CN112980867A - 一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产l-氨基酸的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种对已知启动子进行饱和突变以筛选大量启动活性强度不同的启动子突变体，并对工业上产氨基酸的菌株中涉及氨基酸合成通路的基因前加入改造后的启动子，筛选出氨基酸产量进一步提高的菌株的方法，以及由此获得的突变启动子序列和获得重组菌株。

Description

一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产 L-氨基酸的应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-氨基酸的工业化生产方法中，发酵法是目前应用广泛的方式之一。对发酵法生产L-氨基酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。

用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-氨基酸等。

以赖氨酸为例，赖氨酸作为食品以及饲料的添加剂，每年的产量大约在220万吨。目前工业上赖氨酸主要来源于谷氨酸棒状杆菌发酵生产，根据现有的文献报道赖氨酸在谷氨酸棒状杆菌中的产量约为220g/L，而该菌株的主要改造在于碳源摄取、ATP合成、NADPH合成等方面，却没有对赖氨酸代谢通路中的基因表达进行调控。德国Christoph Wittmann教授在野生型谷氨酸棒状杆菌中，对赖氨酸代谢通路中的相关基因以及NADPH合成相关基因、三羧酸循环途径相关基因进行调控后将赖氨酸的产量提升到了120g/L，而对这些基因表达的调控全部采用了谷氨酸棒状杆菌中的强启动子Psod过表达这些基因。韩国CJ公司通过对ddh基因启动子区的特定位点进行突变，获得了活性更强的P_ddh启动子，利用该启动子启动ddh基因的表达可明显提升谷氨酸棒状杆菌中二氨基庚二酸脱氢酶的活性，并提高赖氨酸的合成。

韩国KAIST的Ki Jun Jeong教授实验室利用GFP作为报告蛋白，随机合成70bp的启动子序列，通过FACS分选，筛选出了20条强度不同的启动子，并成功的利用其中的最强启动子P_H36合成了746mg/L的木聚糖内切酶，然而该系列启动子为IPTG诱导型启动子。中国科学院天津工业生物技术研究所刘君教授通过固定的-10区(NNTANANT)和-35区(NNGNCN)随机构建了长度约为80bp的启动子突变库，通过高通量筛选出了一系列不同强度的启动子，应用这些启动子成功的将谷氨酸棒状杆菌中的苏氨酸产量提高到了12.8g/L，约为野生型菌株的6.1倍。

现有的技术和方法都是过表达或者多拷贝谷氨酸棒杆菌中赖氨酸代谢通路中的关键酶基因，但实际上由于代谢通路调控的复杂性，通路中的产物和前体底物中存在相互协同或反馈抑制等作用，并非是用来过表达关键酶基因的启动子的强度越强，产物积累的越多。此外，目前一部分棒杆菌中的启动子没有具体运用到谷氨酸棒杆菌生产L-赖氨酸通路中，能够提高产物产量的强度适合的启动子需要进一步的验证。

发明内容

本发明通过对已知启动子进行饱和突变，筛选大量启动活性强度不同的启动子突变体，并对工业上高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中赖氨酸合成通路的天冬氨酸激酶(lysC)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)和二氢甲基吡啶酸还原酶(dapB)等关键基因前加入改造后的启动子作为额外拷贝，筛选出赖氨酸产量进一步提高的菌株，从而达到进一步提高L-赖氨酸的合成的目的，并基于所述工作完成了本发明。本发明的方法和结果也同样可适用于对所有产氨基酸细菌进一步提高其产氨基酸能力的改造。

本发明的第一个方面是提供一种筛选能提高L-氨基酸产量的启动子的方法。

所述方法包括：

(1)构建启动子-报告蛋白-载体的表达载体，所述启动子是已知启动子序列；

(2)以步骤(1)中的表达载体为基础，对启动子序列进行饱和突变，构建所述启动子的饱和突变库；

(3)根据报告蛋白的表达情况，筛选出启动子活性强度不等的启动子突变体；

(4)将筛选出的不同启动子突变体，分别整合到产氨基酸的菌株的氨基酸代谢通路的不同基因中，获得具有启动子突变体的重组菌株，检测所述重组菌株的目标氨基酸产量，选择能够提高氨基酸产量的启动子突变体。

根据本发明，所述报告蛋白可以是本领域已知或常规的报告蛋白，包括但不限于：mCherry、GFP、sfGFP、YFP、RFP等等。

根据本发明，所述启动子可以是本领域已知或常规使用的各种启动子，例如：trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子、cj7启动子等，或者其他研究者已报道过的启动子，例如Promoter library-based modulecombination(PLMC)technology for optimization of threonine biosynthesis inCorynebacterium glutamicum.Applied Microbiology and Biotechnology.2018(102)4117-4130中报道的启动子。在本发明的一个实施方式中，所述启动子是H10，其序列如SEQID NO:11所示。

根据本发明，在步骤(1)之前可以任选包括选择用于步骤(1)的已知启动子序列的步骤，所述步骤包括构建已知启动子序列-报告蛋白-载体的表达载体，将其转化入产氨基酸的野生型菌株中，依据报告蛋白的表达情况，选择启动强度高的已知启动子序列，将其用于步骤(1)，并作为后续饱和突变基础的启动子序列。

根据本发明，步骤(1)中所述载体可以是本领域已知或常规使用的表达载体，例如：pEC-XK99E等。

根据本发明，步骤(2)中对启动子序列进行饱和突变，可以采用本领域已知的方式，例如通过合成带有饱和突变的引物，将所述突变引入启动子序列。在本发明的一个实施方式中，对启动子H10的RBS结合位点的非保守区域(NNAGGANNNNN)以及上游的5个碱基区域(NNNNN)进行饱和突变，构建其饱和突变库：GCTCNNNNNTTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATA GTCCGAGCACGGCGNNAGGANNNNN(SEQ ID NO:10)。

根据本发明，所述步骤(4)中，可以采用本领域已知的重组手段，将筛选出的启动子突变体整合到宿主菌株中，例如，同源重组。

根据本发明，所述步骤(4)中，产氨基酸的菌株可以本领域已知的各种能够产氨基酸的菌株，包括各种野生菌株，或已被基因工程技术改造过的菌株。在本发明的一个实施方式中，所述产氨基酸的菌株是高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌YP97158，保藏编号：CGMCCNo.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355(记载于中国专利申请CN106367432A(申请日2016年9月1日，公开日2017年2月1日)中)。在本发明的一个实施方式中，将筛选出的启动子突变体整合到高产赖氨酸菌株YP97158的赖氨酸代谢通路基因中。

根据本发明，所述步骤(4)中，将启动子突变体整合入菌株氨基酸代谢通路不同基因中，可以采用排列组合的方式进行穷尽式启动子和被调控基因的组合，例如将一个启动子突变体单独插入一个基因中，检测该启动子突变体对每一个基因的表达调控及其对氨基酸产量的影响；将一个启动子突变体分别插入两个基因中，检测该启动子突变体对两个基因的表达调控及其对氨基酸产量的影响；以此类推，测试一个启动子突变体和不同基因组合的最佳氨基酸产量改善。还可以将不同启动子突变体与不同基因进行排列组合，筛选出改善氨基酸产量的最佳启动子和基因组合，或者多个启动子和基因组合。

根据本发明，步骤(4)中，所述启动子突变体整合到所述氨基酸代谢通路上的基因中，可以是同源替换内源性启动子，也可以是在保留内源性启动子的情况下，增加所述启动子突变体基因。在本发明的一个实施方式中，是在保留内源性启动子的情况下，增加所述启动子突变体基因。

本发明还提供一种筛选能提高L-氨基酸产量的转化体的方法。

根据本发明，所述方法包括第一方面所述的筛选能提高L-氨基酸产量的启动子方法的步骤(1)-(4)，并进一步包括根据步骤(4)得到启动子突变体-基因组合的转化体。

本发明的第二个方面是提供一种核酸分子，其显示改进的启动子活性。

所述显示改进的启动子活性的核酸分子可被可操作地连接到产L-氨基酸的菌株的相应基因，使得与野生型启动子相比，显示更高的启动子活性，并因此能够提高对应基因所表达的蛋白的水平或活性，进而可能应用于提高L-氨基酸产量的菌株改造中。

所述核酸分子的碱基序列为：GCTCAgctttTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATAGTCCGAGCACGGCGAAAGGATGAAT(SEQ ID NO:9)。

