CN115506035A - 启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库 - Google Patents

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Abstract

本公开属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法、具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的启动子突变体文库、转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。本公开首先提供了谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，通过该方法可以获得一系列高活性的启动子突变体，通用性广，为目标基因的改造提供了具有高启动子活性的丰富的启动子元件。

Description

启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库
技术领域
本公开属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及启动子突变体文库的构建方法、具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的启动子的突变体文库、转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。
背景技术
微生物发酵法可以生产多种目标化合物，如氨基酸、有机酸等，这些目标化合物可广泛应用于医药、食品、动物饲料和化妆品等领域，具有巨大的经济价值。近年来，随着对氨基酸、有机酸等市场需求的不断增加，如何提高目标化合物的产量，实现对目标化合物的工业化大规模生产，是当前亟需解决的重要问题。
选育高产的发酵微生物是提高目标化合物工业化产量的重要手段，与传统诱变育种的技术相比，基因工程选育技术由于其强的针对性和高效性获得了广泛性的应用。众多研究表明，目标化合物的合成途径关键基因的高效表达是提高目标化合物产量和转化率的关键。
通过基因工程的方法对微生物代谢途径中的关键基因进行改造，是提高目标化合物的发酵产量的重要方法。启动子是影响基因表达的重要调控元件，启动子的精细调控可以实现目标化合物转化率的最优化。具有不同表达强度的启动子，可以满足不同基因不同表达强度的需求，进而可以提高目标化合物的产量和转化率。因此，开发更多具有高活性的启动子，以增强目标化合物合成途径关键基因的表达，提高目标化合物的产量，提升生物发酵产业的竞争力，是微生物发酵领域亟需解决的重要问题。
然而，目前高活性启动子突变体的构建方法多为针对某一个启动子而进行的特定改造，方法没有通用性，获得的启动子数量也十分有限，强度范围也十分有限。因此，开发具有普适性的启动子突变体构建方法，构建具有表达强度范围更广泛的启动子文库，是获得高效启动子突变体是亟需解决的重要问题。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的技术问题，例如，需要开发更多具有高活性的启动子，以提高目标化合物合成途径中关键基因的表达。为此，本公开首先提供了一种谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，通过该方法可以获得一系列高活性的启动子突变体，通用性广，为目标基因的改造提供了丰富的启动子元件。
在一些实施方式中，本公开提供了一系列具有启动子活性的多核苷酸，为包含如SEQ ID NO：1-11任一项所示序列的野生型启动子的突变体，与野生型启动子相比，本公开提供的启动子突变体的启动子活性显著提高，为目标基因的改造提供了极具应用潜力的表达调控元件。将启动子突变体与目标基因可操作性地连接，可有效提高目标基因的表达，进而可有效提高目标化合物的产量、转化率。
用于解决问题的方案
本公开首先分析得到了谷氨酸棒杆菌野生型启动子的-10区，并创造性地发现-10区的第一个碱基为T、第二个碱基为A、第六个碱基为T以及-10上游的第二个碱基为G对启动子活性非常重要，在此基础上提出了启动子库的构建方法。
本公开提供了一种谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
构建包含至少一个野生型启动子的启动子文库；
将所述野生型启动子的-10区序列突变为TANNNT，将直接连接于所述-10区上游的随机区序列突变为NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或 NNNNNNNNNNNNNNNNGN中的任一种，以获得启动子突变体；其中，N代表A、T、C、 G中的任一种；并且，所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289-299任一项所示的核苷酸序列；
优选地，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
在一些实施方式中，根据本公开所述的构建方法，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；
优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：
转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖-5-磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。
本公开提供了一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述具有启动子活性的多核苷酸为野生型启动子的启动子突变体，所述启动子突变体包括10区突变序列和直接连接于所述-10区突变序列上游的随机区突变序列；所述-10区突变序列为TANNNT，所述随机区突变序列选自：NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或 NNNNNNNNNNNNNNNNGN；其中，N代表A、T、C、G中的任一种；所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289-299任一项所示的核苷酸序列；
并且，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
在一些实施方式中，根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；
优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：
转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖-5-磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。
在一些实施方式中，根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述启动子突变体的核心区选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)包含如SEQ ID NO：203-213任一项所示的核苷酸序列；
(ii)包含与(i)所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(iii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列；
并且，所述启动子突变体的核心区不包含如SEQ ID NO：192-202任一项所示的核苷酸序列；
优选地，所述启动子突变体选自如下(v)-(viii)组成的组中的任一项：
(v)包含如SEQ ID NO：214-224任一项所示的核苷酸序列；
(vi)包含与(v)所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(vii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(viii)与(v)或(vi)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列；
并且，所述启动子突变体不包含如SEQ ID NO：1-11任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述突变序列选自如下的任一项：
Figure BDA0003185169120000031
Figure BDA0003185169120000041
Figure BDA0003185169120000051
在一些实施方式中，根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，启动子突变体选自如下(a)-(d)组成的组中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：12-187任一项所示的核苷酸序列；
(b)包含与(b)所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(c)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)或(b)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(d)与(a)或(b)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列；
本公开提供了一种启动子的突变体文库，其中，所述启动子的突变体文库包含根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸。
本公开提供了一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包含根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有目标基因，所述目标基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接；优选地，所述目标基因为蛋白编码基因。
本公开提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，或根据本公开所述的转录表达盒。
本公开提供了一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据本公开所述的转录表达盒，或根据本公开所述的重组表达载体。
在一些实施方式中，根据本公开所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067或上述任一种的衍生菌株。
本公开提供了一种根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，根据本公开所述的启动子的突变体文库，根据本公开所述的转录表达盒，根据本公开所述的重组表达载体，根据本公开所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：
(a)增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
(c)生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。
在一些实施方式中，根据本公开所述的用途，其中，所述蛋白选自基因表达调控蛋白、与目标化合物合成相关的蛋白、膜转运相关蛋白中的至少一种。
在一些实施方式中，根据本公开所述的用途，其中，所述目标化合物包括氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物中的至少一种；
可选地，所述氨基酸及其衍生物包括如下的一种或多种：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物；
可选地，所述有机酸及其衍生物包括如下的一种或多种：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物。
本公开提供了一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将本公开任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标RNA或与目标基因可操作地连接的步骤；可选地，所述目标RNA包括tRNA、sRNA中的至少一种，所述目标基因包括与目标化合物合成相关的蛋白的编码基因、基因表达调控蛋白的编码基因、与膜转运相关的蛋白的编码基因中的至少一种；
可选地，所述目标基因包括如下的至少一种酶的编码基因：丙酮酸羧化酶pyc基因、谷氨酸脱氢酶gdh基因、天冬氨酸激酶lysC基因、苏氨酸操纵子thrABC基因、天冬氨酸半醛脱氢酶asd基因、天冬氨酸氨裂合酶aspB基因、高丝氨酸脱氢酶hom基因、高丝氨酸O- 乙酰基转移酶metX基因、二氢吡啶二羧酸合成酶dapA基因、二氢吡啶甲酸还原酶dapB基因、内消旋二氨基庚二酸脱氢酶ddh基因、谷氨酸激酶proB基因、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA 基因、吡咯-5-羧酸脱氢酶proC基因、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA基因、谷氨酰 t-RNA还原酶hemA基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因、氨基酸运输蛋白lysE基因、 ptsG系统相关编码基因、丙酮酸脱氢酶aceE基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN基因、赖氨酸脱羧酶cadA/ldcC基因。
本公开提供了一种制备蛋白的方法，其中，所述方法包括利根据本公开所述的转录表达盒，根据本公开所述的重组表达载体，或根据本公开所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所述蛋白为与目标化合物合成相关的蛋白、基因表达调控蛋白、膜转运相关蛋白；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。
本公开提供了一种生产目标化合物的方法，其中，所述方法包括利用根据本公开所述的转录表达盒，根据本公开所述的重组表达载体，或根据本公开所述的重组宿主细胞表达与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白或膜转运相关蛋白，在所述与目标化合物合成相关的蛋白或所述基因表达调控蛋白或膜转运相关蛋白存在的环境下生产目标化合物的步骤；
可选地，所述目标化合物包括氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物中的至少一种；
可选地，所述氨基酸及其衍生物包括如下的一种或多种：赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物；
可选地，所述有机酸及其衍生物包括如下的一种或多种：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物；
可选地，所述与目标化合物合成相关的蛋白为与L-氨基酸合成相关的蛋白；
可选地，所与L-氨基酸合成相关的蛋白包括丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、氨基酸运输蛋白、ptsG系统、丙酮酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、葡萄糖酸阻遏蛋白、葡萄糖脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶中的一种或两种以上的组合；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。
发明的效果
在一些实施方式中，本公开提供了一种启动子突变体文库的构建方法，通过将对应野生型启动子的-10区序列突变为TANNNT，将直接连接于-10区上游的16-18个核苷酸的随机区序列突变为NNNNNNNNNNNNNNGN，NNNNNNNNNNNNNNNGN， NNNNNNNNNNNNNNNNGN任一项所示的核苷酸序列，可构建得到一系列具有不同强度的启动子突变体，为高活性启动子序列的筛选提供了丰富的突变体文库来源；其中，N 代表A、T、C、G中的任一种。
在一些实施方式中，本公开提供了具有启动子活性的多核苷酸，是在野生型启动子的核心区的一个或多个位置处引入突变的核苷酸，得到启动子突变体。通过在野生型启动子的-10区及直接连接于-10区上游的16-18个核苷酸的随机区序列中引入突变，使-10区突变序列如TANNNT所示的核苷酸序列，且直接连接于-10区上游的16-18个核苷酸的随机区突变序列如NNNNNNNNNNNNNNGN，NNNNNNNNNNNNNNNGN， NNNNNNNNNNNNNNNNGN任一项所示的核苷酸序列，显著提高了启动子突变体的启动子突变体的活性显著提高。将启动子突变体与目标基因可操作地连接后，能够显著提高目标基因的表达量，进而提高目标化合物的产量、转化率，为氨基酸、有机酸等目标化合物的工业发酵提供了极具应用潜力的表达调控元件。
在一些实施方式中，本公开提供了启动子的突变体文库，包含上述的具有启动子活性的多核苷酸。启动子的突变体文库提供了一系列具有不同强启动子活性的启动子突变体，为目标化合物合成途径中关键基因的改造提供了丰富的表达调控元件。
在一些实施方式中，本公开提供了转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，包含上述具有启动子活性的多核苷酸。在转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞中，具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接，能够实现目标化合物合成途径中关键基因的高效表达。
在一些实施方式中，本公开提供了制备蛋白的方法，能够提高与氨基酸、有机酸等合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白的表达量，进而实现目标化合物的高效生产。
在一些实施方式中，本公开提供了生产目标化合物的方法，利用上述具有启动子活性的多核苷酸，能够提高与目标化合物合成相关的蛋白的表达效率，从而有效提高目标化合物的产量和传化率，实现对目标化合物的大规模工业化生产。
附图说明
图1示出了pEC-XK99E-Ptkt-rfp的质粒图谱；
图2示出了平板培养基上生长突变体克隆的荧光结果图。
具体实施方式
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个 DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
如本公开所使用的，术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。
如本公开所使用的，术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变(subsititution)或点突变(point mutation)。
如本公开所使用的，术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目标基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目标基因的转录。在核糖核酸(RNA)的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
如本公开所使用的，术语“启动子核心区”是指位于原核生物启动子区的一段核酸序列，是发挥启动子功能的核心序列区，主要包括-35区、-10区、-35区和-10区之间的核苷酸序列以及转录起始位点，-35区是RNA聚合酶的识别位点，-10区是RNA聚合酶的结合位点。通常情况下，本领域技术人员可以通过实验鉴定启动子的转录起始位点，再结合生物信息学软件预测原核生物启动子的-10区和-35区，就谷氨酸棒杆菌而言，可以基于转录起始位点快速预测-10区，而-35区预测较困难；也可以由一些生物信息学软件基于基因启动子序列预测启动子核心区的-10区和-35区等序列特征[1]。本领域技术人员均知晓，dRNA-seq(Differential RNA sequencing，差异RNA测序)和5’RACE(5’Rapid Amplification ofcDNA Ends，5’端的cDNA末端快速扩增技术)技术可以用于鉴定启动子的转录起始位点。
在一些实施方式中，本公开对-10区引入“TANNNT”突变，得到-10区突变序列；同时对直接连接-10区的上游16-18个核苷酸引入“NNNNNNNNNNNNNNGN”或“NNNNNNNNNNNNNNNGN”或“NNNNNNNNNNNNNNNNGN”，得到随机区突变序列，成功获得活性增强的启动子突变体。对11个启动子进行上述方法的突变，均获得了具有启动子活性显著增强的突变体文库，说明本公开的启动子文库构建方法具有很好的通用性。
如本公开所使用的，术语“随机区”是指直接连接于-10区上游的16-18个核苷酸。在本公开中，术语“直接连接”是指由位于随机区3’末端的羟基与位于-10区5’末端的磷酸基团之间连接形成磷酸二酯键。
在一些具体的实施方式中，启动子突变体是对-10区和随机区序列中的一个或多个位置处的核苷酸进行突变，其中，-10区突变序列为如TANNNT所示的核苷酸序列，随机区突变序列如“NNNNNNNNNNNNNNGN”或“NNNNNNNNNNNNNNNGN”或“NNNNNNNNNNNNNNNNGN”任一项所示的核苷酸序列。本领域技术人员均知晓，对核苷酸进行随机突变时，N表示A、T、C、G中的任一种。本公开中发现，当将启动子进行如上突变后，可以显著提高启动子的启动活性。
在一些实施方式中，野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子。在一些优选地实施方式中，野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子。
如本公开所使用的，术语“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶”(Phosphopyruvatecarboxylase) 催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸的转化，由ppc基因编码。
如本公开所使用的，术语“丙酮酸羧化酶”(Pyruvate carboxylase)催化丙酮酸的可逆羧基化，形成草酸乙酰，由pyc基因编码。
如本公开所使用的，术语“转酮醇酶”(transketolase)催化磷酸酮糖上的乙酮醇基 (Ketol)转移给磷酸醛糖，由基因tkt编码。
如本公开所使用，术语“转醛醇酶”(transaldolase)催化将7-磷酸景天庚酮糖的二羟丙酮基向3-磷酸甘油醛上第一个碳原子转移，产生赤藓糖-4-磷酸和果糖-6-磷酸的酶，由基因tal编码。
如本公开所使用，术语“核糖-5-磷酸异构酶”(ribose 5-phosphate isomerase)催化核糖-5-磷酸与核酮糖-5-磷酸之间的异构化反应，由基因rpi编码。
如本公开所使用，术语“葡萄糖-6-磷酸异构酶”(glucose-6-phosphateisomerase)催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之间的互换，由基因pgi编码。
如本公开所使用，术语“果糖二磷酸醛缩酶”(fructose-bisphosphate aldolase)催化果糖-1,6-双磷酸向甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸的可逆转化，由基因fda编码。
如本公开所使用，术语“磷酸甘油酸变位酶”(phosphoglycerate mutase)催化3-磷酸甘油酸向2-磷酸甘油酸的转化，由基因gpmA编码。
如本公开所使用，术语“烯醇化酶”(enolase)催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的转化，由基因eno编码。
如本公开所使用，术语“柠檬酸合酶”(citrate synthase)催化来自糖酵解或其它异化反应的乙酰CoA与草酰乙酸缩合合成柠檬酸反应的酶，由基因gltA编码。
如本公开所使用，术语“乌头酸水合酶”(aconitate hydratase)催化柠檬酸和异柠檬酸之间相互转换，由基因acn编码。
如本公开所使用，术语“异柠檬酸脱氢酶”(isocitrate dehydrogenase)以NAD+或NADP+为受体、作用于供体CH-OH基团上的氧化还原酶，由基因icd编码。
如本公开所使用，术语“二氢吡啶二羧酸合成酶”(dihydrodipicolinatesynthase)催化天冬氨酸半醛和丙酮酸的耦合，由基因dapA编码。
在一些实施方式中，野生型启动子为转酮醇酶的编码基因(tkt基因)的启动子。tkt 基因的启动子包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，tkt基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的343-364的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第 343-364的核苷酸序列不为CCAAATTTGAACCAATTAACCT。上述位置处引入突变后， tkt基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为转醛醇酶的编码基因(tal基因)的启动子。tal 基因的启动子包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，tal基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：2所示序列的66-87的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第66-87 的核苷酸序列不为TGTTGTTGTTAATCGGTACAAA。上述位置处引入突变后，tal基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为核糖-5-磷酸异构酶的编码基因(rpi基因)的启动子。rpi基因的启动子包含如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，rpi基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：3所示序列的116-137的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第116-137的核苷酸序列不为GTGAAAATGCCTGCAGTAAACT。上述位置处引入突变后，rpi基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为葡萄糖-6-磷酸异构酶的编码基因(pgi基因)的启动子。pgi基因的启动子包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，pgi基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：4所示序列的84-105的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第84-105的核苷酸序列不为GGCCACAAAAGCAAGCTAACCT。上述位置处引入突变后，pgi基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为果糖二磷酸醛缩酶的编码基因(fda基因)的启动子。fda基因的启动子包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，fda基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：5所示序列的69-91的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第69-91的核苷酸序列不为AAGTTGAGTGATGCAGGCATAAT。上述位置处引入突变后，fda基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为磷酸甘油酸变位酶的编码基因(gpmA基因)的启动子。gpmA基因的启动子包含如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，gpmA基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：6所示序列的192-213的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第192-213的核苷酸序列不为GTGGAACATAAAGTGGCAAACT。上述位置处引入突变后，gpmA基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为烯醇化酶的编码基因(eno基因)的启动子。eno 基因的启动子包含如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，eno基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：7所示序列的106-129的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第 106-129的核苷酸序列不为TCGAAACAAGATTCGTGCAACAAT。上述位置处引入突变后，eno基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为柠檬酸合酶的编码基因(gltA基因)的启动子。 gltA基因的启动子包含如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，gltA基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：8所示序列的457-478的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第457-478的核苷酸序列不为ACCGCATTTATCGGTATAGCGT。上述位置处引入突变后， gltA基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为乌头酸水合酶的编码基因(acn基因)的启动子。 acn基因的启动子包含如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，acn基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：9所示序列的184-206的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第184-206的核苷酸序列不为CAGAACGCTTGTACTGTTAGGAT。上述位置处引入突变后， acn基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为异柠檬酸脱氢酶的编码基因(icd基因)的启动子。icd基因的启动子包含如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，icd基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：10所示序列的160-181的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第160-181的核苷酸序列不为AATTAGTAGAACACTGTATTCT。上述位置处引入突变后，icd基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
