CN108118047A

CN108118047A - 一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用

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Publication number: CN108118047A
Application number: CN201611062071.XA
Authority: CN
Inventors: 林白雪; 袁慎键; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2018-06-05

Abstract

本发明公开了一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用。本发明通过用不同长度及不同刚柔性的连接肽融合表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶，率先将MTSase与MTHase进行融合表达，得到一系列同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的双功能酶，并将其用于海藻糖的生产，进一步提高了海藻糖的转化率，并减少了培养菌株的数量，节约了生产工艺与成本，为海藻糖的经济高效生产奠定了基础。

Description

一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用。

背景技术

海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α-1,1糖苷键结合的非还原性糖，分子式为C₁₂H₂₂0₁₁，其相对分子量为342.30。其结构式如式1所示：

海藻糖广泛存在于细菌、酵母、藻类、真菌、昆虫以及一些抗逆性植物中。它对生物大分子具有非特异性的保护作用，这种保护作用体现在：当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压等恶劣环境时，细胞内海藻糖含量迅速上升，对多种大分子产生保护作用，从而维持生物体生命特性，因此海藻糖在科学界素有“生命之糖”的美誉。

目前海藻糖的生产工艺主要有如下三种：一是微生物提取法，二是微生物发酵法，三是酶转化法。酶转化法因为底物来源广泛，转化率高，是工业化生产海藻糖的主要方法。酶转化法根据底物的不同又可以分为如下三种方法：

(1)以葡萄糖为底物：利用专一性很强的海藻糖-6-磷酸合成酶与海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶共同作用生成海藻糖，该方法以葡萄糖-6-磷酸为糖基受体，以UDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖为糖基供体，在整个反应中要消耗高能物质，因此难以实现工业化生产。

(2)以麦芽糖为底物的单酶法：海藻糖合成酶具有较严格的底物专一性，只作用于麦芽糖生成海藻糖及海藻糖生成麦芽糖。此方法反应简单，底物麦芽糖价格便宜，这是较理想的工业生产途径。但海藻糖合成酶催化的是一个可逆反应，它既可以催化麦芽糖生成海藻糖，也可以催化海藻糖生成麦芽糖，当反应进行到一定程度时麦芽糖与海藻糖的转化会达到相对平衡，因此转化率达到60％-70％以后难以再有提高。

(3)以淀粉为底物的双酶法：利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻海藻糖水解酶的作用将淀粉水解物转化为海藻糖，这类酶体系转化率可达80％以上，1995年日本林原公司将该方法应用于工业化大规模生产海藻糖，使海藻糖的价格大大降低。利用双酶法转化率高，原料淀粉价格便宜，来源广泛，是海藻糖工业化生产的主要方法。

以上方法中，以淀粉为底物双酶生产海藻糖是一种较为经济的方式，但目前生产方式存在酶的产量低，转化率得不到进一步提高等问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白。

本发明提供的融合蛋白由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和用于连接二者的连接肽组成；

所述连接肽氨基酸序列为序列4或序列8。

上述融合蛋白中，

所述连接肽的个数为1个或2个或3个或4个或5个或6个。

上述融合蛋白中，

所述融合蛋白的氨基酸序列由所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列、所述连接肽氨基酸序列和所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列组成；且所述连接肽氨基酸序列的第一个氨基酸残基与所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列的最后一个氨基酸残基紧邻，所述连接肽氨基酸序列的最后一个氨基酸残基与所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列的第一个氨基酸残基紧邻。

上述融合蛋白中，

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列为序列2的第1-775位；

所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列为序列2的第776-1373位。

本发明的第二个目的是提供与上述融合蛋白相关的生物材料。

本发明提供的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码上述融合蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，所述核酸分子为如下1)-3)所示的基因：

1)其核苷酸序列由所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码DNA分子核苷酸序列、所述连接肽编码DNA分子核苷酸和所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶编码DNA分子核苷酸组成；且所述连接肽编码DNA分子核苷酸的第一个碱基与所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码DNA分子核苷酸的最后一个碱基紧邻，所述连接肽编码DNA分子核苷酸的最后一个碱基与所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶核苷酸序列的第一个碱基紧邻；

所述连接肽编码DNA分子核苷酸为序列3或序列7；

所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码DNA分子核苷酸序列为序列1第426-2750位；

所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶编码DNA分子核苷酸序列为序列1第2751-4547位；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

本发明的第三个目的是提供上述融合蛋白的新用途。

本发明提供了上述融合蛋白在作为双功能酶中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述生物材料在制备双功能酶中的应用。

上述应用中，所述双功能酶为同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的双功能酶。

本发明的第五个目的是提供上述融合蛋白或上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述融合蛋白或上述生物材料在如下b1)-b6)中任一种中的应用：

b1)海藻糖生产；

b2)制备海藻糖生产的产品；

b3)提高海藻糖生产的效率；

b4)制备提高海藻糖生产的效率的产品。

b5)提高海藻糖转化率；

b6)制备提高海藻糖转化率的产品。

本发明的第六个目的是提供上述融合蛋白的制备方法。

本发明提供的上述融合蛋白的制备方法包括如下步骤：将上述融合蛋白的编码基因导入宿主菌中，得到重组菌；诱导培养所述重组菌，得到所述融合蛋白。

上述方法中，

所述宿主菌为大肠杆菌BW25113。

本发明的第七个目的是提供一种海藻糖的生产方法。

本发明提供的海藻糖的生产方法包括如下步骤：利用上述融合蛋白将淀粉水解物或淀粉转化为海藻糖。

上述方法中，所述融合蛋白和所述淀粉水解物的质量比为0.25mg：1g。

本发明的技术方案与现有技术方案相比具有如下优点：

(1)本发明率先将MTSase与MTHase进行融合表达，得到一系列同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的双功能酶，并将其用于海藻糖的生产。双功能酶的使用使原来需要培养的两株菌减少为一株，简化菌体培养的成本。

(2)MTHase单独表达时容易形成包涵体，其与MTSase融合表达后形成的融合酶绝大部分都以可溶形式存在，融合后提高了MTHase的可溶性。将上述融合酶用于海藻糖的生产，与自由酶相比，融合酶的使用提高了海藻糖生产的效率，并同时也提高了海藻糖的转化率。

(3)相关文献(Seo,J.S.,et al."Bifunctional recombinant fusion enzymebetween maltooligosyltrehalose synthase and maltooligosyltrehalosetrehalohydrolase of thermophilic microorganism Metallosphaera hakonensis."Journal of Microbiology&Biotechnology 18.9(2008):1544-9)提供了一种嗜热菌来源的MTS与MTH融合蛋白MhMTSH。该融合蛋白具有最适反应温度高的特点，因此可以减少其他微生物的污染，同时由于来源于嗜热菌，融合蛋白的热稳定性很好，在70℃下敷育48小时后仍有约80％的残留酶活。但是此融合蛋白的缺点同样突出，首先是融合蛋白的可溶性表达很差，目的蛋白基本上都以包涵体的形式存在于蛋白沉淀中，其次是此融合蛋白转化海藻糖的转化率不高，因此难以实现工业化生产。

本发明利用大肠杆菌重组表达海藻糖酶法转化相关的酶，通过用不同长度及不同刚柔性的连接肽融合表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶，获得了一系列可溶性表达很好的融合蛋白，并用于海藻糖的生产，提高了海藻糖的转化率(海藻糖转化率可达71-73％)，并减少了培养菌株的数量，节约了生产工艺与成本，为海藻糖的经济高效生产奠定了基础。

附图说明

图1为双功能酶酶活的TLC鉴定。其中，1:MTSH，2:MTSRH，3:MTSR2H，4:MTSR3H，5:MTSR5H，6:MTSFH，7:MTSF2H，8:MTSF3H，9:MTSF4H，10:MTSF5H，M:Marker，从上到下依次为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖。

图2为不同融合酶海藻糖转化率的比较。其中，CK为对照组处理(CK)；SH为融合酶(SH)；R1为融合酶(R1)；R2为融合酶(R2)；R3为融合酶(R3)；R5为融合酶(R5)；F1为融合酶(F1)；F2为融合酶(F2)；F3为融合酶(F3)；F4为融合酶(F4)；F5为融合酶(F5)。

图3为自由酶与融合酶转化效率的比较。其中，自由酶为对照组处理(ENZYME)，ArMTSFH融合酶为融合酶(F1)。

图4为融合蛋白的表达验证。其中，1:MTSH，2:MTSRH，3:MTSR2H，4:MTSR3H，5:MTSR5H，6:MTSFH，7:MTSF2H，8:MTSF3H，9:MTSF4H，10:MTSF5H，M:Marker，分子量从上到下依次为200kDa、150kDa、120kDa、100kDa、85kDa、70kDa、60kDa、50kDa、40kDa。

图5为自由酶的表达验证。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的菌体活化培养基(LB培养基)组成：1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠，pH约7.0。

下述实施例中的ZYM自诱导培养基为无菌培养基，其配制方法如下：100mL A+2mLB+2mL C+200μL D+100μL E；

A为ZY溶液，ZY溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨和0.5％(质量百分比浓度)酵母粉；

B为50×M溶液，50×M溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1.25MNa₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C为50×5052溶液，50×5052溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：25％(质量百分比浓度)甘油，2.5％(质量百分比浓度)葡萄糖，10％(质量百分比浓度)L-阿拉伯糖；

D为1M MgSO₄水溶液；

E为1000×微量元素溶液，1000×微量元素溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，2mM CoCl₂，2mM NiCl₂，2mMNa₂Mo₄，2mM Na₂SeO₃，2mM H₃BO₃。

下述实施例中的大肠杆菌BW25113在文献“Tomoya Baba,Takeshi Ara,MikiHasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,MasaruTomita,Barry L Wanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular SystemsBiology(2006):1-11.”中公开过，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、产酶工程菌的构建

本实施例利用大肠杆菌通过不同长度及不同刚柔性的连接肽F或R融合表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶，得到一系列同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的双功能酶。具体步骤如下：

一、表达载体的构建及鉴定

根据连接肽及其长度的不同，构建了如下12个不同的表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达载体。各个表达载体的名称及连入表达载体中的片段如表1所示。

表1、表达载体的组成

1、表达载体的构建

构建的12个表达载体具体如下：

(1)pBAD-MTSH载体

pBAD-MTSH载体为将序列1所示的含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段1替换pBAD载体(Invitrogen，产品目录号：V430-01)的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSH。其中，序列1所示的DNA分子的第426-2750位为麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因，第2751-4547位为麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因。

融合蛋白MTSH的氨基酸序列为序列2；其中，序列2的第1-775位为麦芽寡糖基海藻糖合成酶、第776-1373位为麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

(2)pBAD-MTSRH载体

pBAD-MTSRH载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、1个连接肽R的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段2替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSRH。其中，DNA片段2为将序列3所示的连接肽R的编码基因插入到序列1的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSRH的氨基酸序列为将序列4所示的连接肽R的氨基酸序列插入到序列2的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(3)pBAD-MTSR2H载体

pBAD-MTSR2H载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、2个连接肽R的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段3替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSR2H。其中，DNA片段3为将序列3所示的连接肽R的编码基因插入到DNA片段2的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSR2H的氨基酸序列为将序列4所示的连接肽R的氨基酸序列插入到融合蛋白MTSRH的氨基酸序列的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(4)pBAD-MTSR3H载体

pBAD-MTSR3H载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、3个连接肽R的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段4替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSR3H。其中，DNA片段4为将序列3所示的连接肽R的编码基因插入到DNA片段3的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSR3H的氨基酸序列为将序列4所示的连接肽R的氨基酸序列插入到融合蛋白MTSR2H的氨基酸序列的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(5)pBAD-MTSR5H载体

pBAD-MTSR5H载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、5个连接肽R的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段5替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSR5H。其中，DNA片段5为将序列5所示的2个连接肽R的编码基因插入到DNA片段4的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSR5H的氨基酸序列为将序列6所示的2个连接肽R的氨基酸序列插入到融合蛋白MTSR3H的氨基酸序列的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(6)pBAD-MTSFH载体

pBAD-MTSFH载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、1个连接肽F的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段6替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSFH。其中，其中，DNA片段6为将序列7所示的连接肽F的编码基因插入到序列1的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSFH的氨基酸序列为将序列8所示的连接肽F的氨基酸序列插入到序列2的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(7)pBAD-MTSF2H载体

pBAD-MTSF2H载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、2个连接肽F的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段7替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSF2H。其中，其中，DNA片段7为将序列7所示的连接肽F的编码基因插入到DNA片段6的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSF2H的氨基酸序列为将序列8所示的连接肽F的氨基酸序列插入融合蛋白MTSFH的氨基酸序列的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(8)pBAD-MTSF3H载体

pBAD-MTSF3H载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、3个连接肽F的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段8替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSF3H。其中，其中，DNA片段8为将序列7所示的连接肽F的编码基因插入到DNA片段7的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSF3H的氨基酸序列为将序列8所示的连接肽F的氨基酸序列插入融合蛋白MTSF2H的氨基酸序列的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(9)pBAD-MTSF4H载体

pBAD-MTSF4H载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、4个连接肽F的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段9替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSF4H。其中，其中，DNA片段9为将序列7所示的连接肽F的编码基因插入到DNA片段8的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSF4H的氨基酸序列为将序列8所示的连接肽F的氨基酸序列插入融合蛋白MTSF3H的氨基酸序列的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(10)pBAD-MTSF5H载体

pBAD-MTSF5H载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因、5个连接肽F的编码基因和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段10替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、连接肽和麦芽寡糖基海藻糖水解酶组成的融合蛋白MTSF5H。其中，DNA片段10为将序列7所示的连接肽F的编码基因插入到DNA片段9的第2750和2751位之间，且保持其他序列不变，得到的片段。

融合蛋白MTSF5H的氨基酸序列为将序列8所示的连接肽F的氨基酸序列插入融合蛋白MTSF4H的氨基酸序列的第775和776位之间，且保持其他序列不变，得到的序列。

(11)pBAD-MTS载体

pBAD-MTS载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTS)的编码基因编码基因的DNA片段11替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTS。其中，DNA片段11为将序列1中第2751-4547位缺失后，且保持其他序列不变，得到的序列。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTS的氨基酸序列为序列2的第1-775位。

(12)pBAD-MTH载体

pBAD-MTH载体为将含有麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTH)的编码基因的DNA片段12替换pBAD载体的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTH。其中，DNA片段12为将序列1中第426-2750位缺失后，且保持其他序列不变，得到的序列。

麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTH的氨基酸序列为序列2的第776-1373位。

2、表达载体的鉴定

将上述步骤1构建的12个表达载体分别加入100μL Trans T1感受态细胞(北京全式金公司)，冰浴30min，42℃热激60s，再置于冰上2-5min，加入LB培养基500μL于37℃摇床200rpm活化1小时。取100μL活化的菌液均匀涂于加有终浓度100μg/ml氨苄青霉素的LB固体平板，37℃恒温培养箱培养过夜。挑取阳性克隆提取质粒，并进行测序(北京铂尚测序公司)验证目的基因是否构建进入载体中。测序结果表明：上述表达载体均成功将目的基因构建到骨架载体中。

二、产酶工程菌的构建

1、产酶工程菌的构建

分别将上述测序验证正确的表达载体转化至大肠杆菌BW25113感受态细胞中，分别得到重组菌pBAD-MTSH/BW25113、pBAD-MTSRH/BW25113、pBAD-MTSR2H/BW25113、pBAD-MTSR3H/BW25113、pBAD-MTSR5H/BW25113、pBAD-MTSFH/BW25113、pBAD-MTSF2H/BW25113、pBAD-MTSF3H/BW25113、pBAD-MTSF4H/BW25113、pBAD-MTSF5H/BW25113、pBAD-MTS/BW25113、pBAD-MTH/BW25113。

2、产酶工程菌的鉴定

对上述12株重组菌进行菌液PCR验证，结果表明12株菌均正确，扩增条带大小与目标条带大小相同。

三、融合酶的表达与纯化

1、融合酶的表达

上述阳性菌株先接至加有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃250rpm进行活化过夜，再以1％的接种量接种至200mL的ZYM自诱导培养基，并用终浓度为0.2％(W/V)的L-阿拉伯糖(Coolaber，CA2231-10g)诱导，诱导条件为30℃220rpm，诱导14-16小时后离心收集菌体，所得菌体用双蒸水洗两次后用50mM pH8.0的Tris-HCl重悬至约50OD/mL。重悬的菌体进行超声破碎，条件如下：用直径为6mm的探头超声破碎总时间25min，每个循环超声5s，间隙8s，30％功率。破碎的菌液11000rpm离心30min，离心两次以除去未破碎的细胞及沉淀，离心后取上清，用SDS-PAGE电泳验证蛋白表达情况。

SDS-PAGE电泳结果如图4与图5所示。从图4可以看出：10株菌融合蛋白表达正常，均获得大小为150kDa的融合蛋白，分别将重组菌pBAD-MTSH/BW25113、pBAD-MTSRH/BW25113、pBAD-MTSR2H/BW25113、pBAD-MTSR3H/BW25113、pBAD-MTSR5H/BW25113、pBAD-MTSFH/BW25113、pBAD-MTSF2H/BW25113、pBAD-MTSF3H/BW25113、pBAD-MTSF4H/BW25113、pBAD-MTSF5H/BW25113表达的融合酶命名为融合酶(SH)、融合酶(R1)、融合酶(R2)、融合酶(R3)、融合酶(R5)、融合酶(F1)、融合酶(F2)、融合酶(F3)、融合酶(F4)和融合酶(F5)。从图5可以看出：MTS与MTH表达也正常，分别将pBAD-MTS/BW25113和pBAD-MTH/BW25113表达的自由酶命名为自由酶(MTS)和自由酶(MTH)，目的蛋白的大小分别约为85kDa和70kDa。

2、融合酶的纯化

分别将上述离心样品的上清液用0.22μm水系滤膜过滤后用AKTA FPLC仪器进行蛋白纯化(具体操作见AKTA FPLC操作说明)，分别得到纯化后的融合酶。具体步骤如下：先用Binding buffer(500mM NaCl+50mM Tris-HCl，pH8.0)上样使目的蛋白与1mL的Ni-NTA预装柱(GE公司)结合，用5％的Elution buffer(100mM NaCl+50mM Tris-HCl+500mM咪唑)洗去杂蛋白后，再用20-40％的Elution buffer洗脱目的蛋白。洗脱下来的目的蛋白装入透析袋在50mM pH8.0的Tris-HCl透析四至五次，每次1小时以上，得到透析后的蛋白。透析后的蛋白通过向透析袋外加入固体PEG4000-20000进行浓缩，得到蛋白浓度为1.4-3.5mg/mL的浓缩蛋白液，即为纯化后的融合酶。向浓缩蛋白液加入甘油至甘油体积百分数为50％(V/V)，于-20℃或-80℃保存，共获得10个融合蛋白、MTS自由酶和MTH自由酶共12个蛋白。

四、融合酶活性的初步鉴定

以DE11(淀粉酶水解淀粉得到的DE值为11的淀粉水解物，诺维信公司)为底物，分别加入步骤三制备的纯化后的融合酶，在pH为7.0，40℃条件下反应12小时，取样品进行TLC检测。具体步骤如下：

1、DE11的预处理

将底物DE11与双蒸水混匀，使DE11的质量百分数约为30％，并用乙酸-乙酸钠缓冲液调节pH至约5.0，得到DE11溶液；向DE11溶液中加入适量普鲁兰酶(promozyme D2，诺维信公司)5-15mL，DE11底物与普鲁兰酶的配比为1g：5μL，60℃反应过夜，得到普鲁兰酶处理的DE11。

2、DE11的转化

用磷酸钠缓冲液调节上述普鲁兰酶处理的DE11的pH至约7.0，分别向步骤1制备的普鲁兰酶处理的DE11中加入各融合酶的粗酶液(12OD破碎上清液)，每克底物DE11中加入12OD的各融合酶破碎上清，于40℃反应12小时，分别得到反应产物。分别将反应产物进行TLC初步检测，检测方法详见文献“Ryu S I,Park C S,Cha J,et al.A novel trehalose-synthesizing glycosyltransferase from Pyrococcus horikoshii:Molecular cloningand characterization[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2005,329(2):429-36.”，检测结果见附图1。

所有的样品在与麦芽糖相同的位置都有一个很浓的带(图1中红色框内的条带)，该条带是海藻糖，且海藻糖的含量较其他的糖更高，此结果说明融合酶同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶的活性。直接融合的MTSH条带(lane1)结果表明除了海藻糖和不能反应的麦芽三糖外，还有少许的麦芽四糖。而MTSRH(lane2)和MTSR2H(lane3)除了海藻糖外，还有麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖的存在，MTSR3H(lane4)除了海藻糖外，还有麦芽三糖和麦芽四糖。其他样品则基本上只有海藻糖与麦芽三糖。

实施例2、融合酶在海藻糖生产中的应用

一、自由酶与融合酶的转化率比较

以实施例1步骤四的1中获得的普鲁兰酶处理后的DE11为底物，按照加入的酶的不同分为如下对照组和实验组：

1、对照组处理(CK)

用磷酸钠缓冲液调节上述普鲁兰酶处理的DE11的pH至约7.0，然后加入0.14mgMTSase纯酶(实施例1的步骤三中的获得的纯化的MTS自由酶)和0.11mg MTHase纯酶(实施例1的步骤三中的获得的纯化的MTH自由酶)。其中，DE11底物、MTSase纯酶和MTHase纯酶的配比为1g：0.14mg：0.11mg。

2、实验组处理

用磷酸钠缓冲液调节上述普鲁兰酶处理的DE11的pH至约7.0，然后分别加入0.25mg的纯化后的融合酶(SH)、融合酶(R1)、融合酶(R2)、融合酶(R3)、融合酶(R5)、融合酶(F1)、融合酶(F2)、融合酶(F3)、融合酶(F4)和融合酶(F5)。其中，DE11底物与融合酶的质量比为1g：0.25mg。

将上述对照组与实验组溶液于40℃反应12小时，分别得到反应产物。分别用乙酸-乙酸钠缓冲液调节反应产物pH至4.0-4.5，并分别加入糖化酶(solarbio，货号：01-072)，DE11底物与糖化酶的配比为1g：1μL，在40℃条件下反应过夜，将未反应的麦芽寡糖完全转化为葡萄糖。所得样品经过煮沸灭活后制样，并对所得样品进行HPLC检测，具体检测方法见文献“Gan B B.Determination of Trehalose by HPLC[J].Guangxi Chemical Industry,2003.”，计算各个实验组中融合酶的海藻糖转化率。其中海藻糖的转化率计算方法为：海藻糖转化率＝海藻糖质量/DE11质量×100％。

检测结果如图2所示。结果表明：对照组的未融合酶的转化率为63％，融合酶(SH)的转化率为23.4％，以刚性连接肽(R)连接得到的融合酶的转化率中，随着连接肽(R)长度逐渐增加，转化率逐渐升高。而以柔性连接肽(F)连接得到的融合酶的转化率中，各组间转化率相差不大，均在70％左右，且所有以柔性连接肽(R)连接得到的融合酶的转化率均高于对照组，也高于融合酶(SH)的转化率。

二、自由酶与融合酶的转化效率比较

1、对照组处理(ENZYME)

2、实验组处理

用磷酸钠缓冲液调节上述普鲁兰酶处理的DE11的pH至约7.0，然后加入融合酶(F1)0.25mg。

将上述对照组与实验组溶液于40℃反应，分别于不同反应时间(0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h)取样，所得样品立即煮沸10min灭活酶，分别得到灭活反应后的产物，将灭活反应后的产物用乙酸-乙酸钠缓冲液调节pH至4.0-4.5，并分别加入糖化酶，在40℃条件下反应过夜，将未反应的麦芽寡糖完全转化为葡萄糖。所得样品经过煮沸灭活后制样，对所得样品进行HPLC检测，分别计算实验组在各个时间所得样品中融合酶(F1)的海藻糖转化率及对照组在各个时间所得样品中自由酶的海藻糖转化率。并比较转化效率(相同时间的转化率)。

结果如图3所示。从图中可以看出，相比于对照组的自由酶，融合酶(F1)(即图中的ArMTSFH)在不同反应时间(0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h)的转化率均有显著提高，最高可达73％左右。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用

<160>8

<210>1

<211>8192bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60

tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120

aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180

attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240

atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300

taacaggagg aattaaccat ggggggttct catcatcatc atcatcatgg tatggctagc 360

atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat ctgtacgacg atgacgataa ggatccgagc 420

tcgagatgcg taccccggtt tctacctacc gtctgcagat ccgtaaaggt ttcaccctgt 480

tcgacgctgc taaaaccgtt ccgtacctgc actctctggg tgttgactgg gtttacctgt 540

ctccggttct gaccgctgaa cagggttctg accacggtta cgacgttacc gacccgtctg 600

ctgttgaccc ggaacgtggt ggtccggaag gtctggctgc tgtttctaaa gctgctcgtg 660

ctgctggtat gggtgttctg atcgacatcg ttccgaacca cgttggtgtt gctaccccgg 720

ctcagaaccc gtggtggtgg tctctgctga aagaaggtcg tcagtctcgt tacgctgaag 780

ctttcgacgt tgactgggac ctggctggtg gtcgtatccg tctgccggtt ctgggttctg 840

acgacgacct ggaccagctg gaaatccgtg acggtgaact gcgttactac gaccaccgtt 900

tcccgctggc tgaaggtacc tacgctgaag gtgacgctcc gcgtgacgtt cacgctcgtc 960

agcactacga actgatcggt tggcgtcgtg ctgacaacga actgaactac cgtcgtttct 1020

tcgctgttaa caccctggct ggtgttcgtg ttgaaatccc ggctgttttc gacgaagctc 1080

accaggaagt tgttcgttgg ttccgtgaag acctggctga cggtctgcgt atcgaccacc 1140

cggacggtct ggctgacccg gaaggttacc tgaaacgtct gcgtgaagtt accggtggtg 1200

cttacctgct gatcgaaaaa atcctggaac cgggtgaaca gctgccggct tctttcgaat 1260

gcgaaggtac caccggttac gacgctctgg ctgacgttga ccgtgttctg gttgacccgc 1320

gtggtcagga accgctggac cgtctggacg cttctctgcg tggtggtgaa ccggctgact 1380

accaggacat gatccgtggt accaaacgtc gtatcaccga cggtatcctg cactctgaaa 1440

tcctgcgtct ggctcgtctg gttccgggtg acgctaacgt ttctatcgac gctggtgctg 1500

acgctctggc tgaaatcatc gctgctttcc cggtttaccg tacctacctg ccggaaggtg 1560

ctgaagttct gaaagaagct tgcgaactgg ctgctcgtcg tcgtccggaa ctggaccagg 1620

ctatccaggc tctgcagccg ctgctgctgg acaccgacct ggaactggct cgtcgtttcc 1680

agcagacctc tggtatggtt atggctaaag gtgttgaaga caccgctttc ttccgttaca 1740

accgtctggg taccctgacc gaagttggtg ctgacccgac cgaattcgct gttgaaccgg 1800

acgaattcca cgctcgtctg gctcgtcgtc aggctgaact gccgctgtct atgaccaccc 1860

tgtctaccca cgacaccaaa cgttctgaag acacccgtgc tcgtatctct gttatctctg 1920

aagttgctgg tgactgggaa aaagctctga accgtctgcg tgacctggct ccgctgccgg 1980

acggtccgct gtctgctctg ctgtggcagg ctatcgctgg tgcttggccg gcttctcgtg 2040

aacgtctgca gtactacgct ctgaaagctg ctcgtgaagc tggtaactct accaactgga 2100

ccgacccggc tccggctttc gaagaaaaac tgaaagctgc tgttgacgct gttttcgaca 2160

acccggctgt tcaggctgaa gttgaagctc tggttgaact gctggaaccg tacggtgctt 2220

ctaactctct ggctgctaaa ctggttcagc tgaccatgcc gggtgttccg gacgtttacc 2280

agggtaccga attctgggac cgttctctga ccgacccgga caaccgtcgt ccgttctctt 2340

tcgacgaccg tcgtgctgct ctggaacagc tggacgctgg tgacctgccg gcttctttca 2400

ccgacgaacg taccaaactg ctggttacct ctcgtgctct gcgtctgcgt cgtgaccgtc 2460

cggaactgtt caccggttac cgtccggttc tggcttctgg tccggctgct ggtcacctgc 2520

tggctttcga ccgtggtacc gctgctgctc cgggtgctct gaccctggct acccgtctgc 2580

cgtacggtct ggaacagtct ggtggttggc gtgacaccgc tgttgaactg aacaccgcta 2640

tgaaagacga actgaccggt gctggtttcg gtccgggtgc tgttaaaatc gctgacatct 2700

tccgttcttt cccggttgct ctgctggttc cgcagaccgg tggtgaatct atgacccaca 2760

cctacccgcg tgaagctgct aaaccggttc tgggtccggc tcgttacgac gtttgggctc 2820

cgaacgctga atctgttacc ctgctggctg gtggtgaacg ttacgctatg cagcgtcgtg 2880

ctgaaaccgg tccggaagac gctggttggt ggaccgctgc tggtgctccg accgacggta 2940

acgttgacta cggttacctg ctggacggtg acgaaacccc gctgccggac ccgcgtaccc 3000

gtcgtcagcc ggacggtgtt cacgctctgt ctcgtacctt cgacccgtct gcttactctt 3060

ggcaggacga cgcttggcag ggtcgtgaac tgcagggtgc tgttatctac gaactgcacc 3120

tgggtacctt caccccggaa ggtaccctgg aagctgctgc tggtaaactg gactacctgg 3180

ctggtctggg tgttgacttc atcgaactgc tgccggttaa cgctttcaac ggtacccaca 3240

actggggtta cgacggtgtt cagtggttcg ctgttcacga agcttacggt ggtccggaag 3300

cttaccagcg tttcgttgac gctgctcacg ctgctggtct gggtgttatc caggacgttg 3360

tttacaacca cctgggtccg tctggtaact acctgccgcg tttcggtccg tacctgaaac 3420

agggtgaagg taacacctgg ggtgactctg ttaacctgga cggtccgggt tctgaccacg 3480

ttcgtcgtta catcctggac aacctggcta tgtggctgcg tgactaccgt gttgacggtc 3540

tgcgtctgga cgctgttcac gctctgaaag acgaacgtgc tgttcacatc ctggaagact 3600

tcggtgctct ggctgaccag atctctgctg aagttggtcg tccgctgacc ctgatcgctg 3660

aatctgacct gaacaacccg cgtctgctgt acccgcgtga cgttaacggt tacggtctgg 3720

aaggtcagtg gtctgacgac ttccaccacg ctgttcacgt taacgttacc ggtgaaacca 3780

ccggttacta ctctgacttc gactctctgg ctgctctggc taaagttctg cgtgacggtt 3840

tcttccacga cggttcttac tcttctttcc gtgaacgtca ccacggtcgt ccgatcaact 3900

tctctgctgt tcacccggct gctctggttg tttgctctca gaaccacgac cagatcggta 3960

accgtgctac cggtgaccgt ctgtctcaga ccctgccgta cggttctctg gctctggctg 4020

ctgttctgac cctgaccggt ccgttcaccc cgatgctgct gatgggtgaa gaatacggtg 4080

cttctacccc gtggcagttc ttcacctctc acccggaacc ggaactgggt aaagctaccg 4140

ctgaaggtcg tatcaaagaa ttcgaacgta tgggttggga cccggctgtt gttccggacc 4200

cgcaggaccc ggaaaccttc cgtcgttcta aactggactg ggctgaagct gctgaaggtg 4260

accacgctcg tctgctggaa ctgtaccgtt ctctgaccgc tctgcgtcgt tctaccccgg 4320

acctgaccaa actgggtttc gaagacaccc aggttgcttt cgacgaagac gctcgttggc 4380

tgcgtttccg tcgtggtggt gttcaggttc tgctgaactt ctctgaacag ccggtttctc 4440

tggacggtgc tggtaccgct ctgctgctgg ctaccgacga cgctgttcgt ctggaaggtg 4500

aacgtgctga actgggtccg ctgtctgctg ctgttgtttc tgactgagaa ttcgaagctt 4560

ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga 4620

agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc 4680

atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg 4740

agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 4800

tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc 4860

ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac 4920

tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca 4980

aactcttttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 5040

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 5100

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 5160

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 5220

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 5280

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 5340

