属于本发明的保护范围。
所述转基因重组菌具体可为含有所述海藻糖合成酶编码基因的重组大肠杆菌，如含有所述海藻糖合成酶编码基因的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS。所述重组大肠杆菌优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)PlysScgN-T31-30a27 CGMCC No.2011。
其中，大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011已于2007年04月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号)。
本发明的另一个目的是提供一种表达海藻糖合成酶的方法。
本发明所提供的表达海藻糖合成酶的方法，是培养上述含有海藻糖合成酶CG-TreS编码基因的转基因重组菌，得到海藻糖合成酶。
海藻糖合成酶CG-TreS的分子量为69kDa，酶活性的pH范围为5.0～11.0，最适pH为9.0；酶活性的温度范围为4～45℃，最适反应温度为20℃。
本发明的又一个目的是提供一种制备海藻糖的方法。
本发明所提供的制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用海藻糖合成酶CG-TreS进行催化，得到海藻糖。
所述方法中，反应温度可为4～45℃，反应液的pH可为5.0～11.0；所述反应温度优选为4～20℃，尤其优选为20℃，所述反应液的pH优选为7～10，尤其优选为9.0。
所述方法中，反应时间可为5～25小时，优选为15～20小时，尤其优选为20小时。
本发明的海藻糖合成酶酶活力高，酶活力可达53.0U/mg；本发明表达海藻糖合成酶的方法，表达量高，占细胞可溶性总蛋白的58％；本发明制备海藻糖的方法，海藻糖合成酶催化时间短、所需底物浓度低，以15％(15g/100ml)麦芽糖为底物，催化20小时，转化率达70％。
附图说明
图1为大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011的PCR鉴定图谱
图2为纯化后的重组表达的海藻糖合成酶的SDS-PAGE
图3大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011表达产物的SDS-PAGE分析
图4为温度对CG-TreS活性影响曲线
图5为金属离子对CG-TreS活性影响曲线
图6为海藻糖转化率随时间变化曲线
图7A为标准样品的离子色谱分析图谱
图7B为CG-TreS催化产物的离子色谱分析图谱
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料：
1)菌株和质粒谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC 1.1886购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和表达载体pET-30a(+)为Merck公司产品；pGEM-T Vector为Promega公司产品；大肠杆菌Top10为Invitrogen公司产品。
2)主要试剂Pyrobest DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、X-gal及IPTG均为TaKaRa公司产品；DNA凝胶回收试剂盒购自上海申能博彩公司；Ni-NTA SpinKit购自德国QIAGEN公司；DNA分子量标准DL2000和1Kb DNA Ladder购自天根生化科技有限公司；麦芽糖及海藻糖标准品购自北京化学试剂公司；薄层色谱(TLC)预制板购自Merck公司；其余试剂为国产或进口分析纯。
实施例1、海藻糖合成酶及其编码基因的获得
一、海藻糖合成酶编码基因的获得
1、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)基因组DNA的提取：将活化的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)CGMCC 1.1886菌种转接至营养肉汁液体培养基中(蛋白胨10g/L，牛肉提取物3g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0)，30℃摇床210rpm培养24h。取100mL培养液离心收集菌体，加9.5ml TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％ SDS，50μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀；再加1.5ml 10％CTAB溶液(用0.7mol/LNaCl溶液配制)，混匀，65℃保温20分钟；用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管；用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，上清液加1倍体积异丙醇，沉淀DNA；5000rpm离心10min，去上清，70％乙醇漂洗，吸干，溶解于1mL TE或ddH2O，-20℃保存。
2、PCR扩增海藻糖合成酶编码基因
以步骤1提取的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)CGMCC 1.1886的基因组DNA为模板，用引物CgF和CgR为进行PCR扩增。其中，上游引物CgF：
5’-CCCATATGACTGATACCTCTCCGTTGAA-3’(下划线部分示NdeI识别位点)，下游引物CgR：5’-CGCGGCCGCTTCCATATCGTCCTTTTC-3’(下划线部分示NotI识别位点)。PCR条件为：94℃预变性4min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环后72℃延伸3min。将得到的PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明得到的PCR产物大小约为1800bp。
PCR扩增产物加A后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，与pGEM-T Vector连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10，挑取阳性克隆。进行序列测定，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1的DNA序列(CG-TreS)，编码序列表中序列2的海藻糖合成酶CG-TreS。将含有序列表中序列1的DNA序列的重组载体命名为pGEM-CG-TreS。
二、海藻糖合成酶CG-TreS的表达
1、制备表达海藻糖合成酶CG-TreS的重组菌
分别用NdeI和NotI双酶切pGEM-CG-TreS和pET-30a(+)，将CG-TreS片段连入pET-30a(+)，将该连接产物转化大肠杆菌Top10，挑取阳性克隆，进行PCR测序鉴定和酶切鉴定，得到含有具有序列表中序列1的DNA序列的CG-TreS片段的重组载体pET-CG-TreS。提取pET-CG-TreS，转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，步骤如下：
1)冰上融化-70℃保存的感受态细胞。
2)加入质粒，轻轻旋转混匀，冰浴放置30min。
3)将离心管放入预加温至42℃的水浴中，静止放置90s。
4)快速将离心管转移到冰浴中，冷却1～2min。
5)加400μL LB培养基于转化细胞中。
6)37℃轻柔振荡45～60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。
7)将200μL已转化的感受态细胞转移到含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，用无菌涂布棒轻轻的将菌液涂布均匀。
8)将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12～16h。
通过PCR测序鉴定和酶切鉴定，得到含有重组载体pET-CG-TreS的重组菌-大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011。其中，大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011的PCR鉴定结果如图1所示，表明得到大小约为1800bp的产物。图1中，泳道1为DNA分子量标准DL2000，泳道2为PCR产物。
同时以转入pET-30a(+)的BL21(DE3)pLysS重组菌BL21(DE3)pLysS-30a作为对照。
2、重组菌的诱导表达与海藻酸合成酶的纯化
挑取大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011单菌落接种到LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL，氯霉素34μg/mL)，37℃振荡过夜。按照1％(体积比)的接种量转接至30mL上述LB液体培养基，37℃振荡培养至OD60O为0.6时，加IPTG至终浓度1mmol/L，诱导5h后离心收集菌体。用100mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎(功率250W，工作时间4秒，间歇时间6秒，总时间2.5分钟)，4℃ 10000rpm离心1min后取上清液。上清液采用Ni-NTA SpinKit纯化回收，取纯化的样品进行SDS-PAGE分析。结果表明在69kDa处出现了较明显的单一条带，与理论分子量基本符合(图2)。图2中，泳道1为纯化后的重组海藻糖合成酶，泳道2为纯化前PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011细胞总蛋白，泳道3为低分子量标准。
SDS-PAGE进行凝胶成像扫描结果表明重组海藻糖合成酶占细胞可溶性总蛋白的58％(见图3)。图3中，泳道1为低分子量标准，2为BL21(DE3)pLysS-30a细胞总蛋白，3、4、5为纯化前PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011细胞总蛋白。
酶活力测定：取40μL纯化的海藻糖合成酶酶液，用100mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液稀释至200μL，加等体积的30％(30g/100m)麦芽糖溶液，20℃反应20min，100℃煮沸5min终止反应，12000rpm离心5min，取上清，稀释1000倍用离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。离子色谱为DIONEX 2500，柱子：CarboPac PA-100，流动相：体积比为70∶30的100nmol/L NaOH和500nmol/L NaAC，流速1.0mL/min，进样量10μL。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量。
酶活力单位的定义：在20℃，pH7条件下，1分钟内转化1μmol麦芽糖成为海藻糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。经测定，40μL纯化的蛋白液中含有41.0168μg酶蛋白，反应20min后生成43.475μmol海藻糖，从而得出酶的比活为53.0U/mg。
同时以相同条件培养BL21(DE3)pLysS-30a作为对照，结果表明BL21(DE3)pLysS-30a的菌体破碎上清液无海藻糖合成酶活性。
3、大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011表达的海藻糖合成酶的性质分析
1)海藻糖合成酶CG-TreS最适pH的测定：
分别配制pH 5，6，7，8，9的100mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液，pH10，11，12的100mmol/L K2HPO4-KOH缓冲液。取1.5mL发酵液离心收集菌体，按照步骤2的方法，分别加入100mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液300μL重悬菌体，超声破碎，4℃离心后取上清，分别与用相应缓冲液配制的30％(30g/100ml)麦芽糖溶液等体积混和，37℃振荡反应20h，沸水浴5min终止反应。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。
结果表明酶活性的pH范围为5.0～11.0，特别是在pH 7～10，海藻糖合成酶CG-TreS对底物有60％以上的转化率，说明海藻糖合成酶CG-TreS在中性及偏碱条件下具有较高的活性。酶活性的最适pH为9.0。
2)海藻糖合成酶CG-TreS最适温度的测定：
按照步骤2的方法，取1.5mL发酵液离心收集菌体，加入100mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液300μL重悬菌体，超声破碎，4℃离心后取上清，与等体积的30％(30g/100ml)麦芽糖溶液混和，分别在4℃，20℃，30℃，37℃，45℃振荡反应20h，沸水浴5min终止反应。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。
结果表明酶活性的温度范围为4～45℃，当温度继续升高时，酶活力迅速下降，最适反应温度为20℃(图4)。
温度对重组酶合成酶活的影响主要表现在两方面：一方面当温度升高时，反应速度加快；另一方面随着温度的升高，由于酶是蛋白质，酶逐渐变性而失活，从而引起酶反应速度的下降。酶反应所表现的最适温度是这两种因素综合影响的结果。根据反应的时间，可合理的选择反应的温度。
氨基酸序列分析显示，海藻糖合成酶基因中含有α-淀粉酶的多个保守序列，较高的反应可能导致α-淀粉酶活力升高，把部分底物水解为葡萄糖，从而降低了海藻糖的转化率。
3)金属离子对酶活力的影响：
分别配制100mM的BaCl2·2H2O、CaCl2、CoCl2·6H2O、CuSO4、MgSO4、MnSO4·H2O溶液。按照步骤2的方法，取1.5mL发酵液离心收集菌体，加入去离子水300μL重悬菌体，超声破碎，4℃离心后取上清，与等体积的30％(30g/100mL)麦芽糖溶液混合，再加入上述离子溶液至终浓度1mM和10mM，37℃，pH 7振荡反应20h，沸水浴5min终止反应。以仅含酶液和麦芽糖溶液的混合液作为对照组。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。不同离子浓度下测定的转化率除以对照组的转化率即为相对转化率。
结果表明，1mM的Ba2+、Ca2+、Co2+、Mn2+对酶活影响不大，Mg2+对酶活有促进作用，Cu2+对酶活有明显的抑制作用。10mM的Ba2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Mn2+对酶有强烈抑制，10mM的Mg2+对酶有微弱抑制(图5)。
4)重组酶催化时间测定：
取1.5mL发酵液离心收集菌体，加入100mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液300μL重悬菌体，超声破碎，4℃离心后取上清，与等体积的30％(30g/100mL)麦芽糖溶液混和，37℃振荡反应，分别在0h，1h，2h，4h，8h，16h，25h取样，沸水浴5min终止反应。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。以25h时的转化率(转化率＝(产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量)×100％)为100％基准，其他值与其相比得出相对转化率。从图6可以看出，随着反应时间的延长转化率逐渐提高，在0-4h转化率呈线性快速增长，随后开始减缓，在16h以后反应趋于平衡。
实施例2、利用大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011表达的海藻糖合成酶制备海藻糖
取1ml实施例1中的海藻糖合成酶CG-TreS酶液(19.0U)，与1ml 30％(30g/100ml)麦芽糖溶液混和，20℃振荡反应20h，沸水浴5min终止反应。用离子色谱测定样品中海藻糖的含量。离子色谱的测定方法如下：离心收集反应液上清液，用100mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液稀释1000倍进样。离子色谱为DIONEX 2500，柱子：CarboPac PA-100，流动相：体积比为70∶30的100nmol/L NaOH和500nmol/LNaAC，流速1.0mL/min，进样量10μL。
已知标样浓度，根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式为：
样品浓度＝(样品峰面积÷标样峰面积)×标样浓度×进样稀释倍数。
转化率＝(产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量)×100％。
从图7中可以看出，标准样品中海藻糖的出峰时间是1.93分钟，峰面积为45.382；待测样品中海藻糖的出峰时间是1.93分钟，峰面积为31.740；已知标样浓度，根据标样及待测样品的峰面积可以计算出待测样品中海藻糖的含量。
样品浓度＝(31.740÷45.382)×0.015％×1000＝10.5％
转化率＝(10.5％÷15％)×100％＝70％
同法测得其他样品。
其中，标准样品的色谱图如图7A，各个峰如表2。
表2.标准样品的各个峰
  序号   出峰时间   物质名称   峰高度   峰面积   比例
  min   nC   nC*min   ％
  1   1.93   海藻糖   182.083   45.382   54.94
  2   3.03   1   28.517   4.193   5.08
  3   3.50   2   2.510   0.348   0.42
  4   4.10   3   2.174   0.470   0.57
  5   7.97   麦芽糖   67.880   32.203   38.99
  总计   283.165   82.596   100.00
CG-TreS催化产物的色谱图如图7B，各个峰如表3。
表3.测试样品的各个峰
  序号   出峰时间   物质名称   峰高度   峰面积   比例
  min   nC   nC*min   ％
  1   1.93   海藻糖   132.398   31.740   42.61
  2   2.53   n.a.   1.454   0.173   0.23
  3   3.00   n.a.   11.861   1.713   2.30
  4   3.73   n.a.   1.651   0.218   0.29
  5   4.03   n.a.   6.955   1.187   1.59
  6   7.87   麦芽糖   69.110   36.616   49.16
  7   11.63   n.a.   0.334   0.147   0.20
  8   19.00   n.a.   2.945   2.690   3.61
  总计   226.706   74.485   100.00
序列表
<160>2
<210>1
<211>1797
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400>1
ttgaattctc agccgagtgc agatcaccac cctgatcacg cggctcgccc agttcttgat      60
gcccacggct tgatcgttga gcacgaatcg gaagagtttc cagtccccgc acccgctccc     120
ggtgaacagc cctgggagaa gaaaaaccgc gagtggtaca aagacgccgt tttctacgaa     180
gtgctggttc gtgccttcta cgatccagaa ggcaacggag tcggatcgtt gaaaggcctg     240
accgaaaaac tggattacat ccagtggctc ggcgtggatt gcatttggat cccaccgttt     300
tatgattccc cactgcgcga cggcggttac gatatccgca acttccgtga aatcctgccc     360
gaattcggca ccgtcgatga cttcgtggaa ctcgttgacc acgcccaccg ccgtggcctg     420
cgtgttatca ccgacttggt catgaatcac acctccgacc agcacgcatg gttccaagaa     480
tcccggcgcg acccaaccgg cccctacgga gatttctatg tgtggagcga tgatcccacc     540
ctgtacaacg aagcccgcat catctttgta gatacagaag aatccaactg gacctatgat     600
ccggtgcgtg gccagtactt ctggcaccgc ttcttctccc accaaccaga cctcaactac     660
gacaaccccg cagtccaaga ggccatgcta gatgtcttgc gtttctggct ggacctggga     720
cttgatggtt tccgactaga tgccgttcct tatctttttg aacgcgaagg caccaacggc     780
gaaaacctca aagaaaccca cgatttcctc aaactgtgtc gctctgtcat tgagaaggaa     840
taccccggcc gaatcctgct cgcagaagcc aaccaatggc cccaagatgt ggtcgaatac     900
ttcggtgaaa aagacaaagg cgatgaatgc cacatggcct tccacttccc tttgatgccg     960
cgcatcttca tgggagttcg ccaaggttca cgcaccccga tcagtgagat cctggccaac    1020
accccggaga ttcccaagac tgcccaatgg ggtattttcc tgcgtaatca tgatgagctc    1080
acccttgaaa tggtctccga tgaggaacgc agctacatgt actcccaatt cgcctccgaa    1140
cctcgcatgc gcgccaacgt aggaatccgc aggcgccttt ccccactgct tgaaggcgac    1200
cgcaaccagc tggaactcct tcacggtttg ttgctgtctc tacctggctc acccgtgttg    1260
tattacggtg atgaaattgg catgggcgac aatatctggc tccacgaccg cgacggagtg    1320
cgcaccccca tgcagtggtc caacgaccgc aacggtggtt tctccaaagc tgatcctgaa    1380
cgcctgtacc ttccagcgat ccaaaatgat caatacggct acgcccaagt aaacgtggaa    1440
agccaactca accgcgaaaa ctccctgctg cgctggctcc gaaaccaaat ccttatccgc    1500
aagcagtacc gcgcatttgg tgccggaacc taccgtgaag tgtcctccac caatgagtca    1560
gtgttgacat ttttacgaga acacaagggc caaaccattt tgtgtgtcaa caacatgagc    1620
aaatatcctc aggcagtctc gcttgatttg cgtgaatttg caggacacac ccctcgagag    1680
atgtcgggcg ggcagctgtt ccctaccatt gctgaacggg agtggattgt cactttagcc    1740
cctcacggat tcttctggtt tgatctcacc gccgatgaaa aggacgatat ggaatga       1797
<210>2
<211>598
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400>2
Leu Asn Ser Gln Pro Ser Ala Asp His His Pro Asp His Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Pro Val Leu Asp Ala His Gly Leu Ile Val Glu His Glu Ser Glu Glu
            20                  25                  30
Phe Pro Val Pro Ala Pro Ala Pro Gly Glu Gln Pro Trp Glu Lys Lys
        35                  40                  45
Asn Arg Glu Trp Tyr Lys Asp Ala Val Phe Tyr Glu Val Leu Val Arg
    50                  55                  60
Ala Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Gly Val Gly Ser Leu Lys Gly Leu
65                  70                  75                  80
Thr Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Trp Leu Gly Val Asp Cys Ile Trp
                85                  90                  95
Ile Pro Pro Phe Tyr Asp Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp Ile
            100                 105                 110
Arg Asn Phe Arg Glu Ile Leu Pro Glu Phe Gly Thr Val Asp Asp Phe
        115                 120                 125
Val Glu Leu Val Asp His Ala His Arg Arg Gly Leu Arg Val Ile Thr
    130                 135                 140
Asp Leu Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Ala Trp Phe Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Arg Arg Asp Pro Thr Gly Pro Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Trp Ser
                165                 170                 175
Asp Asp Pro Thr Leu Tyr Asn Glu Ala Arg Ile Ile Phe Val Asp Thr
            180                 185                 190
Glu Glu Ser Asn Trp Thr Tyr Asp Pro Val Arg Gly Gln Tyr Phe Trp
        195                 200                 205
His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Asp Asn Pro Ala
    210                 215                 220
Val Gln Glu Ala Met Leu Asp Val Leu Arg Phe Trp Leu Asp Leu Gly
225                 230                 235                 240
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Phe Glu Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Thr Asn Gly Glu Asn Leu Lys Glu Thr His Asp Phe Leu Lys Leu
            260                 265                 270
Cys Arg Ser Val Ile Glu Lys Glu Tyr Pro Gly Arg Ile Leu Leu Ala
        275                 280                 285
Glu Ala Asn Gln Trp Pro Gln Asp Val Val Glu Tyr Phe Gly Glu Lys
    290                 295                 300
Asp Lys Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe Pro Leu Met Pro
305                 310                 315                 320
Arg Ile Phe Met Gly Val Arg Gln Gly Ser Arg Thr Pro Ile Ser Glu
                325                 330                 335
Ile Leu Ala Asn Thr Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ala Gln Trp Gly Ile
            340                 345                 350
Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ser Asp Glu
        355                 360                 365
Glu Arg Ser Tyr Met Tyr Ser Gln Phe Ala Ser Glu Pro Arg Met Arg
    370                 375                 380
Ala Asn Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asp
385                 390                 395                 400
Arg Asn Gln Leu Glu Leu Leu His Gly Leu Leu Leu Ser Leu Pro Gly
                405                 410                 415
Ser Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile
            420                 425                 430
Trp Leu His Asp Arg Asp Gly Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Ser Asn
        435                 440                 445
Asp Arg Asn Gly Gly Phe Ser Lys Ala Asp Pro Glu Arg Leu Tyr Leu
    450                 455                 460
Pro Ala Ile Gln Asn Asp Gln Tyr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Val Glu
465                 470                 475                 480
Ser Gln Leu Asn Arg Glu Asn Ser Leu Leu Arg Trp Leu Arg Asn Gln
                485                 490                 495
Ile Leu Ile Arg Lys Gln Tyr Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Tyr Arg
            500                 505                 510
Glu Val Ser Ser Thr Asn Glu Ser Val Leu Thr Phe Leu Arg Glu His
        515                 520                 525
Lys Gly Gln Thr Ile Leu Cys Val Asn Asn Met Ser Lys Tyr Pro Gln
    530                 535                 540
Ala Val Ser Leu Asp Leu Arg Glu Phe Ala Gly His Thr Pro Arg Glu
545                 550                 555                 560
Met Ser Gly Gly Gln Leu Phe Pro Thr Ile Ala Glu Arg Glu Trp Ile
                565                 570                 575
Val Thr Leu Ala Pro His Gly Phe Phe Trp Phe Asp Leu Thr Ala Asp
            580                 585                 590
Glu Lys Asp Asp Met Glu
        595

Claims (3)

1.一种转基因重组菌，是含有海藻糖合成酶编码基因的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)PlysS cgN-T31-30a27 CGMCC No.2011。
2.一种表达海藻糖合成酶的方法，是培养权利要求1所述的转基因重组菌，得到海藻糖合成酶。
3.一种制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用海藻糖合成酶进行催化，得到海藻糖；
所述海藻糖合成酶的氨基酸序列是序列表中的序列2；所述海藻糖合成酶是培养权利要求1所述的转基因重组菌得到的；
所述催化反应的温度为20℃，所述反应液的pH为9.0。
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王 俊， 孙晗笑.海藻糖合成酶的分离纯化及部分酶学性质研究.食品科学26 5.2005,26(5),99-102.
王 俊, 孙晗笑.海藻糖合成酶的分离纯化及部分酶学性质研究.食品科学26 5.2005,26(5),99-102. *
登录号NC_003450.Genbank.2004,1-5. *
登录号NP_601502.Genbank.2004,1-2. *
韦宇拓等.谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定.工业微生物35 2.2005,35(2),第1页1.2.3节，第2页1.2.4节、1.2.5节、1.2.6节，第3页2.4节.
韦宇拓等.谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定.工业微生物35 2.2005,35(2),第1页1.2.3节,第2页1.2.4节、1.2.5节、1.2.6节,第3页2.4节. *

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