在一些实施方式中，野生型启动子为二氢吡啶二羧酸合成酶的编码基因(dapA基因) 的启动子。dapA基因的启动子包含如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，dapA基因的启动子突变体在对应SEQ ID NO：11所示序列的202-223的一个或多个位置处具有突变的核苷酸，并且第202-223的核苷酸序列不为AAATGAGGGAAGAAGGTAACCT。上述位置处引入突变后，dapA基因的启动子突变体的启动子活性明显增强。
如本公开所使用的，术语“基因文库”是指通过分子克隆方法得到的包含不同基因序列的基因片段的集合。在一些实施方式中，本公开中的基因文库是对野生型启动子的序列突变后得到的突变体文库。在一些具体的实施方式中，本公开中的突变体文库是对野生型启动子的核心区进行突变，使-10区序列如SEQ ID NO：188所示的核苷酸序列，随机区序列如SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列的启动子的突变体文库。本公开中的启动子的突变体文库提供了一系列具有不同启动子活性的突变体序列，可实现高活性启动子突变体的筛选。
如本公开所使用的，术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以 100来计算同一性百分比。
在一些实施方式中，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如，多核苷酸)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。
如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24 小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24 小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
在一些具体的实施方案中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始蛋白编码基因的表达。在另外一些实施方案中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始非编码基因的表达。
如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
如本公开所使用的，术语“转录表达盒”是包含具有启动子活性的多核苷酸的重组表达元件。在一些实施方式中，对目标基因进行调控的转录调控元件除了具有启动子活性的多核苷酸，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。在一些实施方式中，本公开中目标基因具体为蛋白编码基因。目标基因与具有启动子活性的多核苷酸“可操作地连接”，是指将具有启动子活性的多核苷酸与目标基因功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。
如本公开所使用的，术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目标基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA 的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。在本公开中，“重组表达载体”与“重组载体”可以互换地使用。
如本公开所使用的，术语“目标基因”涉及与本公开中具有启动子活性的多核苷酸连接，以对其转录水平进行调控的任一种的基因。
在一些实施方案中，目标基因是指编码微生物中目标蛋白质的基因。示例性的，目标基因是编码与目标化合物的生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因，编码与糖酵解或TCA循环相关的酶的基因，或编码与目标化合物的释放相关的酶的基因等等。
如本公开所使用的，术语“目标化合物”可以选自氨基酸、有机酸，也可以选自本领域中可能通过生物合成得到的其他种类的化合物。
在一些实施方式中，目标化合物为“氨基酸”或“L-氨基酸”。“氨基酸”或“L-氨基酸”通常是指其中氨基和羧基结合至相同碳原子的蛋白质的基本构成单元。示例性的，氨基酸选自如下的一种或两种以上的组合：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。在另外一些实施方式中，目标化合物还可以是本领域中其他种类的氨基酸。
在一些实施方式中，目标化合物为有机酸。有机酸可以是具有酸性的有机化合物，例如，其中包括羧基和磺酸基的那些化合物。示例性的，有机酸选自如下的一种或两种以上的组合：乳酸、醋酸、琥珀酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物。在另外一些实施方式中，目标化合物还可以是本领域中其他种类的有机酸。
本公开中的术语“蛋白编码基因”是指能够通过一定的规则指导蛋白的合成DNA分子，蛋白编码基因指导蛋白合成的过程一般包括以双链DNA为模板的转录过程和以 mRNA为模板的翻译过程。蛋白编码基因含有CDS序列(Coding Sequence)，能够指导编码蛋白质的mRNA的产生。
示例性的，蛋白编码基因包括但不限于用于编码与目标化合物合成相关的蛋白，在一些实施方式中，蛋白编码基因涉及用于编码与合成L-氨基酸的相关的蛋白。示例性的，与合成L-氨基酸的相关的蛋白包括但不限于丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、氨基酸运输蛋白、ptsG系统、丙酮酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、葡萄糖酸阻遏蛋白、葡萄糖脱氢酶中的一种或两种以上的组合。在一些实施方式中，与合成L-氨基酸的相关的蛋白为与合成L-赖氨酸相关的蛋白，对于与合成L-赖氨酸的相关的蛋白，包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方式中，蛋白编码基因涉及用于编码与合成有机酸相关的蛋白，示例性的，蛋白编码基因用于编码与合成草酰乙酸有关的蛋白，与合成柠檬酸有关的蛋白，或用于编码与合成琥珀酸有关的蛋白。
在一些实施方式中，蛋白编码基因涉及促进草酰乙酸合成的相关酶的编码基因。示例性的，蛋白编码基因为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因ppc基因。依据现有文献[2]中报道，促进草酰乙酸合成的相关酶的表达增强后可以提高5-氨基乙酰丙酸产量。
本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的多核苷酸的转录起始元件或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。
本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、 DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本公开的具有启动子活性的多核苷酸的细胞即可。在一些实施方式中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸、有机酸的微生物，例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。作为优选地，宿主细胞是来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。其中，谷氨酸棒杆菌可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC 14067等，以及由上述菌株衍生的产生氨基酸尤其是赖氨酸的突变体或菌株。示例地，对于生产赖氨酸的菌株，本领域技术人员均知晓，可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶的菌株。
在一些实施方式中，所述生产赖氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a.编码乙醇脱氢酶的adhE基因；
b.编码乙酸激酶的ackA基因；
c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；
d.编码乳酸脱氢酶的ldhA基因；
e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；
f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；
g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；
h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I双功能酶的thrA基因；
i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和
h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
在一些实施方式中，所述宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；
b.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；
c.编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因；
d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；
e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因；
f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；
g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；
i.编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。
示例地，生产苏氨酸的宿主细胞包括但不限于在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶LysC。
在一些实施方式实施方式中，所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被扩增或多表达：
a.编码苏氨酸操纵子的thrABC基因；
b.编码解除反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶的hom基因；
c.编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因；
d.编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；
e.编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因；
f.编码转酮酶的tkt基因；
g.编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因；
h.编码苏氨酸输出的thrE基因；
i.编码烯醇酶的eno基因。
示例地，生产异亮氨酸的宿主细胞包括但不限于通过用丙氨酸取代L-苏氨酸脱水酶 ilvA基因第323位的氨基酸而产生L-异亮氨酸的菌株。
示例地，生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞包括但不限于通过使O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶失活而产生O-乙酰高丝氨酸的菌株。
示例地，生产蛋氨酸的宿主细胞包括但不限于通过使甲硫氨酸和半胱氨酸的转录调节因子失活而产生蛋氨酸的菌株。
本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
除非在本公开中另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
野生型启动子的突变体
本公开中具有启动子活性的多核苷酸，是对野生型启动子的核心区进行突变得到的启动子突变体。其中，所述启动子突变体的-10区突变序列为TANNNT，所述随机区突变序列选自：NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或 NNNNNNNNNNNNNNNNGN；其中，N代表A、T、C、G中的任一种；所述突变区序列不包含如SEQ ID NO：289-299任一项所示的核苷酸序列；并且，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
本公开中的启动子突变体，通过在野生型启动子的核心区引入突变的-10区序列，以及突变的随机区序列，使启动子突变体具有显著提高的启动子活性，为目标基因的改造提供了丰富的强启动子元件。当启动子突变体应用于目标化合物的发酵时，可明显提高目标化合物的产量及转化率。
在一些实施方式中，本公开中具有启动子活性的多核苷酸，是对与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子进行突变后得到的启动子突变体。在一些优选的实施方式中，具有启动子活性的多核苷酸，是对与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子进行突变后得到的启动子突变体。
在一些实施方式中，与氨基酸合成相关的酶的编码基因为如下的一种或多种酶的编码基因：转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖-5-磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。
在一些实施方式中，启动子突变体的核心区包含如SEQ ID NO：203-213任一项所示的核苷酸序列。其中，SEQ ID NO：203-213所示的核苷酸序列依次为如下基因的启动子突变体的核心区序列：tkt、tal、rpi、pgi、fda、gpmA、eno、gltA、can、icd、dapA。并且，启动子突变体的核心区不包含如SEQ ID NO：192-202任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，启动子突变体为tkt基因的启动子突变体。tkt基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：203所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，tkt基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：214所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO： 1所示序列的343-364位置处的核苷酸形成突变区。并且，tkt基因的启动子突变体中突变区的序列不为CCAAATTTGAACCAATTAACCT。当tkt基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，tkt基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Ptkt-1)TTCTTCGGAGTCGTGATACGGT，
(Ptkt-2)GGTGAAAGTCCTGTGATAACCT，
(Ptkt-3)CGTGACGGCGTTATGGTATCTT，
(Ptkt-4)TCGGATACTGTCATGTTAAACT，
(Ptkt-5)ATCGCCCTCGTTGTGATACGGT，
(Ptkt-6)TGGTAATGTACATTGGTACGTT，
(Ptkt-7)GGAGATTTGAGCGTGGTACACT，
(Ptkt-8)TTCGTCTACATTGTGCTAGTGT，
(Ptkt-9)TTCCTTACGCGTGTGATAAGGT，
(Ptkt-10)TCACTGTATTATATGGTATCGT，
(Ptkt-11)AGCCTCCTTGCTATGGTAGACT，
(Ptkt-12)TGAGTGGTGGGTGTGGTAGGGT，
(Ptkt-13)CATTCTAACTTTGTGATAGTGT，
(Ptkt-14)GGTGGAAAAACTATGTTATGCT，
(Ptkt-15)CCGCGCTTCCTCGTGGTATGAT，
(Ptkt-16)TCCTATGGAACTGTGGTAACAT，
(Ptkt-17)CTCTTCTCTTGTATGGTAGAGT，
(Ptkt-18)TGGGCTGGAATTGTGATATGGT，
(Ptkt-19)GAATCAAAATTTCTGGTAATAT，
(Ptkt-20)CTTACGACTACTCTGGTACAAT，
(Ptkt-21)ATGGATAAGAATGTGATAGAGT。
在一些更为具体的实施方式中，tkt基因的启动子突变体与tkt基因的启动子相比，具有1-10倍以上的提高的启动子活性。进一步的，tkt基因的启动子突变体与tkt基因的启动子相比，具有1.2、2.0、2.1、3.0、3.7、4.1、5.9、6.5、7.1、7.3、7.4、7.5、7.9、8.0、 8.7、8.9、9.1、9.3、9.6、9.8、10.0倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，tkt基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：12-32任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：1所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：12-32 所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为tal基因的启动子突变体。tal基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：204所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，tal基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：215所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：2所示序列的66-87位置处的核苷酸形成突变区。并且，tal基因的启动子突变体中突变区的序列不为TGTTGTTGTTAATCGGTACAAA。当tal基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，tal基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Ptal-1)CGAAATATGTTACAGTTAACTT，
(Ptal-2)ATGGCCCATTTAGTGGTATGAT，
(Ptal-3)TCTGATGCTATCCTGGTACAGT，
(Ptal-4)GAAGTGGTCGGTCTGGTAAACT，
(Ptal-5)GAGAGGGAGAGGATGGTACCAT，
(Ptal-6)GGCATCTGGGATATGGTAGTAT，
(Ptal-7)TTTAATCTCTTTTTGGTACACT，
(Ptal-8)ATATTGGCCAGTCTGTTATACT，
(Ptal-9)TAATCGTTCCATATGATAGTGT，
(Ptal-10)AGCTGCTTCAATGCGCTATAAT，
(Ptal-11)CGGTGGATCATTCTGGTAAGGT，
(Ptal-12)GGTGACGATATAGTGATATGAT，
(Ptal-13)CTCGACTCCTCTGTGGTACGAT，
(Ptal-14)GCTAAGACTCTTATGGTAGGCT，
(Ptal-15)TTGTATCCCTTTGTGTTAGAAT，
(Ptal-16)GTTGGATTGTTTGTGCTACCAT，
(Ptal-17)TCGGGAACAAGTGTGGTATTGT，
(Ptal-18)CACGACTAGTTTGTGGTATGTT，
(Ptal-19)TAGTCTTAAGATGTGGTATCAT。
在一些更为具体的实施方式中，tal基因的启动子突变体与tal基因的启动子相比，具有5-15倍以上的提高的启动子活性。进一步的，tal基因的启动子突变体与tal基因的启动子相比，具有5.3、5.5、5.5、7.2、7.4、7.5、8.2、8.4、8.4、9.1、9.1、10.4、11.0、 11.3、11.8、12.0、12.7、14.1、14.5倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，tal基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：33-51任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：2所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：33-51 所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为rpi基因的启动子突变体。rpi基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：205所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，rpi基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：216所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：3所示序列的116-137位置处的核苷酸形成突变区。并且，rpi基因的启动子突变体中突变区的序列不为GTGAAAATGCCTGCAGTAAACT。当rpi基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，rpi基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Prpi-1)CGGAGTTAAGTTCGGGTATATT，
(Prpi-2)CCGCCGTTAACTGTGTTATGGT，
(Prpi-3)TAGAAGGGCAACACGGTAGACT，
(Prpi-4)CGAGTGGCGAGCGTGGTATATT，
(Prpi-5)TAGAGGTGGGATTTGGTATGCT，
(Prpi-6)CGTTTCTTTCCTGTGCTACTAT，
(Prpi-7)TGAACCCCTGTTGTGGTAAACT，
(Prpi-8)GCGTGTCTATTCATGGTAGGCT，
(Prpi-9)TTGTTATTGAATTTGGTATGAT，
(Prpi-10)CAAATTAATTTTGAGGTATAGT，
(Prpi-11)GCCGGTAGGAATCTGGTACTAT，
(Prpi-12)GGCTGCGTGAATTTGATATAAT，
(Prpi-13)TAAGGCTGTAGTGTGTTAGACT，
(Prpi-14)AAGGTGCTTGGTGTGATACAAT，
(Prpi-15)GCCTCTCAGCTTGTGCTAGCAT。
在一些更为具体的实施方式中，rpi基因的启动子突变体与rpi基因的启动子相比，具有1-6倍以上的提高的启动子活性。进一步的，rpi基因的启动子突变体与rpi基因的启动子相比，具有1.2、1.3、1.3、2.0、2.1、2.9、3.0、3.2、3.2、3.2、3.5、3.8、3.8、4.7、 5.1倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，rpi基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：52-66任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：3所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：52-66 所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为pgi基因的启动子突变体。pgi基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：206所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，pgi基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：217所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：4所示序列的84-105位置处的核苷酸形成突变区。并且，pgi基因的启动子突变体中突变区的序列不为GGCCACAAAAGCAAGCTAACCT。当pgi基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，pgi基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Ppgi-1)GATCTTGATATCGTGGTAGGAT
(Ppgi-2)CATCCAGGGCATATGCTAGTGT
(Ppgi-3)ACTCATTAAGATGAGGTAGGGT
(Ppgi-4)TTGCTATATGGAGTGCTAGAGT
(Ppgi-5)CTGCTTTAACCAGTGATACAGT
(Ppgi-6)CTCCGTATCTTCCTGATAGGCT
(Ppgi-7)CGGTTATCCGATGAGTTATGAT
(Ppgi-8)GGCGGCTTGTTTCGGGTAGAGT
(Ppgi-9)CTTTATAAGGTGGTGGTAATCT
(Ppgi-10)ATTCTCGCGTCTATGATACTGT
(Ppgi-11)GACGCCCGGTTTGTGGTAGCGT
(Ppgi-12)GTTCTACTCGATAGGGTAGGAT
(Ppgi-13)TTGGTGAGCGATCTGGTACAAT
(Ppgi-14)CACTCATTCATCATGGTAGCAT
(Ppgi-15)TGGCATGTCGGGGTGGTAAACT
(Ppgi-16)GGCACGTTTTCTCTGATAGTCT
(Ppgi-17)GGTCGAACATTCATGATAGTGT
(Ppgi-18)GGTCTTCGATGTGTGATACTGT
(Ppgi-19)CAGCGGACAGTCGTGGTAGCAT
(Ppgi-20)TGTCTTTGGGTCATGGTACTAT
(Ppgi-21)TGGTACCGCAATCTGATAATAT。
在一些更为具体的实施方式中，pgi基因的启动子突变体与pgi基因的启动子相比，具有1-9倍以上的提高的启动子活性。进一步的，pgi基因的启动子突变体与pgi基因的启动子相比，具有1.0、1.2、1.5、1.8、1.8、2.5、2.5、2.8、3.6、3.6、3.6、4.2、4.3、4.4、 4.4、4.5、5.3、7.6、7.7、7.9、8.3倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，pgi基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：67-87任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：4所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：67-87 所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为fda基因的启动子突变体。fda基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：207所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，fda基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：218所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：5所示序列的69-91位置处的核苷酸形成突变区。并且，fda基因的启动子突变体中突变区的序列不为AAGTTGAGTGATGCAGGCATAAT。当fda基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，fda基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Pfda-1)GTCTAGTGCACACCTGATACTAT
(Pfda-2)CCTTTGGGGAGTTAAGATATAGT
