CN116855523B - 一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116855523B
CN116855523B CN202310864116.9A CN202310864116A CN116855523B CN 116855523 B CN116855523 B CN 116855523B CN 202310864116 A CN202310864116 A CN 202310864116A CN 116855523 B CN116855523 B CN 116855523B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhodosporidium toruloides
protein
sequence
gene
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310864116.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116855523A (zh
Inventor
姜浩
刘锋
庄满生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Heyao Biotechnology Nanjing Co ltd
Original Assignee
Heyao Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Heyao Biotechnology Nanjing Co ltd filed Critical Heyao Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority to CN202310864116.9A priority Critical patent/CN116855523B/zh
Publication of CN116855523A publication Critical patent/CN116855523A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116855523B publication Critical patent/CN116855523B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01002—Glutamate dehydrogenase (1.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01178—Diaminobutyrate acetyltransferase (2.3.1.178)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01001—Aspartate transaminase (2.6.1.1), i.e. aspartate-aminotransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01076—Diaminobutyrate--2-oxoglutarate transaminase (2.6.1.76)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01108—Ectoine synthase (4.2.1.108)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。所述方法包括如下步骤：敲除圆红冬孢酵母中CAR2基因且异源表达伸长盐单胞菌来源的ectB、ectA和ectC基因；进一步的，所述方法还包括过表达L‑谷氨酸脱氢酶基因GDH2的步骤；更进一步的，所述方法还包括过表达丙酮酸羧化酶基因PYC、L‑天冬氨酸:2‑酮戊二酸转氨酶基因AAT2和/或L‑天冬氨酸4‑磷酸转移酶基因HOM3的步骤。通过实验表明：本发明构建的高效生产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌株的依克多因产量最高可达62.1g/L，对于依克多因工业生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大的推广应用价值。

Description

一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
圆红冬孢酵母是一种在生物制造中具有巨大应用潜力的真核生物，可高效利用秸秆木质纤维素水解液等多种碳源，常用于高产油脂类化合物和萜类化合物等，高产其他化合物的应用潜力亟待挖掘。
依克多因(ectoine)又称作四氢甲基嘧啶羧酸，是一种存在于多种细菌中的天然氨基酸衍生物，具有帮助这些细菌耐受高盐、高温、高紫外线辐射等极端环境的作用。依克多因可作为高端化妆品原料使用，具有很高经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。
第一方面，本发明保护一种重组菌的构建方法。
本发明保护的重组菌的构建方法包括如下步骤：降低圆红冬孢酵母中CAR2蛋白的含量和/或活性，且提高所述圆红冬孢酵母中伸长盐单胞菌来源的EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白的含量和/或活性；
所述EctB蛋白为A1)或A2)所示的蛋白质：
A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)由序列表中序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctB蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质；
所述EctA蛋白为B1)或B2)所示的蛋白质：
B1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
B2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctA蛋白活性的由B1)衍生的蛋白质；
所述EctC蛋白为C1)或C2)所示的蛋白质：
C1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
C2)由序列表中序列5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctC蛋白活性的由C1)衍生的蛋白质；
所述CAR2蛋白为D1)或D2)所示的蛋白质：
D1)由序列表中序列24所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
D2)由序列表中序列24所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有CAR2蛋白活性的由D1)衍生的蛋白质。
进一步的，所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中L-谷氨酸脱氢酶GDH2的含量和/或活性的步骤。
所述L-谷氨酸脱氢酶GDH2为E1)或E2)所示的蛋白质：
E1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
E2)由序列表中序列11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L-谷氨酸脱氢酶GDH2活性的由E1)衍生的蛋白质。
更进一步的，所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC和/或L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2和/或L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3的含量和/或活性的步骤。
所述丙酮酸羧化酶PYC为F1)或F2)所示的蛋白质：
F1)由序列表中序列14所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
F2)由序列表中序列14所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸羧化酶PYC活性的由F1)衍生的蛋白质。
所述L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2为G1)或G2)所示的蛋白质：
G1)由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
GF2)由序列表中序列18所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2活性的由G1)衍生的蛋白质。
所述L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3为H1)或H2)所示的蛋白质：
H1)由序列表中序列21所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
H2)由序列表中序列21所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3活性的由H1)衍生的蛋白质。
上述方法中，所述CAR2蛋白的编码基因序列如序列表中序列25所示。
所述EctB蛋白的编码基因序列如序列表中序列2所示。
所述EctA蛋白的编码基因序列如序列表中序列4所示。
所述EctC蛋白的编码基因序列如序列表中序列6所示。
所述L-谷氨酸脱氢酶GDH2的编码基因序列如序列表中序列12所示。
所述圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC的编码基因序列如序列表中序列15所示。
所述L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2的编码基因序列如序列表中序列19所示。
所述L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3的编码基因序列如序列表中序列22所示。
上述方法中，所述降低圆红冬孢酵母中的CAR2蛋白的含量和/或活性的方法为将圆红冬孢酵母中的CAR2基因敲除。
所述提高圆红冬孢酵母中伸长盐单胞菌来源的EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白的含量和/或活性的方法为将提高ectB、ectA和ectC基因表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
所述提高圆红冬孢酵母中L-谷氨酸脱氢酶GDH2的含量和/或活性的方法为将提高L-谷氨酸脱氢酶基因GDH2表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
所述提高圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC的含量和/或活性的方法为将提高丙酮酸羧化酶基因PYC表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
所述提高圆红冬孢酵母中L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2的含量和/或活性的方法为将提高L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
所述提高所述圆红冬孢酵母中L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3的含量和/或活性的方法为将提高L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
进一步的，所述将圆红冬孢酵母中的CAR2基因敲除的方法可为将敲除CAR2基因的物质导入圆红冬孢酵母中。
再进一步的，所述敲除CAR2基因的物质可为采用同源重组方式敲除CAR2基因的质粒。
所述提高ectB、ectA和ectC基因表达量的物质可为含有ectB、ectA和ectC基因表达盒的质粒。
所述提高L-谷氨酸脱氢酶基因GDH2表达量的物质可为含有L-谷氨酸脱氢酶基因GDH2表达盒的质粒。
所述提高丙酮酸羧化酶基因PYC表达量的物质可为含有丙酮酸羧化酶基因PYC表达盒的质粒。
所述提高L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2表达量的物质可为含有L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2表达盒的质粒。
所述提高L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3表达量的物质可为含有L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3表达盒的质粒。
更进一步的，所述采用同源重组方式敲除CAR2基因的质粒和所述含有ectB、ectA和ectC基因表达盒的质粒可为下文中的质粒1。
所述含有L-谷氨酸脱氢酶基因GDH2表达盒的质粒可为下文中的质粒2。
所述含有丙酮酸羧化酶基因PYC表达盒的质粒可为下文中的质粒3。
所述含有L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2表达盒的质粒可为下文中的质粒4。
所述含有L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3表达盒的质粒可为下文中的质粒5。
上述方法中，所述圆红冬孢酵母可为本技术领域公知的任一种圆红冬孢酵母菌株，具体可为圆红冬孢酵母NP11菌株。
第二方面，本发明保护按照上述构建方法构建得到的重组菌。
第三方面，本发明保护如下M1)-M6)中任一所述的应用：
M1)上述重组菌在生产依克多因中的应用；
M2)上述重组菌在提高依克多因产量中的应用；
M3)上述重组菌在制备生产依克多因的产品中的应用；
M4)上述重组菌在制备提高依克多因产量的产品中的应用；
M5)上述降低圆红冬孢酵母中的CAR2蛋白含量和/或活性的物质和/或上述提高EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白含量和/或活性的物质和/或上述提高L-谷氨酸脱氢酶GDH2含量和/或活性的物质和/或上述提高丙酮酸羧化酶PYC含量和/或活性的物质和/或上述提高L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2含量和/或活性的物质和/或上述提高L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3含量和/或活性的物质在构建产依克多因重组菌中的应用；
M6)上述降低圆红冬孢酵母中的CAR2蛋白含量和/或活性的物质和/或上述提高EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白含量和/或活性的物质和/或上述提高L-谷氨酸脱氢酶GDH2含量和/或活性的物质和/或上述提高丙酮酸羧化酶PYC含量和/或活性的物质和/或上述提高L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2含量和/或活性的物质和/或上述提高L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3含量和/或活性的物质在制备构建产依克多因重组菌的产品中的应用。
第四方面，本发明提供了一种生产依克多因的方法。
本发明提供的生产依克多因的方法包括如下步骤：将上述重组菌进行发酵培养，得到发酵产物，所述发酵产物中含有依克多因。
进一步的，所述方法包括如下步骤：
1)将上述重组菌接种于YPD液体培养基中培养，得到种子液；
2)将所述种子液接种于YPD液体培养基中培养，得到发酵产物。
更进一步的，所述1)中，所述培养的条件可为在30℃，250rpm条件下培养24h。
所述2)中，所述培养的条件可为在30℃，250rpm条件下培养72h或在30℃，溶氧30％，用25％氨水维持pH 7，用500g/L葡萄糖溶液维持残糖大于0条件下培养60h。
本发明为了构建得到高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌，首先敲除圆红冬孢酵母NP11菌株(记作菌株1)中CAR2基因且异源表达伸长盐单胞菌来源的ectB、ectA和ectC基因，得到菌株2。接下来，为了提高依克多因产量，又通过在菌株1中敲除CAR2基因且过表达ectB、ectA、ectC和L-谷氨酸脱氢酶基因GDH2，得到菌株3。最后，为了进一步提高依克多因产量，在菌株3中又通过过表达丙酮酸羧化酶基因PYC构建得到菌株4、过表达PYC和L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2构建得到菌株5、过表达PYC、AAT2和L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3构建得到菌株6。通过实验表明：本发明构建的高效生产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌株(菌株6)的依克多因产量可达62.1g/L，对于依克多因工业生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大的推广应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的YPD固体培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、琼脂粉15g/L、葡萄糖20g/L。
下述实施例中的YPD液体培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。
下述实施例中的pKOCAR2质粒记载于文献“Koh CM,Liu Y,Moehninsi,Du M,JiL.Molecular characterization of KU70 and KU80 homologues and exploitation ofa KU70-deficient mutant for improving gene deletion frequency inRhodosporidium toruloides.BMC Microbiol.2014Feb 27；14:50.doi:10.1186/1471-2180-14-50.”中。
下述实施例中的圆红冬孢酵母NP11菌株记载于文献“Zhu Z,Zhang S,Liu H,ShenH,Lin X,Yang F,Zhou YJ,Jin G,Ye M,Zou H,Zhao ZK.A multi-omic map of thelipid-producing yeast Rhodosporidium toruloides.Nat Commun.2012；3:1112.doi:10.1038/ncomms2112.”中。
实施例1、在圆红冬孢酵母中转入3个异源依克多因合成通路基因后，可检测到依克多因的产生
1、3个异源依克多因合成通路基因的序列优化与合成
依克多因合成通路主要包括由ectB、ectA、ectC基因编码的3个酶：EctB是L-2,4-二氨基丁酸:2-酮戊二酸转氨酶，催化细胞中氨基酸合成通路中的已有代谢产物L-天冬氨酸半醛和L-谷氨酸生成L-2,4-二氨基丁酸和2-酮戊二酸；EctA是L-2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶，催化L-2,4-二氨基丁酸和乙酰辅酶A生成N4-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸；EctC是依克多因水解酶，催化N4-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸脱水生成依克多因。
1)将伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)来源的ectB基因，针对圆红冬孢酵母进行密码子优化，得到序列2，其编码序列1所示的EctB蛋白。
2)将伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)来源的ectA基因，针对圆红冬孢酵母进行密码子优化，得到序列4，其编码序列3所示的EctA蛋白。
3)将伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)来源的ectC基因，针对圆红冬孢酵母进行密码子优化，得到序列6，其编码序列5所示的EctC蛋白。
2、重组质粒的构建
圆红冬孢酵母CAR2基因编码的CAR2蛋白是一个双功能酶，催化八氢番茄红素合成反应和番茄红素环化生成β-胡萝卜素的反应，敲除CAR2基因的菌株会丧失类胡萝卜素合成能力，菌落呈现白色。敲除CAR2基因既有利于通过颜色变化进行同源重组成功的菌落筛选，又可去除菌株中的类胡萝卜素副产物。
以质粒pKOCAR2为出发质粒通过吉布森组装法构建农杆菌介导转化圆红冬孢酵母同源重组敲除CAR2基因，并整合潮霉素抗性基因hpt表达盒、ectB基因表达盒、ectA基因表达盒、ectC基因表达盒的质粒pKOCAR2-ectB-ectA-ectC(记作质粒1)。由于质粒pKOCAR2中同源臂为针对圆红冬孢酵母ATCC 10657菌株中的CAR2基因设计，并整合绿色荧光蛋白eGFP表达盒。在此需要将同源臂更换为NP11菌株中的上游同源臂(序列7)和下游同源臂(序列8)，且将eGFP基因更换为“ectB基因-终止子-启动子-ectA基因”片段，以构成ectB表达盒和ectA表达盒，并反向插入ectC的表达盒。其中ectB基因的终止子与质粒pKOCAR2中hpt表达盒的终止子Tsv40相同，ectA基因的启动子为圆红冬孢酵母NP11菌株基因组中SSC1基因编码区前1000碱基对序列。ectC表达盒的启动子与质粒pKOCAR2中eGFP表达盒的启动子GPD1-NCYC1585相同，终止子与hpt表达盒的终止子Tsv40相同。具体步骤如下：
1)根据圆红冬孢酵母NP11菌株(记作菌株1)基因组序列，设计同源重组法敲除CAR2基因的上游同源臂序列和下游同源臂序列。然后以菌株1基因组DNA为模板，采用引物GATGAGGAACCAGCGAGACC和引物CAGAGCTGATCTTCAGAATACCG进行PCR扩增，得到上游同源臂片段(序列7)，采用引物GAAAGCCAAGCCCAGCTTTG和引物GGACTGGACTACTGGCTCGT进行PCR扩增，得到下游同源臂片段(序列8)。
2)以质粒pKOCAR2为模板，采用引物TATTCTGAAGATCAGCTCTGCTGCGATACTCTCAAGGTCAGC和引物GGTCTCGCTGGTTCCTCATCCGAATTCAATTCGGCGTTAA进行PCR扩增，得到载体片段，将载体片段和上游同源臂片段进行吉布森组装，得到替换了上游同源臂的质粒，并将其记作质粒pKOCAR2NP11L。
3)以质粒pKOCAR2NP11L为模板，采用引物ACGAGCCAGTAGTCCAGTCCAAACTATCAGTGTTTGACAGGA和引物CAAAGCTGGGCTTGGCTTTCCGCGGTCTCGATTGTTTAAACAT进行PCR扩增，得到载体片段，将载体片段和下游同源臂片段进行吉布森组装，得到替换了下游同源臂的质粒，并将其记作质粒pKOCAR2NP11。
4)人工全基因合成序列9所示的包含ectB基因和ectA基因的“ectB基因-终止子-启动子-ectA基因”片段和序列10所示的反向的ectC表达盒。
5)以质粒pKOCAR2NP11为模板，采用引物TCCAGACGGACCAGATCTAGGTAGATGCCGACCGGGATCT和引物TCAAGGATTTGAGTCTGCATGTGAGTGATCTGGTGTTGTTCTG进行PCR扩增，得到载体片段。以人工全基因合成的“ectB基因-终止子-启动子-ectA基因”片段为模板，采用引物ATGCAGACTCAAATCCTTGAACG和引物CTAGATCTGGTCCGTCTGGA进行PCR扩增，得到插入片段。将载体片段丙和插入片段进行吉布森组装，得到将eGFP表达盒替换为ectB表达盒和ectA表达盒的质粒，并将其记作质粒pKOCAR2-ectB-ectA。
6)以质粒pKOCAR2-ectB-ectA为模板，采用引物GAAAGCCAAGCCCAGCTTTG和引物CGCGGTCTCGATTGTTTAAACAT进行PCR扩增，得到载体片段。以人工全基因合成的ectC表达盒为模板，采用引物TTAAACAATCGAGACCGCGTTTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGC和引物CAAAGCTGGGCTTGGCTTTCGACGGCTTGTTCTCTCCTGC进行PCR扩增，得到插入片段。将载体片段和插入片段进行吉布森组装，得到反向插入ectC表达盒的质粒，并将其记作质粒pKOCAR2-ectB-ectA-ectC(质粒1)。
3、重组菌的构建
用农杆菌转化的方法将质粒1导入菌株1中，用潮霉素筛选，随机挑选10个白色菌落转化子。
4、重组菌的发酵培养
将挑取的转化子按照如下方法进行发酵培养：挑取圆红冬孢酵母单菌落，接种于2mL YPD液体培养基中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。将种子液以OD600＝0.5转接至10mL的YPD液体培养基中，在30℃，250rpm条件下培养72h，得到发酵液。同时以菌株1作为对照。
5、依克多因的产量检测
取1mL发酵液，5000rpm离心5min，取上清液检测依克多因产量。依克多因产量使用高效液相色谱进行检测，具体参数如下：Kromasil 100-5C18色谱柱(250mm×4.6mm)，UV检测器210nm，柱温30摄氏度，流动相为甲醇：(40mM磷酸二氢钠、10mM庚烷磺酸钠、pH＝4.5)＝3：97，流速1.0mL/min，进样量5.0uL，运行时间15min。
结果显示，菌株1中检测不到依克多因的产量，10个转化子中均可检测到依克多因产量，其中产量最高的转化子记作菌株2，依克多因产量为1.8g/L。
菌株2为将圆红冬孢酵母NP11菌株(菌株1)中的CAR2基因敲除且导入ectB、ectA、ectC基因后得到的菌株。
实施例2、过表达L-谷氨酸脱氢酶基因GDH2可提高依克多因产量
依克多因分子中含有2个氮原子，在其合成途径中分别由L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶和EctB所催化的反应中通过转氨基实现，这两个反应的氨基供体均为L-谷氨酸。L-谷氨酸脱氢酶可催化2-酮戊二酸、氨、氢离子和NADH或NADPH生成L-谷氨酸、水和NAD+或NADP+的反应，这个反应是细胞中谷氨酸的来源。由于依克多因合成途径上游的糖酵解和丙酮酸脱氢过程产生的都是NADH，而不是NADPH，因此依赖NAD+的L-谷氨酸脱氢酶相比于依赖NADP+的L-谷氨酸脱氢酶，对依克多因的合成更有优势。
1、重组质粒的构建
通过吉布森组装法在质粒1第15147-15148位之间插入反向的GDH2基因表达盒(GDH2基因表达盒的核苷酸序列为序列13)，得到质粒pKOCAR2-ectB-ectA-ectC-GDH2(记作质粒2)。其中，GDH2基因表达盒中的启动子和终止子与质粒1中ectA基因表达盒中的启动子和终止子相同。具体构建方法如下：
1)以菌株1的总RNA为模板，采用引物ATGCCATCAGCCATGCTCAG和引物CTAGTTTTCGTCCTGGGTGAG进行RT-PCR扩增，得到依赖NAD+的L-谷氨酸脱氢酶GDH2基因，其核苷酸序列如序列12所示，编码序列11所示的L-谷氨酸脱氢酶。
2)以质粒1为模板，采用引物GAAAGCCAAGCCCAGCTTTG和引物GACGGCTTGTTCTCTCCTGC进行PCR扩增，得到载体片段。以质粒1为模板，采用引物GCAGGAGAGAACAAGCCGTCGCTAATTCGGGGGATCTGGA和引物TCACCCAGGACGAAAACTAGGTAGATGCCGACCGGG进行PCR扩增，得到包含反向终止子的插入片段1。以前述序列12扩增产物(反向插入)为插入片段2。以质粒1为模板，采用引物CTGAGCATGGCTGATGGCATTGCTGTAGTCTGGCTTTGA和引物CAAAGCTGGGCTTGGCTTTCTCACCTTCCCGCGAAGGA进行PCR扩增，得到包含反向启动子的插入片段3。将载体片段、插入片段1、插入片段2、插入片段3一起进行吉布森组装，得到反向插入GDH2表达盒的质粒pKOCAR2-ectB-ectA-ectC-GDH2(质粒2)。
2、重组菌的构建
用农杆菌转化的方法将质粒2导入菌株1中，用潮霉素筛选，随机挑选5个转化子。
3、重组菌的发酵培养
将挑取的转化子按照实施例1步骤4中的方法进行发酵培养，同时以菌株2作为对照。
4、依克多因的产量检测
按照实施例1步骤5中的方法检测依克多因产量。
结果显示：5个转化子中均可检测到依克多因产量，其中产量最高的转化子记作菌株3，依克多因产量为3.9g/L。
菌株3为将圆红冬孢酵母NP11菌株(菌株1)中的CAR2基因敲除且导入ectB、ectA、ectC和GDH2基因后得到的菌株。
实施例3、过表达丙酮酸羧化酶基因PYC可提高依克多因产量
丙酮酸羧化酶催化糖酵解产物丙酮酸与碳酸、ATP反应，生成草酰乙酸、ADP、磷酸。这个反应可以直接生成依克多因合成途径所需的草酰乙酸，而不需要经过三羧酸循环，不仅不损失碳原子，还可利用碳酸，减少碳原子的损失。
1、重组质粒的构建
通过吉布森组装法构建农杆菌介导转化圆红冬孢酵母同源重组敲除潮霉素抗性基因hpt，并整合PYC基因表达盒、博来霉素抗性基因BLE表达盒的质粒pKOhpt-PYC(记作质粒3)。其中，质粒3中的PYC基因表达盒的启动子和终止子与质粒1中ectA基因表达盒的启动子和终止子相同。具体步骤如下：
1)以菌株1的总RNA为模板，采用引物ATGAGCAGGGACGTCACC和引物CGGCATCTACCTAAGAGTGCACAATCTCGAGAA进行RT-PCR扩增，得到丙酮酸羧化酶基因PYC，其核苷酸序列如序列15，编码序列14所示的丙酮酸羧化酶PYC。
2)为敲除质粒2整合所引入的潮霉素抗性基因hpt，根据质粒2序列可设计上游同源臂片段(仍为序列7)和下游同源臂片段(序列16)。
3)以质粒pKOCAR2NP11L为模板，采用引物CCGTTACAAGAAACTATCAGTGTTTGACAGGATAT和引物CTGATAGTTTCTTGTAACGGCTTCCTGCG进行PCR扩增，得到载体片段。将载体片段自身进行吉布森组装，得到去除了大部分eGFP表达盒和下游同源臂，以潮霉素抗性基因hpt的终止子和eGFP表达盒启动子的部分序列作为新的下游同源臂的质粒pKOhpt-hpt。
4)以质粒pKOhpt-hpt为模板，采用引物TGGCCGAGGAGCAGGACTAGCCCATCTAAGATACATTGATGAGT和引物GCACTGGTCAACTTGGCCATGGTTCGAGCTGGAGAAAG进行PCR扩增，得到载体片段。以人工全基因合成的博来霉素抗性基因BLE质粒为模板，采用引物ATGGCCAAGTTGACCAGTGC和引物CTAGTCCTGCTCCTCGGCC进行PCR扩增，得到插入片段。将载体片段和插入片段进行吉布森组装，得到将hpt基因替换为BLE基因的质粒pKOhpt。
5)以质粒pKOhpt为模板，采用引物CGAGACCGCGCATGACCATCTCCAAGGGCG和引物GGGAAGGTGACTAGTATAACTTCGTATAATGTATGCT进行PCR扩增，得到载体片段。以质粒pKOCAR2-ectB-ectA为模板，采用引物GTTATACTAGTCACCTTCCCGCGAAGGA和引物GATGGTCATGCGCGGTCTCGATTGTTTAAACAT进行PCR扩增，得到包含ectA表达盒的插入片段。将载体片段和插入片段进行吉布森组装，得到插入ectA表达盒的质粒pKOhpt-ectA。
6)以质粒pKOhpt-ectA为模板，采用引物GCACTCTTAGGTAGATGCCGACCGGG和引物CCCTGCTCATTGCTGTAGTCTGGCTTTG进行PCR扩增，得到载体片段。以前述包含序列15的RT-PCR扩增产物为插入片段。将载体片段和插入片段进行吉布森组装，得到将ectA基因替换为PYC基因的质粒3。质粒3的核苷酸序列如序列17所示。
2、重组菌的构建
用农杆菌转化的方法将质粒3导入菌株3中，用博来霉素筛选，随机挑选5个转化子。
3、重组菌的发酵培养
将挑取的转化子按照实施例1步骤4中的方法进行发酵培养，同时以菌株3作为对照。
4、依克多因的产量检测
按照实施例1步骤5中的方法检测依克多因产量。
结果显示：5个转化子中均可检测到依克多因产量，其中产量最高的转化子记作菌株4，依克多因产量为6.1g/L。
菌株4为在菌株3中导入PYC基因后得到的菌株。
实施例4、过表达L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2可提高依克多因产量
L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶催化草酰乙酸和L-谷氨酸反应生成L-天冬氨酸和2-酮戊二酸，可将草酰乙酸的代谢流从三羧酸循环引向依克多因的合成途径。圆红冬孢酵母内源的L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶分别由AAT1基因和AAT2基因编码，分别定位在线粒体和细胞质。由于依克多因合成途径相关的酶主要定位在细胞质中，因此AAT2基因编码的细胞质中的酶更有利于依克多因合成。
1、重组质粒的构建
通过吉布森组装法在质粒3第12363-12364位之间插入反向的AAT2基因表达盒(AAT2基因表达盒的核苷酸序列为序列20)，得到质粒pKOhpt-PYC-AAT2(记作质粒4)。其中，AAT2基因表达盒中的启动子和终止子与质粒1中ectC基因表达盒的启动子和终止子相同。
具体步骤如下：
1)以菌株1的总RNA为模板，采用引物ATGGCGTCCTCGTCTTCTG和引物TCAAAGCTGTCCGCGAATCG进行RT-PCR扩增，得到L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2，其核苷酸序列如序列19所示，编码序列18所示的L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2。
2)以质粒3为模板，采用引物CATGACCATCTCCAAGGGCG和引物CGCGGTCTCGATTGTTTAAACAT进行PCR扩增，得到载体片段。以人工全基因合成的ectC表达盒为模板，采用引物TTAAACAATCGAGACCGCGTTTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGC和引物CGATTCGCGGACAGCTTTGAATATCATCTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC进行PCR扩增，得到包含反向终止子的插入片段1。以前述序列19扩增产物(反向插入)为插入片段2。以人工全基因合成的ectC表达盒为模板，采用引物GCAGAAGACGAGGACGCCATGTGAGTGATCTGGTGTTGT和引物CGCCCTTGGAGATGGTCATGGACGGCTTGTTCTCTCCTGC进行PCR扩增得到包含反向启动子的插入片段3。将载体片段、插入片段1、插入片段2、插入片段3一起进行吉布森组装，得到反向插入AAT2表达盒的质粒pKOhpt-PYC-AAT2(质粒4)。
2、重组菌的构建
用农杆菌转化的方法将质粒4导入菌株3中，用博来霉素筛选，随机挑选5个转化子。
3、重组菌的发酵培养
将挑取的转化子按照实施例1步骤4中的方法进行发酵培养，同时以菌株4作为对照。
4、依克多因的产量检测
按照实施例1步骤5中的方法检测依克多因产量。
结果显示：5个转化子中均可检测到依克多因产量，其中产量最高的转化子记作菌株5，依克多因产量为7.9g/L。
菌株5为在菌株3中导入PYC基因和AAT2基因后得到的菌株。
实施例5、过表达L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3可提高依克多因产量
L-天冬氨酸4-磷酸转移酶催化L-天冬氨酸和ATP反应生成4-磷酸L-天冬氨酸和ADP，可将L-天冬氨酸的代谢流引向依克多因的合成途径。
1、重组质粒的构建
通过吉布森组装法在质粒4第14726-14727位之间插入反向的HOM3基因表达盒(HOM3基因表达盒的核苷酸序列为序列23)，得到质粒pKOhpt-PYC-AAT2-HOM3(记作质粒5)。其中，HOM3基因表达盒中的启动子和终止子与质粒1中GDH2基因表达盒的启动子和终止子相同。具体步骤如下：
1)以菌株1的总RNA为模板，采用引物ATGAGCGCTCCCGCCAAG和CTAGGAGAACACCTGCGGC引物进行RT-PC R扩增，得到L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3，其核苷酸序列如序列22所示，编码序列21所示的L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3。
2)以质粒4为模板，采用引物CATGACCATCTCCAAGGGCG和引物ATGGCGTCCTCGTCTTCTG进行PCR扩增，得到载体片段。以质粒2为模板，采用引物GCAGAAGACGAGGACGCCATGTGAGTGATCTGGTGTTGTTCTG和引物CGCCGCAGGTGTTCTCCTAGGTAGATGCCGACCGGG进行PCR扩增，得到包含AAT2表达盒的反向启动子和HOM3表达盒的反向终止子的插入片段1。以前述包含序列22的RT-PCR扩增产物(反向插入)为插入片段2。以质粒1为模板，采用引物AGCTTGGCGGGAGCGCTCATTGCTGTAGTCTGGCTTTG和引物CGCCCTTGGAGATGGTCATGTCACCTTCCCGCGAAGGA进行PCR扩增，得到包含反向启动子的插入片段3。将载体片段、插入片段1、插入片段2、插入片段3一起进行吉布森组装，得到反向插入HOM3表达盒的质粒pKOhpt-PYC-AAT2-HOM3(质粒5)。
2、重组菌的构建
用农杆菌转化的方法将质粒5导入菌株3中，用博来霉素筛选，随机挑选5个转化子。
3、重组菌的发酵培养
将挑取的转化子按照实施例1步骤4中的方法进行发酵培养，同时以菌株5作为对照。
4、依克多因的产量检测
按照实施例1步骤5中的方法检测依克多因产量。
结果显示：5个转化子中均可检测到依克多因产量，其中产量最高的转化子记作菌株6，依克多因产量为9.0g/L。
菌株6为在菌株3中导入PYC基因、AAT2和HOM3基因后得到的菌株。
实施例6、发酵罐发酵
1、挑取实施例5获得的菌株6单菌落，接种于含有250mL YPD液体培养基的摇瓶中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。
2、完成步骤1后，将种子液转接至含有2.25L YPD液体培养基的5L发酵罐中，维持温度30℃，溶氧30％，用25％氨水维持pH 7，用500g/L葡萄糖溶液维持残糖大于0，发酵培养60h，得到发酵液。
3、完成步骤2后，取1mL发酵液，5000rpm离心5min，取上清液使用高效液相色谱检测发酵液中依克多因产量。
结果表明：发酵液中依克多因为62.1g/L。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (11)

1.一种产依克多因重组菌的构建方法，包括如下步骤：降低圆红冬孢酵母中CAR2蛋白的含量和/或活性，且提高所述圆红冬孢酵母中伸长盐单胞菌来源的EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白的含量和/或活性，且提高所述圆红冬孢酵母中L-谷氨酸脱氢酶GDH2的含量和/或活性，且提高所述圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC的含量和/或活性，且提高所述圆红冬孢酵母中L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2的含量和/或活性；且提高所述圆红冬孢酵母中L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3的含量和/或活性；
