CN117106783A - 一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用。本发明通过筛选和突变提供了一种启动子，所述启动子的序列如SEQ ID NO：3或28所示；所述启动子可以提高lysC基因表达量。本发明还提供了：一种基因表达框，包括所述启动子和lysC基因；一种重组载体，所述重组载体包含所述启动子或表达框；以及包含启动子、表达框或重组载体的重组菌株。本发明开发新型的启动子，通过提高lysC基因表达量，使重组菌株的赖氨酸产量获得明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种赖氨酸高产的重组菌株、构建方法及其应用。
背景技术
赖氨酸是人类和哺乳动物的必需氨基酸之一，在机体内无法合成，必须从食物中补充。而只有L-赖氨酸才能被生物体所利用，因此常说的赖氨酸指的是L-赖氨酸。赖氨酸作为组成蛋白质的成分之一，广泛存在于富含蛋白质的食物中，赖氨酸含量比较高的食物为动物性食物、豆类、和一些常见的坚果如杏仁、榛子、花生仁、南瓜子仁等。
赖氨酸具有促进人体生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化、缓解焦虑等作用，对人体和动物体健康具有积极作用。L-赖氨酸因为其必需氨基酸的特性和功能性，已成为世界第二大氨基酸生产品种，并广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。
因为赖氨酸需要大规模生产，所以主要以微生物发酵法生产赖氨酸，具有原料成本低、反应条件温和、易实现大规模生产等优点。但目前赖氨酸菌种的发酵性能和转化率仍有较大提升空间，通过增强氨基酸代谢通路上一些基因的表达，可以使赖氨酸的产量和转化率提升，其中一些关键位置的基因表达量增强可以提高酶的表达水平和基因转录的抗反馈能力。CN111635879B公开了一种L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，遗传改造所述L-赖氨酸生产菌株细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种，使之在胞内弱化或失活，生产菌株的赖氨酸产量显著提高。
天冬氨酸激酶（LysC）是控制赖氨酸合成的第一个酶，也是关键限速步骤，这个步骤受到严格的酶活和基因转录的反馈抑制。启动子作为一个影响转录水平的重要因子，研发人员通常会对其进行人工编辑，以期达到提升基因表达量的作用。CN111909944A公开了对谷氨酸棒杆菌中的lysC基因的启动子区域序列进行点突变形成，提高了L-赖氨酸产量，且菌株稳定性好，作为L-赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。该方法是对lysC基因的原始启动子进行的突变改造，可改造空间较小。
因此，开发新型启动子，在LysC编码区前端替代原有启动子使基因表达水平进一步提高，并且达到解除反馈抑制的效果，是大幅提高赖氨酸产量的一个重要方向。
发明内容
为了解决上述技术问题，开发新型的启动子，本发明通过在天冬氨酸激酶基因前端替换其他启动子，通过筛选，确定有效提高基因的表达量的启动子，还对筛选的启动子进行突变，进一步提高基因的表达量，从而使赖氨酸产量获得明显提高。
本发明提供了一种启动子，所述启动子的序列如SEQ ID NO：3或28所示。
本发明还提供了所述启动子在提高lysC基因表达量的应用，所述启动子作为lysC基因表达的启动子。
本发明还提供了一种基因表达框，包含所述的启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列；优选地，所述编码序列为lysC基因的编码序列。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含所述启动子或表达框；优选地，所述重组载体是在载体pBAD-MCS-pBBR1或pK18mobsacB上连接所述启动子或基因表达框的基因片段而获得。
本发明还提供了所述表达框或重组载体在提高生产赖氨酸的菌株的赖氨酸产量的应用。
本发明还提供了一种重组菌株，所述重组菌株包含上述的启动子、表达框或重组载体；优选地，所述重组菌株为重组谷氨酸棒状杆菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌FF-lys101。
本发明还提供了所述重组菌株的的构建方法，包括如下步骤：制备包含所述启动子和编码序列的基因片段，与载体连接获得重组载体，电转入棒状杆菌获得可增强lysC基因表达量的菌株。
本发明提供了所述重组菌株在生产赖氨酸的应用。本发明提供了一种生产赖氨酸的方法，包括：使用所述的重组菌株进行生产赖氨酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
（1）本发明筛选新型的启动子增强lysC基因表达量，从而提高菌株的赖氨酸产量。
（2）本发明还对筛选出的启动子进行突变，筛选增强lysC基因表达量的优选突变，进一步提高了lysC基因表达量和赖氨酸产量。
附图说明
图1为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-05+lysC的质粒图谱；
图2为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-06+lysC的质粒图谱；
图3为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-07+lysC的质粒图谱；
图4为重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-08+lysC的质粒图谱；
图5为4种菌株中lysC基因的表达量结果；
图6为PFF-07突变启动子重组菌株中lysC基因的表达量结果；
图7为各重组菌株摇瓶发酵生产L-赖氨酸的结果；
图8为各重组菌株5L发酵罐生产L-赖氨酸的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围。
实施例1 重组载体和重组菌株的构建
启动子PFF-05：
以产氨棒杆菌（CJHB100）基因组为模板，启动子PFF-05（序列如SEQ ID NO：1所示）上游、下游同源臂引物为PFF-05-F/PFF-05-R；基因片段lysC（如SEQ ID NO：5所示）上游、下游同源臂引物为PlysC1-F/PlysC1-R；用以上两个片段为模板，以PFF-05-F/PlysC1-R引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-05+lysC片段，在扩增的过程中，引入相应的酶切位点片段用HindIII、XbaI进行双酶切。载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切，两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-05+lysC（质粒图谱如图1所示）。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中，并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基中上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中，培养温度为30℃，200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对（序列如SEQ ID NO：22和23所示）进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析，获得改造菌株分别命名为FF-lys195。
启动子PFF-06：
以黄色短杆菌（ATCC 15168）基因组为模板，启动子PFF-06（序列如SEQ ID NO：2所示）上游、下游同源臂引物为PFF-06-F/PFF-06-R；基因片段lysC上游、下游同源臂引物为PlysC2-F/PlysC2-R；用以上两个片段为模板，以PFF-06-F/PlysC2-R引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-06+lysC片段；片段用HindIII、XbaI进行双酶切，载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切，两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-06+lysC（质粒图谱如图2所示）。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中，并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中，培养温度为30℃，200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析，获得改造菌株分别命名为FF-lys196。
启动子PFF-07：
以氨根棒状杆菌（MGYG-HGUT-01533）基因组为模板，启动子PFF-07（序列如SEQ IDNO：3所示）上游、下游同源臂引物为PFF-07-F/PFF-07-R；基因片段lysC上游、下游同源臂引物为PlysC3-F/PlysC3-R；用以上两个片段为模板，以PFF-07-F/PlysC3-R引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-07+lysC片段；片段用HindIII、XbaI进行双酶切，载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切，两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-07+lysC（质粒图谱如图3所示）。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中，并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中，培养温度为30℃，200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析，获得改造菌株分别命名为FF-lys197。
启动子PFF-08：
以棒状芽孢杆菌（ATCC21170）基因组为模板，启动子PFF-08（序列如SEQ ID NO：4所示）上游、下游同源臂引物为PFF-08-F/PFF-08-R；基因片段PlysC上游、下游同源臂引物为PlysC4-F/PlysC4-R；用以上两个片段为模板，以PFF-08-F/PlysC4-R引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的PFF-08+lysC片段；片段用HindIII、XbaI进行双酶切，载体pBAD-MCS-pBBR1用同样的限制性酶切酶进行双酶切，两个酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，获得重组质粒pBAD-MCS-pBBR1-PFF-08+lysC（图4）。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中，并在含有25μg/mL庆大霉素的LBG培养基上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含庆大霉素的LBG培养基中，培养温度为30℃，200rpm振荡培养。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析，获得改造菌株分别命名为FF-lys198。
实施例1中使用的引物序列如下表所示：
| 引物名称 | 引物序列（5’→3’） | SEQ ID NO. |
| PFF-05-F | CCCAAGCTTAGAAACATCCCAGCGCTA | 6 |
| PFF-05-R | GTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 7 |
| PlysC1-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 8 |
| PlysC1-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGC | 9 |
| PFF-06-F | CCCAAGCTTAACAGGAATGTTCCTTTC | 10 |
| PFF-06-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGGGTAAAAAATCCTTTCGTAG | 11 |
| PlysC2-F | TACGAAAGGATTTTTTACCCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 12 |
| PlysC2-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 13 |
| PFF-07-F | CCCAAGCTTAGAAACAGCCCAGCCCGACAA | 14 |
| PFF-07-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCTTCCTTTCGTTAGGGGTACGT | 15 |
| PlysC3-F | CGTACCCCTAACGAAAGGAAGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 16 |
| PlysC3-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 17 |
| PFF-08-F | CCCAAGCTTAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTT | 18 |
| PFF-08-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 19 |
| PlysC4-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 20 |
| PlysC4-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 21 |
。
实施例2 重组菌株中lysC基因的表达量
通过实时荧光定量PCR，观察基因工程重组菌株FF-lys195、FF-lys196、FF-lys197、FF-lys198中lysC基因的表达量。使用Thermo公司的MaximaTM SYBR Green／ROXqPCR Maxter Mix(2×)试剂盒进行qRT-PCR。qRT-PCR反应体系采用20如下所示：MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Maxter Mix(2 x) 10 µL，QpcrLysC-F 1µL，QpcrLysC-R 1 µL，DNA模板 5 µL，ddH2O (RNase free) 3 µL。其中，QpcrLysC-F序列如SEQ ID NO：24所示，QpcrLysC-R如SEQ ID NO：25所示。
体系充分混匀后分装至96孔板，将96孔板放到ABI仪器中。
PCR反应程序的条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72℃延伸30 s，72 ℃最后延伸5 min；循环40次
16s rRNA：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃最后延伸5 min；循环40次。
溶解曲线设置：95 ℃，1 min；65 ℃，1 min；95 ℃，20 s，stepping 0.5℃/s；30℃，1 min。
4种菌株中lysC基因的表达量结果见图5。由图5可知，FF-lys197基因工程重组菌株中的PFF-07启动子具有更高的活性，可以增强lysC基因的表达。进一步地，选用该启动子进行随机突变用于合成活性更高的启动子，从而获得更高产赖氨酸的生产菌株。
实施例3 PFF-07突变启动子
利用不同程度的连续易错 PCR进行定向进化的方法，配制StarMut Enhancer 1\5\20 μL易错PCR体系；将配制好的PCR反应体系放入PCR仪中进行扩增，以最适的启动子PFF-07为模板通过易错PCR获得一系列突变启动子PFF-07-6、PFF-07-10、PFF-07-15、PFF-07-16、PFF-07-23、PFF-07-25、PFF-07-31。
PCR进行定向进化的具体参数如下：
1） PCR 反应体系：
向 PCR 薄壁管中依次加入下列试剂
| 组分 | 体积 |
| Template Plasmid（1-10 ng/μL） | 1 μL |
| 2xStarMut Random PCR Mix | 25 μL |
| 正向引物（10μM） | 1 μL |
| 反向引物（10μM） | 1 μL |
| StarMut Enhancer | 1\5\20 μL |
| Sterile Water 补足至 | 50 μL |
。
2） 混匀后短暂离心，放入 PCR 仪。
3） PCR 循环参数的设置：
| 流程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 2 min |
| 变性 | 94℃ | 30 s |
| 退火 | 55℃ | 1 min |
| 延伸 | 72℃ | 1 min/kb |
| 终延伸 | 72℃ | 7 min |
取 1-5 μL PCR 产物电泳检测条带浓度和特异性，易错PCR产物电泳结果。
其中，正向引物eppcrPFF-07-F序列如SEQ ID NO：26所示，反向引物eppcrPFF-07-R如SEQ ID NO：27所示。
实施例4 PFF-07突变启动子重组载体和重组菌株的构建
将易错 PCR 产物电泳，切胶回收目标 DNA 片段。通过PCR扩增，得到包含突变型的活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的目的片段PFF-07-6+lysC、PFF-07-10+lysC、PFF-07-15+lysC、PFF-07-16+lysC、PFF-07-23+lysC、PFF-07-25+lysC、PFF-07-31+lysC与载体pBAD-MCS-pBBR1进行连接，构建过表达重组质粒，通过电转将过表达重组质粒转入谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中。以验证引物pBAD-F/pBAD-R引物对进行PCR扩增目的序列、核苷酸序列测序分析，获得改造菌株分别命名为FF-lys199、FF-lys200、FF-lys201、FF-lys202、FF-lys203、FF-lys204、FF-lys205。
实施例5 PFF-07突变启动子重组菌株中lysC基因的表达量
通过实时荧光定量PCR，FF-lys199、FF-lys200、FF-lys201、FF-lys202、FF-lys203、FF-lys204、FF-lys205中lysC基因的表达量。表达量的qRT-PCR的方法如实施例2。
PFF-07突变启动子重组菌株中lysC基因的表达量结果见图6。根据lysC基因的表达量最终选择活性最好的PFF-07-16启动子，选最好的基因工程菌株FF-lys202用以后续实验。其他突变启动子效果较差，选取PFF-07-16启动子进行测序，序列如SEQ ID NO：28所示。
实施例6 包含PFF-07-16启动子的重组载体和重组菌株的构建
目的基因启动子PFF-05敲除质粒的构建，以CJHB100基因组为模板，扩增启动子基因的上游同源臂片段PFF-05-up（序列如SEQ ID NO：29所示）和下游同源臂片段PFF-05-down（序列如SEQ ID NO：30所示），在扩增的过程中，引入相应的酶切位点片段用HindIII、XbaI进行双酶切，载体pK18mobsacB用同样的限制性酶切酶进行双酶切，两个酶切产物以T4 DNALigase进行连接，获得重组质粒pK18mobsacB-PFF-05。将该质粒以电转化方法转化至谷氨酸棒状杆菌FF-lys101感受态细胞中，并在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中上筛选转化子。并将筛得的转化子过夜培养于含卡那霉素的LB培养基中，培养温度为30℃，200rpm振荡培养。此培养过程转化子，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4 )，稀释液涂布在含有10％蔗糖的LB固体培养基上，30℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为FF-lys206。以菌株FF-lys202基因组为模板，以PFF-07-16-F/R引物对（序列如SEQ ID NO：31/32所示）进行PCR扩增，得到启动子PFF-07-16；利用同源重组将启动子PFF-07-16整合到敲除菌株FF-lys206，得到我们最终的生产菌株，命名为FF-lys207。
将重组菌株FF-lys195、FF-lys197、FF-lys202与初始菌株（FF-lys101）置于500ml三角摇瓶中进行发酵培养，培养温度30℃，培养时间14～15小时，每组实验设置三个平行。所述发酵培养基组分如下：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，豆粕水解液10g/L，CaCO330g/L，NaOH调pH＝7.0。各重组菌株摇瓶发酵生产L-赖氨酸的结果如图7所示；各重组菌株5L发酵罐生产L-赖氨酸的结果如图8所示。
结果表明，PFF-07启动子相对于PFF-05启动子提高了重组菌株生产L-赖氨酸的产量，PFF-07-16突变启动子相对于突变前的PFF-07启动子，进一步提高了重组菌株生产L-赖氨酸的产量。
本发明涉及的序列：
| 名称 | 序列 | SEQ ID NO |
| PFF-05启动子 | AGAAACATCCCAGCGCTACTAATAGGGAGCGTTGACCTTCCTTCCACGGACCGGTAATCGGAGTGCCTAAAACCGCATGCGGCTTAGGCTCCAAGATAGGTTCTGCGCGGCCGGGTAATGCATCTTCTTTAGCAACAAGTTGAGGGGTAGGTGCAAATAAGAACGACATAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTTAATCAACATACACCACCACCTAAAAATTCCCCGACCAGCAAGTTCACAGTATTCGGGCACAATATCGTTGCCAAAATATTGTTTCGGAATATCATGGGATACGTACCCAACGAAAGGAAACACTC | 1 |
| PFF-06启动子 | AACAGGAATGTTCCTTTCGAAAATTGAGGAAGCCTTAAGCCCTACAACCCTACTTAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTGTGACCAGCTACCCAATAAATAGGTGGGCTGAAAAATTTCGTTGCAATATCAACAAAAAGGCCTATCATTGGGAAGTGTCGCACCAAGTACTTTTGCGAAGCGCCATCTGACGGATTTTCAAAAGATGTATATGCTCGGTGCGGAAACCTACGAAAGGATTTTTTACCC | 2 |
| PFF-07启动子 | AGAAACAGCCCAGCCCGACAATGAGCGAGCGCTGGCCTTCCTTCCAGGGCCCAGTAATTGGGGTGCCCAAAACTGCGTGCGGCTGAGGATCCAAAATAGGTTCTGAGCGGCCGGGCAGAGCATCTTCTTTAGCAACTAGTTGTGGTGCGGGAGCAAATAAGAACGACATAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTTACTCAACTTACACCACGGGCAAAATATTCCACGACCAGCAAGTTCACAGTATTCGGTCACAATATCGTTGCCAAAATAATCTTTCGACATATCATGGGGAACGTACCCCTAACGAAAGGAA | 3 |
| PFF-08启动子 | AGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTTAATCAACATACACCACCACCTAAAAATTCCCCGACCAGCAAGTTCACAGTATTCGGGCACAATATCGTTGCCAAAATATTGTTTCGGAATATCATGGGATACGTACCCAACGAAAGGAAACACTC | 4 |
| LysC | GCTTCAGGTTCAGGGCAACTGGACCAATGTGCTTTACGACGACCAGGTCGGCAAAGTCTCCCTCGTGGGTGCTGGCATGAAGTCTCACCCAGGTGTTACCGCAGAGTTCATGGAAGCTCTGCGCGATGTCAACGTGAACATCGAATTGATTTCCACCTCTGAGATCCGCATTTCCGTGCTGATCCGTGAAGATGATCTGGATGCTGCTGCACGTGCACTGCACGAGCAGTTCCAGCTTGGCGGCGAAGACGAAGCCGTCGTTTATGCAGGCACCGGACGCTAA | 5 |
| PFF-05-F | CCCAAGCTTAGAAACATCCCAGCGCTA | 6 |
| PFF-05-R | GTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 7 |
| PlysC1-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 8 |
| PlysC1-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGC | 9 |
| PFF-06-F | CCCAAGCTTAACAGGAATGTTCCTTTC | 10 |
| PFF-06-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGGGTAAAAAATCCTTTCGTAG | 11 |
| PlysC2-F | TACGAAAGGATTTTTTACCCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 12 |
| PlysC2-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 13 |
| PFF-07-F | CCCAAGCTTAGAAACAGCCCAGCCCGACAA | 14 |
| PFF-07-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCTTCCTTTCGTTAGGGGTACGT | 15 |
| PlysC3-F | CGTACCCCTAACGAAAGGAAGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 16 |
| PlysC3-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 17 |
| PFF-08-F | CCCAAGCTTAGAAATCGTCTCCTTTCTGTTTTT | 18 |
| PFF-08-R | AGTTGCCCTGAACCTGAAGCGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT | 19 |
| PlysC4-F | CCCAACGAAAGGAAACACTCGCTTCAGGTTCAGGGCAACTG | 20 |
| PlysC4-R | GCTCTAGATTAGCGTCCGGTGCCTGCATA | 21 |
| pBAD-F | TACTCCCGCCATTCAGAG | 22 |
| pBAD-R | GCGTTTAAGGGCACCAAT | 23 |
| QpcrLysC-F | TGTTACCGCAGAGTTCAT | 24 |
| QpcrLysC-R | GCATCCAGATCATCTTCAC | 25 |
| eppcrPFF-07-F | AGAAACAGCCCAGCCCGACAATG | 26 |
| eppcrPFF-07-R | TTCCTTTCGTTAGGGGTACGTTC | 27 |
| PFF-07-16 | agaaacatccctgcggtacaatagcgagcgttgccatcctaccacgcaccgctaatcggagagccttatacggcatgcggctaggctccaagataggtctgcgcggccgggtaatgcatcttctttagcaacaagttgaggggtaggtgcaaataagaacgacatagaaatcgtctcctttctgtttttaatcaacatacaccaccacctaaaaattccccgaccagcaagttcacagtattcgggcacaatatcgttgccaaaatattgtttcggaatatcatgggatacgtacccaacgaaaggaaacactc | 28 |
| PFF-05-up | GCACTACCAAGAGGGTGCCGAAACCAAGTGCTACTGTTTGTAAGAAATATGCCAGCATCGCGGTACTCATGCCTGCCCACCACATCGGTGTCATCAGAGCATTGAGTAAAGGTGAGCTCCTTAGGGAGCCATCTTTTGGGGTGCGGAGCGCGATCCGGTGTCTGACCACGGTGCCCCATGCGATTGTTAATGCCGATGCTAGGGCGAAAAGCACGGCGAGCAGATTGCTTTGCACTTGATTCAGGGTAGTTGACTAAAGAGTTGCTCGCGAAGTAGCACCTGTCACTTTTGTCTCAAATATTAAATCGAATATCAATATATGGTCTGTTTATTGGAACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATCCGCTAAAGCCCCAGGAACCCTGTGCAGAAAGAAAACACTCCTCTGGCTAGGTAGACACAGTTTATAAAGGTAGAGTTGAGCGGGTAACTGTCAGCACCTAGATCGAAAGGTGCACAAAGGGATCAAGGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC | 29 |
| PFF-05-down | ATATGGCCCTGGTCGTACAGAAATATGGCGGTTCCTCGCTTGAGAGTGCGGAACGCATTAGAAACGTCGCTGAACGGATCGTTGCCACCAAGAAGGCTGGAAATGATGTCGTGGTTGTCTGCTCCGCAATGGGAGACACCACGGATGAACTTCTAGAACTTGCAGCGGCAGTGAATCCCGTTCCGCCAGCTCGTGAAATGGATATGCTCCTGACTGCTGGTGAGCGTATTTCTAACGCTCTCGTCGCCATGGCTATTGAGTCCCTTGGCGCAGAAGCCCAATCTTTCACGGGCTCTCAGGCTGGTGTGCTCACCACCGAGCGCCACGGAAACGCACGCATTGTTGATGTCACTCCAGGTCGTGTGCGTGAAGCACTCGATGAGGGCAAGATCTGCATTGTTGCTGGTTTCCAGGGTGTTAATAAAGAAACCCGCGATGTCACCACGTTGGGTCGTGGTGGTTCTGACACCACTGCAGTTGCGTTGGCAGCTGCTTTGAACGCTGATGTGTGTGAGAT | 30 |
| PFF-07-16-F | AGAAACATCCCTGCGGTAC | 31 |
| PFF-07-16-R | GAGTGTTTCCTTTCGTTGG | 32 |
。
最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1. 一种启动子，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO：3或28所示。
2.权利要求1所述的启动子在提高lysC基因表达量的应用，其特征在于，所述启动子作为lysC基因表达的启动子。
3.一种基因表达框，其特征在于，包含权利要求1所述的启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列，所述编码序列为lysC基因的编码序列。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含：权利要求1所述的启动子，或权利要求3所述的基因表达框。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是在载体pBAD-MCS-pBBR1或pK18mobsacB上连接所述启动子或基因表达框的基因片段而获得。
6.权利要求4或5所述的重组载体在提高生产赖氨酸的菌株的赖氨酸产量的应用。
7.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包含权利要求1所述的启动子、权利要求3所述的基因表达框，或权利要求4或5所述的重组载体。
8.如权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组谷氨酸棒状杆菌。
9.权利要求7或8所述重组菌株的的构建方法，包括如下步骤：制备包含权利要求1所述启动子和lysC基因编码序列的基因片段，与载体连接获得重组载体，电转入棒状杆菌获得可增强lysC基因表达量的重组菌株。
10.一种生产赖氨酸的方法，其特征在于，包括：使用权利要求7或8所述重组菌株进行生产赖氨酸。
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