所述对应基因可以是氨基酸代谢通路中的各种基因，包括但不限于天冬氨酸激酶(lysC)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)和二氢甲基吡啶酸还原酶(dapB)等。在本发明的一个优选实施方式中，所述对应基因是产赖氨酸菌株中的天冬氨酸激酶(lysC)。

本发明进一步提供含有所述核酸分子的载体。在本发明的一个实施方式中，所述载体是pEC-XK99E或pK18。

本发明进一步提供一种转化体，所述转化体中含有所述核酸分子，或者含有所述核酸分子的载体。在本发明的一种实施方式中，所述核酸分子通过同源重组整合到宿主菌的基因组中。在本发明的一种实施方式中，所述核酸分子通过同源重组整合到宿主菌的基因组中，替换内源性启动子序列。在本发明的一种实施方式中，所述核酸分子通过同源重组整合到宿主菌的基因组中，同时保留内源性启动子。在本发明的一种实施方式中，所述转化体中所述核酸分子被可操作地连接到氨基酸代谢通路的基因上。在本发明的一种实施方式中，所述转化体中，所述核酸分子被可操作地连接到氨基酸代谢通路的基因上并以核酸分子-基因的形式作为额外拷贝整合到宿主菌株的基因组中。在本发明的一种实施方式中，所述转化体中所述核酸分子被可操作地连接到天冬氨酸激酶(lysC)的基因上。在本发明的一种实施方式中，所述转化体中，所述核酸分子被可操作地连接到天冬氨酸激酶(lysC)的基因上并以核酸分子-天冬氨酸激酶(lysC)基因的形式作为额外拷贝整合到宿主菌株的基因组中。在本发明的一种实施方式中，所述转化体的宿主菌株为棒状细菌。在本发明的一个优选实施方式中，所述转化体的宿主菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌YP97158。在本发明的更优选实施方式中，所述转化体的宿主菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌YP97158，所述核酸分子可操作地连接天冬氨酸激酶(lysC)并以核酸分子-天冬氨酸激酶(lysC)基因的形式作为额外拷贝整合到宿主菌株的基因组中。在本发明的一种实施方式中，所述核酸分子以含有所述核酸分子的载体的形式，独立于宿主基因组存在于转化体中。

本发明的另一个方面提供了生产氨基酸的方法，该方法包括培养所述转化体，并且从培养物中获得氨基酸。

可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行细菌的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的L-氨基酸，即用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。

术语“棒状细菌”是指属于棒状杆菌属或短杆菌属的微生物。可用于本发明的棒状细菌的实例包括但不限于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和产L-氨基酸的突变体或源自其中的菌株。

术语“载体”指DNA构建物，其中感兴趣基因可操作地连接到调节元件以致于该基因可在适当的其中锚定有载体的宿主中表达。调节元件包括起始转录的启动子、控制转录的操纵基因、编码mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。只要可在宿主内复制，本领域所知的任何载体均可用于本发明而没有特别限制。例如，可用于本发明的载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单地是可能的基因组插入物。转化至合适的宿主后，载体可复制或与宿主基因组无关地发挥其功能或本身整合进基因组。载体还可以进一步包括选择标记以指示载体在宿主染色体中的插入。选择标记可使细胞具有如下能力：药物抗性、细胞毒性剂抗性、营养缺陷型或如表面蛋白表达的可选择的表型表达。

术语“转化”，如本文所用，指外源DNA物质引入宿主细胞，其中外源DNA物质可作为独立于宿主基因组或整合到宿主基因组中的元件复制。由于载体转化至宿主细胞，转化体以质粒的形式锚定有载体，或在具有启动子活性的核苷酸序列与宿主细胞基因组上基因的内源启动子进行同源重组后，载体整合进宿主细胞染色体。只要用于将本发明所述的载体引入宿主细胞，任何技术可用于本发明，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、氯化钙沉淀、显微注射、聚乙二醇技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术和醋酸锂-DMSO技术等。

术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于产氨基酸的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。

术语“产氨基酸的菌株或细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的氨基酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集氨基酸的细菌。具有氨基酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的氨基酸的细菌。