所述EctB蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述EctA蛋白为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述EctC蛋白为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述CAR2蛋白为由序列表中序列24所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述L-谷氨酸脱氢酶GDH2为由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述丙酮酸羧化酶PYC为由序列表中序列14所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2为由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3为由序列表中序列21所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述降低圆红冬孢酵母中的CAR2蛋白的含量和/或活性的方法为将圆红冬孢酵母中的CAR2基因敲除。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述提高圆红冬孢酵母中伸长盐单胞菌来源的EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白的含量和/或活性的方法为将提高ectB、ectA和ectC基因表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述提高圆红冬孢酵母中L-谷氨酸脱氢酶GDH2的含量和/或活性的方法为将提高L-谷氨酸脱氢酶基因GDH2表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述提高圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC的含量和/或活性的方法为将提高丙酮酸羧化酶基因PYC表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述提高圆红冬孢酵母中L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶AAT2的含量和/或活性的方法为将提高L-天冬氨酸:2-酮戊二酸转氨酶基因AAT2表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述提高所述圆红冬孢酵母中L-天冬氨酸4-磷酸转移酶HOM3的含量和/或活性的方法为将提高L-天冬氨酸4-磷酸转移酶基因HOM3表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于：所述圆红冬孢酵母为圆红冬孢酵母NP11菌株。
9.按照权利要求1-8任一所述的构建方法构建得到的重组菌。
10.如下M1)-M4)中任一所述的应用：
M1)权利要求9所述的重组菌在生产依克多因中的应用；
M2)权利要求9所述的重组菌在提高依克多因产量中的应用；
M3)权利要求9所述的重组菌在制备生产依克多因的产品中的应用；
M4)权利要求9所述的重组菌在制备提高依克多因产量的产品中的应用。
11.一种生产依克多因的方法，包括如下步骤：将权利要求9所述的重组菌进行发酵培养，得到发酵产物，所述发酵产物中含有依克多因。
CN202310864116.9A 2023-07-14 2023-07-14 一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用 Active CN116855523B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310864116.9A CN116855523B (zh) 2023-07-14 2023-07-14 一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310864116.9A CN116855523B (zh) 2023-07-14 2023-07-14 一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116855523A CN116855523A (zh) 2023-10-10
CN116855523B true CN116855523B (zh) 2024-03-22

Family

ID=88218752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310864116.9A Active CN116855523B (zh) 2023-07-14 2023-07-14 一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116855523B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2743350A1 (en) * 2012-12-13 2014-06-18 Artes Biotechnologie GmbH A method for producing ectoine or a derivative thereof and a yeast cell for use as a host cell in such a method
CN110914435A (zh) * 2017-07-11 2020-03-24 阿尔德里斯公司 产依克多因酵母
CN115427580A (zh) * 2020-02-07 2022-12-02 代谢探索者公司 用于改善依克多因产生的经修饰的微生物和方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001284997A1 (en) * 2000-08-24 2002-03-04 Maxygen, Inc. Constructs and their use in metabolic pathway engineering
EP3234105B1 (en) * 2014-12-15 2020-04-15 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Methods for tuning carotenoid production levels and compositions in rhodosporidium and rhodotorula genera

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2743350A1 (en) * 2012-12-13 2014-06-18 Artes Biotechnologie GmbH A method for producing ectoine or a derivative thereof and a yeast cell for use as a host cell in such a method
CN110914435A (zh) * 2017-07-11 2020-03-24 阿尔德里斯公司 产依克多因酵母
CN115427580A (zh) * 2020-02-07 2022-12-02 代谢探索者公司 用于改善依克多因产生的经修饰的微生物和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Engineering Escherichia coli for high-yield production of ectoine，Green Chemical Engineering;Daoan Wang;Green Chemical Engineering;第4卷;217-223 *
Molecular characterization of KU70 and KU80 homologues and exploitation of a KU70-deficient mutant for improving gene deletion frequency in Rhodosporidium toruloides;Koh C M等;BMC Microbiology;第14卷(第50期);1-10 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116855523A (zh) 2023-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of 3-hydroxypropionic acid from glucose and xylose
EP2379730B1 (en) Method for the preparation of diols
CA2886137C (en) Recombinant cell, and method for producing isoprene
US20110014669A1 (en) Production of 1,4 Butanediol in a Microorganism
EP3652323B1 (en) Ectoine-producing yeast
CN111019878B (zh) L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN111197021A (zh) 一种l-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法
KR20100124332A (ko) 글리옥살라아제 ｉｉｉ 활성을 갖는 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도
EP3739046A1 (en) Novel lysine decarboxylase, and method for producing cadaverine by using same
CN112063572B (zh) 一种高产o-乙酰-l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN107325999B (zh) 强化表达citT基因的克雷伯氏菌及其生产1,3-丙二醇的应用
US20220411837A1 (en) Recombinant methanotrophic bacteria for indigo biosynthesis and methods thereof
CN116855523B (zh) 一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用
US11136601B2 (en) Conversion of S-lignin compounds to useful intermediates
CN116355820A (zh) 一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法
CN112375725B (zh) 一种生产维生素b6的代谢工程菌株及其构建方法与应用
WO2021254927A1 (en) Methods for producing biotin in genetically modified microorganisms
US20150064758A1 (en) Microorganism comprising pyruvate dehydrogenase variant and method of producing c4-chemicals using the same
JP7190322B2 (ja) 組換え細胞およびペンタメチレンジアミンの生産方法
CN112322675B (zh) 环氧角鲨烯的制备方法及工程菌
CN111154706B (zh) L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
Maruyama et al. Isolation and expression of a Bacillus cereus gene encoding benzil reductase
US11535830B2 (en) Threonine-producing yeast
Li et al. Revealing the endogenous homoserine cycle for the effective methanol conversion in Pichia pastoris
Henke et al. Improved Plasmid-Based Inducible and Constitutive Gene Expression in Corynebacterium glutamicum. Microorganisms 2021, 9, 204

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant