CN112322675A - 环氧角鲨烯的制备方法及工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，该制备方法将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML‑SQE4、ML‑SQE3和ML‑SQE2工程菌实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。

Description

环氧角鲨烯的制备方法及工程菌

技术领域

本发明涉及一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，属于生物基因工程领域。

背景技术

三萜类化合物是一类广泛应用于医药、保健和化妆品等行业的天然产物，具有巨大的商业价值。生物合成三萜类化合物依赖于环氧角鲨烯的高效合成。角鲨烯环氧化酶是整个合成途径中的关键酶，它能够催化NAD(P)H依赖的环氧化反应，将角鲨烯转变为环氧角鲨烯。

角鲨烯环氧化酶(squalene epoxidase)催化形成2,3-环氧角鲨烯是整个通路中的第一个重要限速环节。角鲨烯环化酶是一种非细胞色素P450酶系 (cytochrome P450，CYP450)的环氧化烯烃酶。它不含有血红素，活性位点不需要结合金属离子；然而，该酶促反应处需要分子氧[O]外，还需要辅因子FAD、 NAD(P)H的参与。催化过程如同某些细胞色素P450酶系反应一样，还原型黄素蛋白接受分子氧[O]形成亲电体，再将分子氧[O]传递给角鲨烯产生。氧化型黄素蛋白则需要如同细胞色素P450还原酶(cytochrome P450reductase，CPR)作用下以NAD(P)H为电子供体偶联还原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种环氧角鲨烯的制备方法，包括：在大肠杆菌中表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶；所述角鲨烯合酶的编码基因为截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9_TC，所述角鲨烯环氧化酶的编码基因为荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因：McSE基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶基因：FtSE基因或截短型大鼠角鲨烯环化酶基因：RnSE_TC基因中的任一种；所述erg9_TC的序列为SEQ ID NO.1，所述McSE基因的序列为SEQ ID NO.2，所述FtSE基因的序列为SEQ ID NO.3，所述RnSE_TC基因的序列为SEQ ID NO.4。

进一步地，所述制备方法包括以下步骤：

S1、构建含有所述erg9_TC的pSMLSQ载体；

S2、分别构建含有所述McSE、FtSE和RnSE_TC的pTMcSE载体、pTFtSE 载体和pTRnSE_TC载体。

进一步地，步骤S1中，所述pSMLSQ载体由所述erg9_TC克隆至pSMvL2 载体中构建而成。

进一步地，步骤S2中，所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE_TC载体分别由所述McSE、FtSE和RnSE_TC克隆至pTrc99A载体中构建而成。

进一步地，所述制备方法还包括：

S3、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE_TC载体分别与pSMLSQ 载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶的ML-SQE4、 ML-SQE3和ML-SQE2工程菌；

S4、培养所述ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌得到环氧角鲨烯。

进一步地，还包括在所述大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶，所述醌氧化还原酶的编码基因为WrbA基因，所述WrbA基因的序列为SEQ ID NO.5。

进一步地，所述制备方法还包括：

S3、将所述WrbA基因克隆至所述pSMLSQ载体构建pSMLSQWrbA载体；

S4、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE_TC载体分别与 pSMLSQWrbA载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶、角鲨烯环氧化酶和醌氧化还原酶的ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌；

S5、培养所述ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌得到环氧角鲨烯。

本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌。

本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本申请的环氧角鲨烯的制备方法及工程菌将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicolataffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。

同时，本申请还通过在大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶WrbA完成角鲨烯的加氧作用，进一步提高了环氧角鲨烯的产量。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1A为本发明一实施例所示的大肠杆菌中环氧角鲨烯的表达构建示意图；

图1B为本发明一实施例所示的环氧角鲨烯含量的气相色谱分析图；

图2A为本发明一实施例中不同种类的角鲨烯环氧化酶的表达构建示意图；

图2B和图2C为本发明一实施例所示的环氧角鲨烯含量的气相色谱-质谱分析图；

图3A为本发明一实施例所示的强Trc启动子调控CPRL表达构建示意图；

图3B为本发明一实施例所示的ML-SQE2-CRPL-a系列工程菌在培养48小时候的细胞生长和环氧角鲨烯含量的分析图；

图3C为本发明一实施例所示的重度lac启动子调控CPRL表达构建示意图；

图3D为本发明一实施例所示的ML-SQE2-CRPL-b系列工程菌在培养48小时候的细胞生长和环氧角鲨烯含量的分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、载体构建

市面上购买或自行制备：大肠杆菌中完整MVA途径表达载体pSNA；由 MVA到(isoprenyl diphosphate，IPP)和双甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)合成途径表达载体pSMvL2；pTrc99A载体；所采用的其他常见试剂和材料。

将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9_TC用BamH I和Sal I限制性内切酶消化、回收后，亚克隆到pSMvL2载体上构建pSMLSQ载体。

按照大肠杆菌密码子偏爱性合成了荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)角鲨烯环化酶基因McSE、Fluviicola taffensis角鲨烯环化酶基因FtSE、截短型大鼠(Rattus norvegicus)角鲨烯环化酶基因RnSE_TC，通过合成的基因上下游分别引入酶切位点BamH I和Bgl II、Sal I，再亚克隆到pTrc99A载体构建pTMcSE、 pTFtSE和pTRnSE_TC。

通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组扩增NAD(P)依赖的氧化还原酶基因 ytfG、NADPH：醌氧化还原酶基因mdaB、NAD(P)H-黄素还原酶基因fre、tRNA 结合蛋白基因ygjH、硫氧还蛋白还原酶基因trxB、NADPH依赖的FMN还原酶基因ssuE、NADH：醌氧化还原酶基因wrbA，并通过上下游引物引入的限制性内切位点Sal I和BamH I，分别将这7个CPRL(CPR-like，内源性CPR样)基因克隆到pTRnSE_TC构建pTRnSE_TCCPRL系列载体。同样，将上述CPRL相关基因克隆到pSMLSQ构建成pSMLSQ-CPRL系列载体。

二、菌株和培养条件

大肠杆菌DH5α用作载体克隆和环氧角鲨烯合成的宿主菌。将含有不同合成环氧角鲨烯模块的载体转化到大肠杆菌DH5α中构建各环氧角鲨烯工程菌株，其详细信息见表3。挑取重组大肠杆菌DH5α于LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L)中，在37℃恒温气浴摇床中，以200rpm振荡培养12h用作载体的克隆和扩增。环氧角鲨烯工程菌的培养时，首先挑取单克隆于2YT培养基(胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)中，在30℃恒温气浴摇床中，以200rpm振荡培养12h作为种子液，再以0.1OD₆₀₀的接种量接种到含有2％甘油(v/v)和0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的新鲜2YT培养基，在30℃恒温气浴摇床中，以200rpm振荡培养48h后，用于环氧角鲨烯产量的检测。培养时根据需要加入氨苄青霉素和(或)氯霉素至终浓度100mg/L和50mg/L。

三、环氧角鲨烯的提取和测定

将48h培养液进行高转速离心，收集沉淀并用一定体积的灭菌水悬浮。悬浮后的样品与等体积的氯仿和甲醇混合，震荡萃取1h；然后转移上层氯仿相到新Eppendorf管中。再用一体积的氯仿以相同的方式萃取一次。使用真空离心浓缩仪从去除氯仿相，最后将其重新溶解在乙酸乙酯中用于气相色谱和质谱分析。

环氧角鲨烯定性分析使用配有FID的气相色谱仪(GC；Agilent Technologies7890A)进行。样品以1:10的分流比注入19091N-133HP-INNOWAX色谱柱(长度30m；内径250μm；膜厚0.25μm)。GC条件如下：初始烘箱温度为50℃，保持1分钟，以5℃/min的速率加热至80℃，然后再以40℃/min的速率加热至 260℃，以最终温度为260℃保持1分钟；检测器温度保持为260℃。在相同的气相色谱条件下，用气相色谱-质谱法(GC-MS；GCMS-2010ultra；Shimadzu)对样品各析出峰进行表征，数据采集的m/z范围为40～350，溶剂延迟cut-off时间为2.5min。

四、结果

(一)基于酿酒酵母基因的环氧化角鲨烯的生物合成途径的构建

本实施例通过串联截短的酿酒酵母角鲨烯合酶基因erg9(erg9_TC)和大肠杆菌FPP合酶基因ispA，构建了角鲨烯合成模块IspA-Erg9_TC(pTispAErg9_TC)。在此基础上，引入酵母角鲨烯环氧化酶基因erg1构建环氧角鲨烯合成模块 IspA-Erg9TC-Erg1(pTSQErg1)。考虑到角鲨烯的环氧化反应需要CPR辅因子的参与，本实施例串联了酵母NADPH依赖性CPR辅因子基因ncp1构建 pTSQErg1Ncp1表达载体(如图1A所示)。甲羟戊酸途径表达模块(pSNA)能够在大肠杆菌中利用乙酰辅酶A(acetyl-CoA)从头合成异IPP和DMAPP前体。

将新构建的质粒与其分别共转化大肠杆菌DH5α中获得工程菌株NA-SQE1 和NA-SQE1-Ncp1；将pSNA和pTispAErg9TC共转化获得工程菌株NA-SQ，用作无法进行环氧角鲨烯合成的对照组。将所构建的工程菌培养48h后，提取合成产物并进行气相色谱(GC)分析。如图1B所示，角鲨烯标准品的保留时间约为10.2min，环氧角鲨烯标准品的保留时间约为12.7min。工程菌株NA-SQE1、 NA-SQE1-Ncp1同对照组NA-SQ一样，只有10.2min处的角鲨烯特征峰，而在 12.7min处均没有明显的特征峰，。这一结果表明，无论是否引入CPR辅因子Ncp1，构建的环氧角鲨烯合成模块IspA-Erg9TC-Erg1都无法将角鲨烯环化形成环氧角鲨烯，因为酵母角鲨烯环氧化酶Erg1的活性可能受到大肠杆菌宿主环境的影响，从而导致加氧失败。

(二)角鲨烯环氧化酶在大肠杆菌中的活性筛选

本实施例中研究了角鲨烯环氧化酶FtSE、McSE和RnSE_TC在大肠杆菌宿主中进行加氧的性能。

首先，根据大肠杆菌密码子偏爱性对这三个角鲨烯环氧化酶基因FtSE， McSE和RnSE_TC重新设计，并克隆到有高拷贝数和强启动子的pTrc99A载体构建pTMcSE、pTFtSE和pTRnSE_TC载体。其次，为内源性供给角鲨烯，角鲨烯合成模块IspA-Erg9TC重新和甲羟戊酸途径下游部分串联构建从甲羟戊酸到角鲨烯的合成模块(pSMLSQ，如图2A所示)。最后，pTMcSE、pTFtSE和pTRnSE_TC载体与pSMLSQ载体共转化大肠杆菌DH5α获得工程菌株ML-SQE4、ML-SQE3 和ML-SQE2。培养48小时后，GC检测发现，3株工程菌除在10.2min有明显的角鲨烯特征峰(peak 1^#)外，在12.7min处也出现与环氧角鲨烯相同滞留时间的特征峰(peak 2^#，如图2B所示)。其中，含有大鼠角鲨烯环氧化酶RnSE_TC的ML-SQE2工程菌株表现出最强的特征峰信号。

GC-MS进一步分析显示peak 2特征峰确为环氧角鲨烯(如图2C所示)。这一结果表明角鲨烯环氧化酶在大肠杆菌中的活性受到种属来源特异性的影响。同时，也表明大肠杆菌中可能存在存在CPRL辅因子协助角鲨烯环氧化酶共同完成角鲨烯的加氧过程。

(三)大肠杆菌内源性CPRL辅因子对环氧角鲨烯合成的影响

为寻找角鲨烯环氧化过程中行使功能的CPRL辅因子，本实施例选取了七个电子传递酶：NAD(P)依赖的氧化还原酶YtfG、NADPH:醌氧化还原酶MdaB、 NAD(P)H-黄素还原酶Fre、NADPH依赖性铁螯合还原酶YqjH、硫氧还蛋白还原酶TrxB、NADPH依赖的FMN还原酶SsuE、NADH：醌氧化还原酶WrbA作为考察对象。

首先将其与表现优异的角鲨烯环氧化酶基因RnSE_TC串联构建 pTRnSE_TCCPRL载体系列(如图3A所示)，再将七个pTRnSE_TCCPRL载体分别与PMSLQ载体共转化大肠杆菌，获得ML-SQE2-CRPL-a系列工程菌。培养48h 后，各工程菌细胞生长量与ML-SQE2菌株相比较发现，除了过表达MdaB和 Fre的菌株生长较好外，其余各菌株生长均明显低于ML-SQE2菌株。在环氧角鲨烯合成方面，仅过表达MdaB和Fre的两菌株有环氧角鲨烯的生成，但产量仅为ML-SQE2菌株一半左右，其余各菌株环氧角鲨烯产量均低于检测水平(如图 3B所示)。由于ML-SQE2-CRPL-a系列工程菌中，CPRL被构建在高拷贝的 pTrc99A载体上，同时受到强Trc启动子的控制，电子传递酶作为内膜蛋白，其过表达可能造成细胞生长的抑制；其表达量的增加也有可能打破了呼吸链原有的稳态，影响细胞正常的能量代谢，导致细胞生长缓慢。因此，七个候选CPRL 辅因子被重新构建在中度拷贝和相对较弱的Lac启动子控制的pSMLSQ载体，再与pTRnSE_TC载体共转化大肠杆菌，获得ML-SQE2-CRPL-b系列工程菌(如图3C所示)。

本实施例实验结果表明，在相同的培养下，ML-SQE2-CRPL-b系列工程菌表现出与ML-SQE2-CRPL-a系列完全不同结果。如图3D所示，各菌株细胞生长量与ML-SQE2菌株相比没有明显差异；除过表达TrxB菌株，其他各菌株均能生成环氧角鲨烯，其中，过表达WrbA菌株(ML-SQE2-WrbA-b)的环氧角鲨烯产量比ML-SQE2菌株提高了近1.5倍。

在本实施例中，所涉及的引物如表1所示，所涉及的菌株如表2所示。

表1

引物	序列
		Erg1-Sal-F	CTAGTCGACAGAAGGAGATATACATATGTCTGCTGTTAACGTTGCAC
Erg1-Hndxho-R	GAGAAGCTTCTCGAGTTAACCAATCAACTCACCAAAC
		NCP1-Xho-F1	CTACTCGAGAAGGAGATATACATATGCCGTTTGGAATAGACAACAC
NCP1-Hnd-R	GAGAAGCTTACCAGACATCTTCTTGGTATC
		yqjH-bam-F	GCGGATCCAAGGAGATAACAATGAATAACACCC
yqjH-sal-R	AGTGTCGACTTACTTTGCGTGCCAGTAAGC
		ssuE-bam-F	GCGGATCCAGGAGAAATATATGCGTGTCATCACCCTGGC
ssuE-sal-R	AGTGTCGACGATGTTACGCATGGGCATTACC
		wrbA-bam-F	GCGGATCCAAGGAGATAATAAATGGCTAAAGTTCTGGTGC
wrbA-sal-R	AGTGTCGACGCATGCGTATCCTCCTGTTG
		ytfG-bam-F	GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGATCGCTATTACTGGTGCC
ytfG-sal-R	AGTGTCGACGTCATTATCAGAGAGGATGC
		mdaB-bam-F	GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGAGCAACATCCTGATTATC
mdaB-sal-R	CGTGTCGACAAGCCTGAGCTCTAGTTAAC
		fre-bam-F	GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGACAACCTTAAGCTGTAAAGTG
fre-xho-R	GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGGGCACGACCAAACACAG
		trxB-bam-F	GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGGGCACGACCAAACACAG
trxB-sal-R	CGTGTCGACCATAGTCGCATGGTGTCGC

表2

在本实施例中，erg9_TC基因、McSE基因、FtSE基因、RnSE_TC基因、WrbA 基因、YtfG基因、MdaB基因、Fre基因、YgjH基因、TrxB基因、SsuE基因的序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.11所示。

综上所述：本申请的环氧角鲨烯的制备方法及工程菌将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。

同时，本申请还通过在大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶WrbA完成角鲨烯的加氧作用，进一步提高了环氧角鲨烯的产量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 环氧角鲨烯的制备方法及工程菌

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> erg9TC gene

<400> 1

atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60

aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120

cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180

catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240

atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300

gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360

gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420

caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480

gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540

tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600

aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660

accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720

gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780

ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840

ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900

gttatggcca ttgcaacctt ggttttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960

gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020

tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080

ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140

taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200

aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtactaa 1260

<210> 2

<211> 1350

<212> DNA

<213> McSE gene

<400> 2

atgtcgtcta ttgaactggg tgaatgggat gtgctgattg cgggtggtag tgtggcgggc 60

tcggctgctg cggcggctct gagtggtctg ggtctgcgtg ttctgattgt cgaaccggac 120

ccggacccgg gtcgtcgcct ggcaggcgaa ctgattcatc cgccgggtat cgatggcctg 180

ctggaactgg gcctgattca cgatgacgtg ccgcaaggta gcgtggttaa cggctttgcc 240

atctttccgt tcaatgacgg tgaaggtgct ccggcaaccc tgctgccgta tggtgaaatt 300

catggccgtc agcgctgcgg tcgtgtgatc gaacataccc tgctgaaatc ccacctgctg 360

gaaacggttc gtggctttga acgtgtctca gtgtggctgg gtgcccgcgt caccggtatg 420

gaacatgaag atggtaaagg ctacgtggca accgttacgc acgaaggtac cgaaacgcgt 480

atggaagtgc gcctgattat cggtgcggac ggcccgatgt ctcaactgcg taaaatggtt 540

ggcatttctc atgaaaccca gcgctatagt ggtatgatcg gcctggaagt cgaagatacg 600

cacctgccga acccgggtta cggcaacatt tttctgaatc cggccggtgt gagctatgca 660

tacggtatcg gcggtggccg tgcccgcgtt atgttcgaag tcctgaaagg tgcagattca 720

aaagaatcga ttcgtgacca tctgcgcctg tttccggcgc cgttccgtgg tgatatcgaa 780

gccgttctgg cacagggtaa accgctggca gcagcaaact attgtattgt cccggaagcc 840

tcggtgaaag ctaatgtcgc gctggttggc gatgctcgtg gctgctgtca cccgctgacc 900

gcaagcggta tcacggctgc ggttaaagat gcgtttgtca tgcgcgacgc cctgcaggca 960

accggtctga acttcgaagc cgcactgaaa cgttacagtg tgcagtgcgg ccgcctgcaa 1020

ctgacccgtc gcacgctggc agaagaactg cgcgaagctt ttctggcgca aaccccggaa 1080

gcggaactgc tgagtcagtg tattttctcc tattggcgta attcaccgaa aggtcgccag 1140

gcctcgatgg cactgctgag caccctggat agctctatct ttagcctggc ttctcagtac 1200

acgctggttg gcctgcaagc gttccgtctg ctgccgcagt ggctgggtgc caaaatgggt 1260

ggcgattggt ttcgcggcgt ggcacaactg gttagcaaat ccctgaaatt ccagcaagac 1320

gctctgaatc aggctctgcg cgcgaaataa 1350

<210> 3

<211> 1317

<212> DNA

<213> FtSE gene

<400> 3

atgagcaccc atgaatttga cattattgtt atcggcgcag gcgtcgcagg cggcgttttc 60

gcagcatcgc aaccggcaag cacccgtatt ctggtggttg aacgtgatct gtctgaacag 120

gaacgcatta tcggtgaact gatgcagccg ggcggtatcc aagctctgaa tgaactgggt 180

ctgtcacatc tgctggaagg cattgatgcc caggaagtta atggttataa cctgattaaa 240

ggcaatgaac gtttcaccat caactacgac gaagtccaga aaggtattaa aggtatcggc 300

ctgcgcaatg gcaaatttct gaccaacatt cgtaaagaac tggaacagcg cgaaaatatc 360

acgctggtgc agggcaacgt tagccaaatt ctggaaaaca ataacaccat tatcggtgtt 420

tcttatgtcc aggaagatgg caccacgatt agccaatttt ctaaactgac gatcgtttgc 480

gatggtccga tgtcagtcct gcgtgacaaa ctgtcgaaag tcaacaaaaa agtgaccagt 540

tacttcatgg gcctggtgct gaaagacctg gaactggaat ttccgtccta tggtcatatg 600

attgtgaccg gcgactttcc gattctggtt tacccgatcc acacgaacgc gtatcgtatt 660

ctgatcgatt acccgggcgg taaagccccg aaaatgggta aagaatccat tgaacgcctg 720

aaagaagatg tcgtgaaaat tctgccggaa gaaatgatcc cggcgttcct gaaagccatt 780

gacgaagaac cgatcaaagt tatgccgaat cattcaatga aaggccaggc ctttcgtatg 840

aaaggtgcag cactgctggg tgactcgctg aacatgcgtc acccgctgac cggcggtggc 900

atgaccgcaa cgttcagcga tatcctgtgc ctgaatggtc agctggccgg cattgacttt 960

caaaacgaaa ccaaactgga atatgcagtc aatgaatatt acaccaaccg tggtaaagat 1020

gtggaaacga ttaatatcct ggcaaacgct ctgtataaag tgtttaccaa tgacgaactg 1080

aaagaagcat gtttcgaata cctgcagaaa ggtggcgaac aagctacggg tccgctgagt 1140

attctgtccg gcatcaacaa aaacaaaaaa ttcctgctga aacacttttt caaagtggca 1200

atgcagcatc cgattcactt tatcaccaaa ccggcaaaac aaatccgcct gtataaaaac 1260

gctacgcgta ttctgcgccc gatcctgaaa gatgaagaag ttagcgcgat gatttaa 1317

<210> 4

<211> 1428

<212> DNA

<213> RnSETC gene

<400> 4

atggaagtga atctgtcgga aaccaccctg accggtgccg ccacgagcgt ctcaaccagc 60

agcgttacgg acccggaagt tatcatcatt ggtagcggcg tgctgggttc tgcactggca 120

accgttctga gccgtgatgg ccgcaccgtg acggttattg aacgtgatct gaaagaaccg 180

gaccgcatcc tgggtgaatg cctgcagccg ggcggttatc gtgtcctgcg cgaactgggt 240

ctgggcgata cggttgaaag cctgaacgcg catcacattc atggctatgt gatccacgac 300

tgtgaaagcc gttctgaagt tcagattccg tacccggtct cagaaaacaa tcaggtgcaa 360

tcgggtgttg cgtttcatca cggcaaattc atcatgagtc tgcgtaaagc ggccatggcc 420

gaaccgaatg ttaaatttat tgaaggtgtg gttctgcgcc tgctggaaga agatgacgca 480

gttatcggtg tccagtataa agataaagaa accggcgaca cgaaagaact gcatgcaccg 540

ctgaccgtcg tggctgatgg tctgtttagc aaattccgca aaaacctgat cagtaacaaa 600

gtctccgtga gctctcactt tgtgggcttc atcatgaaag atgcgccgca gtttaaagcg 660

aacttcgccg aactggtgct ggttgatccg tctccggttc tgatttacca aatcagtccg 720

tccgaaaccc gtgtgctggt tgatattcgc ggcgaactgc cgcgtaacct gcgcgaatat 780

atgacggaac agatttaccc gcaaatcccg gatcatctga aagaatcatt tctggaagcg 840

tgccagaatg cacgtctgcg taccatgccg gcatcgttcc tgccgccgag ttccgtcaac 900

aaacgtggtg tgctgctgct gggcgatgca tataatctgc gccacccgct gaccggcggt 960

ggcatgacgg tggctctgaa agacattaaa atctggcgtc agctgctgaa agatattccg 1020

gacctgtacg atgacgcagc tatcttccaa gcgaaaaaat ctttcttttg gtcgcgtaaa 1080

cgctcacatt cgtttgttgt caatgtgctg gcacaggctc tgtatgaact gttcagtgcg 1140

accgatgact ccctgcgtca actgcgcaaa gcctgctttc tgtacttcaa actgggtggc 1200

gaatgtctga cgggtccggt tggcctgctg agcattctgt ctccggaccc gctgctgctg 1260

atccgtcatt tctttagcgt cgcagtgtat gctacctact tttgcttcaa atccgaaccg 1320

tgggcaacga aaccgcgcgc tctgttttca tcgggtgcga ttctgtataa agcctgtagc 1380

attatcttcc cgctgatcta ttctgaaatg aaatacctgg tgcactaa 1428

<210> 5

<211> 597

<212> DNA

<213> WrbA gene

<400> 5

atggctaaag ttctggtgct ttattattcc atgtacggac atattgaaac gatggcacgc 60

gcagtcgctg agggtgcaag caaagtggat ggcgctgaag ttgtcgttaa gcgtgtaccg 120

gaaaccatgc cgccgcaatt atttgaaaaa gcaggcggta aaacgcaaac tgcaccggtt 180

gcaaccccgc aagaactggc cgattacgac gccattattt ttggtacacc tacccgcttt 240

ggcaacatgt ccggtcaaat gcgtaccttc ctcgaccaga cgggcggcct gtgggcttcc 300

ggcgcactat acggaaaact ggcgagcgtc tttagttcca ccggtactgg cggcggtcag 360

gaacaaacca tcacatccac ctggacgacc cttgcgcatc acggcatggt aattgtccct 420

attggctacg cagcgcagga attatttgac gtttcacagg ttcgcggcgg tacgccgtac 480

ggcgcaacca ccatcgcagg cggtgacggt tcacgccagc ccagccagga agaactgtct 540

attgctcgtt atcaagggga atatgtcgca ggtctggcag ttaaacttaa cggctaa 597

<210> 6

<211> 861

<212> DNA

<213> YtfG gene

<400> 6

atgatcgcta ttactggtgc cactggccaa cttggtcact atgttattga atccttgatg 60

aaaacggttc ctgccagcca aatagtggct atcgttcgta atccggcaaa agcccaagcc 120

ctggcagcac aaggcattac cgtgcgtcag gctgactacg gcgatgaagc cgcactgaca 180

tctgcacttc agggagtgga aaaactactg ctgatctctt ccagcgaagt gggtcaacgt 240

gccccgcagc atcgtaatgt tattaatgcc gcaaaggcgg ctggcgtgaa atttatcgct 300

tataccagcc tgctacatgc agatacctcc ccgctcggcc tcgccgatga gcacatcgag 360

acggagaaaa tgctggctga ttctggcatc gtttacaccc tgctgcgcaa cggctggtac 420

agcgaaaact acctcgccag cgccccggca gcactggaac acggcgtatt tatcggtgcg 480

gcgggcgatg gcaaaatcgc ctcagcaacg cgggcagatt atgcggcagc tgcggcacgc 540

gtgattagcg aagccggtca cgaaggcaag gtttacgaac tggcgggcga tagtgcctgg 600

acgttgacac agttagcggc agagctgacc aaacagagcg gcaaacaggt tacctatcaa 660

aatctgagcg aagccgattt cgccgcggca ctgaaaagcg tcggactgcc cgacggactg 720

gcggatatgc tggcggattc tgacgttggc gcatcgaaag gcggtctgtt tgatgacagc 780

aaaacactta gcaaattgat tggccaccca acgacaacgt tagccgaaag cgtaagccat 840

ctttttaatg ttaataacta g 861

<210> 7

<211> 582

<212> DNA

<213> MdaB gene

<400> 7

atgagcaaca tcctgattat caacggcgcg aaaaaattcg cccactccaa tggtcaactg 60

aacgacaccc tgaccgaagt cgcggatggc acactgcgcg accttgggca tgatgtccgc 120

atcgttcgcg ccgacagcga ctacgatgtc aaagcggaag tacaaaactt tctctgggct 180

gatgtggtga tctggcagat gccaggctgg tggatgggcg cgccgtggac agtgaaaaaa 240

tacattgatg atgtattcac cgaaggtcac gggacgctgt atgccagcga tggtcgtacc 300

cgcaaagatc cgtcgaaaaa atacggttcc ggcggcctgg tacagggcaa aaaatatatg 360

ctttctctga cctggaacgc accaatggaa gccttcaccg aaaaagatca gttcttccac 420

ggcgttggcg ttgacggtgt gtatctgccg ttccataaag caaaccaatt cctcggtatg 480

gaaccgctgc cgacatttat cgctaatgac gtgataaaaa tgcctgatgt tccccgctat 540

actgaagaat atcgcaagca tcttgtggaa atttttggtt aa 582

<210> 8

<211> 702

<212> DNA

<213> Fre gene

<400> 8

atgacaacct taagctgtaa agtgacctcg gtagaagcta tcacggatac cgtatatcgt 60

gtccgcatcg tgccagacgc ggccttttct tttcgtgctg gtcagtattt gatggtagtg 120

atggatgagc gcgacaaacg tccgttctca atggcttcga cgccggatga aaaagggttt 180

atcgagctgc atattggcgc ttctgaaatc aacctttacg cgaaagcagt catggaccgc 240

atcctcaaag atcatcaaat cgtggtcgac attccccacg gagaagcgtg gctgcgcgat 300

gatgaagagc gtccgatgat tttgattgcg ggcggcaccg ggttctctta tgcccgctcg 360

attttgctga cagcgttggc gcgtaaccca aaccgtgata tcaccattta ctggggcggg 420

cgtgaagagc agcatctgta tgatctctgc gagcttgagg cgctttcgtt gaagcatcct 480

ggtctgcaag tggtgccggt ggttgaacaa ccggaagcgg gctggcgtgg gcgtactggc 540

accgtgttaa cggcggtatt gcaggatcac ggtacgctgg cagagcatga tatctatatt 600

gccggacgtt ttgagatggc gaaaattgcc cgcgatctgt tttgcagtga gcgtaatgcg 660

cgggaagatc gcctgtttgg cgatgcgttt gcatttatct ga 702

<210> 9

<211> 765

<212> DNA

<213> YgjH gene

<400> 9

atgaataaca ccccccgcta cccgcagcgc gttcgcaatg atctgcgctt ccgtgaactg 60

actgtgttac gcgttgagcg catcagcgcc ggttttcagc gcattgtcct cggcggcgag 120

gcgctggacg gttttacatc gcgtggcttt gacgatcaca gcaaactctt ctttcctcaa 180

cctgacgctc actttgtgcc gccaacggta acggaagagg gcatcgtctg gccggaagga 240

ccacgcccac cgtcgcgtga ctatacgccg ctgtatgacg aactacgcca tgaactggcg 300

attgatttct ttattcacga cggtggggtc gccagcggct gggcgatgca ggcgcaaccg 360

ggcgataaac ttacggtggc aggtccgcgc ggttcgctgg tggtgccgga agattacgcg 420

tatcagctgt atgtctgcga tgaatccgga atgcctgcat tgcgccgccg cctggaaacg 480

ttgagcaaac ttgccgttaa accgcaagtt agtgcgctgg ttagcgtgcg ggataacgcc 540

tgtcaggatt atctcgcgca ccttgatggt tttaatatcg aatggctggc acatgatgag 600

caggcggtag atgcgcgtct ggcgcagatg caaatccctg ccgatgatta cttcatctgg 660

ataaccggcg aaggtaaagt cgttaagaat ttaagccgcc gctttgaagc ggaacagtat 720

gacccacagc gggtacgtgc agcggcttac tggcacgcaa agtaa 765

<210> 10

<211> 966

<212> DNA

<213> TrxB gene

<400> 10

atgggcacga ccaaacacag taaactgctt atcctgggtt caggcccggc gggatacacc 60

gctgctgtct acgcggcgcg cgccaacctg caacctgtgc tgattaccgg catggaaaaa 120

ggcggccaac tgaccaccac cacggaagtg gaaaactggc ctggcgatcc aaacgatctg 180

accggtccgt tattaatgga gcgcatgcac gaacatgcca ccaagtttga aactgagatc 240

atttttgatc atatcaacaa ggtggatctg caaaaccgtc cgttccgtct gaatggcgat 300

aacggcgaat acacttgcga cgcgctgatt attgccaccg gagcttctgc acgctatctc 360

ggcctgccct ctgaagaagc ctttaaaggc cgtggggttt ctgcttgtgc aacctgcgac 420

ggtttcttct atcgcaacca gaaagttgcg gtcatcggcg gcggcaatac cgcggttgaa 480

gaggcgctgt atctgtctaa catcgcttcg gaagtgcatc tgattcaccg ccgtgacggt 540

ttccgcgcgg aaaaaatcct cattaagcgc ctgatggata aagtggagaa cggcaacatc 600

attctgcaca ccaaccgtac gctggaagaa gtgaccggcg atcaaatggg tgtcactggc 660

gttcgtctgc gcgatacgca aaacagcgat aacatcgagt cactcgacgt tgccggtctg 720

tttgttgcta tcggtcacag cccgaatact gcgattttcg aagggcagct ggaactggaa 780

aacggctaca tcaaagtaca gtcgggtatt catggtaatg ccacccagac cagcattcct 840

ggcgtctttg ccgcaggcga cgtgatggat cacatttatc gccaggccat tacttcggcc 900

ggtacaggct gcatggcagc acttgatgcg gaacgctacc tcgatggttt agctgacgca 960

aaataa 966

<210> 11

<211> 576

<212> DNA

<213> SsuE gene

<400> 11

atgcgtgtca tcaccctggc gggtagtcct cgctttcctt ctcgctccag ctccttgctg 60

gaatatgcgc gggaaaaact aaatggcctg gatgtagagg tttatcactg gaatctgcaa 120

aacttcgccc cggaagatct actttatgct cgtttcgata gtccggcact caagaccttc 180

accgaacagc tgcaacaggc cgatgggctg attgtcgcca cgcctgtgta taaagccgcc 240

tattccggtg cgttgaaaac cctgctcgac ctgctgccag aacgcgcttt gcaaggcaaa 300

gtggtgctac cgctggcgac gggcggtacc gtggcccatc tgctggcggt cgattatgcc 360

cttaaaccag ttttaagcgc actgaaagct caggagatcc tgcacggcgt gtttgccgat 420

gactcacaag taattgatta ccatcacaga ccccagttca cgccaaatct gcaaacccgt 480

cttgataccg cgctagaaac tttctggcag gcattgcacc gccgcgatgt tcaggttcct 540

gaccttctgt ctctgcgagg taatgcccat gcgtaa 576

Claims (9)

1.一种环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，包括：在大肠杆菌中表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶；所述角鲨烯合酶的编码基因为截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9_TC，所述角鲨烯环氧化酶的编码基因为荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因：McSE基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶基因：FtSE基因或截短型大鼠角鲨烯环化酶基因：RnSE_TC基因中的任一种；所述erg9_TC的序列为SEQ ID NO.1，所述McSE基因的序列为SEQ IDNO.2，所述FtSE基因的序列为SEQ ID NO.3，所述RnSE_TC基因的序列为SEQ ID NO.4。

2.如权利要求1所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1、构建含有所述erg9_TC的pSMLSQ载体；

S2、分别构建含有所述McSE、FtSE和RnSE_TC的pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE_TC载体。

3.如权利要求2所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述pSMLSQ载体由所述erg9_TC克隆至pSMvL2载体中构建而成。

4.如权利要求3所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE_TC载体分别由所述McSE、FtSE和RnSE_TC克隆至pTrc99A载体中构建而成。

5.如权利要求4所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：

S3、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE_TC载体分别与pSMLSQ载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶的ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌；

S4、培养所述ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌得到环氧角鲨烯。

6.如权利要求4所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，还包括在所述大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶，所述醌氧化还原酶的编码基因为WrbA基因，所述WrbA基因的序列为SEQ ID NO.5。

7.如权利要求6所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：

S3、将所述WrbA基因克隆至所述pSMLSQ载体构建pSMLSQWrbA载体；

S4、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE_TC载体分别与pSMLSQWrbA载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶、角鲨烯环氧化酶和醌氧化还原酶的ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b工程菌；

S5、培养所述ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b工程菌得到环氧角鲨烯。

8.一种根据如权利要求1至5中任一项所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，其特征在于，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌。

9.一种根据如权利要求1至4和6至7中任一项所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，其特征在于，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b工程菌。

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