CN110923183A - 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法 - Google Patents

产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110923183A
CN110923183A CN201911282159.6A CN201911282159A CN110923183A CN 110923183 A CN110923183 A CN 110923183A CN 201911282159 A CN201911282159 A CN 201911282159A CN 110923183 A CN110923183 A CN 110923183A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lanosterol
escherichia coli
cpr
squalene
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911282159.6A
Other languages
English (en)
Inventor
宛雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Normal University
Original Assignee
Jiangsu Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Normal University filed Critical Jiangsu Normal University
Priority to CN201911282159.6A priority Critical patent/CN110923183A/zh
Publication of CN110923183A publication Critical patent/CN110923183A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C12N9/0081—Cholesterol monooxygenase (cytochrome P 450scc)(1.14.15.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99007—Squalene monooxygenase (1.14.99.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01021—Squalene synthase (2.5.1.21), i.e. farnesyl-disphosphate farnesyltransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99007—Lanosterol synthase (5.4.99.7), i.e. oxidosqualene-lanosterol cyclase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，包括：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；PCR扩增获得NADPH‑细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段并将其融合成为DNA片段SE‑CPR‑LS，将所述SE‑CPR‑LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c‑SE‑CPR‑LS；将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet‑1上，构建表达载体pACYCduet‑SS；将所述载体pet21c‑SE‑CPR‑LS和pACYCduet‑SS转化进入大肠杆菌感受态细胞，得产羊毛甾醇大肠杆菌菌株。本发明通过外源质粒导入方法改造大肠杆菌BL21(DE3)系统，使其能够合成羊毛甾醇，并通过密码子优化技术提高了外源基因在大肠杆菌系统中的表达量。

Description

产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法。
背景技术
羊毛甾醇别名异胆固醇，分子式为C30H50O。溶于乙醇、乙醚和氯仿；而在甲醇、丙酮中结晶。羊毛甾醇为无色粉末，具有很多重要的生物活性和广泛的药理作用，如降血压、降血糖、抗癌、治疗白内障等。而且羊毛甾醇还是多种重要的甾醇类物质生物合成的中间体，是化工、医药、食品行业的重要原料。
合成生物学的发展为利用快速生长的微生物来异源表达生物合成基因，提供了一种潜在的生产途径。采用大肠杆菌表达系统具有很多优势，如：遗传操作简单、生长速度快，能在廉价培养基中高密度培养等。具报道(图1)，法尼基焦磷酸(FPP)通过鲨烯合成酶(squalene synthase，SS)催化合成鲨烯(squalene)；而鲨烯通过鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase,SE)在 NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450reductase,CPR)的辅助作用下可以转化为2,3环氧角鲨烯(2,3-oxidosqualene)；而2,3环氧角鲨烯在羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase,LS)的进一步催化作用下可以转化为羊毛甾醇。通过将这些合成所需的异源基因在大肠杆菌细胞中表达，就可以利用大肠杆菌胞内已有的法尼基焦磷酸为底物，合成羊毛甾醇。目前，还没有利用大肠杆菌进行羊毛甾醇生物合成的报道。而构建这样一个合成系统，一方面可以直接利用大肠杆菌细胞合成羊毛甾醇，为羊毛甾醇的合成提供一个新的途径；另一方面又可以以该系统为平台细胞，进行以羊毛甾醇为中间体的相关代谢路径的开发和研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：
产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：
S1：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，优化后的序列如 SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以优化合成的载体为模板，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；
S2：以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，PCR扩增获得NADPH-细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；
S3：通过融合PCR的方法将鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成为DNA片段SE-CPR-LS，并将所述SE-CPR-LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c-SE-CPR-LS；
S4：通过PCR扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来，并将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet-1上，构建表达载体pACYCduet-SS；
S5：将所述载体pet21c-SE-CPR-LS和pACYCduet-SS通过化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞，得产羊毛甾醇大肠杆菌菌株。
进一步的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了一种含鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段的表达载体，其序列如SEQ ID NO.13所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。
本发明还提供了一种含上述鲨烯合成酶基因片段的表达载体，其序列如SEQ IDNO.14 所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。
本发明还提供了含上述两种表达载体的工程菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的方法通过外源质粒导入方法改造大肠杆菌BL21(DE3)系统，使其能够合成羊毛甾醇，并通过密码子优化技术提高了外源基因在大肠杆菌系统中的表达量。
附图说明
图1为现有的羊毛甾醇合成路径；
图2本发明实施例制备的羊毛甾醇表达载体的载体图谱，其中A为pet21c-SE-CPR-LS 载体图谱，B为pACYCduet-SS载体图谱；
图3为羊毛甾醇标准品与本发明实施例的菌体样本吸收光谱的对比图，其中，A为羊毛甾醇标准品的吸收光谱，B为菌体样本的吸收光谱。
具体实施方式：
本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。大肠杆菌(Escherichiacoli)XL10 gold作为DNA操作时使用的宿主菌，包含100g/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。大肠杆菌BL21(DE3)用于表达构建的路径基因，包含0.01mmol/L异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，100g/mL氨苄青霉素和170g/mL氯霉素的LB液体培养基作为诱导表达培养基。引物及基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1：羊毛甾醇合成路径基因的合成及克隆
1.鲨烯环氧酶的基因序列的密码子优化、合成和扩增。