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 5400

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 5460

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 5520

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 5580

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 5640

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 5700

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 5760

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 5820

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 5880

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 5940

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 6000

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 6060

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 6120

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 6180

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 6240

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 6300

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 6360

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 6420

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 6480

tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 6540

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 6600

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 6660

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 6720

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 6780

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 6840

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc 6900

tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct 6960

ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc 7020

tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 7080

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 7140

gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagcagat caattcgcgc gcgaaggcga agcggcatgc 7200

ataatgtgcc tgtcaaatgg acgaagcagg gattctgcaa accctatgct actccgtcaa 7260

gccgtcaatt gtctgattcg ttaccaatta tgacaacttg acggctacat cattcacttt 7320

ttcttcacaa ccggcacgga actcgctcgg gctggccccg gtgcattttt taaatacccg 7380

cgagaaatag agttgatcgt caaaaccaac attgcgaccg acggtggcga taggcatccg 7440

ggtggtgctc aaaagcagct tcgcctggct gatacgttgg tcctcgcgcc agcttaagac 7500

gctaatccct aactgctggc ggaaaagatg tgacagacgc gacggcgaca agcaaacatg 7560

ctgtgcgacg ctggcgatat caaaattgct gtctgccagg tgatcgctga tgtactgaca 7620

agcctcgcgt acccgattat ccatcggtgg atggagcgac tcgttaatcg cttccatgcg 7680

ccgcagtaac aattgctcaa gcagatttat cgccagcagc tccgaatagc gcccttcccc 7740

ttgcccggcg ttaatgattt gcccaaacag gtcgctgaaa tgcggctggt gcgcttcatc 7800

cgggcgaaag aaccccgtat tggcaaatat tgacggccag ttaagccatt catgccagta 7860

ggcgcgcgga cgaaagtaaa cccactggtg ataccattcg cgagcctccg gatgacgacc 7920

gtagtgatga atctctcctg gcgggaacag caaaatatca cccggtcggc aaacaaattc 7980

tcgtccctga tttttcacca ccccctgacc gcgaatggtg agattgagaa tataaccttt 8040

cattcccagc ggtcggtcga taaaaaaatc gagataaccg ttggcctcaa tcggcgttaa 8100

acccgccacc agatgggcat taaacgagta tcccggcagc aggggatcat tttgcgcttc 8160

agccatactt ttcatactcc cgccattcag ag 8192

<210>2

<211>1373

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Arg Thr Pro Val Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Arg Lys Gly Phe

1 5 10 15

Thr Leu Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Pro Tyr Leu His Ser Leu Gly

20 25 30

Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Val Leu Thr Ala Glu Gln Gly Ser

35 40 45

Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu Arg

50 55 60

Gly Gly Pro Glu Gly Leu Ala Ala Val Ser Lys Ala Ala Arg Ala Ala

65 70 75 80

Gly Met Gly Val Leu Ile Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala

85 90 95

Thr Pro Ala Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly Arg

100 105 110

Gln Ser Arg Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Ala Gly

115 120 125

Gly Arg Ile Arg Leu Pro Val Leu Gly Ser Asp Asp Asp Leu Asp Gln

130 135 140

Leu Glu Ile Arg Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe Pro

145 150 155 160

Leu Ala Glu Gly Thr Tyr Ala Glu Gly Asp Ala Pro Arg Asp Val His

165 170 175

Ala Arg Gln His Tyr Glu Leu Ile Gly Trp Arg Arg Ala Asp Asn Glu

180 185 190

Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Gly Val Arg

195 200 205

Val Glu Ile Pro Ala Val Phe Asp Glu Ala His Gln Glu Val Val Arg

210 215 220

Trp Phe Arg Glu Asp Leu Ala Asp Gly Leu Arg Ile Asp His Pro Asp

225 230 235 240

Gly Leu Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Val Thr

245 250 255

Gly Gly Ala Tyr Leu Leu Ile Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu Gln

260 265 270

Leu Pro Ala Ser Phe Glu Cys Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Val Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Arg Gly Gln Glu Pro Leu

290 295 300

Asp Arg Leu Asp Ala Ser Leu Arg Gly Gly Glu Pro Ala Asp Tyr Gln

305 310 315 320

Asp Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Arg Ile Thr Asp Gly Ile Leu His

325 330 335

Ser Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Gly Asp Ala Asn Val

340 345 350

Ser Ile Asp Ala Gly Ala Asp Ala Leu Ala Glu Ile Ile Ala Ala Phe

355 360 365

Pro Val Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Glu Val Leu Lys Glu

370 375 380

Ala Cys Glu Leu Ala Ala Arg Arg Arg Pro Glu Leu Asp Gln Ala Ile

385 390 395 400

Gln Ala Leu Gln Pro Leu Leu Leu Asp Thr Asp Leu Glu Leu Ala Arg

405 410 415

Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu Asp

420 425 430

Thr Ala Phe Phe Arg Tyr Asn Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val Gly

435 440 445

Ala Asp Pro Thr Glu Phe Ala Val Glu Pro Asp Glu Phe His Ala Arg

450 455 460

Leu Ala Arg Arg Gln Ala Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Leu Ser

465 470 475 480

Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ser Val

485 490 495

Ile Ser Glu Val Ala Gly Asp Trp Glu Lys Ala Leu Asn Arg Leu Arg

500 505 510

Asp Leu Ala Pro Leu Pro Asp Gly Pro Leu Ser Ala Leu Leu Trp Gln

515 520 525

Ala Ile Ala Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Tyr Tyr

530 535 540

Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Asn Trp Thr Asp

545 550 555 560

Pro Ala Pro Ala Phe Glu Glu Lys Leu Lys Ala Ala Val Asp Ala Val

565 570 575

Phe Asp Asn Pro Ala Val Gln Ala Glu Val Glu Ala Leu Val Glu Leu

580 585 590

Leu Glu Pro Tyr Gly Ala Ser Asn Ser Leu Ala Ala Lys Leu Val Gln

595 600 605

Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Trp

610 615 620

Asp Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Phe Ser Phe Asp

625 630 635 640

Asp Arg Arg Ala Ala Leu Glu Gln Leu Asp Ala Gly Asp Leu Pro Ala

645 650 655

Ser Phe Thr Asp Glu Arg Thr Lys Leu Leu Val Thr Ser Arg Ala Leu

660 665 670

Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Thr Gly Tyr Arg Pro Val

675 680 685

Leu Ala Ser Gly Pro Ala Ala Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Arg Gly

690 695 700

Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro Tyr

705 710 715 720

Gly Leu Glu Gln Ser Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Glu Leu Asn

725 730 735

Thr Ala Met Lys Asp Glu Leu Thr Gly Ala Gly Phe Gly Pro Gly Ala

740 745 750

Val Lys Ile Ala Asp Ile Phe Arg Ser Phe Pro Val Ala Leu Leu Val

755 760 765

Pro Gln Thr Gly Gly Glu Ser Met Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala

770 775 780

Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn

785 790 795 800

Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Ala Met Gln

805 810 815

Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro Glu Asp Ala Gly Trp Trp Thr Ala Ala

820 825 830

Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly

835 840 845

Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Asp Gly

850 855 860

Val His Ala Leu Ser Arg Thr Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser Trp Gln

865 870 875 880

Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr Glu

885 890 895

Leu His Leu Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala

900 905 910

Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu

915 920 925

Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly

930 935 940

Val Gln Trp Phe Ala Val His Glu Ala Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr

945 950 955 960

Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln

965 970 975

Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg

980 985 990

Phe Gly Pro Tyr Leu Lys Gln Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser

995 1000 1005

Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile

1010 1015 1020

Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly

1025 1030 1035

Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp Glu Arg Ala Val

1040 1045 1050

His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala Asp Gln Ile Ser Ala

1055 1060 1065

Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn

1070 1075 1080

Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu

1085 1090 1095

Glu Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His Val Asn

1100 1105 1110

Val Thr Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser Leu

1115 1120 1125

Ala Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly

1130 1135 1140

Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn

1145 1150 1155

Phe Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn

1160 1165 1170

His Asp Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln

1175 1180 1185

Thr Leu Pro Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu

1190 1195 1200

Thr Gly Pro Phe Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly

1205 1210 1215

Ala Ser Thr Pro Trp Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu

1220 1225 1230

Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg

1235 1240 1245

Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu

1250 1255 1260

Thr Phe Arg Arg Ser Lys Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly

1265 1270 1275

Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser Leu Thr Ala Leu

1280 1285 1290

Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu Gly Phe Glu Asp Thr

1295 1300 1305

Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu Arg Phe Arg Arg

1310 1315 1320

Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Asn Phe Ser Glu Gln Pro Val Ser

1325 1330 1335

Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala

1340 1345 1350

Val Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser Ala

1355 1360 1365

Ala Val Val Ser Asp

1370

<210>3

<211>15bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gaagcagccg cgaaa 15

<210>4

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210>5

<211>30bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gaagcagccg cgaaagaagc agccgcgaaa 30

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10

<210>7

<211>15bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ggtggcgggg gatct 15

<210>8

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.融合蛋白，其由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和用于连接二者的连接肽组成；

所述连接肽氨基酸序列为序列4或序列8。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：

所述连接肽的个数为1个或2个或3个或4个或5个或6个。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：

4.根据权利要求1-3中任一所述的融合蛋白，其特征在于：

5.与权利要求1-4任一所述的融合蛋白相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1-4任一所述的融合蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

6.根据权利要求5所述的相关生物材料，其特征在于：

所述核酸分子为如下1)-3)所示的基因：

所述连接肽编码DNA分子核苷酸为序列3或序列7；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1-4任一所述的融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1-4任一所述的融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

7.权利要求1-4任一所述的融合蛋白在作为双功能酶中的应用；

和/或，权利要求5或6所述的生物材料在制备双功能酶中的应用。

8.权利要求1-4任一所述的融合蛋白或权利要求5或6所述的生物材料在如下b1)-b6)中任一种中的应用：

b1)海藻糖生产；

b2)制备海藻糖生产的产品；

b3)提高海藻糖生产的效率；

b4)制备提高海藻糖生产的效率的产品。

b5)提高海藻糖转化率；

b6)制备提高海藻糖转化率的产品。

9.权利要求1-4任一所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-4任一所述的融合蛋白的编码基因导入宿主菌中，得到重组菌；诱导培养所述重组菌，得到所述融合蛋白。

10.一种海藻糖的生产方法，包括如下步骤：利用权利要求1-4任一所述的融合蛋白将淀粉水解物或淀粉转化为海藻糖。