CN111187795B - 一种双葡基海藻糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双葡基海藻糖的制备方法，涉及非还原性糖的生产方法领域，解决提高生产双葡基海藻糖效率的问题，其技术方案要点是：包括将底物与双葡基海藻糖生产成套试剂进行反应得到双葡基海藻糖；所述双葡基海藻糖生产成套试剂包括麦芽四糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶；所述底物为淀粉或淀粉水解物。

Description

一种双葡基海藻糖的制备方法

技术领域

本发明涉及非还原性糖的生产方法领域,更具体地说，它涉及一种双葡基海藻糖的制备方法。

背景技术

双葡基海藻糖是由一个麦芽糖和一个海藻糖通过α-1,4糖苷键结合的非还原性糖，是一种具有多种生物学功能的优质的非还原性糖。双葡基海藻糖很强的亲水性，具有保湿功能。除了保湿、抑制皮肤粗糙外，双葡基海藻糖还具有许多生物学功能，比如对细胞干燥的保护作用，细胞干燥就会受到损伤，双葡基海藻糖起到很有效的保护作用，因此对于干燥、老化的皮肤有很好的修复作用。此外，它还有抗炎症的作用：炎症是诱发皮肤问题的主要原因，微生物、紫外线照射、病毒感染等原因都会穿过角化细胞，使得炎症因子之一的TNF-a因子增多，从而出现皮肤问题。双葡基海藻糖可以抑制TNF-a的产生，从而实现抗炎的作用。但目前缺乏绿色高效的双葡基海藻糖制备技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种双葡基海藻糖的制备方法，达到提高生产双葡基海藻糖效率目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种双葡基海藻糖的制备方法，包括将底物与双葡基海藻糖生产成套试剂进行反应得到双葡基海藻糖；所述双葡基海藻糖生产成套试剂包括麦芽四糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶；所述底物为淀粉或淀粉水解物。

通过采用上述技术方案：加入麦芽四糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶，极大提高了双葡基海藻糖的生产强度，显著降低了生产双葡基海藻糖的时间，提高生产双葡基海藻糖效率，减少了双葡基海藻糖的生产成本和能耗。

本发明进一步设置为，所述麦芽四糖水解酶为如下M1)或M2)的蛋白质：

M1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

M2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述麦芽四糖水解酶功能的由M1)衍生的蛋白质；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶为下述S1)或S2)的蛋白质：

S1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

S2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶功能的由S1)衍生的蛋白质。

本发明进一步设置为，所述双葡基海藻糖生产成套试剂还包括切支酶。

本发明进一步设置为，双葡基海藻糖的制备方法还包括：将麦芽四糖水解酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽四糖水解酶；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

本发明进一步设置为，双葡基海藻糖的制备方法还包括：将麦芽寡糖海藻糖合成酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽寡糖海藻糖合成酶；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

本发明进一步设置为，所述麦芽四糖水解酶基因为下述M11)-M13)中的任一种DNA分子：

M11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；M12)在严格条件下与M11)限定的DNA分子杂交且编码所述麦芽四糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；

M13)与M11)或M12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽四糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因为下述S11)-S13)中的任一种DNA分子：

S11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；

S12)在严格条件下与S11)限定的DNA分子杂交且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA；

S13)与S11)或S12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA。

本发明的另一个目的是提供一种根据上述双葡基海藻糖的制备方法中制备的双葡基海藻糖生产成套试剂。

本发明的另一个目的是提供一种用于生产双葡基海藻糖的生物材料，C1)用于生产双葡基海藻糖的成套DNA分子，包括上述任一所述麦芽四糖水解酶基因和所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因，各基因各自独立包装；

C2)用于生产双葡基海藻糖的重组载体或成套重组载体，所述重组载体或所述成套重组载体能产生上述所述双葡基海藻糖生产成套试剂；C3)用于生产双葡基海藻糖的重组细胞或成套重组细胞，所述重组细胞或所述成套重组细胞能产生上述所述双葡基海藻糖生产成套试剂。本发明的另一个目的是提供一种根据上述的用于生产双葡基海藻糖的生物材料制得的产品，C2)所述重组载体或所述成套重组载体为利用C1)所成套DNA分子产生上述所述双葡基海藻糖生产成套试剂的载体；

C3)所述重组细胞或所述成套重组细胞为利用C1)所成套DNA分子产生上述所述双葡基海藻糖生产成套试剂的细胞。

本发明的另一个目的是提供一种双葡基海藻糖生产成套试剂在制备双葡基海藻糖中的应用；用于生产双葡基海藻糖的生物材料在制备双葡基海藻糖中的应用；所述的产品在制备双葡基海藻糖中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：加入麦芽四糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶，极大提高了双葡基海藻糖的生产强度，显著降低了生产双葡基海藻糖的时间，提高生产双葡基海藻糖效率，减少了双葡基海藻糖的生产成本和能耗。

附图说明

图1为酶法转化生产双葡基海藻糖的HPLC检测；

图2为糖化酶处理后海藻糖和葡萄糖的HPLC检测。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明中所使用的试剂和耗材都为市购获得的常规产品。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：一种双葡基海藻糖的制备方法，包括将底物与双葡基海藻糖生产成套试剂进行反应得到双葡基海藻糖；所述双葡基海藻糖生产成套试剂包括麦芽四糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶；所述底物为淀粉或淀粉水解物。

利用酶活较高的麦芽四糖水解酶(MTAase)和麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)，以淀粉水解物为底物制备双葡基海藻糖的整套工艺采用一锅法，双酶共同处理，降低了生产双葡基海藻糖的时间，因此提高生产双葡基海藻糖效率，减少了双葡基海藻糖的生产成本和能耗。

M1：麦芽四糖水解酶为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；S1：麦芽寡糖基海藻糖合成酶，氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质。

此外也可以是一种经过基因优化的MTSase基因，构建而得到表达载体pBAD-MTSase,含有该表达载体的重组表达菌株表达量很高，使生产酶的成本显著降低，也进一步降低了制备双葡基海藻糖的成本。

麦芽四糖水解酶也可以为在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述麦芽四糖水解酶功能的由M1)衍生的蛋白质。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶也可以为在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶功能的由S1)衍生的蛋白质。

通过基因优化合成得到了来源于Pseudomonas stutzeri菌株的麦芽四糖水解酶(MTAase)基因(GenPept:WP_045633474.1，蛋白序列见SEQ ID NO.1，优化后基因序列见SEQID NO.2)；来源于Arthrobacter sp.Q36菌株的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因(GenBank:D63343.1，蛋白序列见SEQ ID NO.3，优化后基因序列见SEQ ID NO.4)，通过基因重组技术构建到表达载体中，获得了高效表达MTSase的菌株以及有效表达MTAase的一株菌。继续将MTAase和MTSase用在双葡基海藻糖生产中，取得良好效果。

双葡基海藻糖生产成套试剂还包括切支酶，切支酶优选普鲁兰酶，以淀粉水解物为底物，先用切支酶处理具有支链的淀粉水解物，再加入MTAase和MTSase，可显著提高双葡基海藻糖转化率。

双葡基海藻糖生产方法包括以下步骤：配制DE11(诺维信公司)的淀粉水解物溶液，调节pH至约6.0,加入切支酶50℃反应12h，再调节pH至约6.5，加入MTAase和MTSase,40℃反应8-12小时后，制得双葡基海藻糖。

其中DE11质量浓度为30％-33％，每克干重DE11加入7-20UMTAase、15-50UMTSase；双葡基海藻糖中糖化酶处理后海藻糖和葡萄糖的比例TRE/Glu可达0.45。

麦芽四糖水解酶基因为下述M11)-M13)中的任一种DNA分子：

M11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；

M12)在严格条件下与M11)限定的DNA分子杂交且编码麦芽四糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；

M13)与M11)或M12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽四糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；

麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因为下述S11)-S13)中的任一种DNA分子：

S11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；

S12)在严格条件下与S11)限定的DNA分子杂交且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA；

S13)与S11)或S12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA。

双葡基海藻糖的制备方法还包括：将麦芽四糖水解酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽四糖水解酶；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

双葡基海藻糖的制备方法还包括：将麦芽寡糖海藻糖合成酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽寡糖海藻糖合成酶；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

酶活检测和酶活单位定义如下：

(1)麦芽四糖水解酶酶活测定和定义

将DE11(诺维信)溶于DDW中配制成10％(W/V)的溶液，取500μL上述10％的DE11溶液加入纯化的MTAase 10μL，pH6.5的1mol/L磷酸钠缓冲液50μL，DDW 440μL至体积1mL，40℃反应30min，100℃水浴10min灭活MTAase终止反应。麦芽四糖水解酶能从麦芽糊精上依次切下麦芽四糖。通过HPLC检测麦芽四糖的物质的量可计算MTAase的酶活。MTAase的酶活单位(U)定义为每分钟生成1μmol麦芽四糖所需的酶量。

(2)麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活测定和定义

用DDW配制40％(W/V)的麦芽五糖水溶液，取25μL上述40％的麦芽五糖溶液加入纯化的MTSase 1μL、pH7.0的1mol/L磷酸钠缓冲液5μL、DDW 64μL至体积100μL，40℃反应10min后，100℃水浴10min灭活MTSase终止反应,上述反应液调pH至约4.0,加糖化酶(诺维信公司)40℃处理。