根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子，使用在线软件DNAWorks进行荚膜甲氧球菌(Methylococcus capsulatus)的鲨烯环氧酶的密码子优化。优化后的序列(SEQ ID NO.1)送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以优化合成的载体为模板，采用Primstar DNA聚合酶 (TAKARA Co,Japan)PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段。PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用Axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司) 进行回收。
鲨烯环氧酶基因PCR扩增体系：
Figure BDA0002317057800000031
PCR程序
Figure BDA0002317057800000032
公司合成的克隆有密码子优化的鲨烯环氧酶基因序列的载体名称为：pMAL-McSE。
2.NADPH-细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶的克隆。
1)酿酒酵母基因组的制备
使用TIANamp Yeast DNA Kit酵母基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生化科技(北京)有限公司)，根据试剂盒使用说明书进行酿酒酵母w303基因组的提取。
2)以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，采用Primstar DNA聚合酶(TAKARA Co,Japan) PCR扩增获得NADPH-细胞色素P450还原酶(SEQ ID NO.4)、鲨烯合成酶(SEQ IDNO.5) 和羊毛甾醇合成酶(SEQ ID NO.6)基因全长片段。PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用Axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。
①NADPH-细胞色素P450还原酶基因PCR扩增体系：
Figure BDA0002317057800000041
PCR程序
Figure BDA0002317057800000042
②鲨烯合成酶基因PCR扩增体系：
Figure BDA0002317057800000043
PCR程序
Figure BDA0002317057800000051
③羊毛甾醇合成酶基因PCR扩增体系：
Figure BDA0002317057800000052
PCR程序
Figure BDA0002317057800000053
3)扩增基因片段的TA克隆及测序
①基因片段末端加A
使用Taq DNA聚合酶(上海生工)，对上述扩增的基因片段进行末端加A。
加A体系：
Figure BDA0002317057800000061
加A程序：
72℃，1小时。
②TA克隆及测序确认
以上述步骤获得的末端加A的基因片段，使用pGEM-T Easy载体系统(普洛麦格(北京) 生物技术有限公司)根据产品使用说明书进行基因克隆；克隆获得的目标载体送上海生工测序公司进行测序确认。测序结果使用BioEdit序列分析软件进行比对分析。构建的NADPH- 细胞色素P450还原酶克隆载体命名为“pGEM-CPR”、鲨烯合成酶克隆载体命名为“pGEM-SS”和羊毛甾醇合成酶克隆载体命名为“pGEM-LS”
实施例2：羊毛甾醇表达载体的构建
该实施例中，首先，通过融合PCR的方法将鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶片段融合成为DNA片段“SE-CPR-LS”。并将该片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体“pet21c-SE-CPR-LS”(图2A)，其原全序列如SEQ IDNO.13。然后，通过PCR扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来。并将该片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet-1上，构建表达载体“pACYCduet-SS”(图2B)，其全序列如SEQ ID NO.14所示。
具体的实施步骤为：
1.“pet21c-SE-CPR-LS”表达载体的构建
(1)融合PCR制备DNA片段“SE-CPR-LS”
融合PCR扩增体系：
Figure BDA0002317057800000062
Figure BDA0002317057800000071
PCR程序
Figure BDA0002317057800000072
(2)PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用Axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。
(3)“SE-CPR-LS”的酶切
酶切体系：
Figure BDA0002317057800000073
酶切条件：
步骤1：37℃ 3小时
步骤2：4℃ 保持
酶切产物使用Axygen PCR产物回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。
(4)Pet21c载体的酶切
酶切体系：
Figure BDA0002317057800000081
酶切条件：
步骤1：37℃ 3小时
步骤2：4℃ 保持
酶切产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用Axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。
(5)“pet21c-SE-CPR-LS”载体的构建
连接体系：
Pet21c酶切产物 0.3pmol
SE-CPR-LS酶切产物 0.03pmol
Solution I连接酶(宝生物工程(大连)有限公司) 5μl
16℃,16h
2.“pACYCduet-SS”表达载体的构建
(1)PCR制备DNA片段“CEII-SS”
PCR扩增体系：
Figure BDA0002317057800000082
PCR程序
Figure BDA0002317057800000091
(2)PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用Axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。
(3)pACYCduet-1载体的酶切
酶切体系：
Figure BDA0002317057800000092
酶切条件：
步骤1：37℃ 3小时
步骤2：4℃ 保持
酶切产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用Axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。
(4)“pACYCduet-SS”载体的构建。重组反应使用ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd))按照产品使用说明书进行。
实施例3、羊毛甾醇大肠杆菌合成菌株的构建及发酵
1.羊毛甾醇大肠杆菌合成菌株的构建
将实施例2中构建的载体“pet21c-SE-CPR-LS”和“pACYCduet-SS”利用化学转化方法转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。具体操作如下：
1)取大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞于冰上融化。
2)取pet21c-SE-CPR-LS和pACYCduet-SS质粒各100ng混匀后，加入感受态细胞中；冰上静置30分钟。
3)将感受态和质粒混合物，42℃，热激90秒。立即放入冰上静止2分钟。
4)向细胞中加入800μl LB液体培养基，37℃，200rpm培养1小时。
5)取100μl涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和170μg/mL氯霉素的LB固体培养基上， 37℃，过夜培养。平板上所长克隆即为含有羊毛甾醇合成路径质粒的菌株。
实施例4、羊毛甾醇的提取及HPLC检测
1.羊毛甾醇提取
称取3.5g湿菌，加入新鲜配置的含有10％KOH的甲醇溶液20ml，混匀。于80℃水浴，皂化100分钟。加入20ml石油醚(沸程30～60℃)，回流提取3次，提取液至于分液漏斗中，加入20ml超纯水洗涤。醚层于60℃水浴挥发，得到未皂化脂。将未皂化脂用甲醇定容至5ml。定容后的样本使用0.45um有机微孔滤器过滤。获得的样本可直接用于HPLC检测。羊毛甾醇标准品：将羊毛甾醇标准品配制成1mg/ml浓度。
2.HPLC检测
色谱柱：液相色谱柱HALO多孔壳层色谱柱C184.6×150mm，5um
柱温：35℃
流动相：80％甲醇-20％水，等度洗脱
检测波长：205mm
进样量：20ul
检测结果如图3所示，羊毛甾醇标准品在出峰时间18.97min处有个明显的特征峰，而以构建菌株的细胞裂解液提取的样本中在该处也有一个明显的特征峰，说明所构建的菌株具有羊毛甾醇合成能力。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> 荚膜甲氧球菌(Methylococcus capsulatus)
<400> 1
atgtctagca tcgaactcgg tgaatgggac gttctgattg ccggtggttc tgtagcaggc 60
tccgcggctg ccgcagctct gtccggtctc ggcctccgtg ttctcattgt tgaaccggac 120
cctgaccctg gtcgtcgcct ggcaggtgaa ctgattcatc caccgggtat cgatggcctg 180
ctggaactgg gcctcattca tgacgatgtc cctcagggct ccgttgttaa cggctttgcg 240
attttccctt ttaatgatgg cgaaggtgcc cctgcgaccc tgctcccata cggtgagatc 300
cacggtcgtc aacgctgtgg ccgtgtgatc gaacacacgc tcctcaagtc tcacctcctg 360
gaaaccgttc gtggtttcga acgtgtctct gtttggctgg gtgcgcgtgt taccggcatg 420
gagcacgaag acggtaaagg ttacgtcgca accgttaccc atgaaggtac tgagactcgt 480
atggaagtac gtctcatcat tggcgcggac ggtccgatgt ctcagctccg taaaatggtt 540
ggtatcagcc atgaaaccca gcgttattcc ggtatgattg gcctcgaagt tgaagacacc 600
cacctcccga acccgggcta tggtaatatc ttcctcaacc ctgcgggtgt gtcttacgcc 660
tacggtatcg gtggtggtcg tgcgcgcgtt atgttcgagg ttctgaaagg tgcggactct 720
aaagaatcta tccgtgacca cctgcgtctg ttccctgcgc cgttccgtgg tgacattgag 780
gcggttctgg cacagggcaa accgctggct gctgcaaact actgcatcgt cccggaggcg 840
tccgttaagg cgaacgtagc gctggttggc gacgcacgtg gttgctgcca tcctctgacg 900
gcgtctggta ttactgccgc ggtcaaggat gcgttcgtta tgcgcgatgc tctccaggca 960
acgggtctga actttgaggc cgctctgaaa cgttactctg ttcaatgcgg tcgcctccaa 1020
ctgactcgcc gtaccctcgc cgaagaactg cgtgaggcgt ttctcgcgca gaccccagaa 1080
gcagaactcc tgagccaatg catcttcagc tactggcgta attctccaaa aggccgtcaa 1140
gcatctatgg cgctcctgtc tactctggac agctctatct tttctctggc gtcccagtac 1200
accctcgtcg gtctgcaagc attccgtctc ctcccgcagt ggctcggtgc gaaaatgggt 1260
ggtgattggt tccgcggtgt tgcacaactg gtttctaagt ccctgaaatt ccaacaggac 1320
gcactgaatc aagcactccg tgctaag 1347
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactagcta gctctagcat cgaactcggt gaa 33
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatccc ttagcacgga gtgcttgatt c 31
<210> 4
<211> 1977
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
atgtccgatg acggagatat cacagctgtc agctcgggca acagagacat tgctcaggtg 60
gtgaccgaaa acaacaagaa ctacttggtg ttgtatgcgt cgcagactgg gactgccgag 120
gattacgcca aaaagttttc caaggagctg gtggccaagt tcaacctaaa cgtgatgtgc 180
gcagatgttg agaactacga ctttgagtcg ctaaacgatg tgcccgtcat agtctcgatt 240
tttatctcta catatggtga aggagacttc cccgacgggg cggtcaactt tgaagacttt 300
atttgtaatg cggaagcggg tgcactatcg aacctgaggt ataatatgtt tggtctggga 360
aattctactt atgaattctt taatggtgcc gccaagaagg ccgagaagca tctctccgcc 420
gcgggcgcta tcagactagg caagctcggt gaagctgatg atggtgcagg aactacagac 480
gaagattaca tggcctggaa ggactccatc ctggaggttt tgaaagacga actgcatttg 540
gacgaacagg aagccaagtt cacctctcaa ttccagtaca ctgtgttgaa cgaaatcact 600
gactccatgt cgcttggtga accctctgct cactatttgc cctcgcatca gttgaaccgc 660
aacgcagacg gcatccaatt gggtcccttc gatttgtctc aaccgtatat tgcacccatc 720
gtgaaatctc gcgaactgtt ctcttccaat gaccgtaatt gcatccactc tgaatttgac 780
ttgtccggct ctaacatcaa gtactccact ggtgaccatc ttgctgtttg gccttccaac 840
ccattggaaa aggtcgaaca gttcttatcc atattcaacc tggaccctga aaccattttt 900
gacttgaagc ccctggatcc caccgtcaaa gtgcccttcc caacgccaac tactattggc 960
gctgctatta aacactattt ggaaattaca ggacctgtct ccagacaatt gttttcatct 1020
ttgattcagt tcgcccccaa cgctgacgtc aaggaaaaat tgactctgct ttcgaaagac 1080
aaggaccaat tcgccgtcga gataacctcc aaatatttca acatcgcaga tgctctgaaa 1140
tatttgtctg atggcgccaa atgggacaac gtacccatgc aattcttggt cgaatcagtt 1200
ccccaaatga ctcctcgtta ctactctatc tcttcctctt ctctgtctga aaagcaaacc 1260
gtccatgtca cctccattgt ggaaaacttt cctaacccag aattgcctga tgctcctcca 1320
ggtgttggtg ttacgactaa cttgttaaga aacattcaat tggctcaaaa caatgttaac 1380
attgccgaaa ctaacctacc tgttcactac gatttaaatg gcccacgtaa acttttcgcc 1440
aattacaaat tgcccgtcca cgttcgtcgt tctaacttca gattgccttc caacccttcc 1500
accccagtta tcatgatcgg tccaggtacc ggtgttgccc cattccgtgg gtttatcaga 1560
gagcgtgtcg cgttcctcga atcacaaaag aagggcggta acaacgtttc gctaggtaag 1620
catatactgt tttatggatc ccgtaacact gatgatttct tgtaccagga cgaatggcca 1680
gaatacgcca aaaaattgga tggttcgttc gaaatggtcg tggcccattc caggttgcca 1740
aacaccaaaa aagtttatgt tcaagataaa ttaaaggatt acgaagacca agtatttgaa 1800
atgattaaca acggtgcatt tatctacgtc tgtggtgatg caaagggtat ggccaagggt 1860
gtgtcaaccg cattggttgg catcttatcc cgtggtaaat ccattaccac tgatgaagca 1920
acagagctaa tcaagatgct caagacttca ggtagatacc aagaagatgt ctggtaa 1977
<210> 5
<211> 1260
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
atgctattct ccatctatga tcagtccacg tctccatatc tcttgcactg tttcgaactg 60
ttgaacttca cctccagatc gtttgctgct gtgatcagag agctgcatcc agaattgaga 120
aactgtgtta ctctctttta tttgatttta agggctttgg ataccatcga agacgatatg 180
tccatcgaac acgatttgaa aattgacttg ttgcgtcact tccacgagaa attgttgtta 240
actaaatgga gtttcgacgg aaatgccccc gatgtgaagg acagagccgt tttgacagat 300
ttcgaatcga ttcttattga attccacaaa ttgaaaccag aatatcaaga agtcatcaag 360
gagatcaccg agaaaatggg taatggtatg gccgactaca tcttagatga aaattacaac 420
ttgaatgggt tgcaaaccgt ccacgactac gacgtgtact gtcactacgt agctggtttg 480
gtcggtgatg gtttgacccg tttgattgtc attgccaagt ttgccaacga atctttgtat 540
tctaatgagc aattgtatga aagcatgggt cttttcctac aaaaaaccaa catcatcaga 600
gattacaatg aagatttggt cgatggtaga tccttctggc ccaaggaaat ctggtcacaa 660
tacgctcctc agttgaagga cttcatgaaa cctgaaaacg aacaactggg gttggactgt 720
