CN117660454A - 一种解除TrpR基因抑制的L-色氨酸高产重组菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明通过易错PCR对启动子trpLp的碱基序列随机突变，降低对色氨酸代谢途径中关键阻遏调控酶trpR基因的负反馈调节，得到阻遏作用位点缺失的突变启动子trpLp*。本发明还提供了包括所述突变启动子trpLp*的基因表达框、重组载体，并得到了一种解除TrpR基因抑制的L‑色氨酸高产重组菌株，提高了L‑色氨酸的产量，产量达到2.59g/L。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及微生物领域，具体涉及一种解除TrpR基因抑制的L-色氨酸高产重组菌株及其应用。
背景技术
色氨酸是人类和动物生命活动所必需的氨基酸之一。对人类和动物的生长、发育、代谢起着重要的作用，也被广泛用于医药、食品、饲料。生产方法包括:发酵法、蛋白水解法、化学合成法和酶促转化法。余志华等采用重组DNA技术，成功地构建了能够高效表达用于酶法生产的色氨酸合成酶基因工程菌E.coli，并进行了规模化生产。
其中，提高L-色氨酸产量的一种方式为针对色氨酸生产菌株的改造，主要基于基因转录水平，即DNA转录为RNA过程改造。主要包括理性改造和非理性改造。非理性改造主要采用物理、化学及生物诱变；理性改造主要对色氨酸代谢途径中主要关键酶、阻遏代谢、转运蛋白等相关合成基因序列进行敲除或/和过表达，实现对色氨酸产量和转化率的提升。改造的具体方式包括：提高参与氨基酸生物合成的酶的活性和/或使所产生的L-氨基酸的反馈抑制减弱。
阻遏调控酶TrpR是一种色氨酸合成的负反馈调节蛋白，能够抑制色氨酸菌株代谢路径中色氨酸关键启动子trpLp，从而降低色氨酸的产量。已有文献公开通过对TrpR基因的改造，降低阻遏蛋白TrpR的表达，从而提高色氨酸产量。例如，CN111154706B公开了以大肠杆菌CICC 10303作为出发菌株，采用易错PCR和CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除关键基因trpR解除了色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控，敲除预苯脱氢酶编码基因pheA后解除苯丙氨酸合成途径的竞争后，利用基因随机突变试剂盒随机突变L-色氨酸合成相关基因aroK的启动子序列ParoK，构建得到5株重组菌。CN113980882B公开了一种大肠杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株以大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子Ptrp替换了pgi基因原有启动子调控trpR基因的转录表达。
为了解决上述技术问题，本发明采用在基因转录后水平改造，即RNA翻译为蛋白质过程改造，通过色氨酸关键启动子trpLp的突变，降低trpR基因的负反馈调节，提高了色氨酸的产量。
发明内容
针对trpR基因抑制启动子trpLp会导致色氨酸产量降低的技术问题，本发明通过易错PCR对启动子trpLp的碱基序列随机突变，降低对色氨酸代谢途径中关键阻遏调控酶trpR基因的负反馈调节，得到TrpR阻遏作用位点缺失的突变启动子trpLp*。本发明还提供了包括所述突变启动子trpLp*的基因表达框、重组载体，并得到了一种解除TrpR基因抑制的L-色氨酸高产重组菌株。
本发明采用如下技术方案实现：
本发明提供一种trpLp*启动子，所述trpLp*启动子为trpLp启动子的突变体，trpLp*启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种基因表达框，所述表达框包括trpLp*启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列。
在一些实施方式中，所述编码序列含有荧光基因或者trpL基因。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述的trpLp*启动子或上述的基因表达框。
在一些实施方式中，所述重组载体为重组质粒，例如pTrp质粒。
在一些实施方式中，所述重组载体在XbaI、HindⅢ双酶切位点中插入启动子trpLp*基因片段，启动子trpLp*之后可操纵地连接GFP基因。
本发明还提供了一种重组菌株，所述重组菌株包含上述的trpLp*启动子、基因表达框或重组载体。所述重组菌株可以为本领域已知的能够代谢产生L-色氨酸的微生物，例如选自野生型或者经改造的大肠杆菌；优选大肠杆菌E.coli MG1655。
本发明还提供了所述重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
S1.1通过PCR扩增所述trpLp*启动子，得到重组片段，并对质粒载体进行双酶切，得到线性化质粒载体；
S1.2将所述重组片段与线性化质粒载体连接，构建重组质粒；
S1.3以所述产L-色氨酸菌株为宿主菌株，转化至所述重组质粒，得到所述包含trpLp*启动子的重组菌株。
在一些实施方案中，所述步骤S1.1包括：以宿主菌株基因组为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增，获得长度为200bp的DNA片段，即为trpLp*；所述引物P1的核苷酸序列如SEQID NO:4所示，所述引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施方案中，所述双酶切位点为XbaⅠ、HindⅢ。
在一些实施方案中，所述步骤S1.3中，所述重组质粒通过电转转化至宿主菌株。
在一些实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：98℃预变性30s，98℃变性15s，50℃退火15s，以及72℃延伸60s(35个循环)。
本发明还提供了所述的trpLp*启动子、基因表达框、重组载体或重组菌株在生产L-色氨酸的应用。
在一些实施方案中，所述重组菌株和任选地其他菌株进行发酵，生产得到L-色氨酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
(1)本发明通过突变trpLp*启动子降低trpR基因的负反馈调节，具有高效性、随机性、稳定性等优点，能够提升其菌株产酸过程中的鲁棒性。
(2)重组后的菌株与未改造的菌株相比，解除了TrpR基因抑制、提高了L-色氨酸的产量，产量达到2.59g/L，并且为进一步代谢工程改造生产L-色氨酸菌株奠定了基础。
附图说明
图1为pTrp质粒图谱，过表达易错PCR trpLp*启动子的出发质粒。
图2为重组载体pTrp-trpLp*质粒构建图谱的质粒图谱，过表达trpLp*启动子。
图3为丙氨酸-色氨酸二肽的浓度与荧光强度关系图。
图4为所有trpLp突变体的重组菌株荧光值图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围。
实施例1trpLp启动子的突变
采用细菌基因组提取试剂盒抽提大肠杆菌MG1655的基因组DNA；
以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，以P1 5’CCCAAGCTTGTTGACAATTAATCATCGAA’(SEQ ID NO:4)、P2 5’TGCTCTAGTGTTATTCTCTAATTTTGTTC’(SE Q ID NO:5)为引物进行扩增启动子trpLp，引物由北京六合华大基因科技有限公司常规引物合成。
启动子trpLp的序列如下所示：
TGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTGGTGGCGCACTTCCTGAAACGGGCAGTGTATTCACCATGCGTAAAGCAATCAGATACCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAATTAGAGAATAACA(SEQ ID NO:1)。
将大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为目的基因trpLp后续扩增模板。
随机突变反应：
1)PCR反应体系：
向PCR薄壁管中依次加入下列试剂
2)混匀后短暂离心，放入PCR仪。
3)PCR循环参数的设置：
取1-5μL PCR产物电泳检测条带浓度和特异性，易错PCR产物电泳结果。
实施例2色氨酸生物传感器pTrp-trpLp*质粒载体的构建与验证
将易错PCR产物电泳，切胶回收目标DNA片段。
酶切：将pTrp质粒(pTrp质粒图谱如图1所示)、PCR回收产物分别在酶切位点HindⅢ与XbaI，37℃恒温条件下酶切2h 30min，酶切体系如下
连接：将已经酶切完全的线性化质粒载体、候选片段，按照如下连接体系22℃，连接30min，连成质粒pTrp-trpLp*(pTrp-trpLp*质粒图谱如图2)。
为了验证传感器pTrp-trpLp*的效果，把质粒pTrp-trpLp*导入到MG1655中。挑取单菌落于LB过夜培养，以1％的比例转接于LB培养基中，待OD长到0.4-0.5时，胞外添加不同浓度的丙氨酸-色氨酸二肽到培养液中进行测试，培养8h后，用酶标仪进行荧光定量(激发483nm，发射525nm)。结果如图3所示，丙氨酸-色氨酸二肽的浓度与荧光强度呈一定的线性关系，其计算值与误差为生物学重复三次实验的平均值与标准差。
将重组质粒pTrp-trpLp*电转化(电转参数：2.5Kv、5.8ms)到表达宿主菌株MG1655菌株中，采用LB+Gm固体培养基筛选阳性克隆菌株。根据荧光值进行筛选，荧光值如图4。筛选出荧光值最高的目标菌株，该菌株命名为MG1655+trpLp*，该菌株中包含的启动子即为本发明所述的trpLp*启动子。对trpLp*启动子测序，核苷酸序列如下所示：
TGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTTTAAAGGGTATCGACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTGGTGGCGCACTTCCTGAAACGGGCAGTGTATTCACCATGCGTAAAGCAATCAGATACCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAATTAGAGAATAACA(SEQ ID NO:2)。
实施例3色氨酸发酵实验
将目标菌株MG1655+trpLp*在LB+Gm固体培养基中划线，培养单菌落。挑选单菌落于200mL种子培养基(配方如下)。种子培养基：葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO49.5g/L、(NH4)2SO4 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L，调pH至7.0，37℃，200rpm，过夜培养；按照2％接种量接种至装有200mL发酵培养基(配方如下)。发酵培养基：葡萄糖60g/L、酵母提取物1g/L、KH2PO4 5g/L、柠檬酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、(NH 4)2SO4 5g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、ZnSO4·H2O 0.1g/L、CoCl2·6H2O 0.1g/L、CuSO4·5H2O 0.03g/L、CaCO3 20g/L。
温度：37℃、转速：180rpm/min、pH：7.0、发酵时间：48h进行发酵工艺验证。当发酵完成后，采用氨基酸分析仪检测色氨酸含量。以大肠杆菌MG1655为对照，重复三次，实验结果如下表。
本发明还涉及trpR基因编码序列，如下所示：
ATGGCCCAACAATCACCCTATTCAGCAGCGATGGCAGAACAGCGTCACCAGGAGTGGTTACGTTTTGTCGACCTGCTTAAGAATGCCTACCAAAACGATCTCCATTTACCGTTGTTAAACCTGATGCTGACGCCAGATGAGCGCGAAGCGTTGGGGACTCGCGTGCGTATTGTCGAAGAGCTGTTGCGCGGCGAAATGAGCCAGCGTGAGTTAAAAAATGAACTCGGCGCAGGCATCGCGACGATTACGCGTGGATCTAACAGCCTGAAAGCCGCGCCCGTCGAGCTGCGCCAGTGGCTGGAAGAGGTGTTGCTGAAAAGCGATTGA(SEQ ID NO:3)
最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种trpLp*启动子，其特征在于，所述trpLp*启动子为trpLp启动子的突变体，trpLp*启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种基因表达框，其特征在于，所述基因表达框包括trpLp*启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列。
3.如权利要求2所述的基因表达框，其特征在于，所述编码序列含有荧光基因或trpL基因。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1所述的trpLp*启动子、或权利要求2或3所述的基因表达框。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组质粒，所述重组载体在XbaI、HindⅢ双酶切位点中插入启动子trpLp*基因片段，启动子trpLp*之后可操纵地连接GFP基因。
6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包含权利要求1所述的trpLp*启动子、权利要求2或3所述的基因表达框、或权利要求4或5所述的重组载体。
7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌E.coliMG1655。
8.如权利要求6或7所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.1通过PCR扩增所述trpLp*启动子，得到重组片段，并对质粒载体进行双酶切，得到线性化质粒载体；
S1.2将所述重组片段与线性化质粒载体连接，构建重组质粒；
S1.3以所述产L-色氨酸菌株为宿主菌株，转化至所述重组质粒，得到所述包含trpLp*启动子的重组菌株。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述步骤S1.1包括：以宿主菌株基因组为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增，获得长度为200bp的DNA片段，即为trpLp*；所述引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述步骤S1.3中，所述重组质粒通过电转转化至宿主菌株。
10.权利要求1所述的trpLp*启动子、权利要求2或3所述的基因表达框、权利要求4或5所述的重组载体、或权利要求6或7所述的重组菌株在生产L-色氨酸的应用。
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