糖化酶可以水解α,α-1,4糖苷键，但不能水解α,α-1,1糖苷键，因此糖化酶处理后的反应液中只有葡萄糖和海藻糖，且海藻糖的物质的量等于MTSase作用生成的麦芽三糖基海藻糖的物质的量。通过HPLC检测海藻糖的物质的量即可获得麦芽三糖基海藻糖的量进而可以计算MTSase的酶活。MTSase的酶活单位(U)定义为每分钟转化1μmol麦芽五糖生成1μmol麦芽三糖基海藻糖所需的酶量。

菌体活化培养基(LB培养基)组成：1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠，pH约7.0。

自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；

D.1M MgSO4；

E.1000×微量元素：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2Mo4、Na2SeO3和H3BO3各2mM。

产酶工程菌的构建：

通过基因合成后的MTAase和MTSase基因分别连接于pUC57载体，得到的载体pUC57-MTAase和pUC57-MTSase作为模板。

引物设计：根据优化的基因序列，用primer5.0设计引物，引物序列如下：

MTAase上游引物：

5’-CCGCTCGAGATGTCACAGACCCTGCGC-3’下划线为Xho I酶切位点；

MTAase下游引物：

5’-CGGAATTCTTAAAATGAACCTGAGGTG-3’下划线为EcoR I酶切位点。

MTSase上游引物：

5’-GGGGTACCATGCGTACCCCGGTTTCTAC-3’下划线为Kpn I酶切位点；

MTSase下游引物：

5’-CCGGAATTCTTAAGATTCACCACCGGTCTG-3’下划线为EcoR I酶切位点。

(聚合酶链式反应)扩增体系：分别以pUC57-MTAase和pUC57-MTSase载体作为模板，扩增目的基因，条件如下：模板1μL，上下游引物各2μL(10μM),dNTP 4μL，5×fastpfubuffer 10μL,fastpfu DNA聚合酶(北京全式金公司)1μL，DDW 30μL至终体积50μL。

PCR反应程序为：98℃预变性2min，94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸2kb/min，30个循环，最后72℃延伸3min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证，其分子量大小约为1600bp和2300bp，与目的基因大小相当。

PCR产物回收：用PCR产物纯化回收试剂盒(Omega)回收PCR产物，具体操作步骤如试剂盒说明书。

酶切回收：上述PCR纯化回收的MTAase和MTSase基因片段分别用Xho I/EcoR I和Kpn I/EcoR I酶切，载体pBAD分别用Xho I/EcoR I和Kpn I/EcoR I酶切，限制性内切酶(NEB)酶切处理具体步骤如下：10×cutsmart buffer 5μL,对应的Xho I/EcoR I或Kpn I/EcoR I各1μL,DNA 10μL(约1.8μg)，DDW 33μl至终体积50μL，37℃温育2小时。酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳后用Omega胶回收试剂盒回收对应的目的片段。具体操作步骤如试剂盒说明书。

载体与目的基因的连接：双酶切回收的载体与相对应的目的片段用T4 DNAligase(fermentas)连接。连接体系如下：10×T4 DNA ligase buffer 1μL,PEG4000 1μL,纯化回收的酶切pBAD-hisB载体(购自invitrogen公司)3μL，纯化回收的酶切目的基因4.5μL，T4 DNA ligase 0.5μL。22℃连接1小时。

转化：上述连接产物转化Trans T1感受态细胞(北京全式金公司)。具体步骤为：取5μL上述连接产物加入融化了的100μL Trans T1感受态细胞,冰浴30min，42℃热激60s，再置于冰上2-5min，加入LB培养基500μL于37℃摇床200rpm活化1小时。取100μL上述活化的菌液均匀涂于加有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃恒温培养箱培养过夜。

阳性克隆的鉴定：上述平板挑单克隆至加有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃下250rpm培养10-12小时，进行质粒提取，将获得的质粒进行测序(北京睿博兴科测序公司)验证目的基因是否正确构建进入载体中。

相关酶的表达与纯化：

相关酶的表达：

上述验证正确的表达载体pBAD-MTAase和pBAD-MTSase，转化到表达菌株大肠杆菌BW25113(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：TomoyaBaba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill ADatsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner,and Hirotada Mori1.Construction ofEscherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)感受成细胞中，将转化菌液均匀涂布于加有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，从平板中挑3个单克隆至加有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养37℃250rpm进行活化10-12小时，再以1％的接种量接种至ZYM自诱导培养基，并用终浓度为0.2％(W/V)的L-阿拉伯糖诱导，诱导条件为30℃220rpm，诱导14-16小时后离心收集菌体，超声破碎所收集的菌体，离心后取上清与沉淀用SDS-PAGE电泳验证蛋白表达，并用离心上清检测MTAase、MTSase的酶活。蛋白电泳结果表明MTSase表达很好，MTAase的表达量适宜。

细胞破碎上清检测酶活，诱导的pBAD-MTAase/BW25113发酵液可产生MTAase3365U/mL，pBAD-MTSase/BW25113发酵液可产生MTSase81U/mL。

相关酶的纯化：

上述表达正确的菌株先接至加有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃250rpm进行活化过夜，再以1％的接种量接种至200mL的ZYM自诱导培养基，并用终浓度为0.2％(W/V)的L-阿拉伯糖诱导，诱导条件为30℃220rpm，诱导14-16小时后离心收集菌体，所得菌体用DDW洗两次后用50mM pH8.0的Tris-HCl重悬至约50OD/mL。重悬的菌体进行超声破碎，条件如下：用直径为6mm的探头超声破碎总时间25min，每个循环超声5s,间隙8s，30％功率。破碎的菌液11000rpm离心30min，离心两次以除去未破碎的细胞及沉淀，上述离心的样品上清用0.22μm水系滤膜过滤后即可进行相关蛋白纯化。

蛋白纯化：用AKTA FPLC仪器进行蛋白纯化。具体操作见AKTA FPLC操作说明。先用Binding buffer(500mM NaCl+50mM Tris-HCl,pH8.0)上样使目的蛋白与1mL的Ni-NTA预装柱(GE公司)结合，用5％的Elution buffer(100mM NaCl+50mM Tris-HCl+500mM咪唑)洗去杂蛋白后用再用20-40％的Elution buffer洗脱目的蛋白。洗脱下来的目的蛋白装入透析袋在50mM pH8.0的Tris-HCl透析四至五次，每次1小时以上。透析过的蛋白通过向透析袋外加入固体PEG4000-20000进行浓缩。浓缩后的蛋白加入甘油至甘油终浓度为30％-50％(V/V)，于-20℃或-80℃保存。蛋白浓度测定采用Bradford法，用Bradford试剂盒(上海生工生物)用BSA作对照，具体方法见相关说明书。

酶法转化生产双葡基海藻糖：

双酶分开处理：在30％(W/V)的DE11(诺维信)1mL中先加入MTAase重组菌细胞破碎上清100μL，pH6.5，45℃反应12小时L，煮沸灭活MTAase，再加入MTSase的重组菌细胞破碎上清100μL,pH7.0，40℃反应12小时，反应产物用高效液相色谱(HPLC)检测，产物以双葡基海藻糖为主，TRE/GLU可达0.30。(如图1所示)

双酶一锅法处理：在30％(W/V)的DE11(诺维信)1mL中加入MTAase与MTSase的重组菌细胞破碎上清各100μL,pH6.5，40℃反应12小时，反应产物用高效液相色谱(HPLC)检测，产物以双葡基海藻糖为主，TRE/GLU可达0.36。(如图2所示)。

从上述结果可以看出，双酶一锅法处理，减少了双葡基海藻糖的生产时间，提高了生产效率。

切支酶(以普鲁兰酶为例)在双葡基海藻糖生产中的应用：

以30％(W/V)的DE6(诺维信)为底物，按每克干物质的量分别加入MTAase与MTSase粗酶液各20OD和4OD，pH6-6.5，40℃反应12小时，TRE/GLU为0.29。

以30％(W/V)的DE6(诺维信)为底物，调节pH至约6.0，加入普鲁兰酶50℃处理过夜后再调pH至约6.5，按每克干物质的量分别加入MTAase与MTSase粗酶液各20OD和4OD，40℃反应12小时，TRE/GLU为0.44。

以30％(W/V)的DE11(诺维信)为底物，按每克干物质的量分别加入MTAase与MTSase粗酶液各20OD和4OD，pH6-6.5，40℃反应12小时，TRE/GLU为0.36。

以30％(W/V)的DE11(诺维信)为底物，调节pH至约6.0，加入普鲁兰酶50℃处理过夜后再调pH至约6.5，按每克干物质的量分别加入MTAase与MTSase粗酶液各20OD和4OD，40℃反应12小时，TRE/GLU为0.45。

综上，以DE6或DE11直接作为底物，加入切支酶(如普鲁兰酶)预处理后再加入MTAase与MTSase处理，双葡基海藻糖的TRE/GLU有显著提高可达0.45左右。

实施例2：一种根据实施例1制备的双葡基海藻糖生产成套试剂。

实施例3：一种用于生产双葡基海藻糖的生物材料

C1)用于生产双葡基海藻糖的成套DNA分子，包括实施例1中的麦芽四糖水解酶基因和麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因，各基因各自独立包装；

C2)用于生产双葡基海藻糖的重组载体或成套重组载体，重组载体或成套重组载体能产生实施例1中的双葡基海藻糖生产成套试剂；

C3)用于生产双葡基海藻糖的重组细胞或成套重组细胞，重组细胞或成套重组细胞能产生实施例1中的双葡基海藻糖生产成套试剂。重组细胞或成套重组细胞为大肠杆菌。

实施例4：一种根据实施例3制得的产品，C2)重组载体或成套重组载体为利用C1)所成套DNA分子产生实施例1中的双葡基海藻糖生产成套试剂的载体；C3)重组细胞或成套重组细胞为利用C1)所成套DNA分子产生实施例1双葡基海藻糖生产成套试剂的细胞。

实施例5：实施例2中的双葡基海藻糖生产成套试剂在制备双葡基海藻糖中的应用。

实施例3中的用于生产双葡基海藻糖的生物材料在制备双葡基海藻糖中的应用；

实施例4中所述的产品在制备双葡基海藻糖中的应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO.1的序列如下：

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种双葡基海藻糖的制备方法

<130> 2018.11.7

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 551

<212> PRT

<213> 人工合成（Saccharum）

<400> 1

Met Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Ile Leu Leu Pro

1 5 10 15

Phe Pro Ala Leu Ala Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg

20 25 30

Tyr His Gly Gly Asp Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val

35 40 45

Val Arg Glu Ala Pro Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala

50 55 60

Ser Thr Ile Ala Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro

65 70 75 80

Trp Arg Asp Phe Ser Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Glu Gly Tyr Phe Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser

100 105 110

Asp Ala Gln Leu Arg Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val

115 120 125

Lys Val Leu Tyr Asp Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro

130 135 140

Asp Lys Glu Ile Asn Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe Trp Arg Asn Asp

145 150 155 160

Cys Ala Asp Pro Gly Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg

165 170 175

Phe Ile Gly Gly Glu Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr

180 185 190

Gly Met Phe Arg Asp Glu Leu Ala Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala

195 200 205

Gly Gly Phe Arg Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val

210 215 220

Asp Ser Trp Met Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu

225 230 235 240

Leu Trp Lys Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr

245 250 255

Ala Ser Trp Gln Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys

260 265 270

Pro Val Phe Asp Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val

275 280 285

Ala Asp Trp Lys His Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg

290 295 300

Glu Val Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro

305 310 315 320

Gly Gln Asn Gly Gly Gln His His Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile

325 330 335

Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val

340 345 350

Tyr Trp Ser His Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln

355 360 365

Leu Ile Gln Val Arg Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile

370 375 380

Ser Phe His Ser Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser

385 390 395 400

Gln Gln Thr Leu Val Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly

405 410 415

Gln Val Ala Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly

420 425 430

Gln Val Arg Val Trp Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp

435 440 445

Gly Gly Glu Gly Gly Leu Val Asn Val Asn Phe Arg Cys Asp Asn Gly

450 455 460

Val Thr Gln Met Gly Asp Ser Val Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln

465 470 475 480

Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Ser Ala Val Arg Leu Thr Asp Thr Ser

485 490 495

Ser Tyr Pro Thr Trp Lys Gly Ser Ile Ala Leu Pro Asp Gly Gln Asn

500 505 510

Val Glu Trp Lys Cys Leu Ile Arg Asn Glu Ala Asp Ala Thr Leu Val

515 520 525

Arg Gln Trp Gln Ser Gly Gly Asn Asn Gln Val Gln Ala Ala Ala Gly

530 535 540

Ala Ser Thr Ser Gly Ser Phe

545 550

SEQ ID NO.2的序列如下：

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种双葡基海藻糖的制备方法

<130> 2018.11.7

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 2

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工合成（Saccharum）

<400> 2

atgtcacaga ccctgcgcgc ggctgtgctg gctgctattc tgctgccgtt tccggcactg 60

gctgatcagg cgggcaaaag tccggccggt gtgcgttatc atggtggtga tgaaattatt 120

ctgcaaggct ttcattggaa tgttgttcgc gaagcaccga atgattggta taatattctg 180

cgccagcagg caagtaccat tgcggccgat ggtttttctg ctatttggat gccggtgccg 240

tggcgcgatt ttagctcttg gaccgatggc ggcaaaagtg gcggtggcga aggttatttt 300

tggcatgatt ttaataaaaa tggccgttat ggctctgatg cacagctgcg tcaggcagcg 360

ggcgccctgg gtggtgcagg tgttaaagtt ctgtatgatg tggtgccgaa tcacatgaat 420

cgtggctatc cggataaaga aattaatctg ccggctggtc agggtttttg gcgcaatgat 480

tgtgctgatc cgggcaatta tccgaatgat tgtgatgatg gtgatcgttt tattggcggc 540

gaatcagatt taaataccgg ccatccgcag atttatggta tgtttcgcga tgaactggca 600

aatctgcgct ctggctatgg cgccggtggc tttcgttttg attttgttcg tggttatgct 660

ccggaacgtg tggattcatg gatgagtgat tctgccgatt cttcattttg tgttggtgaa 720

ctgtggaaag gtccgagtga atatccgagc tgggattggc gcaataccgc tagttggcag 780

cagattatta aagattggtc tgatcgtgca aaatgtccgg tgtttgattt tgcgctgaaa 840

gaacgtatgc agaatggcag cgtggcggat tggaaacatg gcctgaatgg taatccggac 900

cctcgttggc gcgaagttgc agttaccttt gttgataatc atgataccgg ctatagtccg 960

ggccagaatg gtggccagca tcattgggct ctgcaagatg gtctgattcg tcaggcttat 1020

gcatatattc tgaccagtcc gggtacaccg gtggtgtatt ggtctcacat gtatgattgg 1080

ggttatggcg attttattcg ccagctgatt caggtgcgcc gtaccgcagg cgtgcgtgca 1140

gattcagcaa ttagctttca tagtggctat tctggtctgg ttgcgaccgt gtctggctct 1200

cagcagaccc tggtggtggc gctgaatagc gatctggcta atccgggtca ggtggcgtca 1260

ggcagctttt cagaagccgt taatgcgtca aatggtcagg tgcgcgtttg gcgtagtggt 1320

agtggcgatg gtggcggtaa tgatggcggt gaaggtggcc tggtgaatgt gaattttcgt 1380

tgcgataatg gtgttaccca gatgggtgat tctgtttatg ccgttggtaa tgttagccag 1440

ctgggcaatt ggagcccggc ctcagccgtt cgcctgaccg atacctcaag ttatccgacc 1500

tggaaaggta gcattgccct gccggatggc cagaatgttg aatggaaatg cctgattcgt 1560

aatgaagccg atgccaccct ggttcgccag tggcagagcg gtggtaataa tcaggttcag 1620

gccgcggcgg gtgcgagcac ctcaggttca ttttaa 1656

SEQ ID NO.3的序列如下：

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种双葡基海藻糖的制备方法

<130> 2018.11.7

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 3

<211> 775

<212> PRT

<213> 人工合成（Saccharum）

<400> 3

Met Arg Thr Pro Val Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Arg Lys Gly Phe

1 5 10 15

Thr Leu Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Pro Tyr Leu His Ser Leu Gly

20 25 30

Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Val Leu Thr Ala Glu Gln Gly Ser

35 40 45

Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu Arg

50 55 60

Gly Gly Pro Glu Gly Leu Ala Ala Val Ser Lys Ala Ala Arg Ala Ala

65 70 75 80

Gly Met Gly Val Leu Ile Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala

85 90 95

Thr Pro Ala Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly Arg

100 105 110

Gln Ser Arg Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Ala Gly

115 120 125

Gly Arg Ile Arg Leu Pro Val Leu Gly Ser Asp Asp Asp Leu Asp Gln

130 135 140

Leu Glu Ile Arg Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe Pro

145 150 155 160

Leu Ala Glu Gly Thr Tyr Ala Glu Gly Asp Ala Pro Arg Asp Val His

165 170 175

Ala Arg Gln His Tyr Glu Leu Ile Gly Trp Arg Arg Ala Asp Asn Glu

180 185 190

Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Gly Val Arg

195 200 205

Val Glu Ile Pro Ala Val Phe Asp Glu Ala His Gln Glu Val Val Arg

210 215 220

Trp Phe Arg Glu Asp Leu Ala Asp Gly Leu Arg Ile Asp His Pro Asp

225 230 235 240

Gly Leu Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Val Thr

245 250 255

Gly Gly Ala Tyr Leu Leu Ile Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu Gln

260 265 270

Leu Pro Ala Ser Phe Glu Cys Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Val Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Arg Gly Gln Glu Pro Leu

290 295 300

Asp Arg Leu Asp Ala Ser Leu Arg Gly Gly Glu Pro Ala Asp Tyr Gln

305 310 315 320

Asp Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Arg Ile Thr Asp Gly Ile Leu His

325 330 335

Ser Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Gly Asp Ala Asn Val

340 345 350

Ser Ile Asp Ala Gly Ala Asp Ala Leu Ala Glu Ile Ile Ala Ala Phe

355 360 365

Pro Val Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Glu Val Leu Lys Glu

370 375 380

Ala Cys Glu Leu Ala Ala Arg Arg Arg Pro Glu Leu Asp Gln Ala Ile

385 390 395 400

Gln Ala Leu Gln Pro Leu Leu Leu Asp Thr Asp Leu Glu Leu Ala Arg

405 410 415

Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu Asp

420 425 430

Thr Ala Phe Phe Arg Tyr Asn Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val Gly

435 440 445

Ala Asp Pro Thr Glu Phe Ala Val Glu Pro Asp Glu Phe His Ala Arg

450 455 460

Leu Ala Arg Arg Gln Ala Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Leu Ser

465 470 475 480

Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ser Val

485 490 495

Ile Ser Glu Val Ala Gly Asp Trp Glu Lys Ala Leu Asn Arg Leu Arg

500 505 510

Asp Leu Ala Pro Leu Pro Asp Gly Pro Leu Ser Ala Leu Leu Trp Gln

515 520 525

Ala Ile Ala Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Tyr Tyr

530 535 540

Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Asn Trp Thr Asp

545 550 555 560

Pro Ala Pro Ala Phe Glu Glu Lys Leu Lys Ala Ala Val Asp Ala Val

565 570 575

Phe Asp Asn Pro Ala Val Gln Ala Glu Val Glu Ala Leu Val Glu Leu

580 585 590

Leu Glu Pro Tyr Gly Ala Ser Asn Ser Leu Ala Ala Lys Leu Val Gln

595 600 605

Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Trp

610 615 620

Asp Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Phe Ser Phe Asp

625 630 635 640

Asp Arg Arg Ala Ala Leu Glu Gln Leu Asp Ala Gly Asp Leu Pro Ala

645 650 655

Ser Phe Thr Asp Glu Arg Thr Lys Leu Leu Val Thr Ser Arg Ala Leu

660 665 670

Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Thr Gly Tyr Arg Pro Val

675 680 685

Leu Ala Ser Gly Pro Ala Ala Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Arg Gly

690 695 700

Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro Tyr

705 710 715 720

Gly Leu Glu Gln Ser Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Glu Leu Asn

725 730 735

Thr Ala Met Lys Asp Glu Leu Thr Gly Ala Gly Phe Gly Pro Gly Ala

740 745 750

Val Lys Ile Ala Asp Ile Phe Arg Ser Phe Pro Val Ala Leu Leu Val

755 760 765

Pro Gln Thr Gly Gly Glu Ser

770 775

SEQ ID NO.4的序列如下：

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种双葡基海藻糖的制备方法

<130> 2018.11.7

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 4

<211> 2328

<212> DNA

<213> 人工合成（Saccharum）

<400> 4

atgcgtaccc cggtttctac ctaccgtctg cagatccgta aaggtttcac cctgttcgac 60

gctgctaaaa ccgttccgta cctgcactct ctgggtgttg actgggttta cctgtctccg 120

gttctgaccg ctgaacaggg ttctgaccac ggttacgacg ttaccgaccc gtctgctgtt 180

gacccggaac gtggtggtcc ggaaggtctg gctgctgttt ctaaagctgc tcgtgctgct 240

ggtatgggtg ttctgatcga catcgttccg aaccacgttg gtgttgctac cccggctcag 300

aacccgtggt ggtggtctct gctgaaagaa ggtcgtcagt ctcgttacgc tgaagctttc 360

gacgttgact gggacctggc tggtggtcgt atccgtctgc cggttctggg ttctgacgac 420

gacctggacc agctggaaat ccgtgacggt gaactgcgtt actacgacca ccgtttcccg 480

ctggctgaag gtacctacgc tgaaggtgac gctccgcgtg acgttcacgc tcgtcagcac 540

tacgaactga tcggttggcg tcgtgctgac aacgaactga actaccgtcg tttcttcgct 600

gttaacaccc tggctggtgt tcgtgttgaa atcccggctg ttttcgacga agctcaccag 660

gaagttgttc gttggttccg tgaagacctg gctgacggtc tgcgtatcga ccacccggac 720

ggtctggctg acccggaagg ttacctgaaa cgtctgcgtg aagttaccgg tggtgcttac 780

ctgctgatcg aaaaaatcct ggaaccgggt gaacagctgc cggcttcttt cgaatgcgaa 840

ggtaccaccg gttacgacgc tctggctgac gttgaccgtg ttctggttga cccgcgtggt 900

caggaaccgc tggaccgtct ggacgcttct ctgcgtggtg gtgaaccggc tgactaccag 960

gacatgatcc gtggtaccaa acgtcgtatc accgacggta tcctgcactc tgaaatcctg 1020

cgtctggctc gtctggttcc gggtgacgct aacgtttcta tcgacgctgg tgctgacgct 1080

ctggctgaaa tcatcgctgc tttcccggtt taccgtacct acctgccgga aggtgctgaa 1140

gttctgaaag aagcttgcga actggctgct cgtcgtcgtc cggaactgga ccaggctatc 1200

caggctctgc agccgctgct gctggacacc gacctggaac tggctcgtcg tttccagcag 1260

acctctggta tggttatggc taaaggtgtt gaagacaccg ctttcttccg ttacaaccgt 1320

ctgggtaccc tgaccgaagt tggtgctgac ccgaccgaat tcgctgttga accggacgaa 1380

ttccacgctc gtctggctcg tcgtcaggct gaactgccgc tgtctatgac caccctgtct 1440

acccacgaca ccaaacgttc tgaagacacc cgtgctcgta tctctgttat ctctgaagtt 1500

gctggtgact gggaaaaagc tctgaaccgt ctgcgtgacc tggctccgct gccggacggt 1560

ccgctgtctg ctctgctgtg gcaggctatc gctggtgctt ggccggcttc tcgtgaacgt 1620

ctgcagtact acgctctgaa agctgctcgt gaagctggta actctaccaa ctggaccgac 1680

ccggctccgg ctttcgaaga aaaactgaaa gctgctgttg acgctgtttt cgacaacccg 1740

gctgttcagg ctgaagttga agctctggtt gaactgctgg aaccgtacgg tgcttctaac 1800

tctctggctg ctaaactggt tcagctgacc atgccgggtg ttccggacgt ttaccagggt 1860

accgaattct gggaccgttc tctgaccgac ccggacaacc gtcgtccgtt ctctttcgac 1920

gaccgtcgtg ctgctctgga acagctggac gctggtgacc tgccggcttc tttcaccgac 1980

gaacgtacca aactgctggt tacctctcgt gctctgcgtc tgcgtcgtga ccgtccggaa 2040

ctgttcaccg gttaccgtcc ggttctggct tctggtccgg ctgctggtca cctgctggct 2100

ttcgaccgtg gtaccgctgc tgctccgggt gctctgaccc tggctacccg tctgccgtac 2160

ggtctggaac agtctggtgg ttggcgtgac accgctgttg aactgaacac cgctatgaaa 2220

gacgaactga ccggtgctgg tttcggtccg ggtgctgtta aaatcgctga catcttccgt 2280

tctttcccgg ttgctctgct ggttccgcag accggtggtg aatcttaa 2328

Claims (9)

1.一种双葡基海藻糖的制备方法，双葡基海藻糖是由一个麦芽糖和一个海藻糖通过α-1,4糖苷键结合的非还原性糖，其特征在于，包括将底物与双葡基海藻糖生产成套试剂进行反应得到双葡基海藻糖；所述双葡基海藻糖生产成套试剂包括麦芽四糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶；所述底物为淀粉或淀粉水解物；

所述麦芽四糖水解酶为如下M1）的蛋白质：

M1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶为下述S1）的蛋白质：

S1）氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的一种双葡基海藻糖的制备方法，其特征在于，所述双葡基海藻糖生产成套试剂还包括切支酶。

3.根据权利要求1所述的一种双葡基海藻糖的制备方法，其特征在于，双葡基海藻糖的制备方法还包括：将麦芽四糖水解酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽四糖水解酶；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

4.根据权利要求1所述的一种双葡基海藻糖的制备方法，其特征在于，双葡基海藻糖的制备方法还包括：将麦芽寡糖海藻糖合成酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽寡糖海藻糖合成酶；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

5.根据权利要求1所述的一种双葡基海藻糖的制备方法，其特征在于，所述麦芽四糖水解酶基因为下述M11）-M13）中的任一种DNA分子：

M11）编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；

M12）在严格条件下与M11）限定的DNA分子杂交且编码所述麦芽四糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；

M13）与M11）或M12）限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽四糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因为下述S11）-S13）中的任一种DNA分子：

S11）编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；

S12）在严格条件下与S11）限定的DNA分子杂交且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA；

S13）与S11）或S12）限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA。

6.一种根据权利要求1或2所述的双葡基海藻糖的制备方法中的双葡基海藻糖生产成套试剂。

7.一种用于生产双葡基海藻糖的生物材料，其特征在于：

C1）用于生产双葡基海藻糖的成套DNA分子，包括权利要求4-6中任一所述麦芽四糖水解酶基因和所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因，各基因各自独立包装；

C2）用于生产双葡基海藻糖的重组载体或成套重组载体，所述重组载体或所述成套重组载体能产生权利要求1或2所述双葡基海藻糖生产成套试剂；

C3）用于生产双葡基海藻糖的重组细胞或成套重组细胞，所述重组细胞或所述成套重组细胞能产生权利要求1或2所述双葡基海藻糖生产成套试剂。

8.一种根据权利要求7所述的用于生产双葡基海藻糖的生物材料制得的产品，其特征在于：

C2）所述重组载体或所述成套重组载体为利用C1）所述成套DNA分子产生权利要求1或2所述双葡基海藻糖生产成套试剂的载体；

C3）所述重组细胞或所述成套重组细胞为利用C1）所述成套DNA分子产生权利要求1或2所述双葡基海藻糖生产成套试剂的细胞。

9.如权利要求6中所述的双葡基海藻糖生产成套试剂在制备双葡基海藻糖中的应用；

如权利要求7中所述的用于生产双葡基海藻糖的生物材料在制备双葡基海藻糖中的应用；

如权利要求8中所述的产品在制备双葡基海藻糖中的应用。