(Pfda-3)ACTCGATTTAAACCAGCTAGTAT
(Pfda-4)TGACTGAAGGTGTGGGTTATAAT
(Pfda-5)TAAATATGTAGGCATGCTACCCT
(Pfda-6)TCGCTCCGTAATCATGTTAGAAT
(Pfda-7)GCTTCTAGTAGGGAGGGTATACT
(Pfda-8)GGTTGTTGCTGCCGTGCTAGAGT
(Pfda-9)GAGTTGTAGTTTCATGGTATGCT
(Pfda-10)ACTACTCAGTAGTTTGATACAGT
(Pfda-11)AGAGATCGTAGGGATGGTAGGCT
(Pfda-12)TAATATTATTTTTTTGCTACTAT
(Pfda-13)ATTTGGCACAACTTTGGTAGAAT
(Pfda-14)GTAAATGTACTTGATGGTAGGAT
(Pfda-15)CGGACGGGACTTGATGCTATACT
(Pfda-16)TCCTCCGTGCTTTGAGGTATTAT
(Pfda-17)TGTACCTTCCCATGTGCTATGAT
(Pfda-18)AGACGCGAGTCTTATGATAGTCT。
在一些更为具体的实施方式中，fda基因的启动子突变体与fda基因的启动子相比，具有1-5倍以上的提高的启动子活性。进一步的，fda基因的启动子突变体与fda基因的启动子相比，具有1.0、1.1、1.2、1.3、1.3、1.9、2.0、2.0、2.1、2.1、2.5、2.9、3.1、3.1、 3.2、3.3、3.3、4.5倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，fda基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：88-105 任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：5所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：88-105所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为gpmA基因的启动子突变体。gpmA基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：208所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，gpmA 基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：219所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应 SEQ ID NO：6所示序列的192-213位置处的核苷酸形成突变区。并且，gpmA基因的启动子突变体中突变区的序列不为GTGGAACATAAAGTGGCAAACT。当gpmA基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，gpmA基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(PgpmA-1)AGGTTGGTCGTGGGGGTATGCT
(PgpmA-2)TCTCTGCCCTTATTGGTACGCT
(PgpmA-3)TATCACTTTTATTTGGTACGTT
(PgpmA-4)TGCGGCCGCCGTACGATAGTAT
(PgpmA-5)TTGCTTCTCGATGGGCTAATAT
(PgpmA-6)GTGGTTTATAAACTGGTAAGTT
(PgpmA-7)ACGGGTTTATCTCTGCTAGATT
(PgpmA-8)ATTCGGCTCGTGATGCTAAACT
(PgpmA-9)CTGAAGTTTCTTTTGTTATGCT
(PgpmA-10)TGTGGGCAGTTTATGGTATGTT
(PgpmA-11)TCCGCACTTCCTGTGATACTGT
(PgpmA-12)CTGGCCGCAGGTGTGATAGACT
(PgpmA-13)ATACCATTTCTTCTGGTAATAT
(PgpmA-14)CGAACGCATATTGTGATATTGT
(PgpmA-15)CGGTCTGCCGATCTGATATACT
(PgpmA-16)CTGAATAGTTTTGTGATAGGAT。
在一些更为具体的实施方式中，gpmA基因的启动子突变体与gpmA基因的启动子相比，具有1-5倍以上的提高的启动子活性。进一步的，gpmA基因的启动子突变体与gpmA 基因的启动子相比，具有1.2、1.2、1.2、1.3、2.0、2.0、2.0、3.1、3.1、4.0、4.0、4.1、 4.1、4.3、4.4、4.6倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，gpmA基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：106-121任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：6所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：106-121所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为eno基因的启动子突变体。eno基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：209所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，eno基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：220所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：7所示序列的106-129位置处的核苷酸形成突变区。并且，eno基因的启动子突变体中突变区的序列不为TCGAAACAAGATTCGTGCAACAAT。当eno基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，eno基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Peno-1)TCGGTTCTATGCCCGGGGTAAGAT
(Peno-2)TTTACTGGCCTAGAGTGCTAGGGT
(Peno-3)TTTACGCTCGGGTACAGGTATAAT
(Peno-4)TCAGAGCCGGCGTCATGCTAACCT
(Peno-5)AACTTTGTGTTAGTGTGCTAACGT
(Peno-6)CTTGGTTTGGGTCTCTGCTAAACT
(Peno-7)ACATCGTACCCGTTATGTTAGTAT
(Peno-8)ATATGTCAGGGGGTGTGCTACAGT
(Peno-9)TTACCGCTGTTGATCTGGTAGACT
(Peno-10)TTGTTGGGGGACACATGATAACAT
(Peno-11)TTAGGCGGTCAAGTATGTTATGGT
(Peno-12)GAACCACGGCCCCTGTGTTATGCT
(Peno-13)CACTGTGTACACACCTGGTACTGT
(Peno-14)CCCAGAAGTGGGGTATGATACTAT
(Peno-15)TTCTTGGCGCTGCTATGATATGGT
(Peno-16)AAGAGCGTTCGTCTATGATATAAT。
在一些更为具体的实施方式中，eno基因的启动子突变体与eno基因的启动子相比，具有0.5-11倍以上的提高的启动子活性。进一步的，eno基因的启动子突变体与eno基因的启动子相比，具有0.9、2.1、3.2、3.3、3.4、4.2、4.2、4.2、4.8、5.4、5.7、6.0、6.3、 8.0、8.4、10.1倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，eno基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：122-137 任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：7所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：122-137 所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为gltA基因的启动子突变体。gltA基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：210所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，gltA基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：221所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：8所示序列的457-478位置处的核苷酸形成突变区。并且，gltA基因的启动子突变体中突变区的序列不为ACCGCATTTATCGGTATAGCGT。当gltA基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，gltA基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(PgltA-1)GCAGGGTTTATCTTGGTACTAT
(PgltA-2)CAGCCGATCTTCATGTTAGGGT
(PgltA-3)ACATGATTATTTGTGTTATGTT
(PgltA-4)TGTTGTCCATCTGTGTTAGTGT
(PgltA-5)TCCACCAAAAATATGGTAACAT
(PgltA-6)CCATGAGATTATGTGCTAAGTT
(PgltA-7)TCATTACAGCGTCTGTTATAGT
(PgltA-8)GAACCGATTTGCATGTTATTCT
(PgltA-9)CCTGCCCCCTATCTGATATGCT
(PgltA-10)ATCTTCCCTCACGTGTTACTCT
(PgltA-11)CGGTTTATACTTGTGATAGTCT
(PgltA-12)AGATGCTGGATCATGCTATTAT
(PgltA-13)TCCGTTCAAGCGGTGCTAAACT
(PgltA-14)AGCTCCGCCTTTGCGGTAGACT
(PgltA-15)GTCACTTTCCACGTGCTACAGT
(PgltA-16)GATTGTTTTATTCTGGTAGACT
(PgltA-17)GATGTATAAGATCTGATAGACT
(PgltA-18)GCGTGGATTATTATGTTACAAT
(PgltA-19)ATTTTTGATCTTGTGTTACGCT
(PgltA-20)TTGACGAAAGGGGTGATAGGCT
(PgltA-21)AAATCTTAATTTGTGATAGTAT
(PgltA-22)AAATGAAATCTTCGGGTAACGT
(PgltA-23)TTATTCGGGACAATGCTATACT。
在一些更为具体的实施方式中，gltA基因的启动子突变体与gltA基因的启动子相比，具有1-9倍以上的提高的启动子活性。进一步的，gltA基因的启动子突变体与gltA基因的启动子相比，具有1.0、1.9、2.6、2.8、3.1、3.1、3.4、3.6、3.8、4.1、4.1、4.1、4.6、 5.0、5.0、5.6、5.6、5.7、6.1、6.6、7.1、7.6、8.2倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，gltA基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：138-160 任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：8所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：138-160 所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为acn基因的启动子突变体。acn基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：211所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，acn基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：222所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：9所示序列的184-206位置处的核苷酸形成突变区。并且，acn基因的启动子突变体中突变区的序列不为CAGAACGCTTGTACTGTTAGGAT。当acn基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，acn基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Pacn-1)AAGCACGTCAAGCGTGCTAGTTT
(Pacn-2)TTCTGTACACTGTAGGGTACCTT
(Pacn-3)TCGGCAACCTATGGCGCTATTAT
(Pacn-4)ACTAGGCATCTAACGGGTAGAGT
(Pacn-5)CGCTTTGGTAGTGTTGTTACACT
(Pacn-6)ACATAGTGTCTTTCAGGTACGCT
(Pacn-7)CGGGTAGGAACGATTGCTATAGT
(Pacn-8)CCCGCATGCGCGTCTGTTAAAGT
(Pacn-9)GGATTTTTTCTAGCTGGTACCAT
(Pacn-10)CAAGCGTTTTTGACAGCTATACT
(Pacn-11)GTCTCATGTCATCCTGCTAGTAT
(Pacn-12)GGCCTACGAGGCCATGGTAGGCT
(Pacn-13)GGGTCGCAGTTTCATGGTAATAT
(Pacn-14)TTTAAGAGAGAGCATGGTAGAGT
(Pacn-15)GAAGAGGGGTGGTATGGTAGAGT
(Pacn-16)ACATTCCGCATTTATGTTAAACT
(Pacn-17)TTGACACCCGGGTGTGATATAGT。
在一些更为具体的实施方式中，acn基因的启动子突变体与acn基因的启动子相比，具有1-12倍以上的提高的启动子活性。进一步的，acn基因的启动子突变体与acn基因的启动子相比，具有1.9、2.5、3.3、4.0、4.0、4.5、4.6、5.2、5.3、5.4、6.6、7.2、8.2、 9.4、9.4、10.9、11.7倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，acn基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：161-177 任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：9所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：161-177 所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为icd基因的启动子突变体。icd基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：212所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，icd基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：223所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应SEQ ID NO：10所示序列的160-181位置处的核苷酸形成突变区。并且，icd基因的启动子突变体中突变区的序列不为AATTAGTAGAACACTGTATTCT。当icd基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，icd基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(Picd-1)TCGCGAGGGGTAAAGGTATACT
(Picd-2)AGGGTACTATTCACGGTAAGGT
(Picd-3)TTATGTTCGATTCTGGTAGCGT
(Picd-4)AAGTGTCCCTCAGTGATACACT
(Picd-5)AAGGTCTTACTTAGGGTAACAT
(Picd-6)GTTTGCTCTCATATGATAAGGT
(Picd-7)AGGGGCGTCGGTATGATAATAT。
在一些更为具体的实施方式中，icd基因的启动子突变体与icd基因的启动子相比，具有1-5倍以上的提高的启动子活性。进一步的，icd基因的启动子突变体与icd基因的启动子相比，具有1.1、1.1、1.2、1.2、2.1、3.2、4.1倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，icd基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：178-184 任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：10所示序列的启动子相比，SEQ ID NO： 178-184所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，启动子突变体为dapA基因的启动子突变体。dapA基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：213所示的启动子核心区序列。其中，启动子核心区的突变区序列为“NNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT”。在一些具体的实施方式中，dapA 基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：224所示的核苷酸序列，启动子突变体在对应 SEQ ID NO：11所示序列的202-223位置处的核苷酸形成突变区。并且，dapA基因的启动子突变体中突变区的序列不为AAATGAGGGAAGAAGGTAACCT。当dapA基因的启动子在引入上述突变后，可以获得明显提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，dapA基因的启动子突变体中突变区的核苷酸序列选自如下的任一项：
(PdapA-1)CGCCTTGTAACTGTGGTATCGT
(PdapA-2)GCTAGGGCTCATGTGGTACTGT
(PdapA-3)TTGACTAAGTTTGTGGTAAGGT。
在一些更为具体的实施方式中，dapA基因的启动子突变体与dapA基因的启动子相比，具有2-5倍以上的提高的启动子活性。进一步的，dapA基因的启动子突变体与icd 基因的启动子相比，具有2.6、4.0、4.6倍的提高的启动子活性。
在一些更为具体的实施方式中，dapA基因的启动子突变体包含如SEQ ID NO：185-187任一项所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：11所示序列的启动子相比，SEQ ID NO：185-187所示核苷酸序列的启动子具有显著提高的启动子活性，可用于提高目标化合物合成途径中关键基因的表达量，提高目标化合物的转化率和产量。
在一些实施方式中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸，还包括与tkt、tal、rpi、 pgi、fda、gpmA、eno、gltA、can、icd或dapA基因的启动子突变体的核苷酸序列反向互补的多核苷酸。且与野生型启动子相比，多核苷酸具有提高的启动子活性。
在一些实施方式中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸，还包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，与tkt、tal、rpi、pgi、fda、gpmA、eno、gltA、can、 icd或dapA基因的启动子突变体的核苷酸序列杂交的序列的反向互补的多核苷酸。并且所述多核苷酸不包含如SEQ ID NO：1-11任一项所示的核苷酸序列。且与野生型启动子相比，多核苷酸具有提高的启动子活性。
在一些实施方式中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸，为与上述的多核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性(包括这些数值之间所有范围和百分数)的序列。并且所述多核苷酸不包含如SEQ ID NO：1-11 任一项所示的核苷酸序列。且与野生型启动子相比，多核苷酸具有提高的启动子活性。
启动子的突变体文库
在一些实施方式中，本公开提供了包括tkt、tal、rpi、pgi、fda、gpmA、eno、gltA、acn、icd和dapA基因中至少一个基因的至少一种突变区序列的启动子的突变体文库。
启动子的突变体文库的构建步骤包括：
启动子文库的构建步骤：构建包含至少一个野生型启动子的启动子文库；
突变步骤：将所述野生型启动子的-10区序列突变为TANNNT，随机区序列突变为：NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或 NNNNNNNNNNNNNNNNGN中的任一种，以获得启动子突变体；其中，N代表A、T、C、 G中的任一种；并且，所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289-299任一项所示的核苷酸序列。
在一些优选的实施方式中，野生型启动子来源于谷氨酸棒杆菌，本公开以上述方法对来源于谷氨酸棒杆菌的11个野生型启动子进行突变，所得的突变体文库中均包含了众多启动子活性显著增强的启动子突变体，说明本公开提供的构建方法具有很好的通用性。
在一些优选的实施方式中，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括tkt基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含tkt基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如 SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO： 189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：289所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以tkt-1/2为引物扩增tkt基因的启动子(序列如SEQ ID NO：1所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒[3]为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Ptkt-rfp，得到包含tkt基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Ptkt-rfp为模板，以tkt-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以tkt-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到tkt基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括tal基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含tal基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如 SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO： 189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：290所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以tal-1/2为引物扩增tal基因的启动子(序列如SEQ ID NO：2所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Ptal-rfp，得到包含tal基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Ptal-rfp为模板，以tal-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以tal-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到tal基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括rpi基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含rpi基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如 SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO： 189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：291所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以rpi-1/2为引物扩增rpi基因的启动子(序列如SEQ ID NO：3所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Prpi-rfp，得到包含rpi基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Prpi-rfp为模板，以rpi-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以rpi-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到rpi基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括pgi基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含pgi基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：292所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以pgi-1/2为引物扩增pgi基因的启动子(序列如SEQ ID NO：4所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Ppgi-rfp，得到包含pgi基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Ppgi-rfp为模板，以pgi-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以pgi-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到pgi基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括fda基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含fda基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：293所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以fda-1/2为引物扩增fda基因的启动子(序列如SEQ ID NO：5所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Pfda-rfp，得到包含fda基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Pfda-rfp为模板，以fda-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以fda-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到fda基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括gpmA基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含gpmA基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如SEQID NO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如 SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：294 所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以gpmA-1/2为引物扩增gpmA基因的启动子(序列如SEQ ID NO：6所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-PgpmA-rfp，得到包含gpmA基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-PgpmA-rfp为模板，以gpmA-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以gpmA-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到dapA基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括eno基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含eno基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：295所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以eno-1/2为引物扩增eno基因的启动子(序列如SEQ ID NO：7所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Peno-rfp，得到包含eno基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Peno-rfp为模板，以eno-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以eno-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到eno基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括gltA基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含gltA基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如SEQID NO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：296所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以gltA-1/2为引物扩增gltA基因的启动子(序列如SEQ ID NO：8所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-PgltA-rfp，得到包含gltA基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-PgltA-rfp为模板，以gltA-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以gltA-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到gltA基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括acn基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含acn基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：297所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以acn-1/2为引物扩增acn基因的启动子(序列如SEQ ID NO：9所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Pacn-rfp，得到包含acn基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Pacn-rfp为模板，以acn-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以acn-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到acn基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括icd基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含icd基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如 SEQ IDNO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO： 189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：298所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以icd-1/2为引物扩增icd基因的启动子(序列如SEQ ID NO：10所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-Picd-rfp，得到包含icd基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-Picd-rfp为模板，以icd-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以icd-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到icd基因的突变体文库。
在一些具体的实施方式中，启动子的突变体文库包括dapA基因的启动子突变体的突变体文库。具体的，突变体文库的构建步骤包括：(1)构建包含dapA基因的启动子序列的重组表达载体；(2)对所述重组表达载体进行突变，使野生型启动子的-10区突变为如SEQID NO：188所示的核苷酸序列，上游的16-18个核苷酸的随机区突变为如SEQ ID NO：189-191任一项所示的核苷酸序列；且突变区序列不包含如SEQ ID NO：299所示的核苷酸序列。
在一些更为具体的实施方式中，本公开以ATCC13032基因组(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)为模板，以dapA-1/2为引物扩增dapA基因的启动子(序列如SEQ ID NO：11所示)和N端96-180bp序列的片段；以pEC-XK99E-rfp 质粒为模板，以pEC-1和pEC-2为引物，扩增pEC-XK99E质粒骨架；以RFP-1/2为引物，以pEC-XK99E-rfp质粒为模板，扩增包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段；重组连接，构建重组表达载体pEC-XK99E-PdapA-rfp，得到包含dapA基因的野生型启动子的启动子文库。
以pEC-XK99E-PdapA-rfp为模板，以dapA-N1和TK-1为引物扩增包含突变区的片段，以dapA-N2和TK-2为引物扩增质粒骨架片段，重组连接得到dapA基因的突变体文库。
在另外一些实施方式中，本公开还可以根据具体的克隆需要，利用(Ptkt-1)～(Ptkt-21)、 (Ptal-1)～(Ptal-19)、(Prpi-1)～(Prpi-15)、(Ppgi-1)～(Ppgi-21)、(Pfda-1)～(Pfda-18)、 (PgpmA-1)～(PgpmA-16)、(Peno-1)～(Peno-16)、(PgltA-1)～(PgltA-23)、(Pacn-1)～(Pacn-17)、 (Picd-1)～(Picd-7)、(PdapA-1)～(PdapA-3)任一项所示的启动子突变体构建所需的重组表达载体。
在一些实施方式中，本公开以重组表达载体转化谷氨酸棒杆菌，得到重组宿主细胞。
目标化合物的生产过程
(1)将具有启动子活性的多核苷酸，与目标化合物合成相关的蛋白编码基因或基因表达调控蛋白编码基因可操作地连接，得到能够与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白的重组表达载体，利用重组表达载体转化宿主细胞，获得重组宿主细胞。
(2)对重组宿主细胞进行发酵培养，从重组宿主细胞或重组宿主细胞的培养液中收集目标化合物，完成目标化合物的生产过程。
上述生产过程中，由于多核苷酸具有改进的启动子活性，在重组宿主细胞中，与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白的编码基因的转录活性提高，与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白的表达量提高，进而使目标化合物的产量显著提升。
在一些实施方式中，目标化合物为氨基酸，与目标化合物合成相关的蛋白编码基因是指与合成氨基酸相关的蛋白编码基因。在一些实施方式中，目标化合物为L-氨基酸，与合成氨基酸相关的蛋白编码基因是指与合成L-氨基酸相关的蛋白编码基因。
在一些具体的实施方案中，与氨基酸合成相关的蛋白为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，以具有启动子活性的多核苷酸增加ppc的表达，可以加强从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸的合成，进而促进依赖于草酰乙酸前体供应的目标化合物的生产，包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)等。
在一些具体的实施方案中，宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，谷氨酸棒杆菌是用于生产氨基酸、有机酸等目标化合物的重要菌株，具有增强的启动子活性的多核苷酸、转录表达盒或重组表达载体对谷氨酸棒杆菌进行改造后，谷氨酸棒杆菌内与目标化合物合成相关的蛋白的表达量显著提高，进而使谷氨酸棒杆菌发酵积累目标化合物的能力大大提高。
在一些具体的实施方案中，宿主细胞是经过如下改良的谷氨酸棒杆菌：谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上天冬氨酸激酶(lysC基因编码)第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸。
在一些具体的实施方案中，重组宿主细胞的培养条件为：重组宿主细胞接种到TSB液体培养基中培养，培养物作为种子接种到每孔含有发酵培养基的24孔板中，30℃培养18h，孔板摇床转速为800rpm，发酵结束后检测L-赖氨酸产量。
对于赖氨酸发酵培养基，配方为：葡萄糖，80g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1 g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，10g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O， 0.45g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40 g/L；初始pH7.2。培养基中补加25μg/mL卡那霉素。
在一些具体的实施方案中，对于重组宿主细胞或重组细胞的培养液回收目标化合物，可通过本领域常用方法，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶或HPLC。
在本领域，用于操纵微生物的方法是已知的，如《分子生物学现代方法》(OnlineISBN： 9780471142720,John Wiley and Sons,Inc.)、《微生物代谢工程：方法和规程》(Qiong Cheng Ed.,Springer)和《系统代谢工程：方法和规程》(Hal S.Alper Ed.,Springer)等出版物中被解释。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1.谷氨酸棒杆菌基因启动子强度表征质粒的构建
本公开选择谷氨酸棒杆菌中心代谢及部分赖氨酸合成途径相关基因的启动子进行强度表征，并进一步引入特定区域突变构建启动子文库，获得表达强度增强的启动子突变体。所选定的基因包括：转酮醇酶tkt(transketolase)、转醛醇酶tal(transaldolase)、核糖-5-磷酸异构酶rpi(ribose 5-phosphate isomerase)、葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi(glucose-6-phosphate isomerase)、果糖二磷酸醛缩酶fda(fructose-bisphosphatealdolase)、磷酸甘油酸变位酶gpmA(phosphoglycerate mutase)、烯醇化酶eno(enolase)、柠檬酸合酶gltA(citrate synthase)、乌头酸水合酶acn(aconitate hydratase)、异柠檬酸脱氢酶icd (isocitrate dehydrogenase)、二氢吡啶二羧酸合成酶dapA(dihydrodipicolinate synthase)，共11个基因。在细菌中，基因的表达调控序列及N端编码区是影响基因表达的关键区域。本公开采用基因上游启动子、基因N端96-180bp编码区、一个柔性连接肽linker和一个红色荧光蛋白基因rfp顺序连接的方法，基于荧光强度表征目标启动子的表达强度。
本实施例首先构建选定的11个基因启动子的表征载体。在pEC-XK99E质粒骨架基础上，由选定基因上游包含启动子的表达调控区表达选定基因N端32-60个氨基酸、一个连接肽和红色荧光蛋白。具体构建如下：
(1)扩增启动子和N端序列片段
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032，Gene ID:2830649)、以上11个基因的注释信息，设计扩增引物。tkt、tal、 rpi、pgi、fda、gpmA、eno、gltA、acn、icd、dapA，分别以tkt-1/2、tal-1/2、rpi-1/2、pgi-1/2、 fda-1/2、gpmA-1/2、eno-1/2、gltA-1/2、acn-1/2、icd-1/2、dapA-1/2为引物，以ATCC13032 基因组为模板，扩增对应基因的野生型启动子(序列如SEQ ID NO：1-11所示)和N端 96-180bp序列的片段。
(2)扩增质粒骨架和rfp片段
以文献报道的pEC-XK99E-rfp质粒为模板，分别以pEC-1/2为引物扩增pEC-XK99E质粒骨架，以RFP-1/2为引物扩增包含连接肽(DNA序列为： GGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCT)的红色荧光蛋白基因 DNA片段。
以上获得的tkt、tal、rpi、pgi、fda、gpmA、eno、gltA、acn、icd、dapA基因启动子和N端96-180bp片段，分别与包含连接肽的红色荧光蛋白基因DNA片段、质粒骨架通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-XK99E-Ptkt-rfp、pEC-XK99E-Ptal-rfp、 pEC-XK99E-Prpi-rfp、pEC-XK99E-Ppgi-rfp、pEC-XK99E-Pfda-rfp、pEC-XK99E-PgpmA-rfp、 pEC-XK99E-Peno-rfp、pEC-XK99E-PgltA-rfp、pEC-XK99E-Pacn-rfp、pEC-XK99E-Picd-rfp、 pEC-XK99E-PdapA-rfp表征载体。
以pEC-XK99E-Ptkt-rfp载体为例，质粒图谱如图1所示。以上所用引物序列如表1所示。
表1构建表征载体引物
Figure BDA0003185169120000291
Figure BDA0003185169120000301
实施例2.谷氨酸棒杆菌基因启动子突变体筛选及强度表征
(1)谷氨酸棒杆菌基因启动子突变体文库的构建及初步筛选
本公开对谷氨酸棒杆菌基因启动子的核心区的-10区及上游16-18bp的随机区序列中引入“(N)14-16GNTANNNT”序列突变，构建启动子文库。
tkt启动子核心区
Figure BDA0003185169120000302
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
Figure BDA0003185169120000303
tal启动子核心区
Figure BDA0003185169120000304
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“ATGATTCTCCGGAATTTTATTGCCCCGGGTNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT GGGTCTTA”突变。
rpi启动子核心区：
Figure BDA0003185169120000311
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“AATAGGGGAAAAGTCCGGGTATCCGCCGTTNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTGACTTCCA”突变。
pgi启动子核心区
Figure BDA0003185169120000312
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“TTTCCCACTTTGAACACTCTTCGATGCGCTTNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTGAAGATG”突变。
fda启动子核心区
Figure BDA0003185169120000313
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“CTTAGGTTGAAGGAAATATCACACGACAANNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTTGGCTATA”突变。
gpmA启动子核心区
Figure BDA0003185169120000314
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“TGAAACGCATCACGGCTAAGTAAACGCGCGTCNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTAGTACCTA”突变。
eno启动子核心区
Figure BDA0003185169120000315
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“TCGCCACTAATTTCAACTGATTGCCTCANNNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTTGGGTGTA”突变。
gltA启动子核心区
Figure BDA0003185169120000316
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“GGAATTGGCTCTCACTTCGGATATGGCTAANNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTGTTAACCG”突变。
acn启动子核心区
Figure BDA0003185169120000317
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“ACGCGCCAAGAACCCCAACTTTCCCGCNNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTA ATGAAGACG”突变。
icd启动子核心区
Figure BDA0003185169120000321
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“GGGCTGAAACTGCCACCATAGGCGCCAGCNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNT AGGTAGCTG”突变。
dapA启动子核心区
Figure BDA0003185169120000322
下划线处为该启动子的-10区(加粗序列为-10区序列)及随机区序列，引入
“TAGGTTTTTTGCGGGGTTGTTTAACCCCCNNNNNNNNNNNNNNGNTANNNTT GAACTCTA”突变。
分别以实施例1构建的对应表征载体为模板，分别采用对应基因的N1引物和TK-1引物扩增包含突变区的片段，分别采用对应基因的N2引物和TK-2引物扩增质粒骨架片段。对应基因的2个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，分别对每个基因启动子突变所获得的所有克隆进行收集并提取质粒，分别获得tkt、tal、rpi、pgi、fda、gpmA、 eno、gltA、acn、icd、dapA基因启动子突变体质粒文库。
将以上质粒文库，分别转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032，涂布TSB补加25μg/mL卡那霉素的固体平板，通过荧光成像系统对长有数百个克隆的平板进行荧光拍照，根据克隆的荧光亮度初步筛选表达强度提高的突变体。TSB平板培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O， 1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L；琼脂粉，15g/L。同时将实施例1中获得的11个野生型启动子表征质粒分别转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032，获得对照菌株。本公开分别对每个启动子文库的大于1万个克隆进行初步平板筛选，获得荧光亮度增强的突变体。以tkt基因启动子突变库筛选为例，筛选平板如图2所示。以上所用引物序列如表2所示。
表2建库引物
Figure BDA0003185169120000323
Figure BDA0003185169120000331
(2)谷氨酸棒杆菌基因启动子突变体文库的表征及序列分析
对以上平板中荧光成像显示荧光亮度增强的突变体进行96孔板培养表征启动子的强度。TSB液体培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.1g/L；生物素， 0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L。培养基中添加25μg/mL卡那霉素。将平板获得的荧光亮度增强的克隆和野生型启动子的对照菌株，分别用牙签接种至每孔含有200μL TSB液体培养基的96孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800rpm， 30℃培养24h后采用酶标仪检测菌株的荧光强度。荧光测定激发波长为560nm，发射波长为607nm；同时测定菌液OD600，计算菌株的荧光强度。对荧光强度较野生型对照提高菌株，采用pEC-F(TACGGTTCCTGGCCTTTTGC)和RFP-CX (CGGGTGTTTAACGTAAGCTTTG)引物扩增包含突变区片段并进行测序分析。
启动子突变体表征及测序结果如表3-13所示：
tkt基因的启动子突变体文库最终成功获得21个表达强度较tkt基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：12-32)，提高倍数范围为1.2-10.0倍。
tal基因的启动子突变体文库最终成功获得19个表达强度较tal基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：33-51)，提高倍数范围为5.3-14.5倍。
rpi基因的启动子突变体文库最终成功获得15个表达强度较rpi基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：52-66)，提高倍数范围为1.2-5.1倍。
pgi基因的启动子突变体文库最终成功获得21个表达强度较pgi基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：67-87)，提高倍数范围为1.0-8.3倍。
fda基因的启动子突变体文库最终成功获得18个表达强度较fda基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：88-105)，提高倍数范围为1.0-4.5倍。
gpmA基因的启动子突变体文库最终成功获得16个表达强度较gpmA基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：106-121)，提高倍数范围为1.2-4.6倍。
eno基因的启动子突变体文库最终成功获得16个表达强度较eno基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：122-137)，提高倍数范围为0.9-10.1倍。
gltA基因的启动子突变体文库最终成功获得23个表达强度较gltA基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：138-160)，提高倍数范围为1.0-8.2倍。
acn基因的启动子突变体文库最终成功获得17个表达强度较acn基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：161-177)，提高倍数范围为1.9-11.7倍。
icd基因的启动子突变体文库最终成功获得7个表达强度较icd基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：178-184)，提高倍数范围为1.1-4.1倍。
dapA基因的启动子突变体文库最终成功获得3个表达强度较dapA基因野生型启动子提高的启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：185-187)，提高倍数范围为2.6-4.6倍。
表3 tkt基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000341
Figure BDA0003185169120000351
表4 tal基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000352
表5 rpi基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000353
Figure BDA0003185169120000361
表6 pgi基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000362
表7 fda基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000371
表8 gpmA基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000372
Figure BDA0003185169120000381
表9 eno基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000382
表10 gltA基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000383
Figure BDA0003185169120000391
表11 acn基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000392
表12 icd基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000401
表13 dapA基因启动子突变体
Figure BDA0003185169120000402
实施例3.谷氨酸棒杆菌基因启动子突变体应用于L-赖氨酸生产
(1)基因启动子突变体应用于L-赖氨酸生产的菌株构建
本公开首先将谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株天冬氨酸激酶基因lysC引入了T311I点突变，密码子由ACC突变为ATC，获得SCgL30菌株。本公开进一步应用tkt、tal、 pgi、fda、gpmA、acn基因启动子突变体过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC， NCBI-GeneID:1019553，NCBI-ProteinID:NP_600799)，测试其对L-赖氨酸生产的影响。
过表达质粒构建如下：在pEC-XK99E质粒骨架基础上采用Ptkt-21、Ptal-19、Ppgi-21、Pfda-18、PgpmA-16、Pacn-17启动子突变体过表达ppc基因。分别以实施例2中筛选的对应启动子突变体质粒为模板，分别以对应基因的P1/P2引物扩增各个启动子突变体片段；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组为模板，以ppc-1/ppc-2为引物扩增ppc基因片段；以pEC-XK99E质粒为模板，以PEC-1/2引物扩增质粒骨架。以上获得的启动子突变体片段分别与ppc基因片段和质粒骨架片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，分别获得pEC-Ptkt-21-ppc、pEC-Ptal-19-ppc、pEC-Ppgi-21-ppc、pEC-Pfda-18-ppc、pEC-PgpmA-16-ppc、 pEC-Pacn-17-ppc质粒。将pEC-XK99E对照质粒及以上质粒分别转化至SCgL30菌株，获得对照菌株和突变体启动子过表达菌株SCgL30(pEC-XK99E)、SCgL30(pEC-Ptkt-21-ppc)、 SCgL30(pEC-Ptal-19-ppc)、SCgL30(pEC-Ppgi-21-ppc)、SCgL30(pEC-Pfda-18-ppc)、 SCgL30(pEC-PgpmA-16-ppc)、SCgL30(pEC-Pacn-17-ppc)。以上所用引物序列如表14所示。
表14
Figure BDA0003185169120000411
(2)启动子突变体过表达菌株的L-赖氨酸生产能力评价
为了测试谷氨酸棒杆菌中应用Ptkt-21、Ptal-19、Ppgi-21、Pfda-18、PgpmA-16、Pacn-17启动子突变体过表达ppc基因对菌株产L-赖氨酸的影响，分别对SCgL30(pEC-XK99E)、SCgL30(pEC-Ptkt-21-ppc)、SCgL30(pEC-Ptal-19-ppc)、SCgL30(pEC-Ppgi-21-ppc)、 SCgL30(pEC-Pfda-18-ppc)、SCgL30(pEC-PgpmA-16-ppc)、SCgL30(pEC-Pacn-17-ppc)进行发酵测试。发酵培养基成份为：葡萄糖，80g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1 g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，10g/L；K2HPO4·3H2O，1g/L；MgSO4·7H2O，0.45g/L； FeSO4·7H2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.2。培养基中补加25μg/mL卡那霉素。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养 8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，接种量为12μl， 30℃培养18h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后采用SBA生物传感分析仪检测L-赖氨酸产量，并采用酶标仪测定OD600。结果如表15所示，启动子突变体过表达菌株的L-赖氨酸产量均有提高，其中SCgL30(pEC-Pacn-17-ppc)菌株产量提高达70％。以上结果表明采用本公开的启动子突变体可用于增强PPC的表达，并应用于L- 赖氨酸生产。
表15
菌株 OD<sub>600</sub> L-赖氨酸产量(g/L)
SCgL30(pEC-XK99E) 17.7±1.2 4.50±0.0
SCgL30(pEC-P<sub>tkt-21</sub>-ppc) 18.6±1.1 6.17±0.6
SCgL30(pEC-P<sub>tal-19</sub>-ppc) 17.8±0.3 5.33±0.3
SCgL30(pEC-P<sub>pgi-21</sub>-ppc) 19.4±0.8 6.33±0.3
SCgL30(pEC-P<sub>fda-18</sub>-ppc) 17.5±2.1 5.67±0.8
SCgL30(pEC-P<sub>gpmA-16</sub>-ppc) 19.5±1.1 5.83±0.8
SCgL30(pEC-P<sub>acn-17</sub>-ppc) 17.8±1.1 7.67±0.3
以上结果说明：本公开的启动子突变体可用于谷氨酸棒杆菌中增强PPC的表达，进而强化从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸的合成，其可应用至依赖于草酰乙酸前体供应的目标产物的生产，包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5- 氨基乙酰丙酸等以草酰乙酸为重要代谢前体的氨基酸的生物法生产。
由于促进草酰乙酸合成的相关酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶)的活性增强可以用于提高5-氨基乙酰丙酸等目标化合物的产量[2]，而本公开的启动子突变体都可以用于增强PPC的表达和活性，因此，本公开的启动子突变体也可以用于5-氨基乙酰丙酸生产。
本公开的启动子突变体已经证实可以提高自身基因N端序列与RFP融合蛋白的表达，也可以用于提高PPC的表达，本公开的启动子突变体还可以用于表达其他基因，应用于各种产品的生产。
引用文献：
[1]Pfeifer-Sancar et al.,Comprehensive analysis of theCorynebacterium glutamicum transcriptome using an improved RNAseqtechnique.BMC Genomics 2013,14:888
[2]CN103981203A
[3]王迎春等，基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子[J].生物工程学报，2018，34(11):1760～1771。
序列表
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<120> 启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库
<130> 6A17-2143179I
<160> 299
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 445
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgccaaattt gaaccaatta 360
acctaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 2
<211> 167
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
cgggttgttg ttgttaatcg gtacaaaggg tcttaagcac atcccttact tgcctgctct 120
ccttgagcac agttcaagaa caattctttt aaggaaaatt tagtttc 167
<210> 3
<211> 228
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
caggtacgga agtgtcctac ccgagtcaga gccgatccgc tttaccaaga ttgagtcgag 60
ctattttgcg atttgtgaac ccccaaatag gggaaaagtc cgggtatccg ccgttgtgaa 120
aatgcctgca gtaaactgac ttccatgcgc gtataccttg gagcagacca cgctggtttc 180
gaaactaaaa atgcaatcgc agaacacctt aaggcccacg gccacgaa 228
<210> 4
<211> 139
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttggccaca aaagcaagct aacctgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
<210> 5
<211> 246
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaaaa gttgagtgat gcaggcataa ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 6
<211> 235
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cgtggaacat aaagtggcaa actagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 7
<211> 206
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
aacttaacaa gcgcaacccc cgaaaatgtg agattatgtc tgatcggaca cgtgcgggct 60
ggggatatgg gtagttttcg ccactaattt caactgattg cctcatcgaa acaagattcg 120
tgcaacaatt gggtgtagac gtgattgaag acatttgatc acgtgaataa ttctagttag 180
ctcccaagtt ggcataggag gccaca 206
<210> 8
<211> 624
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
cccaaacgat gaaaaacgcc caaaactggc gacaccgaac tattgaaaac gcggggatta 60
gttgaccagc caccaatttg ggggtagctc aaagttttgc aaagttttca atttctaggt 120
tgttaatatc ccctgaggtt gcgttatagg gtggcgaatt gcatggggaa agctactcgg 180
cacccatcct tgtcgcgtgc atcacaaact ttgctaaact gtgcaccagt ccacttattg 240
tgggattttt aatgccttaa aggccagcat tttcaccctc tagcggggtt gaatgctggc 300
cttgagggtg cagaactaaa tagcagcaca tcggcacaat tgatctgagt tctattggcg 360
tgaccgtggc tactgattac ggtggctgtg ggtggtcggg aatgatgtaa ccaacgtgat 420
tgtgggggaa ttggctctca cttcggatat ggctaaaccg catttatcgg tatagcgtgt 480
taaccggacc agattgggaa agaaatgtgt cgagtaacaa aaactgacat gcgcttggcg 540
catcccagtt ggtaagaata aacgggacta cttccgtaat ccggaagagt ttttttccga 600
acaaatatgt ttgaaaggga tatc 624
<210> 9
<211> 334
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 9
aagagcggga accgacttta ctcaataagc aatgggggtg agtaaggggg tgatagaaag 60
tcacatcacg cacgtaccca tttcgagcaa atccgacaaa accgctgcct agggacatta 120
gacacgctag caggccaaaa ttccatgacg ttattgacgc gccaagaacc ccaactttcc 180
cgccagaacg cttgtactgt taggataatg aagacgtagg gtccttttcc acagttctgt 240
ggaatgagaa tccgatgttt ttctcacgcc ggctcagccg aagcagacgc cgtcgcgaaa 300
tctcacccta aaaaagttag aattggagct cact 334
<210> 10
<211> 220
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 10
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagca attagtagaa cactgtattc 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 11
<211> 291
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 11
ggcaacaagc ccgtatgtca tggactttta acgcaaagct cacacccacg agctaaaaat 60
tcatatagtt aagacaacat ttttggctgt aaaagacagc cgtaaaaacc tcttgctcgt 120
gtcaattgtt cttatcggaa tgtggcttgg gcgattgtta tgcaaaagtt gttaggtttt 180
ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagaaggtaa ccttgaactc tatgagcaca 240
ggtttaacag ctaagaccgg agtagagcac ttcggcaccg ttggagtagc a 291
<210> 12
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 12
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgttcttcgg agtcgtgata 360
cggtaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 13
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 13
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgggtgaaag tcctgtgata 360
acctaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 14
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 14
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgcgtgacgg cgttatggta 360
tcttaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 15
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 15
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgtcggatac tgtcatgtta 360
aactaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 16
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 16
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgatcgccct cgttgtgata 360
cggtaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 17
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 17
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgtggtaatg tacattggta 360
cgttaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 18
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 18
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
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tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgggagattt gagcgtggta 360
cactaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 19
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 19
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
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tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgttcgtcta cattgtgcta 360
gtgtaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 20
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 20
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
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tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
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aggtaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 21
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 21
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
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tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 22
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 22
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
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tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
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gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgagcctcct tgctatggta 360
gactaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 23
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 23
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
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gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgtgagtggt gggtgtggta 360
gggtaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 24
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 24
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
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gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgcattctaa ctttgtgata 360
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tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 25
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 25
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tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 26
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 26
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tgataagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 27
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 27
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
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gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgtcctatgg aactgtggta 360
acataagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 28
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 28
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
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gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgctcttctc ttgtatggta 360
gagtaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 29
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 29
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
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tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
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tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 30
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 30
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
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gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tggaatcaaa atttctggta 360
atataagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 31
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 31
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
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gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgcttacgac tactctggta 360
caataagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 32
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<400> 32
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgatggataa gaatgtgata 360
gagtaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 33
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 33
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
cgggtcgaaa tatgttacag ttaacttggg tcttaagcac atcccttact tgcctgctct 120
ccttgagcac agttcaagaa caattctttt aaggaaaatt tagtttc 167
<210> 34
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 34
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
cgggtatggc ccatttagtg gtatgatggg tcttaagcac atcccttact tgcctgctct 120
ccttgagcac agttcaagaa caattctttt aaggaaaatt tagtttc 167
<210> 35
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 35
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
cgggttctga tgctatcctg gtacagtggg tcttaagcac atcccttact tgcctgctct 120
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<211> 167
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 36
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
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<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 37
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
cgggtgagag ggagaggatg gtaccatggg tcttaagcac atcccttact tgcctgctct 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 38
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
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<212> DNA
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<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 39
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
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<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 40
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
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<223> tal基因的启动子突变体序列
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<223> tal基因的启动子突变体序列
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ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
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<223> tal基因的启动子突变体序列
<400> 50
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cgggtcacga ctagtttgtg gtatgttggg tcttaagcac atcccttact tgcctgctct 120
ccttgagcac agttcaagaa caattctttt aaggaaaatt tagtttc 167
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<400> 51
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<212> DNA
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<223> rpi基因的启动子突变体序列
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ctattttgcg atttgtgaac ccccaaatag gggaaaagtc cgggtatccg ccgtttagaa 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> rpi基因的启动子突变体序列
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<223> rpi基因的启动子突变体序列
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<223> rpi基因的启动子突变体序列
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
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<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
<400> 61
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
<400> 62
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<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
<400> 63
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<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
<400> 64
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gaaactaaaa atgcaatcgc agaacacctt aaggcccacg gccacgaa 228
<210> 65
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
<400> 65
caggtacgga agtgtcctac ccgagtcaga gccgatccgc tttaccaaga ttgagtcgag 60
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gaaactaaaa atgcaatcgc agaacacctt aaggcccacg gccacgaa 228
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<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
<400> 66
caggtacgga agtgtcctac ccgagtcaga gccgatccgc tttaccaaga ttgagtcgag 60
ctattttgcg atttgtgaac ccccaaatag gggaaaagtc cgggtatccg ccgttgcctc 120
tcagcttgtg ctagcatgac ttccatgcgc gtataccttg gagcagacca cgctggtttc 180
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 68
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 69
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttactcatt aagatgaggt agggtgaaga tgttatttaa 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 70
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttttgctat atggagtgct agagtgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 71
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttctgcttt aaccagtgat acagtgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
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<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 72
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
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cgacaataaa ggagttttc 139
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 73
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 74
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
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cgacaataaa ggagttttc 139
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 75
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<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 76
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<210> 77
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 77
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
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<213> Artificial Sequence
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<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 78
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<212> DNA
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<400> 79
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 80
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
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<210> 81
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 81
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 82
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<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 83
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttggtcgaa cattcatgat agtgtgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
<210> 84
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 84
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttggtcttc gatgtgtgat actgtgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
<210> 85
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 85
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttcagcgga cagtcgtggt agcatgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
<210> 86
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 86
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg ctttgtcttt gggtcatggt actatgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
<210> 87
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<400> 87
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg ctttggtacc gcaatctgat aatatgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
<210> 88
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 88
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaagt ctagtgcaca cctgatacta ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 89
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 89
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaacc tttggggagt taagatatag ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 90
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 90
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaaac tcgatttaaa ccagctagta ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 91
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 91
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaatg actgaaggtg tgggttataa ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 92
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 92
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaata aatatgtagg catgctaccc ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 93
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 93
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaatc gctccgtaat catgttagaa ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 94
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 94
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaagc ttctagtagg gagggtatac ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 95
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 95
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaagg ttgttgctgc cgtgctagag ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 96
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 96
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaaga gttgtagttt catggtatgc ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 97
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 97
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaaac tactcagtag tttgatacag ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 98
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 98
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaaag agatcgtagg gatggtaggc ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 99
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 99
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaata atattatttt tttgctacta ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 100
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 100
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaaat ttggcacaac tttggtagaa ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 101
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 101
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaagt aaatgtactt gatggtagga ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 102
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 102
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaacg gacgggactt gatgctatac ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 103
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 103
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaatc ctccgtgctt tgaggtatta ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 104
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 104
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaatg taccttccca tgtgctatga ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 105
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<400> 105
cccgatagtg tatgtgctga cctgcgttta tgcattttcc ttaggttgaa ggaaatatca 60
cacgacaaag acgcgagtct tatgatagtc ttggctatag gcaactgaag atgccacaat 120
caatgtttga tccaacagaa tcagacattg tgaatgtggg attatcggtt cgcgcttcac 180
catgtttctg catgatgaaa ttacatacat agttcagtga cagtcacctt ttggaggaga 240
cacctt 246
<210> 106
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 106
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt caggttggtc gtgggggtat gctagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 107
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 107
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt ctctctgccc ttattggtac gctagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 108
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 108
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt ctatcacttt tatttggtac gttagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 109
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 109
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt ctgcggccgc cgtacgatag tatagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 110
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 110
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cttgcttctc gatgggctaa tatagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 111
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 111
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cgtggtttat aaactggtaa gttagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 112
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 112
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cacgggttta tctctgctag attagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 113
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 113
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cattcggctc gtgatgctaa actagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 114
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 114
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cctgaagttt cttttgttat gctagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 115
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 115
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt ctgtgggcag tttatggtat gttagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 116
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 116
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt ctccgcactt cctgtgatac tgtagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 117
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 117
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cctggccgca ggtgtgatag actagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 118
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 118
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cataccattt cttctggtaa tatagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 119
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 119
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt ccgaacgcat attgtgatat tgtagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 120
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 120
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt ccggtctgcc gatctgatat actagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 121
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<400> 121
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cctgaatagt tttgtgatag gatagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 122
<211> 206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eno基因的启动子突变体序列
<400> 122
aacttaacaa gcgcaacccc cgaaaatgtg agattatgtc tgatcggaca cgtgcgggct 60
ggggatatgg gtagttttcg ccactaattt caactgattg cctcatcggt tctatgcccg 120
gggtaagatt gggtgtagac gtgattgaag acatttgatc acgtgaataa ttctagttag 180
ctcccaagtt ggcataggag gccaca 206
<210> 123
<211> 206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eno基因的启动子突变体序列
<400> 123
aacttaacaa gcgcaacccc cgaaaatgtg agattatgtc tgatcggaca cgtgcgggct 60
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ggaatgagaa tccgatgttt ttctcacgcc ggctcagccg aagcagacgc cgtcgcgaaa 300
tctcacccta aaaaagttag aattggagct cact 334
<210> 176
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> acn基因的启动子突变体序列
<400> 176
aagagcggga accgacttta ctcaataagc aatgggggtg agtaaggggg tgatagaaag 60
tcacatcacg cacgtaccca tttcgagcaa atccgacaaa accgctgcct agggacatta 120
gacacgctag caggccaaaa ttccatgacg ttattgacgc gccaagaacc ccaactttcc 180
cgcacattcc gcatttatgt taaactaatg aagacgtagg gtccttttcc acagttctgt 240
ggaatgagaa tccgatgttt ttctcacgcc ggctcagccg aagcagacgc cgtcgcgaaa 300
tctcacccta aaaaagttag aattggagct cact 334
<210> 177
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> acn基因的启动子突变体序列
<400> 177
aagagcggga accgacttta ctcaataagc aatgggggtg agtaaggggg tgatagaaag 60
tcacatcacg cacgtaccca tttcgagcaa atccgacaaa accgctgcct agggacatta 120
gacacgctag caggccaaaa ttccatgacg ttattgacgc gccaagaacc ccaactttcc 180
cgcttgacac ccgggtgtga tatagtaatg aagacgtagg gtccttttcc acagttctgt 240
ggaatgagaa tccgatgttt ttctcacgcc ggctcagccg aagcagacgc cgtcgcgaaa 300
tctcacccta aaaaagttag aattggagct cact 334
<210> 178
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<400> 178
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagct cgcgaggggt aaaggtatac 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 179
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<400> 179
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagca gggtactatt cacggtaagg 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 180
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<400> 180
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagct tatgttcgat tctggtagcg 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 181
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<400> 181
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagca agtgtccctc agtgatacac 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 182
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<400> 182
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagca aggtcttact tagggtaaca 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 183
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<400> 183
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagcg tttgctctca tatgataagg 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 184
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<400> 184
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagca ggggcgtcgg tatgataata 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 185
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dapA基因的启动子突变体序列
<400> 185
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gtcaattgtt cttatcggaa tgtggcttgg gcgattgtta tgcaaaagtt gttaggtttt 180
ttgcggggtt gtttaacccc ccgccttgta actgtggtat cgttgaactc tatgagcaca 240
ggtttaacag ctaagaccgg agtagagcac ttcggcaccg ttggagtagc a 291
<210> 186
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dapA基因的启动子突变体序列
<400> 186
ggcaacaagc ccgtatgtca tggactttta acgcaaagct cacacccacg agctaaaaat 60
tcatatagtt aagacaacat ttttggctgt aaaagacagc cgtaaaaacc tcttgctcgt 120
gtcaattgtt cttatcggaa tgtggcttgg gcgattgtta tgcaaaagtt gttaggtttt 180
ttgcggggtt gtttaacccc cgctagggct catgtggtac tgttgaactc tatgagcaca 240
ggtttaacag ctaagaccgg agtagagcac ttcggcaccg ttggagtagc a 291
<210> 187
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dapA基因的启动子突变体序列
<400> 187
ggcaacaagc ccgtatgtca tggactttta acgcaaagct cacacccacg agctaaaaat 60
tcatatagtt aagacaacat ttttggctgt aaaagacagc cgtaaaaacc tcttgctcgt 120
gtcaattgtt cttatcggaa tgtggcttgg gcgattgtta tgcaaaagtt gttaggtttt 180
ttgcggggtt gtttaacccc cttgactaag tttgtggtaa ggttgaactc tatgagcaca 240
ggtttaacag ctaagaccgg agtagagcac ttcggcaccg ttggagtagc a 291
<210> 188
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区突变序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 188
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 随机区突变序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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nnnnnnnnnn nnnngn 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 随机区突变序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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nnnnnnnnnn nnnnngn 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 随机区突变序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n is a, c, g, t or u
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nnnnnnnnnn nnnnnngn 18
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 192
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 193
atgattctcc ggaattttat tgccccgggt tgttgttgtt aatcggtaca aagggtctta 60
<210> 194
<211> 60
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 194
aataggggaa aagtccgggt atccgccgtt gtgaaaatgc ctgcagtaaa ctgacttcca 60
<210> 195
<211> 60
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 195
tttcccactt tgaacactct tcgatgcgct tggccacaaa agcaagctaa cctgaagatg 60
<210> 196
<211> 60
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 196
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<210> 197
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<400> 197
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ta 62
<210> 198
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<400> 198
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<212> DNA
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<400> 199
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<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 200
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 201
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<211> 60
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 202
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggtaacc ttgaactcta 60
<210> 203
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt基因的启动子核心区突变序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子核心区突变序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 212
gggctgaaac tgccaccata ggcgccagcn nnnnnnnnnn nnngntannn taggtagctg 60
<210> 213
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dapA基因的启动子核心区突变序列
<220>
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<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 213
taggtttttt gcggggttgt ttaacccccn nnnnnnnnnn nnngntannn ttgaactcta 60
<210> 214
<211> 445
<212> DNA
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<220>
<223> tkt基因的启动子突变体序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (363)..(363)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 214
atagatgggt gtagacgctt gattggcgga cggttcacag cggacgattt caggccctcg 60
tagctcgaga gtttgaaggg gtccgattcg ttccgttcgt gacgctttgt gaggtttttt 120
gacgttgcac cgtattgctt gccgaacatt tttcttttcc tttcggtttt tcgagaattt 180
tcacctacaa aagcccacgt cacagctccc agacttaaga ttgatcacac ctttgacaca 240
tttgaaccac agttggttat aaaatgggtt caacatcact atggttagag gtgttgacgg 300
gtcagattaa gcaaagacta ctttcggggt agatcacctt tgnnnnnnnn nnnnnngnta 360
nnntaagtcg tagatctgat catcggatct aacgaaaacg aaccaaaact ttggtcccgg 420
tttaacccag gaaggattga ccacc 445
<210> 215
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tal基因的启动子突变体序列
<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 215
ttgccctgct gtttttagct tcaacccggg gcaatatgat tctccggaat tttattgccc 60
cgggtnnnnn nnnnnnnnng ntannntggg tcttaagcac atcccttact tgcctgctct 120
ccttgagcac agttcaagaa caattctttt aaggaaaatt tagtttc 167
<210> 216
<211> 144
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpi基因的启动子突变体序列
<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(136)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 216
caggtacgga agtgtcctac ccgagtcaga gccgatccgc tttaccaaga ttgagtcgag 60
ctattttgcg atttgtgaac ccccaaatag gggaaaagtc cgggtatccg ccgttnnnnn 120
nnnnnnnnng ntannntgac ttcc 144
<210> 217
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgi基因的启动子突变体序列
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (96)..(96)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(97)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(99)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (104)..(104)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 217
ccggatggcc acgtcgaaaa gcagcccaat aaacgcacct aaatttgtcg tgtttcccac 60
tttgaacact cttcgatgcg cttnnnnnnn nnnnnnngnt annntgaaga tgttatttaa 120
cgacaataaa ggagttttc 139
<210> 218
<211> 247
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fda基因的启动子突变体序列
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(76)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (89)..(89)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(91)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 218
ccccgatagt gtatgtgctg acctgcgttt atgcattttc cttaggttga aggaaatatc 60
acacgacaan nnnnnnnnnn nnnngntann nttggctata ggcaactgaa gatgccacaa 120
tcaatgtttg atccaacaga atcagacatt gtgaatgtgg gattatcggt tcgcgcttca 180
ccatgtttct gcatgatgaa attacataca tagttcagtg acagtcacct tttggaggag 240
acacctt 247
<210> 219
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gpmA基因的启动子突变体序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (192)..(192)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (193)..(193)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (194)..(194)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (195)..(195)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(204)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (207)..(207)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (210)..(210)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (211)..(211)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 219
ctgggccgac gccttagcca cactcttgga cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga 60
agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc 120
gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt 180
aaacgcgcgt cnnnnnnnnn nnnnngntan nntagtacct atgactaacg gaaaa 235
<210> 220
<211> 206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eno基因的启动子突变体序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(106)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (108)..(108)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (110)..(110)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (111)..(111)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (112)..(112)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(113)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (128)..(128)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 220
aacttaacaa gcgcaacccc cgaaaatgtg agattatgtc tgatcggaca cgtgcgggct 60
ggggatatgg gtagttttcg ccactaattt caactgattg cctcannnnn nnnnnnnnnn 120
ngntannntt gggtgtagac gtgattgaag acatttgatc acgtgaataa ttctagttag 180
ctcccaagtt ggcataggag gccaca 206
<210> 221
<211> 624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gltA基因的启动子突变体序列
<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (476)..(476)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (477)..(477)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 221
cccaaacgat gaaaaacgcc caaaactggc gacaccgaac tattgaaaac gcggggatta 60
gttgaccagc caccaatttg ggggtagctc aaagttttgc aaagttttca atttctaggt 120
tgttaatatc ccctgaggtt gcgttatagg gtggcgaatt gcatggggaa agctactcgg 180
cacccatcct tgtcgcgtgc atcacaaact ttgctaaact gtgcaccagt ccacttattg 240
tgggattttt aatgccttaa aggccagcat tttcaccctc tagcggggtt gaatgctggc 300
cttgagggtg cagaactaaa tagcagcaca tcggcacaat tgatctgagt tctattggcg 360
tgaccgtggc tactgattac ggtggctgtg ggtggtcggg aatgatgtaa ccaacgtgat 420
tgtgggggaa ttggctctca cttcggatat ggctaannnn nnnnnnnnnn gntannntgt 480
taaccggacc agattgggaa agaaatgtgt cgagtaacaa aaactgacat gcgcttggcg 540
catcccagtt ggtaagaata aacgggacta cttccgtaat ccggaagagt ttttttccga 600
acaaatatgt ttgaaaggga tatc 624
<210> 222
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> acn基因的启动子突变体序列
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (192)..(192)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (193)..(193)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (194)..(194)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (195)..(195)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (196)..(196)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (197)..(197)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (205)..(205)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 222
aagagcggga accgacttta ctcaataagc aatgggggtg agtaaggggg tgatagaaag 60
tcacatcacg cacgtaccca tttcgagcaa atccgacaaa accgctgcct agggacatta 120
gacacgctag caggccaaaa ttccatgacg ttattgacgc gccaagaacc ccaactttcc 180
cgcnnnnnnn nnnnnnnngn tannntaatg aagacgtagg gtccttttcc acagttctgt 240
ggaatgagaa tccgatgttt ttctcacgcc ggctcagccg aagcagacgc cgtcgcgaaa 300
tctcacccta aaaaagttag aattggagct cact 334
<210> 223
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> icd基因的启动子突变体序列
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (168)..(168)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (169)..(169)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (172)..(172)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (173)..(173)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (175)..(175)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (178)..(178)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (179)..(179)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (180)..(180)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 223
gcgactacta ctggattgct ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag 60
tgaaagagaa aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg 120
tttccatgcg gggctgaaac tgccaccata ggcgccagcn nnnnnnnnnn nnngntannn 180
taggtagctg aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc 220
<210> 224
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dapA基因的启动子突变体序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (202)..(202)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (203)..(203)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(204)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (205)..(205)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (206)..(206)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (207)..(207)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (208)..(208)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (211)..(211)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (213)..(213)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (214)..(214)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (215)..(215)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (217)..(217)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (220)..(220)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (221)..(221)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (222)..(222)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 224
ggcaacaagc ccgtatgtca tggactttta acgcaaagct cacacccacg agctaaaaat 60
tcatatagtt aagacaacat ttttggctgt aaaagacagc cgtaaaaacc tcttgctcgt 120
gtcaattgtt cttatcggaa tgtggcttgg gcgattgtta tgcaaaagtt gttaggtttt 180
ttgcggggtt gtttaacccc cnnnnnnnnn nnnnngntan nnttgaactc tatgagcaca 240
ggtttaacag ctaagaccgg agtagagcac ttcggcaccg ttggagtagc a 291
<210> 225
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 225
cctgatgcgg tattttctcc atagatgggt gtagacgctt gattg 45
<210> 226
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 226
ccacctccag agccaccgcc gtacaaggtg tatgcaaggg gagc 44
<210> 227
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 227
cctgatgcgg tattttctcc ttgccctgct gtttttagct tcaac 45
<210> 228
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 228
ccacctccag agccaccgcc agcgtcgtag gaatcgccct tg 42
<210> 229
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 229
cctgatgcgg tattttctcc caggtacgga agtgtcctac 40
<210> 230
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 230
ccacctccag agccaccgcc tgagcctggg tcgtttactg tg 42
<210> 231
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 231
cctgatgcgg tattttctcc ccggatggcc acgtcgaaaa g 41
<210> 232
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 232
ccacctccag agccaccgcc ggtgagggtg gcgtcgtcaa g 41
<210> 233
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 233
cctgatgcgg tattttctcc cccgatagtg tatgtgctga cctg 44
<210> 234
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 234
ccacctccag agccaccgcc accgaactct gcaccaccgg 40
<210> 235
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 235
cctgatgcgg tattttctcc ctgggccgac gccttagcca cac 43
<210> 236
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 236
ccacctccag agccaccgcc cagcaaggag gtgtatacaa cgcc 44
<210> 237
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 237
cctgatgcgg tattttctcc aacttaacaa gcgcaacccc cg 42
<210> 238
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 238
ccacctccag agccaccgcc gcccaggtag cgatcgccac 40
<210> 239
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 239
cctgatgcgg tattttctcc cccaaacgat gaaaaacgcc c 41
<210> 240
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 240
ccacctccag agccaccgcc ggagccagtg ctcacataac ctg 43
<210> 241
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 241
cctgatgcgg tattttctcc aagagcggga accgacttta ctc 43
<210> 242
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 242
ccacctccag agccaccgcc ggtgatgttt gcgccgtctt c 41
<210> 243
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 243
cctgatgcgg tattttctcc gcgactacta ctggattgct ggc 43
<210> 244
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 244
ccacctccag agccaccgcc taccttctga tcttcggtga ggc 43
<210> 245
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 245
cctgatgcgg tattttctcc ggcaacaagc ccgtatgtca tg 42
<210> 246
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 246
ccacctccag agccaccgcc ggattcacca gtggtgccc 39
<210> 247
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 247
ctgcaggcat gcaagcttgg 20
<210> 248
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
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ggagaaaata ccgcatcagg c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 249
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aaag 64
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 250
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<210> 251
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
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ttcggggtag atcacctttg nnnnnnnnnn nnnngntann ntaagtcgta gatctgatca 60
tcgg 64
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<223> 引物序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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ggcaatatga ttctccggaa ttttattgcc ccgggtnnnn nnnnnnnnnn gntannntgg 60
gtcttaagca catcccttac ttgc 84
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
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ttccggagaa tcatattgcc 20
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<220>
<223> 引物序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 255
aagtccgggt atccgccgtt nnnnnnnnnn nnnngntann ntgacttcca tgcgcgtata 60
cc 62
<210> 256
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 256
aacggcggat acccggactt ttc 23
<210> 257
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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gaacactctt cgatgcgctt nnnnnnnnnn nnnngntann ntgaagatgt tatttaacga 60
c 61
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
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<220>
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<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
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aaggaaatat cacacgacaa nnnnnnnnnn nnnnngntan nnttggctat aggcaactga 60
agatg 65
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<220>
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<210> 261
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<223> 引物序列
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<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
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aaaattg 67
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<213> Artificial Sequence
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<223> 引物序列
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<210> 263
<211> 67
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<223> 引物序列
<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<222> (38)..(38)
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<223> n is a, c, g, t or u
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tgaagac 67
<210> 264
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 264
tgaggcaatc agttgaaatt agtgg 25
<210> 265
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 265
ctcacttcgg atatggctaa nnnnnnnnnn nnnngntann ntgttaaccg gaccagattg 60
gg 62
<210> 266
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 266
ttagccatat ccgaagtgag agcc 24
<210> 267
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 267
aagaacccca actttcccgc nnnnnnnnnn nnnnngntan nntaatgaag acgtagggtc 60
cttttc 66
<210> 268
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 268
gcgggaaagt tggggttctt g 21
<210> 269
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 269
ctgccaccat aggcgccagc nnnnnnnnnn nnnngntann ntaggtagct gaacaaaaga 60
gccc 64
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 270
gctggcgcct atggtggcag 20
<210> 271
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 271
tttttgcggg gttgtttaac ccccnnnnnn nnnnnnnngn tannnttgaa ctctatgagc 60
acaggtttaa c 71
<210> 272
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 272
gttaaacaac cccgcaaaaa ac 22
<210> 273
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 273
aaccttccat acgaactttg aaacg 25
<210> 274
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 274
caaagttcgt atggaaggtt ccg 23
<210> 275
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 275
cctgatgcgg tattttctcc atagatgggt gtagacgctt gattg 45
<210> 276
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 276
tcgcgtaaaa aatcagtcat ggtggtcaat ccttcctggg ttaaac 46
<210> 277
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 277
cctgatgcgg tattttctcc ttgccctgct gtttttagct tcaac 45
<210> 278
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 278
tcgcgtaaaa aatcagtcat gaaactaaat tttccttaaa agaattg 47
<210> 279
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 279
cctgatgcgg tattttctcc ccggatggcc acgtcgaaaa g 41
<210> 280
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 280
tcgcgtaaaa aatcagtcat gaaaactcct ttattgtcgt taaataacat c 51
<210> 281
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 281
cctgatgcgg tattttctcc cccgatagtg tatgtgctga cctg 44
<210> 282
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 282
tcgcgtaaaa aatcagtcat aaggtgtctc ctccaaaagg tgac 44
<210> 283
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 283
cctgatgcgg tattttctcc ctgggccgac gccttagcca cac 43
<210> 284
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 284
tcgcgtaaaa aatcagtcat ttttccgtta gtcataggta ctatcctatc ac 52
<210> 285
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 285
cctgatgcgg tattttctcc aacttaacaa gcgcaacccc cg 42
<210> 286
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 286
tcgcgtaaaa aatcagtcat tgtggcctcc tatgccaact tg 42
<210> 287
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 287
atgactgatt ttttacgcga tgac 24
<210> 288
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 288
ccaagcttgc atgcctgcag ctagccggag ttgcgcagc 39
<210> 289
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 289
ccaaatttga accaattaac ct 22
<210> 290
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 290
tgttgttgtt aatcggtaca aa 22
<210> 291
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 291
gtgaaaatgc ctgcagtaaa ct 22
<210> 292
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 292
ggccacaaaa gcaagctaac ct 22
<210> 293
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 293
aagttgagtg atgcaggcat aat 23
<210> 294
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 294
gtggaacata aagtggcaaa ct 22
<210> 295
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 295
tcgaaacaag attcgtgcaa caat 24
<210> 296
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 296
accgcattta tcggtatagc gt 22
<210> 297
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 297
cagaacgctt gtactgttag gat 23
<210> 298
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 298
aattagtaga acactgtatt ct 22
<210> 299
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -10区和上游的随机区序列
<400> 299
aaatgaggga agaaggtaac ct 22

Claims (18)

1.一种谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
构建包含至少一个野生型启动子的启动子文库；
将所述野生型启动子的-10区序列突变为TANNNT，将直接连接于所述-10区序列上游的随机区序列突变为NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或NNNNNNNNNNNNNNNNGN中的任一种，以得到启动子突变体；其中，N代表A、T、C、G中的任一种；并且，所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289-299任一项所示的核苷酸序列；
优选地，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；
优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：
转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖-5-磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。
3.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述具有启动子活性的多核苷酸为野生型启动子的启动子突变体；所述启动子突变体包括-10区突变序列和直接连接于所述-10区突变序列上游的随机区突变序列；所述-10区突变序列为TANNNT，所述随机区突变序列选自：NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或NNNNNNNNNNNNNNNNGN；其中，N代表A、T、C、G中的任一种；所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289-299任一项所示的核苷酸序列；
并且，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
4.根据权利要求3所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；
优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：
转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖-5-磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。
5.根据权利要求3或4所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述启动子突变体的核心区选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)包含如SEQ ID NO：203-213任一项所示的核苷酸序列；
(ii)包含与(i)所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(iii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列；
并且，所述启动子突变体的核心区不包含如SEQ ID NO：192-202任一项所示的核苷酸序列；
优选地，所述启动子突变体选自如下(v)-(viii)组成的组中的任一项：
(v)包含如SEQ ID NO：214-224任一项所示的核苷酸序列；
(vi)包含与(v)所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(vii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(viii)与(v)或(vi)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列；
并且，所述启动子突变体不包含如SEQ ID NO：1-11任一项所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求3-5任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述突变序列选自如下的任一项：
Figure FDA0003185169110000021
Figure FDA0003185169110000031
Figure FDA0003185169110000041
7.根据权利要求3-6任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，启动子突变体选自如下(a)-(d)组成的组中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：12-187任一项所示的核苷酸序列；
(b)包含与(b)所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(c)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)或(b)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(d)与(a)或(b)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列。
8.一种启动子的突变体文库，其中，所述启动子的突变体文库包含根据权利要求3-7任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸。
9.一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包含根据权利要求3-7任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有目标基因，所述目标基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接；优选地，所述目标基因为蛋白编码基因。
10.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含权利要求3-7任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，或权利要求9所述的转录表达盒。
11.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含权利要求9所述的转录表达盒，或权利要求10所述的重组表达载体。
12.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067或上述任一种的衍生菌株。
13.一种根据权利要求3-7任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，根据权利要求8所述的启动子的突变体文库，根据权利要求9所述的转录表达盒，根据权利要求10所述的重组表达载体，根据权利要求11或12所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：
(a)增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
(c)生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。
14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述蛋白选自基因表达调控蛋白、与目标化合物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白中的至少一种。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其中，所述目标化合物包括氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物中的至少一种；
可选地，所述氨基酸及其衍生物包括如下的一种或多种：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物；
可选地，所述有机酸及其衍生物包括如下的一种或多种：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物。
16.一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将权利要求3-7任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标RNA或与目标基因可操作地连接的步骤；可选地，所述目标RNA包括tRNA、sRNA中的至少一种，所述目标基因包括与目标化合物合成相关的蛋白的编码基因、基因表达调控蛋白的编码基因、与膜转运相关的蛋白的编码基因中的至少一种；
可选地，所述目标基因包括如下的至少一种酶的编码基因：丙酮酸羧化酶pyc基因、谷氨酸脱氢酶gdh基因、天冬氨酸激酶lysC基因、苏氨酸操纵子thrABC基因、天冬氨酸半醛脱氢酶asd基因、天冬氨酸氨裂合酶aspB基因、高丝氨酸脱氢酶hom基因、高丝氨酸O-乙酰基转移酶metX基因、二氢吡啶二羧酸合成酶dapA基因、二氢吡啶甲酸还原酶dapB基因、内消旋二氨基庚二酸脱氢酶ddh基因、谷氨酸激酶proB基因、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA基因、吡咯-5-羧酸脱氢酶proC基因、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA基因、谷氨酰t-RNA还原酶hemA基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因、氨基酸运输蛋白lysE基因、ptsG系统相关编码基因、丙酮酸脱氢酶aceE基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN基因、赖氨酸脱羧酶cadA/ldcC基因。
17.一种制备蛋白的方法，其中，所述方法包括利用权利要求9所述的转录表达盒，权利要求10所述的重组表达载体，或权利要求11-12任一项所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所述蛋白为与目标化合物合成相关的蛋白、基因表达调控蛋白、膜转运相关蛋白；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。
18.一种生产目标化合物的方法，其中，所述方法包括利用权利要求9所述的转录表达盒，权利要求10所述的重组表达载体，或权利要求11-12任一项所述的重组宿主细胞表达与目标化合物合成相关的蛋白、基因表达调控蛋白、膜转运相关蛋白，在所述与目标化合物合成相关的蛋白或所述基因表达调控蛋白或膜转运相关蛋白存在的环境下生产目标化合物的步骤；
可选地，所述目标化合物包括氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物中的至少一种；
可选地，所述氨基酸及其衍生物包括如下的一种或多种：赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物；
可选地，所述有机酸及其衍生物包括如下的一种或多种：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物；
可选地，所述与目标化合物合成相关的蛋白为与L-氨基酸合成相关的蛋白；
可选地，所与L-氨基酸合成相关的蛋白包括丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、氨基酸运输蛋白、ptsG系统、丙酮酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、葡萄糖酸阻遏蛋白、葡萄糖脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶中的一种或两种以上的组合；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。
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