术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。

产氨基酸的菌株或细菌可以是能够在培养基中以优选0.5g/L以上，更优选1.0g/L以上的量积累目标氨基酸的细菌。

氨基酸优选为L-氨基酸，L-氨基酸的实例包括碱性氨基酸，如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族氨基酸，如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和甘氨酸；作为羟基-单氨基羧酸的氨基酸，如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状氨基酸，如L-脯氨酸；芳香族氨基酸，如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫氨基酸，如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；酸性氨基酸，如L-谷氨酸和L-天冬氨酸；和侧链具有酰胺基的氨基酸，如L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。

L-氨基酸的具体实例包括L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸。

L-氨基酸的更具体的实例包括L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸。L-氨基酸的更具体实例包括L-谷氨酸、L-赖氨酸。

在本发明中，除非另有说明，术语“氨基酸”是指L-氨基酸。在本发明中，除非另有说明，术语“L-氨基酸”是指游离形式的L-氨基酸、其盐或其混合物。

有益效果

目前工业上产氨基酸的水平已有较大提高，但如何在较高水平的基础上进一步提升氨基酸的产量，则需要全面考虑产氨基酸的菌生长所需的碳源，以及在发酵后期碳源如何最大限度的进入氨基酸的合成途径。为了解决该问题，对于产某种氨基酸的细菌而言，不同强度的启动子需要应用到所述氨基酸代谢通路的不同基因上，以达到氨基酸代谢通路与细菌生长的平衡。

对产赖氨酸的细菌，本发明将不同活性强度的启动子分别启动赖氨酸代谢通路基因，然后通过赖氨酸的产量获得每个代谢通路基因的最适启动子。将赖氨酸代谢通路每个基因及其最适启动子作为额外的拷贝整合到高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株中，从而达到进一步提高赖氨酸合成的目的。

本发明提供的启动子突变筛选方法，突变启动子与不同代谢通路基因的最适配合方法，使得筛选获得有效的启动子以及基因工程菌株的效率得到极大提高。

附图说明

图1启动子H10以及启动子EPH16在高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌中相比pdapA启动子的强度。

图2以mCherry为报告基因，启动子H10，EPH9，EPH5，EPH2，EPH1，EPM9，EPM7，EPM6，EPM4，EPM3，EPL10，EPL8在高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌中的活性强度分析。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备；所进行的操作都是本领域已知的，或者按照市售商品的用户手册进行。

实施例1构建谷氨酸棒状杆菌中强启动子H10启动mCherry表达的pEC-H10-mCherry质粒

以Wei等人(Promoter library-based module combination(PLMC)technologyfor optimization of threonine biosynthesis in Corynebacteriumglutamicum.Applied Microbiology and Biotechnology.2018(102)4117-4130.)报道的在谷氨酸棒状杆菌中最强启动子H10(SEQ ID NO:11，GCTCAACCCTTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATA GTCCGAGCACGGCGAAAGGATACTC)为模板，以及mCherry蛋白的基因序列和谷氨酸棒状杆菌中表达载体pEC-XK99E的序列，设计并合成引物用于构建pEC-H10-mCherry的载体。引物设计如下(广州金唯智公司合成)：

构建方法：以pEC-XK99E为模板，以引物1(SEQ ID NO:1)和2(SEQ ID NO:2)扩增pEC质粒的骨架区域(6743bp)，以引物3(SEQ ID NO:3)和4(SEQ ID NO:4)扩增含有H10启动子上游区域的片段(387bp)；以含有mCherry基因的质粒pBblactam(Zhang et al.,Development of a transcription factor based lactam biosensor.ACS syntheticbiology.2017,6,439-445.)为模板，以引物5(SEQ ID NO:5)和6(SEQ ID NO:6)扩增含有H10启动子下游区域以及mCherry基因的片段(810bp)。PCR反应体系为：模板DNA 0.5μl，引物(100pmol)各0.25μl，pfu(诺唯赞2×Phanta Master mix)25μl，dH₂O 24μl，总体积50μl。所述PCR扩增按如下方式进行：95℃预变性5min，(95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s/4min40s，35个循环)，72℃延伸5min，分别获得长度为387bp，810bp以及6743bp的条带，将上述三个条带分别进行琼脂糖凝胶电泳切胶回收，回收完后，以387bp和810bp条带为模板，引物3和6进行融合PCR扩增，反应体系如下：模板DNA(两条带为1：1摩尔比)，引物(100pmol)各0.25μl，pfu(诺唯赞2×Phanta Master mix)25μl,总体积为50μl。PCR扩增方法为95℃预变性5min，(95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸40s，35个循环)，72℃延伸5min，获得长度为1181bp片段，对该片段进行切胶回收。然后将回收后的片段与pEC骨架片段分别进行酶切(SpeI,XbaI)，酶切完成后过柱纯化片段。以1：2的摩尔比将pEC骨架片段与含有H10和mCherry的片段混合，并加入T4 DNA连接酶反应液，16℃连接1h后，将片段转入大肠杆菌DH5α菌株中，获得pEC-H10-mCherry质粒，保存备用。

实施例2构建强启动子H10的饱和突变库

以pEC-H10-mCherry质粒为模板，对H10启动子区的RBS结合位点的非保守区域(NNAGGANNNNN)以及上游的5个碱基区域进行饱和突变库引物的设计合成，引物设计如下(广州金唯智公司合成)：

构建方法：以pEC-H10-mCherry质粒为模板，引物3和7(SEQ ID NO:7)扩增含有H10启动子上游区域饱和突变的片段，以引物8(SEQ ID NO:8)和6扩增含有RBS结合位点的饱和突变片段，PCR反应体系为：模板DNA 0.5μl，引物(100pmol)各0.25μl，pfu(诺唯赞2×Phanta Master mix)25μl，dH₂O 24μl，总体积50μl。所述PCR扩增按如下方式进行：95℃预变性5min，(95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，35个循环)，72℃延伸5min，分别获得长度为387bp，810bp的片段，将这两个片段切胶回收后按照1：1的摩尔比以引物3和6进行融合PCR扩增，反应体系如下：模板DNA(两条带为1：1摩尔比)，引物(100pmol)各0.25μl，pfu(诺唯赞2×Phanta Master mix)25μl,总体积为50μl。PCR扩增方法为95℃预变性5min，(95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸40s，35个循环)，72℃延伸5min，获得长度为1181bp片段，对该片段(含有H10突变库)进行切胶回收。然后将该突变库片段与以引物1(SEQ ID NO:1)和2(SEQ ID NO:2)扩增的pEC质粒骨架区域片段分别进行酶切(SpeI,XbaI)，酶切完成后过柱纯化片段。以1：2的摩尔比将pEC骨架片段与含有H10突变库的片段混合，并加入T4 DNA连接酶反应液，4℃连接16h后，将连接反应液过柱纯化回收，然后电击转入大肠杆菌DH5α菌株中，获得H10启动子的突变库，保种并提取质粒。将该H10突变库质粒电击转入野生型谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032中，获得H10启动子在谷氨酸棒状杆菌中的突变库。

实施例3从H10启动子突变库中筛选活性更高的启动子

从实施例2中获得的在谷氨酸棒状杆菌中的H10启动子突变库中随机挑选克隆至含有900μl LBHIS培养基的96深孔板中，共挑选5个96深孔板，其中每个96深孔板均含有3个未突变H10启动子菌株，在30℃，800rpm条件下培养24h后用酶标仪检测mCherry的荧光数值，并根据荧光强度筛选出比H10启动子活性更强的启动子，将筛选出来的更强启动子命名为EPH16，并测序，其序列为(SEQ ID NO:9)：GCTCAgctttTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATAGTCCGAGCACGGCGAAAGGATGAAT。

将H10、EPH16和pdapA的每个启动子分别和mCherry为报告蛋白，基于pEC质粒构建载体；制备高产赖氨酸菌株YP97158的感受态，然后通过电转分别将含有H10和mCherry，EPH16和mCherry，pdapA和mCherry的载体转入高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌YP97158中，待长出克隆后，挑选三个转化子，分别培养于LBHIS培养基中，然后24h后取样检测mCherry的荧光强度。

感受态的具体制备：

1.挑取谷氨酸棒状杆菌甘油保存菌种划线接种于LBHIS平板上，30℃恒温培养48h；

2.挑取单菌落接种于20mL种子培养基中，30℃，200rpm过夜培养；

3.以10％的接种量接取500μl种子液进50mL LB培养基(含3％甘氨酸和0.1％吐温80)，30℃，200rpm培养至OD600为0.9，约3-5h，将菌液转移到50mL离心管，冰浴冷15min；

4. 4℃，5000rpm冷冻离心10min收集菌体，弃上清；加入20-30mL预冷的超纯水洗2遍，再用预冷的10％的无菌甘油洗涤一遍，每次4℃，5000rpm离心10min，去上清。

5.用400μl 10％甘油重悬菌体，分装至1.5mL离心管中，每管80μl，-80℃保存备用。

6.于感受态细胞中加入2-5μl质粒，混匀，冰上放置5-10min。

7.将混合液转入预冷的直径0.1cm电击杯，预设2.5kV，4ms进行电击，电击结束后立即加入800μl LBHIS液体培养基，混合后吸取并转入1.5ml离心管中，46℃水浴6min，30℃静置培养2-3h；

8. 5000rpm收集菌体，留存约100μl培养基重悬菌体，均匀涂布于含有相应抗性的LBHIS固体平板，30℃倒置培养。

LBHIS：5g Tryptone/l，5g NaCl/l，2.5g yeast extract/l，18.5g BHI/l，91gsorbitol/l，18g agar/l，pH 7.2。

附图1中显示了启动子H10以及筛选后的启动子EPH16在高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌中相比pdapA启动子的强度。

实施例4谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸代谢通路基因启动子的增加并测试赖氨酸的产量

将实施例3中筛选出的启动子EPH16，以及Promoter library-based modulecombination(PLMC)technology for optimization of threonine biosynthesis inCorynebacterium glutamicum.Applied Microbiology and Biotechnology.2018(102)4117-4130.论文中不同强度的启动子(H10，EPH9，EPH5，EPH2，EPH1，EPM9，EPM7，EPM6，EPM4，EPM3，EPL10，EPL8，其中EPH为高活性启动子，EPM为中等活性启动子，EPL为低活性启动子，所述启动子序列如下文所述。附图2显示了以mCherry为报告基因，这些启动子在高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌YP97158中的活性强度分析)，将上述启动子分别与不同的基因进行可操作连接，采用pk18载体，以同源重组的方法将不同的启动子-基因作为整体分别整合到高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌(YP97158)中，从而将不同启动子整合到赖氨酸代谢通路中的lysA，lysC，dapB，ddh基因的单一基因中，获得含有额外拷贝的不同启动子-基因组合的突变体，对这些突变体进行发酵测试，发现以EPH16-lysC作为额外拷贝的突变体，可以增加赖氨酸的产量，将该菌株命名为YPL-4-1。

同源重组的具体方法如下：

1.通过Gibson方法将融合片段(含有目的基因以及基因组特定位点同源序列)与pK18载体相连，构建敲入基因组的pK18质粒，通过测序验证质粒是否正确；将构建好的正确的质粒通过电击转入高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中，加入LBHIS培养基，在30℃摇床220rpm培养2h后，涂布于含有kana抗性的LBHIS平板中，30℃培养48h；

2.通过菌落PCR验证外源基因是否敲入基因组中，将验证正确的转化子划线在含有1.5％蔗糖的LBHIS培养基上，30℃培养48h；

3.随机挑选从LBHIS含有蔗糖平板上长出的克隆，进行克隆PCR验证，将验证正确的克隆同时分别培养在LBHIS含有kana和不含kana的平板上(以确认pk18载体是否在基因组中脱掉)；

4.将在不含kana平板生长，在含有kana平板上不生长的克隆进行高保真酶扩增目的片段，并送PCR产物测序，以确保基因敲入在基因组上的正确位置；

5.将测序验证正确的菌株进行培养并保种。

将上述菌株YPL-4-1进行发酵罐发酵测试，所用培养基如表1所示，发酵工艺如表2所示，发酵结果如表3(三次发酵的平均值)所示。

表1发酵培养基配方

表1发酵控制工艺

表2L-赖氨酸发酵实验结果

菌株	L-赖氨酸产量(％)
		YP97158	18.58
YPL-4-1	20.39

H10:(SEQ ID NO:11)

GCTCAACCCTTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATAGTCCGAGCACGGCGAAAGGATACTC

EPH9:(SEQ ID NO:12)

GCTCCCATGGTATACATATTAGTTTTCAGGGCGACATTCTGGTAAGGTACGATCCTAGAGTCTTAAGAGAACGGAAAGGAATTGC

EPH1:(SEQ ID NO:13)

GCTCGCTCTTGAGTCTCGTACTTGCTTGCGCCGGCTATATATGCTTATACTGGGCTAAATTAGAGCCTTAGCGAAAGGATGGGC

EPH2:(SEQ ID NO:14)

GCTCTGTCTCGACTTACTGTGCCTGGTATTCTGTCGAGGAATACTGTATACTATTTAAAATTCATTGGATAGCAAAGGACGGAT

EPH5：(SEQ ID NO:15)

GCTCTTCCCCGATTACACGTAGCGTACTGAGTGACAACCAGTTATACTGTGACGGTACAATCGTAAGCGGAAGAAAGGAACACG

EPM9:(SEQ ID NO:16)

GCTCCTGTTGAATTAAGCTACGGTTAGTCGTTGTCCTCGGGGGTTCATGGTATCCTAGAGTTGCCAATCGACGAAAGGAGTATT

EPM7:(SEQ ID NO:17)

GCTCACTCAGTCTATCGTGTACAAATGGTCGGGACGATAGTAATGTATCATAAAGTAAATTCTAGATACCGGGAAAGGACTTCG

EPM6:(SEQ ID NO:18)

GCTCCCTCCCTTGACTCTTTTCCATTCTTGATGGCGTGTTATACTCAGTATTAAGTAGAGTTGGATGCTAAAGAAAGGACAGTT

EPM4:(SEQ ID NO:19)

GCTCCGTGTTTCATGGTACTCTGGGGGGGTAGGTCACTGGTATCCCAGCGTATAGTAAACTCAAACCCTTTCGAAAGGACGTGT

EPM3:(SEQ ID NO:20)

GCTCGGGGTATGGTTATCAACGGCTCTGGAAAGGCCGACTTCGCTAAAGATTCGATATAATTTGTTCTAAAGGAAAGGATTTGC

EPL10:(SEQ ID NO:21)

GCTCTCCGGTGGAGATACAGACTATGAATAAGGGCGCCTTTTTTTGAAAGTGTTGTAGACTCGTAATAATTAGAAAGGAGAGGA

EPL8:(SEQ ID NO:22)

GCTCGCGTTATTTAACTTTGCCTTACACGCGTGCCATAGACTCCCTAGGATGCTGTATATTCTTTCTATTGGCAAAGGATTGTT

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院；宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> 一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产L-氨基酸的应用

<130> CPCN20411402

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

ggatctagag tcgacctgca g 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

ttaactagta ttgcgttgcg ctcac 25

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

caatactagt taatgtgagt tagcgcg 27

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

agagcttacc atacgccgcc ggcttagagc cgaccggtaa gggttgagcc tagaggatcc 60

ccgggtac 68

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

gcgtatggta agctctgtta tgtatagtcc gagcacggcg aaaggatact catgcgtaaa 60

ggagaagaag 70

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

cgactctaga tccgccaaaa cagcc 25

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(53)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

tacataacag agcttaccat acgccgccgg cttagagccg accggtaann nnngagccta 60

gaggatcccc gggtac 76

<210> 8

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (47)..(48)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (53)..(57)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

ccggcggcgt atggtaagct ctgttatgta tagtccgagc acggcgnnag gannnnnatg 60

cgtaaaggag aagaag 76

<210> 9

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

gctcagcttt taccggtcgg ctctaagccg gcggcgtatg gtaagctctg ttatgtatag 60

tccgagcacg gcgaaaggat gaat 84

<210> 10

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(75)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(84)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

gctcnnnnnt taccggtcgg ctctaagccg gcggcgtatg gtaagctctg ttatgtatag 60

tccgagcacg gcgnnaggan nnnn 84

<210> 11

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

gctcaaccct taccggtcgg ctctaagccg gcggcgtatg gtaagctctg ttatgtatag 60

tccgagcacg gcgaaaggat actc 84

<210> 12

<211> 85

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

gctcccatgg tatacatatt agttttcagg gcgacattct ggtaaggtac gatcctagag 60

tcttaagaga acggaaagga attgc 85

<210> 13

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

gctcgctctt gagtctcgta cttgcttgcg ccggctatat atgcttatac tgggctaaat 60

tagagcctta gcgaaaggat gggc 84

<210> 14

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

gctctgtctc gacttactgt gcctggtatt ctgtcgagga atactgtata ctatttaaaa 60

ttcattggat agcaaaggac ggat 84

<210> 15

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

gctcttcccc gattacacgt agcgtactga gtgacaacca gttatactgt gacggtacaa 60

tcgtaagcgg aagaaaggaa cacg 84

<210> 16

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 16

gctcctgttg aattaagcta cggttagtcg ttgtcctcgg gggttcatgg tatcctagag 60

ttgccaatcg acgaaaggag tatt 84

<210> 17

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

gctcactcag tctatcgtgt acaaatggtc gggacgatag taatgtatca taaagtaaat 60

tctagatacc gggaaaggac ttcg 84

<210> 18

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

gctccctccc ttgactcttt tccattcttg atggcgtgtt atactcagta ttaagtagag 60

ttggatgcta aagaaaggac agtt 84

<210> 19

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

gctccgtgtt tcatggtact ctgggggggt aggtcactgg tatcccagcg tatagtaaac 60

tcaaaccctt tcgaaaggac gtgt 84

<210> 20

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

gctcggggta tggttatcaa cggctctgga aaggccgact tcgctaaaga ttcgatataa 60

tttgttctaa aggaaaggat ttgc 84

<210> 21

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 21

gctctccggt ggagatacag actatgaata agggcgcctt tttttgaaag tgttgtagac 60

tcgtaataat tagaaaggag agga 84

<210> 22

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 22

gctcgcgtta tttaactttg ccttacacgc gtgccataga ctccctagga tgctgtatat 60

tctttctatt ggcaaaggat tgtt 84

Claims (9)

1.一种筛选能提高L-氨基酸产量的启动子的方法，其特征在于，包括：

(1)构建启动子-报告蛋白-载体的表达载体，所述启动子是已知启动子序列；

(2)以步骤(1)中的表达载体为基础，对启动子序列进行饱和突变，构建所述启动子的饱和突变库；

(3)根据报告蛋白的表达情况，筛选出启动子活性强度不等的启动子突变体；

(4)将筛选出的不同启动子突变体，分别整合到产氨基酸的菌株的氨基酸代谢通路的不同基因中，获得具有启动子突变体的重组菌株，检测所述重组菌株的目标氨基酸产量，选择能够提高氨基酸产量的启动子突变体；

在步骤(1)之前包括或不包括选择用于步骤(1)的所述已知启动子序列的步骤，所述步骤包括构建已知启动子序列-报告蛋白-载体的表达载体，将其转化入产氨基酸的野生型菌株中，依据报告蛋白的表达情况，选择启动强度高的已知启动子序列，将其用于步骤(1)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述启动子是H10，其序列如SEQID NO:11所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中对启动子H10的RBS结合位点的非保守区域NNAGGANNNNN以及上游的5个碱基区域NNNNN进行饱和突变，构建其饱和突变库：GCTCNNNNNTTACCGGTCGGCTCTAAGCCGGCGGCGTATGGTAAGCTCTGTTATGTATAGTCCGAGCACGGCGNNAGGANNNNN。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述产氨基酸的菌株是高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌YP97158。

5.一种筛选能提高L-氨基酸产量的转化体的方法，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的方法；

优选，并进一步包括根据步骤(4)得到启动子突变体-基因组合的转化体。

6.一种核酸分子，其显示改进的启动子活性，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO:9所示。

7.一种载体，其包含权利要求6所述的核酸分子。

8.一种转化体，其包含权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体；

优选，所述转化体的宿主菌是棒杆菌属；更优选，所述转化体的宿主菌是高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌YP97158；

优选，所述核酸分子通过同源重组整合到宿主菌的基因组中；

优选，所述转化体中所述核酸分子被可操作地连接到天冬氨酸激酶的基因上；

优选，所述转化体的宿主菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌YP97158，所述核酸分子可操作地连接天冬氨酸激酶；

优选，所述核酸分子以含有所述核酸分子的载体的形式，独立于宿主基因组存在于转化体中。

9.一种生产氨基酸的方法，其特征在于，培养权利要求8所述的转化体，并且从培养物中获得氨基酸。

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