ataaaccacc tcgtcttaaa cgcattgagt catgttatcg atgtgttgac ttatttggcc 780
ggtatccacg agcaatccac tttccaattt tgtgccattc cccaagttat ggccattgca 840
accttggctt tggtattcaa caaccgtgaa gtgctacatg gcgatgtaaa gattcgtaag 900
ggtactacct gctgtttaat tttgaaatca aggactttgc gtggctgtgt cgagattttt 960
gactattact tacgtgatat caaatctaaa ttggctgtgc aagatccaaa tttcttaaaa 1020
ttgaacattc aaatctccaa gatcgaacag tttatggaag aaatgtacca ggataaatta 1080
cctcctaacg tgaagccaaa tgaaactcca attttcttga aagttaaaga aagatccaga 1140
tacgatgatg aattggttcc aacccaacaa gaagaagagt acaagttcaa tatggtttta 1200
tctatcatct cgtccgttct tcttgggttt tattatatat acactttaca cagagcgtga 1260
<210> 6
<211> 2196
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 6
atgacagaat tttattctga cacaatcggt ctaccaaaga cagatccacg tctttggaga 60
ctgagaactg atgagctagg ccgagaaagc tgggaatatt taacccctca gcaagccgca 120
aacgacccac catccacttt cacgcagtgg cttcttcaag atcccaaatt tcctcaacct 180
catccagaaa gaaataagca ttcaccagat ttttcagcct tcgatgcgtg tcataatggt 240
gcatcttttt tcaaactgct tcaagagcct gactcaggta tttttccgtg tcaatataaa 300
ggacccatgt tcatgacaat cggttacgta gccgtaaact atatcgccgg tattgaaatt 360
cctgagcatg agagaataga attaattaga tacatcgtca atacagcaca tccggttgat 420
ggtggctggg gtctacattc tgttgacaaa tccaccgtgt ttggtacagt attgaactat 480
gtaatcttac gtttattggg tctacccaag gaccacccgg tttgcgccaa ggcaagaagc 540
acattgttaa ggttaggcgg tgctattgga tcccctcact ggggaaaaat ttggctaagt 600
gcactaaact tgtataaatg ggaaggtgtg aaccctgccc ctcctgaaac ttggttactt 660
ccatattcac tgcccatgca tccggggaga tggtgggttc atactagagg tgtttacatt 720
ccggtcagtt acctgtcatt ggtcaaattt tcttgcccaa tgactcctct tcttgaagaa 780
ctgaggaatg aaatttacac taaaccgttt gacaagatta acttctccaa gaacaggaat 840
accgtatgtg gagtagacct atattacccc cattctacta ctttgaatat tgcgaacagc 900
cttgtagtat tttacgaaaa atacctaaga aaccggttca tttactctct atccaagaag 960
aaggtttatg atctaatcaa aacggagtta cagaatactg attccttgtg tatagcacct 1020
gttaaccagg cgttttgcgc acttgtcact cttattgaag aaggggtaga ctcggaagcg 1080
ttccagcgtc tccaatatag gttcaaggat gcattgttcc atggtccaca gggtatgacc 1140
attatgggaa caaatggtgt gcaaacctgg gattgtgcgt ttgccattca atactttttc 1200
gtcgcaggcc tcgcagaaag acctgaattc tataacacaa ttgtctctgc ctataaattc 1260
ttgtgtcatg ctcaatttga caccgagtgc gttccaggta gttataggga taagagaaag 1320
ggggcttggg gcttctcaac aaaaacacag ggctatacag tggcagattg cactgcagaa 1380
gcaattaaag ccatcatcat ggtgaaaaac tctcccgtct ttagtgaagt acaccatatg 1440
attagcagtg aacgtttatt tgaaggcatt gatgtgttat tgaacctaca aaacatcgga 1500
tcttttgaat atggttcctt tgcaacctat gaaaaaatca aggccccact agcaatggaa 1560
accttgaatc ctgctgaagt ttttggtaac ataatggtag aatacccata cgtggaatgt 1620
actgattcat ccgttctggg gttgacatat tttcacaagt acttcgacta taggaaagag 1680
gaaatacgta cacgcatcag aatcgccatc gaattcataa aaaaatctca attaccagat 1740
ggaagttggt atggaagctg gggtatttgt tttacatatg ccggtatgtt tgcattggag 1800
gcattacaca ccgtggggga gacctatgag aattcctcaa cggtaagaaa aggttgcgac 1860
ttcttggtca gtaaacagat gaaggatggc ggttgggggg aatcaatgaa gtccagtgaa 1920
ttacatagtt atgtggatag tgaaaaatcg ctagtcgttc aaaccgcatg ggcgctaatt 1980
gcacttcttt tcgctgaata tcctaataaa gaagtcatcg accgcggtat tgacctttta 2040
aaaaatagac aagaagaatc cggggaatgg aaatttgaaa gtgtagaagg tgttttcaac 2100
cactcttgtg caattgaata cccaagttat cgattcttat tccctattaa ggcattaggt 2160
atgtacagca gggcatatga aacacatacg ctttaa 2196
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgcgtcgac aaggagatat acatatgtcc gatgacggag atatc 45
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaagcttt taccagacat cttcttggta tct 33
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcggatccg atgctattct ccatctatga tcagtcc 37
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaactagcta gctcacgctc tgtgtaaagt gtat 34
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccaagctta aggagatata catatgacag aattttattc tgacacaatc g 51
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgctcgagt taaagcgtat gtgtttcata tgcc 34
<210> 13
<211> 10952
<212> DNA
<213> 载体(pet21c-SE-CPR-LS)
<400> 13
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 5160
cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatggct agctctagca 5220
tcgaactcgg tgaatgggac gttctgattg ccggtggttc tgtagcaggc tccgcggctg 5280
ccgcagctct gtccggtctc ggcctccgtg ttctcattgt tgaaccggac cctgaccctg 5340
gtcgtcgcct ggcaggtgaa ctgattcatc caccgggtat cgatggcctg ctggaactgg 5400
gcctcattca tgacgatgtc cctcagggct ccgttgttaa cggctttgcg attttccctt 5460
ttaatgatgg cgaaggtgcc cctgcgaccc tgctcccata cggtgagatc cacggtcgtc 5520
aacgctgtgg ccgtgtgatc gaacacacgc tcctcaagtc tcacctcctg gaaaccgttc 5580
gtggtttcga acgtgtctct gtttggctgg gtgcgcgtgt taccggcatg gagcacgaag 5640
acggtaaagg ttacgtcgca accgttaccc atgaaggtac tgagactcgt atggaagtac 5700
gtctcatcat tggcgcggac ggtccgatgt ctcagctccg taaaatggtt ggtatcagcc 5760
atgaaaccca gcgttattcc ggtatgattg gcctcgaagt tgaagacacc cacctcccga 5820
acccgggcta tggtaatatc ttcctcaacc ctgcgggtgt gtcttacgcc tacggtatcg 5880
gtggtggtcg tgcgcgcgtt atgttcgagg ttctgaaagg tgcggactct aaagaatcta 5940
tccgtgacca cctgcgtctg ttccctgcgc cgttccgtgg tgacattgag gcggttctgg 6000
cacagggcaa accgctggct gctgcaaact actgcatcgt cccggaggcg tccgttaagg 6060
cgaacgtagc gctggttggc gacgcacgtg gttgctgcca tcctctgacg gcgtctggta 6120
ttactgccgc ggtcaaggat gcgttcgtta tgcgcgatgc tctccaggca acgggtctga 6180
actttgaggc cgctctgaaa cgttactctg ttcaatgcgg tcgcctccaa ctgactcgcc 6240
gtaccctcgc cgaagaactg cgtgaggcgt ttctcgcgca gaccccagaa gcagaactcc 6300
tgagccaatg catcttcagc tactggcgta attctccaaa aggccgtcaa gcatctatgg 6360
cgctcctgtc tactctggac agctctatct tttctctggc gtcccagtac accctcgtcg 6420
gtctgcaagc attccgtctc ctcccgcagt ggctcggtgc gaaaatgggt ggtgattggt 6480
tccgcggtgt tgcacaactg gtttctaagt ccctgaaatt ccaacaggac gcactgaatc 6540
aagcactccg tgctaaggga tccgaattcg agctccgtcg acaaggagat atacatatgt 6600
ccgatgacgg agatatcaca gctgtcagct cgggcaacag agacattgct caggtggtga 6660
ccgaaaacaa caagaactac ttggtgttgt atgcgtcgca gactgggact gccgaggatt 6720
acgccaaaaa gttttccaag gagctggtgg ccaagttcaa cctaaacgtg atgtgcgcag 6780
atgttgagaa ctacgacttt gagtcgctaa acgatgtgcc cgtcatagtc tcgattttta 6840
tctctacata tggtgaagga gacttccccg acggggcggt caactttgaa gactttattt 6900
gtaatgcgga agcgggtgca ctatcgaacc tgaggtataa tatgtttggt ctgggaaatt 6960
ctacttatga attctttaat ggtgccgcca agaaggccga gaagcatctc tccgccgcgg 7020
gcgctatcag actaggcaag ctcggtgaag ctgatgatgg tgcaggaact acagacgaag 7080
attacatggc ctggaaggac tccatcctgg aggttttgaa agacgaactg catttggacg 7140
aacaggaagc caagttcacc tctcaattcc agtacactgt gttgaacgaa atcactgact 7200
ccatgtcgct tggtgaaccc tctgctcact atttgccctc gcatcagttg aaccgcaacg 7260
cagacggcat ccaattgggt cccttcgatt tgtctcaacc gtatattgca cccatcgtga 7320
aatctcgcga actgttctct tccaatgacc gtaattgcat ccactctgaa tttgacttgt 7380
ccggctctaa catcaagtac tccactggtg accatcttgc tgtttggcct tccaacccat 7440
tggaaaaggt cgaacagttc ttatccatat tcaacctgga ccctgaaacc atttttgact 7500
tgaagcccct ggatcccacc gtcaaagtgc ccttcccaac gccaactact attggcgctg 7560
ctattaaaca ctatttggaa attacaggac ctgtctccag acaattgttt tcatctttga 7620
ttcagttcgc ccccaacgct gacgtcaagg aaaaattgac tctgctttcg aaagacaagg 7680
accaattcgc cgtcgagata acctccaaat atttcaacat cgcagatgct ctgaaatatt 7740
tgtctgatgg cgccaaatgg gacaacgtac ccatgcaatt cttggtcgaa tcagttcccc 7800
aaatgactcc tcgttactac tctatctctt cctcttctct gtctgaaaag caaaccgtcc 7860
atgtcacctc cattgtggaa aactttccta acccagaatt gcctgatgct cctccaggtg 7920
ttggtgttac gactaacttg ttaagaaaca ttcaattggc tcaaaacaat gttaacattg 7980
ccgaaactaa cctacctgtt cactacgatt taaatggccc acgtaaactt ttcgccaatt 8040
acaaattgcc cgtccacgtt cgtcgttcta acttcagatt gccttccaac ccttccaccc 8100
cagttatcat gatcggtcca ggtaccggtg ttgccccatt ccgtgggttt atcagagagc 8160
gtgtcgcgtt cctcgaatca caaaagaagg gcggtaacaa cgtttcgcta ggtaagcata 8220
tactgtttta tggatcccgt aacactgatg atttcttgta ccaggacgaa tggccagaat 8280
acgccaaaaa attggatggt tcgttcgaaa tggtcgtggc ccattccagg ttgccaaaca 8340
ccaaaaaagt ttatgttcaa gataaattaa aggattacga agaccaagta tttgaaatga 8400
ttaacaacgg tgcatttatc tacgtctgtg gtgatgcaaa gggtatggcc aagggtgtgt 8460
caaccgcatt ggttggcatc ttatcccgtg gtaaatccat taccactgat gaagcaacag 8520
agctaatcaa gatgctcaag acttcaggta gataccaaga agatgtctgg taaaagctta 8580
aggagatata catatgacag aattttattc tgacacaatc ggtctaccaa agacagatcc 8640
acgtctttgg agactgagaa ctgatgagct aggccgagaa agctgggaat atttaacccc 8700
tcagcaagcc gcaaacgacc caccatccac tttcacgcag tggcttcttc aagatcccaa 8760
atttcctcaa cctcatccag aaagaaataa gcattcacca gatttttcag ccttcgatgc 8820
gtgtcataat ggtgcatctt ttttcaaact gcttcaagag cctgactcag gtatttttcc 8880
gtgtcaatat aaaggaccca tgttcatgac aatcggttac gtagccgtaa actatatcgc 8940
cggtattgaa attcctgagc atgagagaat agaattaatt agatacatcg tcaatacagc 9000
acatccggtt gatggtggct ggggtctaca ttctgttgac aaatccaccg tgtttggtac 9060
agtattgaac tatgtaatct tacgtttatt gggtctaccc aaggaccacc cggtttgcgc 9120
caaggcaaga agcacattgt taaggttagg cggtgctatt ggatcccctc actggggaaa 9180
aatttggcta agtgcactaa acttgtataa atgggaaggt gtgaaccctg cccctcctga 9240
aacttggtta cttccatatt cactgcccat gcatccgggg agatggtggg ttcatactag 9300
aggtgtttac attccggtca gttacctgtc attggtcaaa ttttcttgcc caatgactcc 9360
tcttcttgaa gaactgagga atgaaattta cactaaaccg tttgacaaga ttaacttctc 9420
caagaacagg aataccgtat gtggagtaga cctatattac ccccattcta ctactttgaa 9480
tattgcgaac agccttgtag tattttacga aaaataccta agaaaccggt tcatttactc 9540
tctatccaag aagaaggttt atgatctaat caaaacggag ttacagaata ctgattcctt 9600
gtgtatagca cctgttaacc aggcgttttg cgcacttgtc actcttattg aagaaggggt 9660
agactcggaa gcgttccagc gtctccaata taggttcaag gatgcattgt tccatggtcc 9720
acagggtatg accattatgg gaacaaatgg tgtgcaaacc tgggattgtg cgtttgccat 9780
tcaatacttt ttcgtcgcag gcctcgcaga aagacctgaa ttctataaca caattgtctc 9840
tgcctataaa ttcttgtgtc atgctcaatt tgacaccgag tgcgttccag gtagttatag 9900
ggataagaga aagggggctt ggggcttctc aacaaaaaca cagggctata cagtggcaga 9960
ttgcactgca gaagcaatta aagccatcat catggtgaaa aactctcccg tctttagtga 10020
agtacaccat atgattagca gtgaacgttt atttgaaggc attgatgtgt tattgaacct 10080
acaaaacatc ggatcttttg aatatggttc ctttgcaacc tatgaaaaaa tcaaggcccc 10140
actagcaatg gaaaccttga atcctgctga agtttttggt aacataatgg tagaataccc 10200
atacgtggaa tgtactgatt catccgttct ggggttgaca tattttcaca agtacttcga 10260
ctataggaaa gaggaaatac gtacacgcat cagaatcgcc atcgaattca taaaaaaatc 10320
tcaattacca gatggaagtt ggtatggaag ctggggtatt tgttttacat atgccggtat 10380
gtttgcattg gaggcattac acaccgtggg ggagacctat gagaattcct caacggtaag 10440
aaaaggttgc gacttcttgg tcagtaaaca gatgaaggat ggcggttggg gggaatcaat 10500
gaagtccagt gaattacata gttatgtgga tagtgaaaaa tcgctagtcg ttcaaaccgc 10560
atgggcgcta attgcacttc ttttcgctga atatcctaat aaagaagtca tcgaccgcgg 10620
tattgacctt ttaaaaaata gacaagaaga atccggggaa tggaaatttg aaagtgtaga 10680
aggtgttttc aaccactctt gtgcaattga atacccaagt tatcgattct tattccctat 10740
taaggcatta ggtatgtaca gcagggcata tgaaacacat acgctttaac tcgagcacca 10800
ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc 10860
tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 10920
ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg at 10952
<210> 14
<211> 5271
<212> DNA
<213> 载体(pACYCduet-SS)
<400> 14
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cctattctcc 120
atctatgatc agtccacgtc tccatatctc ttgcactgtt tcgaactgtt gaacttcacc 180
tccagatcgt ttgctgctgt gatcagagag ctgcatccag aattgagaaa ctgtgttact 240
ctcttttatt tgattttaag ggctttggat accatcgaag acgatatgtc catcgaacac 300
gatttgaaaa ttgacttgtt gcgtcacttc cacgagaaat tgttgttaac taaatggagt 360
ttcgacggaa atgcccccga tgtgaaggac agagccgttt tgacagattt cgaatcgatt 420
cttattgaat tccacaaatt gaaaccagaa tatcaagaag tcatcaagga gatcaccgag 480
aaaatgggta atggtatggc cgactacatc ttagatgaaa attacaactt gaatgggttg 540
caaaccgtcc acgactacga cgtgtactgt cactacgtag ctggtttggt cggtgatggt 600
ttgacccgtt tgattgtcat tgccaagttt gccaacgaat ctttgtattc taatgagcaa 660
ttgtatgaaa gcatgggtct tttcctacaa aaaaccaaca tcatcagaga ttacaatgaa 720
gatttggtcg atggtagatc cttctggccc aaggaaatct ggtcacaata cgctcctcag 780
ttgaaggact tcatgaaacc tgaaaacgaa caactggggt tggactgtat aaaccacctc 840
gtcttaaacg cattgagtca tgttatcgat gtgttgactt atttggccgg tatccacgag 900
caatccactt tccaattttg tgccattccc caagttatgg ccattgcaac cttggctttg 960
gtattcaaca accgtgaagt gctacatggc gatgtaaaga ttcgtaaggg tactacctgc 1020
tgtttaattt tgaaatcaag gactttgcgt ggctgtgtcg agatttttga ctattactta 1080
cgtgatatca aatctaaatt ggctgtgcaa gatccaaatt tcttaaaatt gaacattcaa 1140
atctccaaga tcgaacagtt tatggaagaa atgtaccagg ataaattacc tcctaacgtg 1200
aagccaaatg aaactccaat tttcttgaaa gttaaagaaa gatccagata cgatgatgaa 1260
ttggttccaa cccaacaaga agaagagtac aagttcaata tggttttatc tatcatctcg 1320
tccgttcttc ttgggtttta ttatatatac actttacaca gagcgtgagg atccgaattc 1380
gagctcggcg cgcctgcagg tcgacaagct tgcggccgca taatgcttaa gtcgaacaga 1440
aagtaatcgt attgtacacg gccgcataat cgaaattaat acgactcact ataggggaat 1500
tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta agtataagaa ggagatatac 1560
atatggcaga tctcaattgg atatcggccg gccacgcgat cgctgacgtc ggtaccctcg 1620
agtctggtaa agaaaccgct gctgcgaaat ttgaacgcca gcacatggac tcgtctacta 1680
gcgcagctta attaacctag gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg 1740
gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaacc tcaggcattt gagaagcaca 1800
cggtcacact gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta 1860
tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaat ttctgccatt 1920
catccgctta ttatcactta ttcaggcgta gcaccaggcg tttaagggca ccaataactg 1980
ccttaaaaaa attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc 2040
attctgccga catggaagcc atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc 2100
agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg cccatagtga aaacgggggc gaagaagttg 2160
tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg 2220
aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc 2280
acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc 2340
gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat 2400
atcaccagct caccgtcttt cattgccata cggaactccg gatgagcatt catcaggcgg 2460
gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa 2520
aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat 2580
gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt 2640
tttttctcca ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc 2700
ggtagtgatc ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct 2760
cattttcgcc aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt 2820
tattctgcga agtgatcttc cgtcacaggt atttattcgg cgcaaagtgc gtcgggtgat 2880
gctgccaact tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt 2940
ttctatcagc tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg gtgcgtaacg gcaaaagcac 3000
cgccggacat cagcgctagc ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt 3060
gtcagtgaag tgcttcatgt ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata 3120
tgtgatacag gatatattcc gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac 3180
tgcggcgagc ggaaatggct tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga 3240
tacttaacag ggaagtgaga gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc 3300
tgacaagcat cacgaaatct gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata 3360
aagataccag gcgtttcccc tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg 3420
tttaccggtg tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag 3480
ttccgggtag gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga 3540
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc 3600
accactggca gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg 3660
gttaaggcta aactgaaagg acaagttttg gtgactgcgc tcctccaagc cagttacctc 3720
ggttcaaaga gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt 3780
cgttttcaga gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc tcaagaagat catcttatta 3840
atcagataaa atatttctag atttcagtgc aatttatctc ttcaaatgta gcacctgaag 3900
tcagccccat acgatataag ttgtaattct catgttagtc atgccccgcg cccaccggaa 3960
ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt 4020
gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 4080
gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 4140
ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct 4200
ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct 4260
gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca 4320
ctaccgagat gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca 4380
gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt 4440
gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct 4500
gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag 4560
aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca 4620
cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag 4680
agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct 4740
ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca 4800
ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac 4860
ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca 4920
gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc 4980
ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag 5040
aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact 5100
ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg 5160
ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga 5220
cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aaattaatac gactcactat a 5271
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catcatcacc acagccagga tccctattct ccatctatga tcagtccacg 50
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcgcgccga gctcgaattc ggatcctcac gctctgtgta aagtgt 46

Claims (5)

1.产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以优化合成的载体为模板，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；
S2：以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，PCR扩增获得NADPH-细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；
S3：通过融合PCR的方法将鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成为DNA片段SE-CPR-LS，并将所述SE-CPR-LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c-SE-CPR-LS；
S4：通过PCR扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来，并将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet-1上，构建表达载体pACYCduet-SS；
S5：将所述载体pet21c-SE-CPR-LS和pACYCduet-SS通过化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞，得产羊毛甾醇大肠杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
3.一种含鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段的表达载体，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.13所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。
4.一种含权利要求1中所述鲨烯合成酶基因片段的表达载体，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.14所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。
5.含权利要求3中所述表达载体且含权利要求4中所述表达载体的工程菌。
CN201911282159.6A 2019-12-13 2019-12-13 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法 Pending CN110923183A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911282159.6A CN110923183A (zh) 2019-12-13 2019-12-13 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911282159.6A CN110923183A (zh) 2019-12-13 2019-12-13 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110923183A true CN110923183A (zh) 2020-03-27

Family

ID=69859737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911282159.6A Pending CN110923183A (zh) 2019-12-13 2019-12-13 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110923183A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322640A (zh) * 2020-11-09 2021-02-05 上海市农业科学院 一种在大肠杆菌中表达并降解4-氟苯酚的基因组及其应用
CN112322675A (zh) * 2020-11-05 2021-02-05 苏州大学 环氧角鲨烯的制备方法及工程菌
CN113957084A (zh) * 2021-12-06 2022-01-21 上海市农业科学院 一种完全降解2,4-二硝基甲苯的大肠杆菌工程菌的构建及其应用
CN114774299A (zh) * 2022-05-16 2022-07-22 滨州医学院 代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100285565A1 (en) * 2007-03-01 2010-11-11 Tadashi Fujii Escherichia coli expressing the cytochrome p-450 gene and a method for microbial conversion using them
CN103266137A (zh) * 2013-06-14 2013-08-28 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种角鲨烯的生产方法
CN103695493A (zh) * 2013-12-24 2014-04-02 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法
CN104894077A (zh) * 2014-03-06 2015-09-09 中国科学院上海生命科学研究院 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用
US20170130233A1 (en) * 2014-02-12 2017-05-11 Organobalance Gmbh Yeast strain and microbial method for production of pentacyclic triterpenes and/or triterpenoids
JP6348530B2 (ja) * 2015-03-26 2018-06-27 石川県公立大学法人 トリテルペンの生産方法
CN108977456A (zh) * 2018-08-08 2018-12-11 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100285565A1 (en) * 2007-03-01 2010-11-11 Tadashi Fujii Escherichia coli expressing the cytochrome p-450 gene and a method for microbial conversion using them
CN103266137A (zh) * 2013-06-14 2013-08-28 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种角鲨烯的生产方法
CN103695493A (zh) * 2013-12-24 2014-04-02 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法
US20170130233A1 (en) * 2014-02-12 2017-05-11 Organobalance Gmbh Yeast strain and microbial method for production of pentacyclic triterpenes and/or triterpenoids
CN104894077A (zh) * 2014-03-06 2015-09-09 中国科学院上海生命科学研究院 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用
JP6348530B2 (ja) * 2015-03-26 2018-06-27 石川県公立大学法人 トリテルペンの生産方法
CN108977456A (zh) * 2018-08-08 2018-12-11 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAMES M. TRZASKOSS，等: "Cytochrome P-450-dependent Oxidation of Lanosterol in Cholesterol Biosynthesis", 《THEJ OURNALO F BIOLOGICAL CHEMISTR》 *
张强等: "大肠杆菌异源合成三萜化合物研究进展和前景分析", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322675A (zh) * 2020-11-05 2021-02-05 苏州大学 环氧角鲨烯的制备方法及工程菌
CN112322640A (zh) * 2020-11-09 2021-02-05 上海市农业科学院 一种在大肠杆菌中表达并降解4-氟苯酚的基因组及其应用
CN113957084A (zh) * 2021-12-06 2022-01-21 上海市农业科学院 一种完全降解2,4-二硝基甲苯的大肠杆菌工程菌的构建及其应用
CN114774299A (zh) * 2022-05-16 2022-07-22 滨州医学院 代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110923183A (zh) 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法
CN111893104B (zh) 一种基于结构的crispr蛋白的优化设计方法
CN110229838B (zh) 一种生物转化类固醇类化合物获取羟基化化合物的方法
CN112553176B (zh) 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶
CN106755031B (zh) 鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用
CN114426957B (zh) 一种糖醛酸脱氢酶突变体及其在制备糖二酸中的应用
CN110964702B (zh) 一种Diels-Alder反应酶的应用及其突变体的制备方法与应用
CN111748034B (zh) 一种滑液囊支原体单克隆抗体的制备方法
CN109402109B (zh) 一种改进的重叠延伸pcr方法
CN107075495B (zh) 裂解酶和编码该裂解酶的dna、含该dna的载体以及用于不对称合成(s)-苯基乙酰基甲醇的方法
CN106715689B (zh) 裂解酶以及不对称合成(s)-苯基乙酰基甲醇的方法
CN113755512B (zh) 一种制备串联重复蛋白质的方法与应用
CN113234746B (zh) 一种农药诱导蛋白互作和诱导基因表达的方法
CN113980883B (zh) 一种高产羟基化甾体原料药的重组大肠杆菌及其应用
RU2792132C1 (ru) Рекомбинантная плазмида pET-GST-3CL, обеспечивающая синтез протеазы 3CL SARS-CoV-2 в клетках E.coli в растворимой форме
RU2774333C1 (ru) Рекомбинантная плазмида pET-GST-3CL-GPG, обеспечивающая синтез протеазы 3CL SARS-CoV-2 в клетках E.coli в растворимой форме
CN114317473B (zh) 一种催化活性和热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
CN112553177B (zh) 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
CN115161335B (zh) 用于构建tardbp基因突变的als模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
KR100902634B1 (ko) 재조합 ｈｍｇｂ1 펩티드를 포함하는 핵산 전달 복합체
KR101137021B1 (ko) 퓨조박테리움 뉴클레텀 유래의 신규 글리코실트랜스퍼라제및 이를 이용한 올리고당 제조방법
CN109666689B (zh) 一种重组高温镍铁氢化酶的异源表达纯化方法及其应用
CN112813087A (zh) 一种SalI限制性内切酶的制备方法
CN109306354A (zh) 一种大量表达抗真菌蛋白的方法
CN114934060A (zh) 一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200327

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication