CN112662603B - 一种用于发酵生产l-赖氨酸的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于发酵生产L‑赖氨酸的基因工程菌及其构建方法，所述菌株与对应的野生型菌株相比yebO基因被过表达，其中，所述yebO的基因序列如SEQ ID NO:7所示。在相同的发酵培养条件下，与初始菌株野生大肠杆菌菌株MG1655相比，所述改造菌株无论是在L‑赖氨酸产量还是在糖酸转化率上，都有了显著的提高。

Description

一种用于发酵生产L-赖氨酸的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种用于发酵生产L-赖氨酸的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

赖氨酸作为人类和动物必需的氨基酸之一，在饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等方面被广泛使用，其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。目前，L-赖氨酸己是世界上第二大氨基酸品种。

目前，L-赖基酸的生产方法主要有四种，分别是提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法。前三种方法由于前体物成本高、工艺复杂等缺点，难以达到工业化生产的目的，微生物发酵法制备L-赖氨酸是当前的主要生产方式。发酵法生产L-赖氨酸的微生物主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌，其次是黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。

就使用大肠杆菌来发酵生产L-赖氨酸而言，大肠杆菌基因组共有4000多个基因，但是其中部分基因的功能目前并不是十分明确，因此，有必要对大肠杆菌内的未知基因进行一系列测试，以进一步明确其是否对发酵过程中的L-赖氨酸积累有一定影响。

发明内容

本发明利用基因工程技术来改造大肠杆菌基因组中目前功能未知的基因，最终发现一个对大肠杆菌发酵生产L-赖氨酸具有影响的yebO基因——过表达该基因的改造大肠杆菌菌株在发酵过程中能有效地积累L-赖氨酸，从而提高了赖氨酸的产量。

本发明的第一个目的是提供一种经基因改造的大肠杆菌L-赖氨酸生产菌株，所述菌株与对应的野生型菌株相比yebO基因被过表达。

本发明的另一个目的是提供制备所述yebO基因被过表达的发酵生产L-赖氨酸基因工程菌的构建方法，所述方法包括：PCR扩增获得yebO基因被过表达的同源重组片段；制备野生型感受态细胞；将所得同源重组片段通过电转化引入所述感受态细胞中，筛选得到阳性菌株。

附图说明

图1表示大肠杆菌MG1655中野生型yebO基因，以及本申请中使用的引物的相对位置。

图2表示通过基因工程技术将yebO过表达并同时引入KAN(卡那霉素)抗性的改造序列，以及本申请中使用的引物的相对位置。

具体实施方式

在本发明中，经基因改造的大肠杆菌L-赖氨酸生产菌株优选为MG1655菌株。

在本发明中，用于制备yebO基因过表达的发酵生产L-赖氨酸基因工程菌的方法包括以下步骤：PCR扩增获得yebO基因过表达的同源重组片段；制备野生型感受态细胞；将所得同源重组片段通过电转化引入所述感受态细胞中，筛选得到阳性菌株。

在一个具体实施方案中，所述PCR扩增使用以下表1中所示的SEQ ID NO:1-6；所述yebO基因过表达的同源重组片段为SEQ ID NO:7所示的序列。

在另一个具体实施方案中，所述制备感受态细胞包括将PET30A质粒转化于感受态细胞中。

通过所述制备方法得到经基因改造的大肠杆菌L-赖氨酸生产菌株，所述菌株与对应的野生型菌株相比yebO基因过表达；优选地，所述菌株为MG1655菌株。

表1：本申请中使用的引物序列信息

实施例1：构建yebO基因过表达的大肠杆菌菌株MG1655

本发明中使用的野生型大肠杆菌菌株是大肠杆菌MG1655，购自丰晖生物。在本实施例中，amp(氨苄青霉素)终浓度为50μg/μL，KAN(卡那霉素)终浓度为50μg/μL。

1.通过PCR扩增获得目的重组片段

PCR扩增使用的Fast HiFidelity PCR试剂盒(购买自北京天根生化科技有限公司)。

(1)以PET30A质粒(购于优宝生物)作为模板，引物kan-F(yebO)和kan-R(trc)扩增约1.3kb得到kan(trc)片段，凝胶回收待用(回收使用琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自北京博迈德基因技术有限公司，以下同)。

PCR反应液50μL体系配制(其中4-6为Fast HiFidelity PCR试剂盒自带，引物由吉林省库美生化科技有限公司合成，以下同)：

	组成成分	体积
			1	PET30A质粒	0.5μL
2	引物kan-F(yebO)(10μM)	2μL
			3	引物kan-R(trc)(10μM)	2μL
4	5*Fast HiFidelity PCR缓冲液	10μL
			5	Fast HiFidelity聚合酶	1μL
6	20*Fast PCR增强剂	2.5μL
			7	dd水	32μL

PCR反应条件：

(2)以ptrc99a质粒(购于淼灵质粒平台)作为模板，引物trc-F和trc-R(yebO)扩增约200bp得到trc(yebO)片段，凝胶回收待用。

PCR反应液50μL体系配制：

	组成成分	体积
			1	ptrc99a质粒	0.5μL
2	引物trc-F(10μM)	2μL
			3	引物trc-R(yebO)(10μM)	2μL
4	5*Fast HiFidelity PCR缓冲液	10μL
			5	Fast HiFidelity聚合酶	1μL
6	20*Fast PCR增强剂	2.5μL
			7	dd水	32μL

PCR反应条件

(3)以kan(trc)片段和trc(yebO)片段共同作为模板，引物kan-F(yebO)和trc-R(yebO)扩增kan-trc(yebO)-1476bp重组片段，DpnI消化后回收待用。

PCR反应液50μL体系配制：

	组成成分	体积
			1	kan(trc)片段	2μL
2	trc(yebO)片段	2μL
			3	引物kan-F(yebO)(10μM)	2μL
4	引物trc-R(yebO)(10μM)	2μL
			5	5*Fast HiFidelity PCR缓冲液	10μL
6	Fast HiFidelity聚合酶	1μL
			7	20*Fast PCR增强剂	2.5μL
8	dd水	28.5μL

PCR反应条件：

2.感受态细胞制备：

将PKD46质粒(购自丰晖生物)转化于MG1655感受态细胞中(转化方法及制备感受态方法均参照《分子克隆III》第一章第96页)。挑取MG1655/PKD46单菌落于5ml含有amp的LB培养基试管中，同时加入50μl的L-阿拉伯糖(1M/L)，30℃、220r/min培养直至菌液浓度OD600达到0.4，将其制备成电转化感受态(制备电感受态方法均参照《分子克隆III》第一章第99页)。

3.电转化：

将经Dpn1消化过的kan-trc(yebO)-1476bp片段通过电转化引入MG1655/PKD46电感受态细胞中(电转化条件为2.5kv，200Ω，25μF)。将转化后的感受态细胞涂布于含amp和APR的LB平板上，30℃静置培养至长出的单菌落。

4.重组验证

用引物yebO-VF和yebO-VR对上述菌落进行菌落PCR验证(阳性片段约2.2kb，得到的阴性片段约800bp)。使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(购买自北京天根生化科技有限公司)，具体步骤如下：

4.1提取MG1655 yebO::kan-trc/PKD46菌株基因组

(1)取MG1655菌株细菌培养液2ml，10000rpm离心1分钟，弃上清。

(2)向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮。

(3)向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

(4)加入220μl缓冲液GB，震荡15秒，70度放置10分钟，溶液应变得清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)加220μl无水乙醇，充分震荡15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

(9)重复操作步骤8。

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

4.2测序片段PCR扩增

以MG1655 yebO::kan-trc/PKD46菌株基因组作为模板，引物yebO-VF

和yebO-VR扩增2164bp片段。

PCR反应液50μL体系配制：

	组成成分	体积
			1	MG1655 yebO::kan-trc/PKD46基因组	0.3μL
2	引物yebO-VF(10μM)	2μL
			3	引物yebO-VR(10μM)	2μL
4	5*Fast HiFidelity PCR缓冲液	10μL
			5	Fast HiFidelity聚合酶	1μL
6	20*Fast PCR增强剂	2.5μL
			7	dd水	32.2μL

PCR反应条件：

4.3测序

菌落PCR验证正确的菌株，进一步测序验证。

5.PKD46质粒消除：

将测序验证正确的菌株MG1655 yebO::kan-trc/PKD46接于LB试管中，37℃培养过夜；次日菌液划线于LB平板上，37℃培养过夜；次日挑取单菌落转接于含amp的LB试管中。若不能生长，则表明相应单菌落PKD46质粒消除成功，得到MG1655 yebO::kan-trc菌株。将该菌株保藏于-80℃的甘油中备用。

实施例2：经基因改造的大肠杆菌菌株MG1655yebO::kan-trc的发酵验证

1.发酵培养基配方：

在本实施例中，所述发酵的发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH₄)₂SO₄ 16g/L、KH₂PO₄ 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、MnSO₄·7H₂O 0.01g/L、酵母粉2g/L，用KOH调pH 7.1。

2.发酵培养

将保藏在-80℃的MG1655和MG1655yebO::kan-trc甘油菌活化于无抗生素LB平板上，37℃培养过夜。次日挑取单菌落接种于无抗生素LB试管中，37℃、220rpm过夜培养。按1％比例接种，37℃、220rpm，初糖全部消耗完发酵结束。过程中利用氨水控制PH为7.0。

3.发酵结果的测定与总结

发酵结束后，利用氨基酸分析仪测定发酵液上清液中的L-赖氨酸含量，如下表所示。

表1：MG1655和MG1655 yebO::kan-trc发酵的L-赖氨酸产量及糖酸转化率

	L-赖氨酸(mg/dL)	糖酸转化率(％)*
			MG1655	14	1.05
MG1655、yebO::kan-trc	23	1.72

*注：糖酸转化率(％)＝[产量(14mg/dl)*结束体积(45ml)]/[初始体积(30ml)*(初糖浓度20g/L)]＝(6.3mg)/(600mg)＝0.0105＝1.05％

从上表中可知，在相同的发酵培养条件下，与野生大肠杆菌菌株MG1655相比，强化了yebO基因的MG1655改造菌株MG1655 yebO::kan-trc无论是在L-赖氨酸产量还是在糖酸转化率上，都有了显著的提高。这表明yebO基因过表达有利于大肠杆菌发酵过程中发酵液中L-赖氨酸的积累，提高了L-赖氨酸的产量及糖酸转化率。因此，通过yebO基因过表达而改造大肠杆菌菌株的基因工程方法在L-赖氨酸生产中具有广泛的工业应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种大肠杆菌基因工程菌株在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其特征在于，所述菌株与对应的野生型菌株相比yebO基因被过表达，其中，所述yebO的基因序列如SEQ ID NO:7所示，所述菌株为MG1655菌株。