CN111197021A - 一种l-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法 - Google Patents

一种l-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。本发明的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4～6所示的序列中的一种，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.7～9所示的序列中的一种，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10～12所示的序列中的一种。本发明通过对L‑赖氨酸生物合成途径相关基因的改造，构建得到27株重组菌CGL3‑1～CGL3‑27，其中CGL3‑7使得L‑赖氨酸的产量得到了显著提高，达到了62g/l，是原始菌株的的产量的1.48倍。本发明提供了一种改造微生物中L‑赖氨酸生物合成途径提高L‑赖氨酸产量的方法，为构建L‑赖氨酸的高产菌株提供了理论依据。

Description

一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-赖氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-赖氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。
目前，L-赖氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。目前生产L-赖氨酸的常用菌株包括大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，其中谷氨酸棒杆菌为食品安全级菌株，但其在摇瓶水平的L-赖氨酸产量一直未得到大幅提升。
谷氨酸棒杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径中关键性酶基因的过表达是对谷氨酸棒杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在谷氨酸棒杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造的方法，对于生产食品安全级L-赖氨酸有重要的意义。在前期工作中，我们以谷氨酸棒杆菌CICC 23604作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，异源表达来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，提高胞内NADPH供给；敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB，减少发酵过程副产物苏氨酸的积累，得到积累L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，产量达到42g/l。但是L-赖氨酸产量还有待进一步提高，更加适用于工业化生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，以谷氨酸棒杆菌CGGA0T为出发菌株，利用基因随机突变试剂盒随机突变L-赖氨酸合成相关基因dapA、dapB和ddh的启动子序列，并筛选出最适组合得到高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌CGL3-7。
本发明的第一个目的是提供一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4～6所示的序列中的一种，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ IDNO.7～9所示的序列中的一种，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10～12所示的序列中的一种。
进一步地，所述的谷氨酸棒杆菌宿主菌为谷氨酸棒杆菌CGGA0T，所述的谷氨酸棒杆菌CGGA0T是在谷氨酸棒杆菌CICC 23604中异源表达来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB。
进一步地，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4所示的序列，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.9所示的序列，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10所示的序列。
进一步地，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.5所示的序列，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.8所示的序列，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10所示的序列。
进一步地，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.6所示的序列，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.7所示的序列，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.12所示的序列。
进一步地，所述的dapA基因的核苷酸序列如NCgl1971所示，dapB基因的核苷酸序列如NCgl1898所示和ddh基因的核苷酸序列如NCgl2617所示。
本发明的第二个目的是提供一种所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建突变启动子的整合片段：合成含有PdapA突变启动子基因的dapA上下游同源臂片段融合得到重组片段mdapA，合成含有PdapB突变启动子基因的dapB上下游同源臂片段融合得到重组片段mdapB，合成含有Pddh突变启动子基因的ddh上下游同源臂片段融合得到重组片段mddh；
(2)构建重组质粒：分别将重组片段与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到含重组片段mdapA的重组质粒、含重组片段mdapB的重组质粒和含重组片段mddh的重组质粒；
(3)构建重组谷氨酸棒杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化谷氨酸棒杆菌宿主菌，得到谷氨酸棒杆菌CGCas9，然后将重组质粒依次转化谷氨酸棒杆菌CGCas9，去除外源质粒，得到重组谷氨酸棒杆菌。
进一步地，所述的含有cas9蛋白的质粒包括pFSC质粒。
本发明的第三个目的是提供所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。
进一步地，所述的应用是将重组谷氨酸棒杆菌在发酵培养基中培养60～80h得到所述的L-赖氨酸，所述的发酵培养基(g/L)：葡萄糖80～100，糖蜜15～25，硫酸铵50～70，豆粕水解液35～45，七水硫酸镁1.0～1.5，磷酸二氢钾1.0～1.2，醋酸铵2～4，碳酸钙15～25，MgSO4·7H2O 0.20～0.3，CaCl2 0.01～0.02，FeSO4·7H2O 0.01～0.02，MnSO4·H2O 0.03～0.05，ZnSO4·7H2O 0.02～0.04，CuSO4·5H2O 0.001～0.003，NiCl2·6H2O 0.0020～0.0025，生物素0.001～0.003。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过对L-赖氨酸生物合成途径相关基因的改造，构建得到27株重组菌CGL3-1～CGL3-27，其中CGL3-7使得L-赖氨酸的产量得到了显著提高，达到了62g/l，是原始菌株的的产量的1.48倍。
(2)本发明提供了一种改造微生物中L-赖氨酸生物合成途径提高L-赖氨酸产量的方法，为构建L-赖氨酸的高产菌株提供了理论依据。
附图说明
图1为CGGA0T转化含荧光质粒菌落PCR验证结果；M：marker；1-10菌落PCR结果。
图2为PmdapA表达绿色荧光蛋白时相对荧光强度。
图3为PmdapB表达绿色荧光蛋白时相对荧光强度。
图4为Pmddh表达绿色荧光蛋白时相对荧光强度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明的谷氨酸棒杆菌CGGA0T为本实验室构建保藏的高产L-赖氨酸谷氨酸棒杆菌，出发菌株为谷氨酸棒杆菌CICC 23604。
重组谷氨酸棒杆菌种子培养及发酵：
平板培养基(g/l)：蔗糖10，酵母粉5，NaCl 2.5，牛肉浸膏5，蛋白胨10，醋酸铵3，尿素2，琼脂粉20，pH调至6.8。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖90，糖蜜20，硫酸铵60，豆粕水解液40，七水硫酸镁1.2，磷酸二氢钾1.1，醋酸铵3，碳酸钙20，MgSO4·7H2O 0.25，CaCl2 0.01，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.04，ZnSO4·7H2O 0.03，CuSO4·5H2O 0.002，NiCl2·6H2O 0.0022，生物素0.002。
L-赖氨酸含量的测定方法：
1)发酵液先用离心机离心(转速≥4000rpm)15min，取上清液约稀释100倍，赖氨酸的浓度必须稀释到0.2-0.5g/l的范围内。
2)量取稀释液1.0mL，加茚三酮显色液1.0mL，加盖锡帽后于100℃水浴加热15min后，即可用流水冷却，加蒸馏水8.0mL，摇匀，用分光光度计在460nm波长处测定OD，在标准曲线查相应的赖氨酸值M。
L-赖氨酸含量C(g/l)＝M×稀释倍数
下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规的分子生物学实验方法。
实施例1：启动子文库的构建
以谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组为模板，采用引物dapA.FOR和dapA.REV以及Quick Mutation基因随机突变试剂盒扩增dapA基因的上游启动子序列PdapA(序列如SEQ IDNO.1所示)，PCR条件：94℃，3min预变性，然后94℃，变性30s，55℃，退火30s，72℃，延伸0.5min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到PdapA不同序列的混合启动子片段PmdapA。采用dapB.FOR和dapB.REV引物用上述方法可以获得PdapB(序列如SEQ ID NO.2所示)不同序列的混合启动子片段PmdapB.采用ddh.FOR和ddh.REV引物用上述方法可以获得Pddh(序列如SEQ ID NO.3所示)不同序列的混合启动子片段Pmddh。
实施例2：含不同启动子序列载体的获得
将含有eGFP的载体pJYW-4采用引物ZTdapA.FOR,ZTdapA.REV；ZTdapB.FOR,ZTdapB.REV和ZTddh.FOR，ZTddh.REV分别线性化，PCR条件：98℃，3min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共34个循环，切胶回收大小正确的片段，得到线性化载体片段ZTdapA,ZTdapB，ZTddh。将载体片段与实施案例1中得到的混合启动子片段分别连接后转化大肠杆菌JM109，提取混合质粒。
实施例3：混合质粒的转化
将实施例2中得到的混合质粒分别转化到谷氨酸棒杆菌CGGA0T感受态细胞中。具体步骤为：
(1)将实施例2中构建好的质粒电转化谷氨酸棒杆菌CGGA0T的感受态细胞，添加量为100-200ng，电转化条件：电压5kV，电击时间5ms，30℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL的卡那霉素抗性的LB平板，30℃厌氧培养48h。卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的谷氨酸棒杆菌。
(2)挑选平板上长出的单菌落，利用引物DAPYZ.FOR，DAPYZ.REV进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为1500bp(参见图1)。并进行测序。
实施例4：重组菌株荧光强度的检测
挑取测序正确的菌株各10株，进行96浅孔板培养30℃培养18h，采用酶标仪在523nm处检测每个重组菌株发酵液的荧光强度(参见图2～4)，提取RNA检测相对转录强度。
实施例5：同源重组片段的构建
在整合PdapA不同序列的混合启动子片段PmdapA的菌株中选取荧光强度较强的菌株，测序后选择3个不同的突变序列(序列分别如SEQ ID NO.4～6所示)，分别与dapA位点上游800bp的片段重新合成，设计引物dapA-1-F、dapA-1-R扩增；根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，设计dapA-2-F和dapA-2-R(见表1)，从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增dapA下游同源臂基因序列，将所得2个片段通过融合PCR技术融合得到重组片段mdapA-(1-3)。
在整合PdapB不同序列的混合启动子片段PmdapB的菌株中选取荧光强度较强的菌株，测序后选择3个不同的突变序列(序列分别如SEQ ID NO.7～9所示)，分别与dapB位点上游800bp的片段重新合成，设计引物dapB-1-F、dapB-1-R扩增；根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，设计dapB-2-F和dapB-2-R(见表1)，从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增dapB下游同源臂基因序列，将所得2个片段通过融合PCR技术融合得到重组片段mdapB-(1-3)。
在整合Pddh不同序列的混合启动子片段Pmddh的菌株中选取荧光强度较强的菌株，测序后选择3个不同的突变序列(序列分别如SEQ ID NO.10～12所示)，分别与ddh位点上游800bp的片段重新合成，设计引物ddh-1-F、ddh-1-R扩增；根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，设计ddh-2-F和ddh-2-R(见表1)，从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增ddh下游同源臂基因序列，将所得2个片段通过融合PCR技术融合得到重组片段mddh-(1-3)。
表1 引物序列表
Figure BDA0002365141200000061
实施例6：同源重组质粒的构建
根据载体pEC-XK99序列信息，设计引物zhdapA-F、zhdapA-R、zhdapB-F、zhdapB-R、zhddh-F、zhddh-R,使用上述引物进行PCR，分别得到含有sgRNA的线性化载体pEC-XK99-dapA；pEC-XK99-dapB和pEC-XK99-ddh后，分别与重组片段mdapA-(1-3)、mdapB-(1-3)、mddh-(1-3)连接构建重组质粒。经过Eco32I、XmaJI双酶切验证及测序，确认重组质粒pEC-XK99-dapA(1-3)、pEC-XK99-dapB(1-3)和pEC-XK99-ddh(1-3)构建成功。
实施例7：重组PmdapA启动子谷氨酸棒杆菌的构建
将含有cas9蛋白的pFSC质粒(在专利CN201811465343.X中公开)转化谷氨酸棒杆菌CGGA0T。采用kana抗性板筛选转化成功的重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGCas9，随后将重组质粒pEC-XK99-dapA(1-3)分别转化谷氨酸棒杆菌CGCas9，得到替换了dapA基因原始启动子的重组谷氨酸棒杆菌，选用引物dapA-1-F与dapA-1-R挑选转化子进行菌落PCR，出现1500bp条带后测序构建成功重组谷氨酸棒杆菌，加入0.01M IPTG诱导，在30℃条件下培养24h可以去除pEC-XK99-dapA(1-3)质粒，命名为CGL1-(1-3)。
实施例8：重组PmdapB启动子谷氨酸棒杆菌的构建
将重组质粒pEC-XK99-dapB(1-3)分别转化谷氨酸棒杆菌CGL1(1-3)，得到替换了dapA和dapB基因原始启动子的重组谷氨酸棒杆菌，选用引物dapB-1-F与dapB-1-R挑选转化子进行菌落PCR，出现1500bp条带后测序构建成功重组谷氨酸棒杆菌，加入0.01M IPTG诱导，在30℃条件下培养24h可以去除pEC-XK99-dapB(1-3)质粒，命名为CGL2-(1-9)。
实施例9：重组Pmddh启动子谷氨酸棒杆菌的构建
将重组质粒pEC-XK99-ddh(1-3)分别转化谷氨酸棒杆菌CGL2(1-9)，得到替换了dapA、dapB和ddh基因原始启动子的重组谷氨酸棒杆菌，选用引物ddh-1-F与ddh-1-R挑选转化子进行菌落PCR，出现1000bp条带后测序构建成功重组谷氨酸棒杆菌,加入0.01M IPTG诱导，在30℃条件下培养24h可以去除pEC-XK99-ddh(1-3)质粒，随后37℃培养24h即可去除pFSC质粒，命名为CGL3-(1-27)。
实施例7、8、9构建的菌株基因型见表2。
表2 菌株基因型
Figure BDA0002365141200000071
实施例10：利用重组PmdapA，PmdapB和Pmddh启动子菌株发酵生产L-赖氨酸
(1)种子液制备
将出发菌株谷氨酸棒杆CGGA0T及实施例8中构建得到的重组菌CGL3-(1-27)分别接种到种子培养基中，在30℃、220rpm下培养18h得到谷氨酸棒杆菌种子液。
(2)发酵培养
将步骤(1)中得到的种子液转入发酵培养基，于30℃，220rpm条件下培养72h后，取发酵液测定L-赖氨酸的含量(参见表3)。
表3 菌株发酵生产L-赖氨酸
Figure BDA0002365141200000081
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学，无锡中粮工程科技有限公司
<120> 一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法
<160> 44
<170> PatentIn version 3.3
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cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga 180
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<213> （人工序列）
<400> 7
aactggagca ggactagcag aggttgtagg cgttgagccg cttccatcac aagcacttaa 60
aagtaaagag gcggaaacca caagcgccaa ggaactacct gcggaacggg cggtgaaggg 120
caacttaagt ctcatatttc aaacacgcca agtgtgtgat taatccctag aacggaacaa 180
actgcgatga acaatcgtta acaacacaga ccaaaacggt cagttaggta tggatatcag 240
caccttctga acgggttgtg gtataatggt gggcgtttga aaaactcttc gccccacgaa 300
aatgaaggag cata 314
<210> 8
<211> 315
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
aactggagca ggactagcag aggttgtagg cgttgagccg cttccatcac aagcacttaa 60
aagtaaagag gcggaaacca caagcgccaa ggaactacct gcggaacggg cggtgaaggg 120
caacttaagt ctcatatttc aaacatagtt ccacctgtgt gattaatccc tagaacggaa 180
caaactgatg accaatcgtt aacaacacag accaaaacgg tcagttaggt atggatatca 240
gcaccttctg aacgggtacg tctagactgg tgggcgtttg aaaaactctt cgccccacga 300
aaatgaagga gcata 315
<210> 9
<211> 315
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
aactggagca ggactagcag aggttgtagg cgttgagccg cttccatcac aagcacttaa 60
aagtaaagag gcggaaacca caagcgccaa ggaactacct gcggaacggg cggtgaaggg 120
caacttaagt ctcatatttc aaacatagtt ccacctgtgt gattaatccc tagaacggaa 180
caaactgatg aacaatcgtt aacaacacag accaaaacgg tcagttaggt atggatatca 240
gcaccttctg aacgggttgt ggtataatgg tgggcgtttg aaaaactctt cgccccacga 300
aaatgaagga gcata 315
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ctaagtatgc attgtggtaa gctcgaccag gacagtgcca ccacaatttt ggaggattac 60
aagaac 66
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
ctaagtatgc atctcggtaa gattcaccag gacagtgcca ccacaatttt ggaggattac 60
aagaac 66
<210> 12
<211> 67
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
ctaagtatgc atctcggtaa gattcaccag gacagtgcat ccgacaattt tggaggatta 60
caagaac 67
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
cgcaaagctc acacccac 18
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
acctgtgctc atagagttca a 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
gtttctgtca caactggagc agga 24
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
accttgattc ccattatgct ccttca 26
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
tttcggtcct gatgaaagag atgtc 25
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
tcccaggttt ccgtagccc 19
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
gtaaccttga actctatgag taaaggagaa gaacttttca ctgga 45
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
ttagctcgtg ggtgtgagct ttgcgcagct caaacgtcca aaatcacca 49
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
cacgaaaatg aaggagcata atgagtaaag gagaagaact tttcactgga 50
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
ctgctagtcc tgctccagtt cagctcaaac gtccaaaatc acca 44
<210> 23
<211> 89
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
tgcatctcgg taagctcgac caggacagtg ccaccacaat tttggaggat tacaagaaca 60
tgagtaaagg agaagaactt ttcactgga 89
<210> 24
<211> 76
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
ccaaaattgt ggtggcactg tcctggtcga gcttaccgag atgcatactt agcagctcaa 60
acgtccaaaa tcacca 76
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
tggcctttta tgggttggaa cc 22
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
atttgtatag ttcatccatg ccatgtgt 28
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
ttgatagcgt gcagttcttt tact 24
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
gtgtgagctt tgcgttaaaa gtccatgaca tacgg 35
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
cgcaaagctc acacccacga gctaaaaa 28
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
tcccgattgt cgtttccggc ggt 23
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
cgtcgtcaag accaccgcat tcggagc 27
<210> 32
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
ccgagaacgc caaccttgat tcccattatg ctccttcatt ttcgtggggc gaag 54
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 33
atgggaatca aggttggcgt tctcgg 26
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 34
gacgagtgct tccgcgccct caac 24
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 35
ttgaggcgag cgcttacggc gtcgcgatg 29
<210> 36
<211> 69
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 36
attgtggtgg cactgtcctg gtcgagctta ccgagatgca tacttagatg atgattcagg 60
gacatctct 69
<210> 37
<211> 65
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 37
tcgaccagga cagtgccacc acaattttgg aggattacaa gaacatgacc aacatccgcg 60
tagct 65
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 38
gctaaattag acgtcgcgtg cgat 24
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 39
gaccgccgga aacgacaatc gggagggctt acatggcgat agctagactg ggcg 54
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 40
agtaaaagaa ctgcacgcta tcaaactgca agctacctgc tttctctttg cgctt 55
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 41
gttgagggcg cggaagcact cgtcgggctt acatggcgat agctagactg ggcg 54
<210> 42
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 42
ccgaatgcgg tggtcttgac gacgactgca agctacctgc tttctctttg cgctt 55
<210> 43
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 43
atcgcacgcg acgtctaatt tagcgggctt acatggcgat agctagactg ggcg 54
<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 44
gcgacgccgt aagcgctcgc ctcaaactgc aagctacctg ctttctcttt gcgctt 56

Claims (10)

1.一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4～6所示的序列中的一种，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.7～9所示的序列中的一种，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10～12所示的序列中的一种。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的谷氨酸棒杆菌宿主菌为谷氨酸棒杆菌CGGA0T，所述的谷氨酸棒杆菌CGGA0T是在谷氨酸棒杆菌CICC 23604中异源表达来源于丙酮丁醇梭菌的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB。
3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.4所示的序列，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.9所示的序列，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10所示的序列。
4.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.5所示的序列，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.8所示的序列，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.10所示的序列。
5.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中，将dapA基因的启动子序列PdapA突变为如SEQ ID NO.6所示的序列，将dapB基因的启动子序列PdapB突变为如SEQ ID NO.7所示的序列，并将ddh基因的启动子序列Pddh突变为如SEQ ID NO.12所示的序列。
6.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的dapA基因的核苷酸序列如NCgl1971所示，dapB基因的核苷酸序列如NCgl1898所示和ddh基因的核苷酸序列如NCgl2617所示。
7.一种权利要求1～6任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建突变启动子的整合片段：合成含有PdapA突变启动子基因的dapA上下游同源臂片段融合得到重组片段mdapA，合成含有PdapB突变启动子基因的dapB上下游同源臂片段融合得到重组片段mdapB，合成含有Pddh突变启动子基因的ddh上下游同源臂片段融合得到重组片段mddh；
(2)构建重组质粒：分别将重组片段与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到含重组片段mdapA的重组质粒、含重组片段mdapB的重组质粒和含重组片段mddh的重组质粒；
(3)构建重组谷氨酸棒杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化谷氨酸棒杆菌宿主菌，得到谷氨酸棒杆菌CGCas9，然后将重组质粒依次转化谷氨酸棒杆菌CGCas9，去除外源质粒，得到重组谷氨酸棒杆菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的含有cas9蛋白的质粒包括pFSC质粒。
9.权利要求1～6任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用是将重组谷氨酸棒杆菌在发酵培养基中培养60～80h得到所述的L-赖氨酸，所述的发酵培养基(g/L)：葡萄糖80～100，糖蜜15～25，硫酸铵50～70，豆粕水解液35～45，七水硫酸镁1.0～1.5，磷酸二氢钾1.0～1.2，醋酸铵2～4，碳酸钙15～25，MgSO4·7H2O 0.20～0.3，CaCl2 0.01～0.02，FeSO4·7H2O0.01～0.02，MnSO4·H2O 0.03～0.05，ZnSO4·7H2O 0.02～0.04，CuSO4·5H2O 0.001～0.003，NiCl2·6H2O0.0020～0.0025，生物素0.001～0.003。
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