CN103205475B - 新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。本发明中麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶具有较高的最适反应温度和热稳定性，具有较低的最适pH，降低了染菌风险，提高了生产的稳定性，显著提高了其和普鲁兰酶联合作用还原性淀粉水解物生产海藻糖的效率，降低了海藻糖成本，为海藻糖在医药、食品和化妆领域的广泛应用奠定坚实的基础。

Description

新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及具有较高最适反应温度和热稳定性、较低最适pH的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用。

背景技术

海藻糖 (Trehalose)是一种由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以α -1,1糖苷键结合的非还原性糖，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，相对分子量为378.33。其结构式如式1所示：

式1 海藻糖的分子结构

海藻糖广泛存在于细菌、酵母、真菌、藻类、昆虫和植物中。它对生物体和生物大分子具有非特异性的保护作用。这种非特异性保护作用主要体现在，当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、低温冷冻、辐射、高渗透压及有毒试剂等各种胁迫环境时，胞内海藻糖含量迅速上升，从而保护生命本身。

外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有非特异性的保护作用，海藻糖这种独特的生物学性质，使其广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。

目前海藻糖的生产工艺分为三种：

（1）提取法

酵母在恶劣的环境下（饥饿、高温、高渗、高压）生长，酵母体内能够积累大量海藻糖，大约占菌体干重的15%。因此最初海藻糖的生产采用从酵母体内提取的方法。在酵母细胞内，由于海藻糖属胞内产物，合成受外界环境条件的影响较大，且分离提取困难，因而用此法生产海藻糖的产量较低，商品化生产的发酵水平为0.4-0.6%，成本较高，此种生产方法海藻糖价格昂贵。

（2）单酶法

1995年，日本林原生化研究所从Pimelobacter 、 Psceuclomonus和Thermus三属微生物中分离纯化了一种新型淀粉酶—海藻糖合酶，它可以转化麦芽糖为海藻糖，并申请了专利CN1106065A。此后我国科研单位也相继从不同细菌中发现了海藻糖合酶并进行基因工程表达，例如CN200410013007.3、CN200910114318.1、CN200910007259.8、CN201010614814.6、CN201010614832.4、CN201210160403.3、CN201210011457.3，其中栖热菌属海藻糖合酶具有80℃的热稳定性。随着反应温度升高，海藻糖合酶转化麦芽糖生产海藻糖的转化率会下降，40℃麦芽糖对海藻糖的转化率可达到80%，60℃转化率约为60%。目前还没有利用该工艺大规模生产海藻糖的报道。

（3）双酶法

1994年林原生化研究所发现了新型海藻糖合成酶—麦芽寡糖基海藻糖合成酶（malt ooligosyl tehalose synthase，MTSase）和水解酶（maltooliogsyl trehalose hydrolase, MTHase），双酶联合作用于淀粉水解物产生海藻糖，首先MTSase作用于淀粉水解物，淀粉水解物末端形成海藻糖单元，然后MTHase切割掉末端海藻糖，形成一分子海藻糖和少两个葡萄糖基的淀粉水解物。

目前以还原性淀粉水解物为原料，双酶转化生产海藻糖是最经济的工艺路线，仍存在以下问题：

（1）专利CN99123896.6提供了最适温度50℃和最适pH6.0的MTSase和MTHase，转化率可达到80%，目前日本林原生化研究所已利用该技术实现大规模生产。50℃双酶转化容易染菌，此外淀粉水解物需要普鲁兰酶脱支处理。目前商品普鲁兰酶最适温度为55-60℃，最适pH5.0-5.5，pH6.0时活力较低，导致普鲁兰酶和双酶共同转化淀粉生产海藻糖时效率较低，转化时间达到48 h以上。

（2）文献Production of Trehalose from Starch by Thermostable Enzymes from Sulfolob us acidocaldarius（DOI:10.1002/star.19970490107）报道了嗜酸热硫化叶菌可产最适温度75℃和最适pH5.5左右的MTSase和MTHase。该双酶虽然具有较高的最适反应温度和较低的最适pH，但是文献报道该双酶活力均很低。

发明内容

本发明得到了具有较高的最适反应温度和热稳定性，具有较低最适pH的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶，提供了麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用。

本发明还提供了一种海藻糖的生产方法，该方法以淀粉为底物，利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶（简称MTSase，下同）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（简称MTHase，下同）在普鲁兰酶的协同作用下生产海藻糖，因为酶的改进，可以降低海藻糖生产成本，提高其生产效率。

本发明的MTSase和MTHase具有较高的最适反应温度和热稳定性，提高了生产海藻糖的稳定性，和普鲁兰酶具有相同的最适pH，能显著提高其和普鲁兰酶联合生产海藻糖的效率。

本发明还涉及一种表达该MTSase的基因、含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，该基因表达量高，使酶成本显著降低，也进一步降低了制备海藻糖的成本。

本发明还涉及一种制备麦芽寡糖基海藻糖合成酶的方法，通过基因重组技术高效表达得到合成酶，大大降低了合成酶的成本。

本发明还涉及表达该MTHase的基因、含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，该基因表达量高，使酶成本显著降低，也进一步降低了制备海藻糖的成本。

本发明还涉及一种制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，通过基因重组技术高效表达得到水解酶，大大降低了水解酶的成本。

为了得到特性良好的MTSase和MTHase，发明人广泛从土壤中和现有菌库中筛选具有MTSase和MTHase活性的微生物。经过大量筛选工作，发明人筛选出一株氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）TL-3，其具有MTSase和MTHase活性。经过分离纯化鉴定，MTSase和MTHase具有最适反应温度60℃和最适pH5.3-5.5，与现有MTSase和MTHase相比是更具有工业化应用前景的新型MTSase和MTHase。发明人继续研究，通过基因克隆技术获得了编码该酶的核苷酸，进一步获得了相应的氨基酸序列。发明人通过基因重组技术，将编码MTSase和MTHase的DNA导入大肠杆菌宿主中，获得了高效表达MTSase和MTHase的方法，发明人进一步进行了研究将MTSase和MTHase用在海藻糖生产中，取得了很好的效果。

本发明具体技术方案如下：

一种新型MTSase，其特征是：它具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

上述MTSase具有以下特性：

（1）作用

可以作用于葡萄糖聚合度大于3的还原性淀粉水解物，形成海藻糖作为末端单元的非还原糖；

（2）分子量

根据十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量约为85000Da；

（3）最适作用温度

当pH5.5温育60 min，最适作用温度60℃；

（4）最适作用pH

当60℃温育60 min，最适pH为5.5；

（5）热稳定性

当于pH5.5温浴60 min，在高达65℃下稳定；

（6）pH稳定性

当于60℃温浴60 min，在pH4.8-6.3下稳定；

一种表达上述MTSase的基因，该基因含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者含有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列因遗传密码子的兼并性而取代一个或多个碱基所形成的核苷酸序列、但该突变序列不改变由SEQ ID NO:2所示核苷酸所编码的氨基酸序列，或者含有上述两种核苷酸序列的互补核苷酸序列。上述MTSase可以通过表达该基因而高效获得。

本发明还得到了含有MTSase表达基因的重组表达载体，所述重组表达载体优选由表达载体pET24a(+)和MTSase表达基因构建而成。

本发明还得到了含有MTSase表达基因的重组工程菌。该重组工程菌是将含有MTSase表达基因的重组表达载体转入大肠杆菌中构建而成；所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。

制备MTSase的方法，其特征是：通过培养含有MTSase表达基因的重组工程菌制得。

上述方法能高效获得MTSase，其步骤包括：将重组工程菌在含有0.10-0.30 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基中34-37℃培养12-15 h后，降温至26-29℃，加入终浓度为0.1-0.3 mMol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，下同）或者0.3-0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，在26-29℃下诱导培养12-18 h，然后离心或过滤收集菌体细胞；将菌体细胞破碎、离心收集上清液，得含MTSase的粗酶液。

一种新型MTHase，其特征是，它具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

上述MTHase具有以下特性：

（1）作用

特异性作用于海藻糖作为末端单元的非还原糖，得到一分子海藻糖和少了两个葡萄糖基的非还原糖；

（2）分子量

根据十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量约为65000Da；

（3）最适作用温度

当pH5.3温育60 min，最适作用温度60℃；

（4）最适作用pH

当60℃温育60 min，最适pH为5.3；

（5）热稳定性

当于pH5.3温浴60min，在高达70℃下稳定；

（6）pH稳定性

当于60℃温浴60min，在pH4.5-6.5下稳定。

一种表达上述MTHase的基因，该基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或者含有由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列因遗传密码子的兼并性而取代一个或多个碱基所形成的核苷酸序列、但该突变序列不改变由SEQ ID NO:4所示核苷酸所编码的氨基酸序列，或者含有上述两种核苷酸序列的互补核苷酸序列。本发明MTHase可以通过表达该基因而高效获得。

本发明还得到了含有MTHase表达基因的重组表达载体；所述重组表达载体优选由表达载体pET24a(+)和MTHase表达基因构建而成。

本发明还得到了含有MTHase表达基因的重组工程菌。所述重组工程菌由含有MTHase表达基因的重组表达载体转入大肠杆菌中构建而成；所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。

制备MTHase的方法，其特征是：通过培养含MTHase表达基因的重组工程菌制得。

上述方法能高效获得MTHase，其步骤包括：将重组工程菌在含有0.10-0.30 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基中34-37℃培养13-16 h后，降温至27-30℃，加入终浓度为0.1-0.3 mMol/L的IPTG或者0.3-0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，在27-30℃下诱导培养12-18 h，然后离心或过滤收集菌体细胞；将菌体细胞破碎、离心收集上清液，得含MTHase的粗酶液。

MTSase和MTHase在海藻糖生产中的应用，其特征是：所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

一种海藻糖的生产方法，其特征是：以淀粉为底物，通过双酶转化法制备海藻糖，所用酶包括本发明上述MTSase和MTHase，MTSase具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，MTHase具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

上述海藻糖生产方法包括以下步骤：配制淀粉乳，调节pH为5.3-5.8，向其中加入诺维信高温淀粉酶进行反应，得到DE值为6-10的淀粉水解物后，高温灭酶；向淀粉水解物中加入MTSase、MTHase和普鲁兰酶，在50-65℃、pH5.3-5.5的条件下反应25-35 h，制得海藻糖。

上述方法中，所述淀粉乳的质量浓度为20-35%。

上述方法中，每升淀粉乳中加入0.2-0.5 ml的诺维信高温淀粉酶。

上述方法中，酶解后在132℃下灭酶1-10 min。

上述方法中，诺维信高温淀粉酶在90-100℃下对淀粉进行酶解，一般酶解20-30min即可达到DE值为6-10。

上述方法中，每升淀粉水解物中加入100-300 U MTSase、300-900 U MTHase，0.2-1mL普鲁兰酶。

根据本发明方法所得海藻糖的转化率可达到76.5-85.4%。

本发明公开了一种MTSase和MTHase、表达这两种酶的基因，含有这两种酶的基因的重组表达载体和重组工程菌、制备这两种酶的方法以及利用这两种酶制备海藻糖的方法，在知道了酶的基因和核苷酸序列的基础上，可以通过现有技术得到基因的核苷酸序列和酶的氨基酸序列，例如PCR扩增技术。此外，相关载体、宿主细胞、内切酶、试剂等都是现有技术中公开的内容，本领域人员可以很容易的得到。

本发明的技术方案与现有技术相比具有以下优点：

（1）本发明得到表达酶的基因，采用基因重组技术构建基因工程菌生产MTSase和MTHase，菌体培养简单，MTSase和MTHase表达量高，酶制备效率显著提高，酶成本显著降低，降低了海藻糖的成产成本，为海藻糖在食品、医药、化妆品等领域的广泛应用奠定了坚实的成本基础。

（2）本发明MTSase和MTHase具有较高的最适反应温度和热稳定性，具有60℃的最适反应温度和65-70℃热稳定性，双酶转化淀粉水解物生产海藻糖过程中，不易染菌，降低了染菌风险，提高了海藻糖生产的稳定性。

（3）本发明MTSase和MTHase具有较低的最适pH，在酸性条件pH5.3-5.5最适宜反应，和普鲁兰酶具有相同的最适pH，更适合和普鲁兰酶协同作用淀粉水解物生产海藻糖，显著提高了其和普鲁兰酶联合作用还原性淀粉水解物生产海藻糖的效率，最佳条件下转化周期从48 h缩短到25 h，转化率最高可达到85.4%，显著提高了海藻糖生产效率。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1显示温度对麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性的影响。

图2显示pH对麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性的影响。

图3显示温度对麦芽寡糖基海藻糖合成酶稳定性的影响。

图4显示pH对麦芽寡糖基海藻糖合成酶稳定性的影响。

图5为麦芽寡糖基海藻糖合成酶重组质粒限制性图谱，粗黑实线显示是编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的核苷酸序列。

图6显示温度对麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的影响。

图7显示pH对麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的影响。

图8显示温度对麦芽寡糖基海藻糖水解酶稳定性的影响。

图9显示pH对麦芽寡糖基海藻糖水解酶稳定性的影响。

图10为麦芽寡糖基海藻糖水解酶重组质粒限制性图谱，粗黑实线显示是编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的核苷酸序列。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。但是本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

无特殊说明，以下实施例中酶活检测和酶活单位定义如下：

（1）麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）酶活测定和定义

将麦芽五糖溶于100 mMol/L pH 5.5的柠檬酸缓冲液中，配成20%的溶液。取100 mL该溶液，加入1 mL MTSase酶液，60℃反应10 min，100℃沸水中煮10 min终止反应。将转化液冷却后，调节pH到4.2，加入0.1 mL葡萄糖糖化酶（诺维信公司产品），60℃糖化24 h，常规液相色谱测定糖化液中海藻糖的含量。MTSase催化麦芽五糖生成麦芽糖五糖基海藻糖，糖化酶可以水解α-1,4-糖苷键，而不能水解α-1,1-糖苷键，故而糖化后的溶液中只含有海藻糖和葡萄糖。因此，最终海藻糖的摩尔生成量即等于MTSase催化产生的麦芽五糖基海藻糖摩尔的量。MTSase的酶活单位(U)定义为每1 min转化麦芽五糖生成1 mMol麦芽五糖基海藻糖所需的酶量。

（2）麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）酶活测定和定义

将麦芽五糖溶于100 mMol/L pH 5.5的柠檬酸缓冲液中，配成20%的溶液。取100 mL该溶液，加入200 U MTSase酶液，60℃反应5 h，100℃沸水中煮10 min终止反应。待溶液冷却后，调节pH 5.3，加入1 mLMTHase酶液，60℃反应10 min，100℃沸水中煮10 min终止反应。HPLC测定转化液中海藻糖的含量。MTHase的酶活单位(U)定义为每1 min水解麦芽五糖基海藻糖生成1 mMol海藻糖所需的酶量。

培养基组成 (W/V) ：1% 蛋白胨，0.5% 酵母膏，1% NaCl，pH7.0±0.2。

培养基组成 (W/V) ：2% 蛋白胨，0.5% 酵母膏，0.05% NaCl，0.0186% KCl，0.095% MgCl₂，0.36% 葡萄糖，pH7.0±0.2。

本发明所用到的技术，例如PCR扩增技术、引物设计技术、载体构建技术、工程菌构建技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中比较成熟的技术，本领域人员可以根据现有技术实现。在操作过程中所用的设备或者试剂、载体、酶等，如无特别说明，均能在市场中得到。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶（ MTSase ）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（ MTHase ）的筛选

实施例 1 菌体培养

经过大量的筛选，选择出具有MTSase和MTHase良好活性的氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans） TL-3，该菌株保存于美国模式菌种收集中心（ATCC），保藏编号：14358。该菌株的培养基组成为：蛋白胨10 g/L、酵母抽提物30 g/L、葡萄糖10 g/L、MgSO₄ 0.06 g/L, KH₂PO₄ 2.13 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43 g/L，pH 7.0。121℃加热灭菌15 min。

菌体培养过程为：培养基冷却后，从斜面菌种，取两环A.oxydans TL-3菌体接种装有200 mL上述培养基的1000 mL三角瓶，220 rpm，38℃震荡培养24 h。

实施例 2 MTSase 分离纯化和酶学特性研究

实施例 2-1 MTSase 分离纯化

（1）菌体破碎

按实施例1中方法进行菌体培养，获得10升培养物，以8000 rpm离心20 min，收获150 g湿菌体，重新悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎菌体。缓冲液组成为0.2 Mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.5。超声破碎后离心(10000 r/min, 20 min)，取上清液，得粗酶液。

（2）硫酸铵沉淀

硫酸铵沉淀及透析均在冰浴中进行，在粗酶液中缓慢加入硫酸铵使饱和度达到40 %，4 ℃放置过夜，然后12000 r/min 离心20 min，上清液中继续缓慢加入硫酸铵使饱和度达到60 %，再次离心，收集沉淀并溶于0.025 Mol/L磷酸钾缓冲液（pH5.8）中，用截留分子量为10000 Da的透析袋透析除盐。

（3）DEAE-Sepharose 阴离子交换层析

将硫酸铵沉淀并透析过后的酶液进行DEAE-Sepharose (16 mMol/L×350 mm)阴离子交换层析，上样缓冲液A为0.025 Mol/L 磷酸钾(pH=5.8)缓冲液，洗脱缓冲液B为缓冲液A+1Mol/L NaCl. 用0-100%缓冲液B进行线性梯度洗脱，分管收集洗脱液，检测酶活。

（4）SP Fast Flow 强阳离子交换层析

将DEAE-Sepharose 阴离子交换层析得到的含有酶活力的酶液透析、浓缩，进行SP Fast Flow强阳离子交换层析，上样缓冲液C为0.025 Mol/L 磷酸钾(pH=5.8)缓冲液，洗脱缓冲液D为缓冲液C+1 Mol/L NaCl。用0%-25%缓冲液D线性梯度洗脱，收集活性峰，浓缩。浓缩处理的纯酶进行凝胶过滤层析，使用分子筛Sephacryl S-300（Mr：1×10⁴-1.5×10⁶）对酶进行分子量标定。分子筛标准品分别为：Thyroglobulin(669 kD)，Ferritin(440 kD)， Aldolase(158 kD)，BSA(67 kD)，VB12（1.382 kD）。

MTSase纯化结果见表1：

SP Fast Flow阳离子交换层析后样品经电泳检测为单条带，作logMr−Rf 分子量标准曲线，对照Marker分子量，计算得MTSase分子量约为85 kDa。

实施例 2-2 MTSase 酶学性质

（1）MTSase的最适温度

在30℃-80℃范围进行酶反应，除了温度外酶反应步骤和条件同酶活检测一致，测定MTSase酶活力，酶活最高时的温度即为最适温度。结果表明，MTSase最适作用温度为60℃，见附图1。

（2）MTSase的最适pH

麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，其他条件同酶活测定，测定酶活力，MTSase活力最高时的pH即为最适pH值。结果表明，MTSase最适pH值为5.5，见附图2。

（3）MTSase的热稳定性

将酶液分别在30℃、40 ℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中保存60 min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTSase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTSase在高达65℃下稳定，见附图3。

（4）MTSase的pH稳定性

麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，于60℃水浴中保存60 min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTSase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTSase在pH4.8-6.3下稳定，见附图4。

实施例 3 MTHase 分离纯化和酶学特性研究

实施例 3-1 MTHase 分离纯化

(1)菌体破碎

按实施例1中方法进行菌体培养，获得10升培养物以8000 rpm离心20 min，收获150 g湿菌体，重新悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎菌体。缓冲液组成为0.2 Mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.3。超声破碎后离心(12000 r/min，20 min)，取上清液，得粗酶液。

（2）硫酸铵沉淀

硫酸铵沉淀及透析均在冰浴中进行，在粗酶液中缓慢加入硫酸铵使饱和度达到40%，4℃放置过夜，然后12000 r/min 离心20 min，上清液中继续缓慢加入硫酸铵使饱和度达到60%，再次离心，收集沉淀并溶于0.025 Mol/L磷酸钾缓冲液（pH5.8）中，用截留分子量为10000 Da的透析袋透析除盐。

（3）DEAE-Sepharose阴离子交换层析

将硫酸铵沉淀并透析过后的酶液进行DEAE-Sepharose (16 mMol/L×350 mm)阴离子交换层析，上样缓冲液A为0.025 Mol/L 磷酸钾(pH=5.5)缓冲液，洗脱缓冲液B为缓冲液A+1Mol/L NaCl. 用0-100%缓冲液B进行线性梯度洗脱，分管收集洗脱液，检测酶活。

（4）SP Fast Flow强阳离子交换层析

将DEAE-Sepharose 阴离子交换层析得到的含有酶活力的酶液透析、浓缩，进行SP Fast Flow强阳离子交换层析，上样缓冲液C为0.025 Mol/L 磷酸钾(pH=5.5)缓冲液，洗脱缓冲液D为缓冲液C+1 Mol/L NaCl。用0%-25%缓冲液D线性梯度洗脱，收集活性峰，浓缩。浓缩处理的纯酶进行凝胶过滤层析，使用分子筛Sephacryl S-300（Mr：1×10⁴-1.5×10⁶）对酶进行分子量标定。分子筛标准品分别为：Thyroglobulin (669 kD)，Ferritin(440 kD)， Aldolase(158 kD)，BSA(67 kD)，VB12（1.382 kD）。

MTHase纯化结果见表2：

SP Fast Flow阳离子交换层析后样品经电泳检测为单条带，作logMr−Rf分子量标准曲线，对照Marker分子量，计算得MTHase分子量约为65 kDa。

实施例 3-2 MTHase 酶学性质

（1）MTHase的最适温度

在30℃-80℃范围进行酶反应，除了温度外酶反应步骤和条件同酶活检测一致，测定MTHase酶活力，酶活最高时的温度即为最适温度。结果表明，MTHase最适作用温度为63℃，见附图6。

（2）MTHase的最适pH

麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，其他条件同酶活测定，测定酶活力，MTHase活力最高时的pH即为最适pH值。结果表明，MTHase最适为5.3，见附图7。

（3）MTHase的热稳定性

将酶液分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中保存60 min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTHase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTHase在高达70℃下稳定，见附图8。

（4）MTHase的pH稳定性

麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，于60℃水浴中保存60 min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTHase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTHase在pH 4.5-6.5下稳定，见附图9。

基因的克隆和表达

实施例 4 总 DNA 提取

A ． oxydans TL-3按实施例1中培养18 h，8000 rpm离心收集菌体，然后按照Takara大连公司提供的Genonic DNA Purification Kit使用说明，提取基因组DNA。

实施例 5 MTSase 基因克隆、表达

(1)MTSase 基因克隆

引物设计：根据Genbank上已报道的节杆菌Arthrobacter sp. Q36来源的MTSase的基因序列，用Vector NTI软件设计引物：

上游引物：5’-CCCATATGGGATGACGCACACCTACCCT-3’下划线为Nde Ⅰ酶切位点；

下游引物：5’-TTGCGGCCGCAAAGTCAGCGACTGCTGC-3’下划线为Not Ⅰ酶切位点。

（聚合酶链式反应）的扩增体系：以A.oxydans TL-3基因组为模板，扩增目的基因片段，条件如下：基因组DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，dNTP 4 μL，10×Taq缓冲液5 μL，Taq酶（宝生物工程(大连) 有限公司）1 μL，ddH₂O 34 μL；

PCR 反应程序为：94℃预变性2 min；96℃变性30 s，然后59℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环25次；最后72℃延伸10 min；

产物测序：产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证，扩增得到2300 bp左右的DNA片段，切胶回收，基因测序表明片段为2331 bp的开放阅读框，如SEQ ID NO:2所示，编码一个由776个氨基酸组成的蛋白质，如SEQ ID NO:1所示。NCBI序列比对分析表明，该蛋白属于淀粉酶家族，和Arthrobacter sp. Q36来源的MTSase氨基酸序列有75%的相似性。

基因表达

限制性酶切：首先用Nde Ⅰ限制性内切酶（宝生物工程(大连) 有限公司）分别对上述（1）中PCR产物和pET24a(+)进行酶切处理，酶切体系为：DNA 5 μL，Nde Ⅰ5 μL，10×H缓冲液10 μL，ddH₂O 80 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。纯化后，再分别用Not Ⅰ限制性内切酶（宝生物工程(大连) 有限公司）酶切，酶切反应体系为：DNA 5 μL，Not Ⅰ5 μL，10×H缓冲液10 μL，0.1%BSA（牛血清白蛋白） 10 μL，0.1%TritonX-100 10 μL，ddH₂O 60 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。

连接：双酶切产物纯化后用T4连接酶（宝生物工程(大连) 有限公司）连接，连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物8 μL，酶切纯化的pET24a(+)8 μL，T4连接酶2 μL，10×T4缓冲液2 μL。37℃连接2 h，纯化后获得重组质粒pET24a(+)-MTSase，见图5。

转化： E.coli BL21（大肠杆菌）宿主菌在LB液体培养基中培养12h，按5%接种量移至新鲜的LB液体培养基中，37℃培养2 h，取1 mL培养液加入1.5 mL离心管中，5000 rpm离心5 min（4℃），倾去上清液加入用冰冷却的0.1 Mol/L CaCl₂ 500 μL,震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，再加入500 μL CaCl₂，震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，收集菌体，加入200 μL CaCl₂摇匀，作为感受态细胞。吸取5 μL重组质粒pET24a(+)-MTSase加入100 μL感受态细胞中，冰浴30 min，42℃水浴90 s，迅速将离心管转移至冰浴中，冷却1-2 min，然后加入1 mLSOC培养基中，37℃培养45 min后，取200 μL涂布于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12-16 h至单菌落出现，保存单菌落于LB固体培养基斜面。

鉴定：将上述单菌落接种于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养15 h，降温至27℃，加入终浓度为0.2 mMol/L的IPTG作为诱导剂，27℃诱导培养14 h后离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心收集上清液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 28.7U，说明MTSase表达成功，并且和原始菌相比，产酶量提高了89.7倍。

实施例 6 MTHase 基因克隆、表达

(1)MTHase 基因克隆

引物设计：根据Genbank上已报道的节杆菌Arthrobacter sp. Q36来源的MTHase的基因序列，用Vector NTI软件设计引物：

上游引物：5’-CCCATATGGGATGAGTACGCCAGTGTCC-3’下划线为Nde Ⅰ酶切位点；

下游引物：5’-TTGCGGCCGCAAGTGAGAGGTGGACAGACG-3’下划线为Not Ⅰ酶切位点。

（聚合酶链式反应）的扩增体系：以A.oxydans TL-3基因组为模板，扩增目的基因片段，条件如下：基因组DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，dNTP 4 μL，10×Taq缓冲液5 μL，Taq酶1 μL，ddH₂O 34 μL；

PCR 反应程序为：94℃预变性2 min；96℃变性30 s，然后58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环25次；最后72℃延伸10 min；

产物测序：产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证，扩增得到1800bp左右的DNA片段，切胶回收，基因测序表明片段为1797 bp的开放阅读框，如SEQ ID NO:4所示，编码一个由598个氨基酸组成的蛋白质，如SEQ ID NO:3所示。NCBI序列比对分析表明，该蛋白属于淀粉酶家族，和Arthrobacter sp. Q36来源的MTHase氨基酸序列有79%的相似性。

基因表达

限制性酶切：首先用Nde Ⅰ限制性内切酶分别对上述（1）中PCR产物和pET24a(+)进行酶切处理，酶切体系为：DNA 5 μL，Nde Ⅰ5 μL，10×H缓冲液10 μL，ddH₂O 80 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。纯化后，再分别用Not Ⅰ限制性内切酶酶切，酶切反应体系为：DNA 5 μL，Not Ⅰ5 μL，10×H缓冲液10 μL，0.1%BSA 10 μL，0.1%TritonX-100 10 μL，ddH₂O 60 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。

连接：双酶切产物纯化后用T4连接酶连接，连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物8 μL，酶切纯化的pET24a(+)8 μL，T4连接酶2 μL，10×T4缓冲液2 μL。37℃连接2 h，纯化后获得重组质粒pET24a(+)-MTHase，见图10。

转化： E.coli BL21宿主菌在LB液体培养基中培养12h，按5%接种量移至新鲜的LB液体培养基中，37℃培养2 h，取1 mL培养液加入1.5 mL离心管中，5000 rpm离心5 min（4℃），倾去上清液加入用冰冷却的0.1 Mol/L CaCl₂ 500 μL,震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，再加入500 μL CaCl₂，震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，收集菌体，加入200 μL CaCl₂摇匀，作为感受态细胞。吸取5 μL重组质粒pET24a(+)-MTHase加入100 μL感受态细胞中，冰浴30 min，42℃水浴90 s，迅速将离心管转移至冰浴中，冷却1-2 min，然后加入1 mLSOC培养基中，37℃培养45 min后，取200 μL涂布于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12-16 h至单菌落出现，保存单菌落于LB固体培养基斜面。

鉴定：将上述单菌落接种于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养15 h，降温至28℃，加入终浓度为0.2 mMol/L的IPTG作为诱导剂，28℃诱导培养16 h后离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心收集上清液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTHase 86.2 U，说明MTHase重组表达成功，并且和原始菌相比，产酶量提高了70.4倍。

实施例 7 MTSase 制备

实施例 7-1 MTSase 制备

重组菌（含有重组质粒pET24a(+)-MTSase的E.coli BL21大肠杆菌）在含有0.10 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基34℃培养15h，降温至26℃，加入终浓度为0.1 mMol/L的IPTG作为诱导剂，26℃诱导培养18 h后离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 24.6 U。

实施例 7-2 MTSase 制备

重组菌在含有0.20 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基37℃培养13.5h，降温至29℃，加入终浓度为0.3 mMol/L的IPTG作为诱导剂，29℃诱导培养18 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规高压匀浆机破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 29.3 U。

实施例 7-3 MTSase 制备

重组菌在含有0.30 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基37℃培养15 h，降温至26℃，加入终浓度为0.3 mMol/L的乳糖作为诱导剂，26℃诱导培养18 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 30.4 U。

实施例 7-4 MTSase 制备

重组菌在含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基34℃培养15 h，降温至29℃，加入终浓度为0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，29℃诱导培养15 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 31.2 U。

实施例 8 MTHase 制备

实施例 8-1 MTHase 制备

重组菌（含有重组质粒pET24a(+)-MTHase的E.coli BL21大肠杆菌）在含有0.10 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基34℃培养16 h，降温至27℃，加入终浓度为0.1 mMol/L的IPTG作为诱导剂，27℃诱导培养18 h后8000 rpm离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTHase 84.7 U。

实施例 8-2 MTHase 制备

重组菌在含有0.2 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基37℃培养13 h，降温至30℃，加入终浓度为0.3 mMol/L的IPTG作为诱导剂，30℃诱导培养12 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规高压匀浆机破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTHase 81.2 U。

实施例 8-3 MTHase 制备

重组菌在含有0.3 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基37℃培养15 h，降温至28℃，加入终浓度为0.3 mMol/L的乳糖作为诱导剂，28℃诱导培养16 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTHase 90.2 U。

实施例 8-4 MTHase 制备

重组菌在含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基35℃培养15 h，降温至27℃，加入终浓度为0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，27℃诱导培养14 h后8000 rpm离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTHase 87.5 U。

实施例 9 MTSase 和 MTHase 在海藻糖生产中的应用

实施例 9-1 MTSase 和 MTHase 在海藻糖生产中的应用

质量浓度35%的淀粉乳调pH5.5，每升反应液加入0.5 mL的诺维信高温淀粉酶（诺维信公司，下同），100℃反应30 min，可得到DE值为10.0的淀粉水解物，132℃灭酶1 min。

DE值为10还原性淀粉水解物1 L，加入200U MTSase、700U MTHase，0.5 mL普鲁兰酶（Promozyme D2，诺维信公司，下同），pH5.3条件下62℃反应35 h，海藻糖的转化率可达到80.2%。

实施例 9-2 MTSase 和 MTHase 在海藻糖生产中的应用

质量浓度27.5%的淀粉乳调pH5.8，每升反应液加入0.3 mL的诺维信高温淀粉酶，95℃反应25 min，可得到DE值为8.3的淀粉水解物，132℃灭酶5 min。

DE值为8.3还原性淀粉水解物1 L，加入300 U MTSase、300 U MTHase，1.0 mL诺维信普鲁兰酶，pH5.4条件下60℃反应29.5 h，海藻糖的转化率可达到85.4%。

实施例 9-3 MTSase 和 MTHase 在海藻糖生产中的应用

质量浓度20%的淀粉乳调pH5.3，每升反应液加入0.2 mL的诺维信高温淀粉酶，90℃反应20 min，可得到DE值为6.0的淀粉水解物，132℃灭酶10 min。

DE值为6.0还原性淀粉水解物1 L，加入200 U MTSase、600 U MTHase，0.2 mL诺维信普鲁兰酶，pH5.5条件下65℃反应25 h，海藻糖的转化率可达到76.5%。

实施例 9-4 MTSase 和 MTHase 在海藻糖生产中的应用

质量浓度35%的淀粉乳调pH5.6，每升反应液加入0.4 mL的诺维信高温淀粉酶（诺维信公司，下同），98℃反应30 min，可得到DE值为9.6的淀粉水解物，132℃灭酶3 min。

DE值为9.6还原性淀粉水解物1 L，加入250 U MTSase、650 U MTHase，0.4 mL普鲁兰酶（Promozyme D2，诺维信公司，下同），pH5.4条件下50℃反应30 h，海藻糖的转化率可达到77.6%。

实施例 9-5 MTSase 和 MTHase 在海藻糖生产中的应用

质量浓度27.5%的淀粉乳调pH5.4，每升反应液加入0.5 mL的诺维信高温淀粉酶，94℃反应25 min，可得到DE值为7.6的淀粉水解物，132℃灭酶7 min。

DE值为7.6还原性淀粉水解物1 L，加入100 U MTSase、900 U MTHase，0.6 mL诺维信普鲁兰酶，pH5.3条件下65℃反应32 h，海藻糖的转化率可达到83.7%。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

〈110〉山东天力药业有限公司

〈120〉新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用

〈160〉4

〈210〉1

〈211〉776

〈212〉PRT

〈213〉氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）

〈400〉1

Met Ser Thr Pro Val Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Ile Arg Lys Gly Phe

5 10 15

Thr Leu Phe Asp Ala Ala Glu Lys Val Leu Tyr Leu Lys Ser Ile Gly

20 25 30

Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Ile Leu Thr Ala Glu Gln Gly Ser

35 40 45

Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu Arg

50 55 60

Gly Gly Pro Glu Gly Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ala Arg Glu His

65 70 75 80

Gly Met Gly Leu Leu Met Asp Ile Leu Pro Asn His Val Cys Val Ala

85 90 95

Thr Pro Val Gln Asn Pro Trp Trp Ser Ser Leu Leu Lys Glu Gly Arg

100 105 110

Arg Ser Arg Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Gly Gly

115 120 125

Gly Lys Val Arg Leu Thr Lys Leu Gly Thr Asp Glu Asp Leu Asp Gln

130 135 140

Leu Glu Ile Lys Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe Pro

145 150 155 160

Leu Ala Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Arg Asp Ser Pro Gln Glu Val His

165 170 175

Ala Arg Gln His Tyr Glu Leu Met Asp Trp Arg Arg Ala Asp Thr Glu

180 185 190

Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Thr Thr Leu Asp Gly Ile Arg

195 200 205

Val Glu Met Pro Ala Val Phe Glu Glu Ala His Ala Glu Val Gly Arg

210 215 220

Trp Phe Pro Glu Gly Leu Val Asp Gly Leu Arg Val Asp His Pro Asp

225 230 235 240

Gly Leu Ala Asp Pro Ala Gly Tyr Leu Arg Trp Leu Gln Asp Leu Thr

245 250 255

Gly Gly Ala Tyr Val Leu Val Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu Val

260 265 270

Leu Pro Ala Asn Phe Ala Cys Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Val Asp Arg Val Phe Val Asp Pro Ala Gly Glu Gln Pro Leu

290 295 300

Asp Ala Leu Asp Ala Ala Leu Arg Gly Ala Pro Glu Ala Ala Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Glu Met Ile Pro Gly Thr Lys Arg Leu Ile Ala Asp Gly Ile Leu

325 330 335

Arg Ser Glu Val Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Glu Ser His Gly

340 345 350

Leu Ala Leu Glu Glu Ala Ala Asp Ala Ile Ala Glu Ile Ile Ala Ser

355 360 365

Phe Pro Val Tyr Arg Ser Tyr Leu Pro Thr Gly Ala Glu Val Leu Lys

370 375 380

Glu Ala Ser Glu Ser Ala Ala Glu Asp Arg Pro Asp Leu Ala Val Ala

385 390 395 400

Ile Gly Thr Leu Leu Pro Leu Leu Leu Asp Pro Ala Asn Arg Ile Ala

405 410 415

Val Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu

420 425 430

Asp Thr Ala Phe Tyr Arg Tyr Thr Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val

435 440 445

Gly Ala Glu Pro Thr Glu Phe Ala Val Tyr Pro Glu Glu Phe His Asp

450 455 460

Arg Met Arg Arg Arg Gln Asp Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Met

465 470 475 480

Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Ala Arg Ala Arg Ile Ser

485 490 495

Val Ile Ala Glu Leu Pro Gly Glu Trp Ala Ala Thr Leu Asp Thr Leu

500 505 510

Arg Lys Leu Ala Pro Ile Pro Asp Gly Pro Tyr Glu His Leu Leu Trp

515 520 525

Gln Ala Ile Val Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Cys

530 535 540

Tyr Ala Glu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Lys Trp Thr

545 550 555 560

Asp Pro Asp Glu Asp Phe Glu Tyr Arg Val Lys Ala Ala Val Asp Ala

565 570 575

Val Phe Asp Asp Ala Gly Val Ala Arg Val Val Glu Gly Leu Val Ala

580 585 590

Arg Ile Asp Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ser Leu Ala Ala Lys Leu Val

595 600 605

Gln Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Gly Tyr Gln Gly Ser Glu Phe

610 615 620

Trp Glu Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Val Asp Phe

625 630 635 640

Ala Ile Arg Arg Ala Glu Leu Ala Arg Ile Asp Ala Gly Thr Leu Pro

645 650 655

Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ser Lys Leu Leu Ala Thr Thr Arg Ala Leu

660 665 670

Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Glu Gly Tyr Arg Pro Val

675 680 685

Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Gly Phe Tyr Arg Gly

690 695 700

Thr Ala Asp Gly Thr Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro

705 710 715 720

Ala Gly Leu Glu Ala Gly Gly Gly Trp Arg Asp Thr Val Ile Glu Leu

725 730 735

Asn Ala Ala Met Tyr Asp Glu Leu Thr Gly Ala Gly Phe Gly Thr Val

740 745 750

Ala Val Lys Ile Ala Asp Ile Phe Arg Thr Phe Ala Val Ala Pro Leu

755 760 765

Val Pro Gln Thr Gly Gly Glu Ser

770 775

〈210〉2

〈211〉2331

〈212〉DNA

〈213〉氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）

〈400〉2

atgagtacgc cagtgtccac ttaccggttg gagatccgca agggtttcac cctgttcgac 60

gccgccgaga aggtcctgta cctcaaatcg atcggcgttg actgggtcta cctgtcgccc 120

atccttacgg cggaacaggg ctccgaccac ggctacgacg tgaccgatcc ctccgccgtc 180

gaccccgagc gtggtggccc ggaagggctg ctggcactgt ccagtgccgc ccgcgagcac 240

ggcatgggcc tgctgatgga catcttgccc aaccacgtgt gcgtcgcgac cccggtgcag 300

aacccctggt ggtcatcgct gctgaaggaa ggccgtcggt cgcggtacgc ggaagcgttc 360

gacgtcgatt gggacttggg cggcggcaag gtccggctca cgaagctggg caccgacgag 420

gacctggacc agctggagat caaggacggg gaactccggt actacgacca ccgattcccg 480

ctcgctgagg gaacctactc cgagagggac tccccacagg aggtacacgc ccgccagcac 540

tacgagctca tggactggcg ccgcgccgac accgagctca actaccgccg cttcttcgcg 600

gtgaccacgt tggacggcat ccgggtggag atgccggcgg tcttcgaaga agcccacgcc 660

gaagttggcc gctggttccc cgaaggcctg gtggacggtc tgcgcgtcga ccacccggac 720

ggcctggccg accccgcagg ctacctgagg tggctccagg acctcactgg cggcgcctac 780

gtcctggtgg agaagatcct ggaacccggc gaggtgctgc cggccaactt cgcctgcgag 840

ggcaccacag ggtacgacgc tctcgccgac gtggaccggg tgttcgtgga tcctgccggg 900

gagcagcccc tggacgcact ggacgcggcg ttgcggggcg ctcccgaggc cgctgactac 960

gcggagatga tccccggcac caagcggctg atcgccgacg gcatcctccg ctccgaggtg 1020

ctgcggctgg ccaggctggt tccggaatcc cacggtctgg cgctggagga agcagccgac 1080

gctatcgccg agatcatcgc ttccttcccg gtctaccgca gctacctgcc caccggggcc 1140

gaggtgctga aggaagccag cgagtctgcc gcagaagacc gtccggacct cgccgtcgca 1200

atcgggacac tccttccgct gctgttggat ccggccaatc gcattgccgt caggttccag 1260

cagacctccg gcatggtgat ggccaagggt gtggaagaca ccgcgttcta ccgctacacc 1320

cgccttggca cgctgaccga ggtgggcgca gaacccaccg agttcgccgt gtacccggag 1380

gaattccacg accggatgcg ccggcggcag gacgagctgc cgctgtccat gaccaccatg 1440

tccacgcacg ataccaagcg cagcgaggac gcccgggcac ggatctccgt gatcgccgag 1500

ctgccggggg agtgggcagc caccctggac actctccgga agctggctcc catcccggac 1560

ggcccctacg agcacctgct gtggcaggcc atcgtgggcg cctggcctgc cagccgggaa 1620

cggctccagt gctacgcgga gaaggccgcc cgagaagccg gcaactccac gaagtggacc 1680

gacccggacg aggacttcga gtaccgggtg aaggcggccg tggatgcggt attcgacgac 1740

gccggcgtgg ccagggtggt ggagggcctc gttgcacgca tcgatgcctt agcggcctcc 1800

aactccctcg ccgcgaagct ggtccagctg accatgcccg gcgtccccga cggctaccaa 1860

ggcagcgagt tctgggaacg gtcgttgact gatcccgata accgccggcc cgtcgacttc 1920

gcaatccggc gagccgagct ggccaggatc gacgccggaa cgttgcccgc gtcgggcacg 1980

gaagccagca agctccttgc caccacacgg gcgctccgcc tgcggcggga ccggccggaa 2040

ctcttcgagg gctaccgccc ggtcccggcc acgggcgctg cagccgggct cctgctcgga 2100

ttctaccgcg gcacggcgga cggcacgccc ggggcactga ctctggcaac gcggctgcct 2160

gcgggcctgg aagccggcgg cggctggcgc gataccgtca tcgaacttaa tgctgcaatg 2220

tatgacgaac tgaccggtgc cggcttcgga acggtggcag tgaagattgc cgacatattc 2280

cggacgttcg ccgttgcgcc gctggtgccg cagacaggag gagagtcatg a 2331

〈210〉3

〈211〉598

〈212〉PRT

〈213〉氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）

〈400〉3

Met Thr His Thr Tyr Pro Arg Gln Ala Ala Ile Pro Val Leu Gly Pro

5 10 15

Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ser Pro Asn Ala Gly Ser Val Ser Leu Leu

20 25 30

Ser Gly Gln Glu Arg Tyr Ala Met Gln His Arg Ala Glu Ser Gly Leu

35 40 45

Glu Glu Ala Asp Trp Arg Thr Ala Pro Asp Ala Pro Ala Asp Gly Glu

50 55 60

Val Asp Tyr Gly Tyr Arg Leu Asp Val Asp Asn His Pro Leu Pro Asp

65 70 75 80

Arg Arg Ser Arg Arg Val Pro Glu Gly Val His Asp Leu Ser Arg Thr

85 90 95

Phe Asp Pro Ala Ala Tyr Ala Trp Lys Asp Ala Ala Trp Lys Gly Thr

100 105 110

Glu Leu Thr Gly Ala Val Ile Tyr Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr

115 120 125

Pro Lys Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ser Gly Lys Leu Gly Tyr Leu Ala

130 135 140

Asp Leu Gly Ile Asp Phe Met Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn

145 150 155 160

Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Tyr Ala Val His

165 170 175

Glu Ala Tyr Gly Cys Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Val Asp Ala Ala

180 185 190

His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn Arg Leu

195 200 205

Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Gln Phe Gly Thr Tyr Leu Lys Gln

210 215 220

Cys Asp Gly Asn Thr Trp Ser Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly

225 230 235 240

Ser Asp Val Val Arg Gln Tyr Ile Ile Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu

245 250 255

Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ser Val His Ala Leu

260 265 270

Asn Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Leu Val Ala Leu Gly

275 280 285

Asp Ala Val Ser Thr Glu Ala Gly Leu Pro Gln Thr Leu Ile Ala Glu

290 295 300

Ser Asp Leu Asn Ile Pro Arg Leu Leu Tyr Gln Arg Val Ala Asn Gly

305 310 315 320

Tyr Gly Leu Glu Glu Gln Cys Ser Asp Asp Phe Asp His Thr Val His

325 330 335

Ala Lys Val Thr Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Glu Ser

340 345 350

Leu Ala Val Leu Ala Lys Val Leu Gln Asp Gly Phe Leu His Asp Ser

355 360 365

Arg Tyr Ser Arg Phe Arg Asp Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Ala

370 375 380

Ser Leu Val Thr Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Tyr Gln Asn His Asp

385 390 395 400

Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Arg Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Pro

405 410 415

Tyr Gly Gln Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Ser Pro Phe

420 425 430

Thr Pro Met Leu Leu Met Val Glu Glu Tyr Gly Ala Thr Thr Arg Trp

435 440 445

Gln Phe Phe Thr Ser His Ala Glu Pro Glu Leu Val Met Ala Thr Glu

450 455 460

Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Gln Arg Ile Gly Trp Asp Arg Ala Val

465 470 475 480

Val Pro Asp His Gln Asp Pro Glu Thr Phe Cys Arg Tyr Lys Leu Asn

485 490 495

Trp Asp Glu Ala Ala Met Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr

500 505 510

His Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Tyr His Gln Glu Leu Thr Glu Leu

515 520 525

Gly Phe Gly Glu Thr Glu Leu Ala Phe Asp Glu Asp Ser Gly Trp Leu

530 535 540

Arg Phe Ser Arg Gly Arg Val Gln Leu Leu Leu Asn Phe Ser Glu Gln

545 550 555 560

Leu Val Ser Leu Asp Gly Ala Gly Ser Ala Leu Gln Leu Ala Thr Asp

565 570 575

Asp Ala Val Arg Leu Asp Gly Glu Ser Ala Glu Leu Gly Arg Leu Ser

580 585 590

Ala Ala Val Val Ser Asp

595

〈210〉4

〈211〉1797

〈212〉DNA

〈213〉氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）

〈400〉4

atgacgcaca cctaccctcg gcaagccgcg ataccagtcc tggggcccgc tcgctacgac 60

gtctggtcgc cgaacgctgg atccgtgtcg ctgctgtccg gccaggagcg ctacgccatg 120

cagcaccggg ccgagtccgg gctggaggaa gccgactgga ggacggcacc ggacgcgcct 180

gccgacggcg aagtggacta cggctaccgg ctcgacgtcg acaaccaccc gctgccggac 240

cgccggtccc gccgcgtgcc cgaaggagtc cacgacctgt cccggacgtt cgatcccgcc 300

gcgtacgcgt ggaaggacgc cgcctggaag ggcacggaac tcaccggcgc ggtcatctac 360

gaactccacc tgggcacatt cacgccgaag ggcacgctgg acgcggcctc cgggaagctt 420

ggctacctgg cggatctggg catcgacttc atggagctac tgccggtcaa cgcgttcaac 480

ggcactcaca actggggcta cgacggcgtg cagtggtacg ccgtccacga ggcctacggc 540

tgccctgaag cgtacgagcg gctcgttgac gcagcgcatg cggccgggct tggcgtgatc 600

caggatgtgg tctacaaccg cctcggcatc agcggcaatt acctgccgca gttcggcacg 660

tacctgaaac agtgcgacgg taacacctgg agcgactccg tcaacctcga cgggccaggc 720

tcggacgtgg tccgccagta catcatcgac aacctcgcca tgtggctccg tgattaccgg 780

gtggacggtc tgcgcctcga ctccgtgcat gcgctgaacg acgagcgtgc ggtgcacatc 840

ctcgaagacc tcgtggcgct gggtgacgcg gtctccaccg aggccggcct cccccaaacg 900

ctgatcgcag agtcagacct caacatcccg cgcctgctct atcagcgtgt cgccaacggg 960

tacggcctgg aagagcagtg cagcgacgac ttcgaccaca ccgtccacgc aaaagttacc 1020

ggcgaaacca ccgggtatta cagcgacttc gagtcgttgg ccgtcctagc caaggtactc 1080

caagacggct tcctccacga cagcaggtac tccaggttcc gcgaccgtca ccacggaagg 1140

cccatcaacg cctcgctggt aacgcctgcg gcgctggtgg tgtgctacca gaaccacgat 1200

cagataggca accgtgccac gcgggacagg ctctcgcagt cactgcccta cgggcagttg 1260

gccctggctg cggtacttac gctgacgtcg ccgttcacgc ccatgctgct catggtggag 1320

gaatacgggg ccaccacacg gtggcagttc ttcacctcgc acgcggaacc ggagctcgtc 1380

atggccaccg aggagggccg catcaaggaa ttccagcgca tcgggtggga tcgcgcagtc 1440

gtgcccgatc accaggaccc cgaaaccttc tgccggtaca agctgaactg ggacgaggcc 1500

gccatgggtg accacgctcg cctgctcgag ctgtaccatt cgctcaccgc gctgcggcgc 1560

taccaccagg agctcaccga actgggtttc ggggagacgg agctggcgtt cgacgaggac 1620

tccggctggc tacggttcag ccggggtcga gtgcagctgc tgctcaactt ctcagaacag 1680

ctcgtgagct tggacggtgc aggctcggcc ctgcagctgg ccaccgacga cgcagtccgg 1740

ctagacggtg agagtgcgga actcggtcgg ctgagcgccg ccgtcgtcag cgactga 1797

Claims (6)

1.一种海藻糖的生产方法，其特征是：以淀粉为底物，通过双酶转化法制备海藻糖，所用酶包括麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶具有以下特性：

（1）最适作用温度

当pH 5.5温育60 min，最适作用温度60℃；

（2）最适作用pH

当60℃温育60 min，最适pH为5.5；

（3）热稳定性

当于pH 5.5温浴60 min，在高达65℃下稳定；

（4）pH稳定性

当于60℃温浴60 min，在pH 4.8-6.3下稳定；

所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶具有以下特性：

（1）最适作用温度

当pH 5.3温育60 min，最适作用温度60℃；

（2）最适作用pH

当60℃温育60 min，最适pH为5.3；

（3）热稳定性

当于pH 5.3温浴60 min，在高达70℃下稳定；

（4）pH稳定性

当于60℃温浴60 min，在pH 4.5-6.5下稳定；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的基因表达而得，方法为：将含麦芽寡糖基海藻糖合成酶表达基因的重组工程菌在含有0.10-0.30 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基中34-37℃培养12-15 h后，降温至26-29℃，加入终浓度为0.1-0.3 mMol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或者0.3-0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，在26-29℃下诱导培养12-18 h，然后离心或过滤收集菌体细胞；将菌体细胞破碎、离心收集上清液，得含麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液；

所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的基因表达而得，方法为：将含麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因的重组工程菌在含有0.10-0.30 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基中34-37℃培养13-16 h后，降温至27-30℃，加入终浓度为0.1-0.3 mMol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或者0.3-0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，在27-30℃下诱导培养12-18 h，然后离心或过滤收集菌体细胞；将菌体细胞破碎、离心收集上清液，得含麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是包括以下步骤：配制淀粉乳，调节pH为5.3-5.8，向其中加入高温淀粉酶进行反应，得到DE值为6-10的淀粉水解物后，高温灭酶；向淀粉水解物中加入麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和普鲁兰酶，在50-65℃、pH5.3-5.5的条件下反应25-35 h，制得海藻糖。

3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征是：淀粉乳的质量浓度为20-35%。

4.根据权利要求2所述的生产方法，其特征是：每升淀粉乳中加入0.2-0.5 ml的高温淀粉酶；每升淀粉水解物中加入100-300 U麦芽寡糖基海藻糖合成酶、300-900 U水解酶，0.2-1.0 mL普鲁兰酶。

5.根据权利要求2或4所述的生产方法，其特征是：高温淀粉酶在90-100℃下对淀粉进行酶解；高温淀粉酶的酶解时间为20-30 min；酶解后在132℃下灭酶1-10 min。

6.根据权利要求2、3或4所述的生产方法，其特征是：海藻糖的转化率为76.5-85.4%。